JPH03183476A

JPH03183476A - ２―ケト酪酸の製造法

Info

Publication number: JPH03183476A
Application number: JP32329189A
Authority: JP
Inventors: Setsuo Furuyoshi; 古吉　節夫; Yoshiharu Nawa; 慶東名和; Nariaki Kawabata; 川端　成彬
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1989-12-12
Filing date: 1989-12-12
Publication date: 1991-08-09
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: JPH0822222B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規な微生物と該微生物による２−ケト酪酸の
製造法に関する。２−ケト酪酸は例えばインロイシン発
酵の原料あるいは光学活性なヒドロキシ酪酸、光学活性
なアミノ酪酸、抗生物質であるバウロマイシンＡなどの
原料となる。

（従来の技術）従来、２−ケト酪酸を工業的に合成する方法としては、
シュウ酸ジエチルとプロピオン酸ジエチルを脱水縮合さ
せた後、濃硫酸で加水分解する方法が知られている。こ
のほか、アセトアルデヒドとシアノメチルクロライドを
出発物質として多段階で得る方法や、２−メタンスルホ
ニルオキシクロトン酸を加水分解する方法、エトキサリ
ルプロビオン酸エチルエステルを加水分解する方法等が
公知である。

また、上記の化学合成法とは別に、微生物を用いる方法
については、アエロバクタ−・アエロバクタ（Ａｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、ミクロコツカス
・リソデイクトリカス（Ｍｌｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉｙ
ｓｏｄｅｌｋｔｒｌｃｕｓ）、トルロプシス・ニーティ
リス（丁ｏｒｕｌｏｐｓ１ｓ　ｕｔｌ目Ｓ）、ｆｆ１．
ッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｌｌｃｈｌａ　ｃｏｌ
ｌ）、サツカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）などが産出する
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（Ｄｌｈｙｄｒｏｘｙａ
ｃｌｄ　ｄｅｂｙｄｒａｔａｓｅ（４，２，１，９）　
）が、２．３−ジヒドロキシ酪酸を基質とし、これを２
−ケト酪酸に変換する能力を持つことなどが知られてい
る（Ｗｌｘｏｍ、　Ｒ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ。

Ｂ（ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、ｉｌ、４３３　（１９８
１）　）。

（発明が解決しようとする問題点）これら従来の方法は、化学合成法では、多段階の合成を
必要としたり、出発原料が高価であったりするため工業
的に有利な方法ではなく、また、微生物を用いる方法で
は、生成収率が低いためにやはり工業生産には適さない
。そこで、安価な合成法の確立が求められていた。本発
明は、従来法よりも安価に２−ケト酪酸の製造を可能な
らしめるものである。

Ｃ問題点を解決するための手段）本発明者らは、２−ケト酪酸製造の原料として安価なり
ロトン酸から容易にトレオ体またはエリスロ体として有
機合成される２、３−ジヒドロキシ酪酸に着目した。そ
して、２，３−ジヒドロキシ酪酸を効率よく２−ケト酪
酸に変換する酵素系をもつ微生物を得るために、基質と
してトレオ体を用いて広く天然界から検索した結果、シ
ュードモナス・プチダに属する微生物が、トレオー２゜
３−ジヒドロキシ酪酸を効率よく２−ケト酪酸に変換す
る酵素系をもつことを見いだし、発明を完成した。

すなわち、本発明はシュードモナス属に属し、２．３−
ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に変換する能力を有す
る微生物であり、また当該微生物あるいはその処理物の
存在下に、２，３−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に
変換して２−ケト酪酸を蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする２−ケト酪酸の製造法である。

従来、２，３−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に変換
する酵素系をシュードモナス属細菌が産生ずることは公
知ではなかった。したがって、２゜３−ジヒドロキシ酪
酸を２−ケト酪酸に変換する酵素系をもつ本願の微生物
は、新規なものである。

本発明に使用される酵素系は、シュードモナス属に属す
る細菌が有する２、３−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪
酸に変換する作用を利用するものである。

本発明者らは、トレオー２，３−ジヒドロキシ酪酸を効
率よく２−ケト酪酸に変換する酵素系をもつ微生物を天
然界から検索した結果、５Ｄ３Ａ株（微工研菌寄第目１
２Ｇ号）を単離した。５Ｄ３Ａ株は、トレオー２，３−
ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪率よく蓄積するためには
有利であり、５Ｄ３Ａ株（微工研菌寄第１１１２８号）
は、本発明に用いる微生物として好ましいものである。

５Ｄ３Ａ株（微工研菌寄第１１１２Ｇ号）の菌学的性質
を以下に示す。

以上の菌学的諸性質を基準として、Ｂｅｒｇｅｙ’５）
Ｉａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｖｌｎａｔｌｖｅ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　第８版（１９７４）の分類
基準により検索すると、５Ｄ３Ａ株（微工研菌寄第１１
１２８号）は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）であると同定された。

本発明は、シュードモナス属に属する微生物を使用して
、２−ケト酪酸を製造する方法に関するものである。

本発明において使用するシュードモナス属に属し、２，
３−ジヒドロキシ酪酸を２−ケト酪酸に変換する能力を
有する微生物としては、上記シュードモナス・プチダ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）５Ｄ３Ａ株（
シュードモナス・プチダ　丁Ｅ３４８７とも呼ぶ）（微
工研菌寄第１１１２１１ｉ号）が例示されるが、該菌株
に限定されない。該微生物の処理物とは、該微生物の培
養物から精製された酵素ならびに該酵素の固定化物など
を意味する。

本発明において原料となるトレオ（またはエリスロ）−
２，３−ジヒドロキシ酪酸は、一般にクロトン酸から合
成される。合成法については、４酸化オスミウム触媒の
存在下に、クロトン酸をＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オ
キサイドによって酸化する方法（Ｆｒａｎｋ　Ｂ、　Ａ
ｒｍｓｔｒｏｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、　　Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｔｒａｎ
ｓ、　　Ｉ、　　１９８５．　８９１（１９８５）　　
）また、４酸化オスミウムと過酸化水素の存在下にクロ
トン酸から合成する方法（Ｆ、Ｗ、　Ｂａｃｈｅｌｏｒ
ａｎｄＧ、Ａ、旧ａｎａ、　ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊ、　
Ｃｈｅｗ、、　柱、　４０８９（１９８９））などが公
知である。

本発明の微生物を培養するための培地組成としては、炭
素源・窒素源・無機物及び必要に応じて少量の微量栄養
素を含むものであれば、合成培地または天然培地のいず
れも使用可能である。培地に使用する炭素源としては、
グリセリン、グルコース、可溶性でんぷん等、資化され
るものならばいずれも可能である。トレオ（またはエリ
スロ）＝２，３−ジヒドロキシ酪酸は、それ自身は炭素
源にならないが、この反応系に関与する酵素系を誘導す
る効果があり、培地中に添加することが好ましい。また
、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩等が用いら
れる。たとえば、硝酸アンモニウムまたは硫酸アンモニ
ウムである。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグ
ネシウムイオン、カリウムイオン、その他が適宜用いら
れる。さらに、有機栄養素として、酵母エキス、ペプト
ン、肉エキス、コ、−ンスティープリカーなどが適宜用
いられる。

上記培地にて、本発明の微生物をｐＨ６〜８（好ましく
は７．２）、温度１７〜２８℃（好ましくは２５℃）に
おいて１２〜２４時間培養する。調製された微生物の培
養物は、トレオ（またはエリスロ）−２，３−ジヒドロ
キシ酪酸を２−ケト酪酸に変換する酵素系をもつもので
ある。このような培養物はそのまま酵素源として反応に
使用してもよく、また、培養物を遠心分離などで分離し
て得られる生菌株、その乾燥菌体、あるいは、分離した
菌体を超音波処理・自己消化・磨砕などの方法により処
理して得られる菌体処理物、さらにはこれらの菌体より
の抽出物ならびに該抽出物より得られる酵素の粗製物ま
たは精製物として使用してもよい。もちろん、これらの
固定化菌体または固定化酵素としても使用できる。

本発明方法ではこのようにして調製した菌体、菌体処理
物、固定化菌体などを触媒として用い、トレオ（または
エリスロ）−２，３−ジヒドロキシ酪酸を反応液中で変
換せしめて、２−ケト酪酸を生成蓄積せしめる。

反応液には、２−ケト酪酸の生成率を高めるために、基
質であるトレオ（またはエリスロ）　−２，３−ジヒド
ロキシ酪酸の他に、２ａｉカチオンの添加が好ましく、
例えば反応液中に１ｍＭの塩化コバルトを共存させるこ
とにより、著しく生成効率を高めることができる。基質
の使用量には制限が無いが、好ましくは１００＋Ｍであ
る。酵素反応は、通常ｐＨ８〜１０（好ましくは９．０
）、温度は１０〜４０℃（好ましくは２５℃）において
行う。

反応時間は、目的に応じ適宜設定されるものであるが、
通常１〜２０時間である。

得られた反応液からの２−ケト酪酸の採取方法は、例え
ば、反応液を遠心分離した上清をクロマトグラフィーに
より分画する等の方法に従って行うことができる。

（実施例）以下、実施例を挙げて説明するが、これらは例示であっ
て本発明を限定するものではない。

なお、トレオー２，３−ジヒドロキシ酪酸の定量は高速
液体クロマトグラフ法で、２−ケト酪酸の定量は、２．
４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いて分光光度法に
より行った。

実施例　１グリセリン０．５％、トレオー２，３−ジヒドロキシ酪
酸０．３％１酵母エキス０．１５％、硫酸アンモニウム
０．１％、リン酸−カリウム０．１５％、リン酸二カリ
ウム０．１５％、食塩０．１％、硫酸マグネシウム七水
塩０，０２％ほか微量要素を含む培地（ｐＨ７，２）を
肩付きフラスコに５０−人れ、１２０℃で２０分間殺菌
した。これにシュードモナス、プチダ５Ｄ３Ａ株（微工
研菌寄第１１１２１１ｉ号）を接種し、２５℃で１２時
間、振とう培養した。この培養液より菌体を遠心分離に
より採取した後ｔｌｏｏｍＭ）レオ−２，３−ジヒドロ
キシ酪酸を含む１００ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９
，０）で、菌体濃度が４０■／ＩＬｌになるように懸濁
した。また、懸濁の際には同時に塩化コバルトを濃度１
ｍＭになるよう加えた（全量１０ｗＬり。この反応液を
、振とうしながら２５℃、０〜２４時間保持し、２−ケ
ト酪酸生成量を測定した。結果を第１表に示す。

第　　　　１　　　表また、菌体濃度が１０，２０．８０ｍｇ／−の場合でも
同様の操作を行った。その結果を、菌体濃度４０■／ｊ
の場合を含めて、第１図に示す。

第１図は、遠心分離により採取した菌体を、１００＋ｌ
Ｉ）レオ−２，３−ジヒドロキシ酪酸を含む１００■関
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）で、菌体濃度がそれ
ぞれ１０１２０％　４０１８０ｗ／ｌＺにまなるように
懸濁し、また、懸濁の際に同時に塩化コバルトを濃度１
ｍＭになるよう加えた反応液（全量１０−）を、振とう
しながら２５℃、０〜２４時間保持した場合の２−ケト
酪酸生成量を示したものである。

図中の記号〇−〇は菌体濃度１０■／−の場合を、以下
Δ−Δは２　Ｏｎ　／　ｄ　、ローロは４０■／−１・
−・は８０ｍｇ／−の場合をそれぞれ表す。

実施例　２グリセリン０．５％、酵母エキス０．１５％、硫酸アン
モニウム０．１％、りん酸−カリウム０．１５％、りん
酸二カリウム０．１５％、食塩０．１％、硫酸マグネシ
ウム七水塩０．０２％ばか微量要素を含む培地（ｐＨ７
，２）に、さらにＯ〜２．Ｏｄの範囲でトレオー２，３
−ジヒドロキシ酪酸を添加して、肩つきフラスコに５０
−入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。それぞれにシュ
ードモナス・プチダ５Ｄ３Ａ株（微工研菌寄第１１１２
１１ｉ号）を接種し、２５℃で１２時間振とう培養のの
ち、菌体を遠心分離により集めた。

集めた菌体を、１００ｍＭ）レオ−２，３−ジヒドロキ
シ酪酸を含む１００＋＋＋Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９，０）で、菌体濃度が２０■／−になるようにそれぞ
れ懸濁した。また、懸濁の際には同時に塩化コバルトを
濃度１ｍ旧こなるよう加えた（全量１ＯＴＬり。これら
の反応を、振とうしながら２５℃、２４時間保持し、２
−ケト酪酸生成量を測定した。結果を第２表に示す。

第表（発明の効果）本発明は、新規な微生物ならびに該微生物による２−ケ
ト酪酸の製造法を提供するものであり、実施例において
示されたごとく、効率よく２−ケト酪酸の生成が可能で
あることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２−ケト酪酸生成量を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シュードモナス属に属し、２，３−ジヒドロキシ
酪酸を２−ケト酪酸に変換する能力を有する微生物。
（２）シュードモナス属に属し、２，３−ジヒドロキシ
酪酸を２−ケト酪酸に変換する能力を有する微生物ある
いはその処理物の存在下に、２，３−ジヒドロキシ酪酸
を２−ケト酪酸に変換して２−ケト酪酸を蓄積せしめ、
これを採取することを特徴とする２−ケト酪酸の製造法
。