JPH10179153A

JPH10179153A - ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその製法

Info

Publication number: JPH10179153A
Application number: JP33933596A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Adachi; 収生足立; Kazunobu Matsushita; 一信松下
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 1998-07-07
Anticipated expiration: 2016-12-19
Also published as: JP3997441B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】Ｋｍ値の低い新規な３α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼおよびその製造法に関するものであ
る。【解決手段】下記理化学的性質を有する３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼおよびシュードモナス属
に属する細菌から該酵素を製造する方法。作用：３α−ヒドロキシステロイド＋ＮＡＤ⁺ →
３−ケトステロイド＋ＮＡＤＨ基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオ
キシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコ
ール酸、リトコール酸に作用する。至適温度：４５℃、
至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１、熱安定性：４０℃以下（ｐ
Ｈ８．０、１０分間）、ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５
℃、１６時間）、コール酸に対するＫｍ値：０．０１５
ｍＭ、分子量：２５，０００（ゲルろ過法）、２５，０
００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＫｍ値の低い新規な
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびそ
の製造法に関するものである。胆汁酸は、生体内では肝
臓でコレステロールより合成され、一次胆汁酸であるコ
ール酸、ケノデオキシコール酸が生成する。しかし、こ
れらは腸内細菌により更に代謝され、デオキシコール
酸、リトコール酸等の二次胆汁酸やウルソデオキシコー
ル酸等の二次胆汁酸となって存在している。胆汁中に分
泌された、これらのコール酸は、一般に腸管により再吸
収され、門脈を経て肝臓にもどる腸肝循環を営んでいる
が、肝外側副血行、肝臓での輸送障害、胆汁うっ滞など
を起こす病態で血清中に漏出してくる。このため、血清
胆汁酸は肝胆道疾患のスクリーニングや経過観察に有用
なマーカーとなっている。上記胆汁酸は３αにＯＨ基を
有しており、この水酸基を酸化する酵素、３α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼが測定に利用されてい
る。

【０００２】

【従来の技術】３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲ
ナーゼ(EC1.1.1.50)の存在は古くから知られており、１
９５２年には該酵素がテストステロンで誘導されたシュ
ードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testostero
ni）で生産されることが報告されている。また、該酵素
は既に市販されている。更に、該酵素の起源としては、
ノカルディア（Nocardia）属由来の酵素（特開昭620151
199 号公報) 、セルロモナス・ツルバータ(Cellulomona
s turubata) 由来の酵素（特公平3-23154 号公報) が知
られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般に、血清胆汁酸の
濃度レベルは低く、正常値は１０μＭ以下、肝胆道疾患
でも５０μＭ程度に過ぎない。このため、胆汁酸を精度
良く測定するには胆汁酸に対するＫｍ値の低い３α−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが求められてい
た。

【０００４】

【発明を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シュードモナス
（Pseudomonas)に属する微生物から、胆汁酸に対するＫ
ｍ値の低い３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼを見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は下記理化学的性質を有
する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであ
る。作用：次の反応を触媒する。３α−ヒドロキシステロイド＋ＮＡＤ⁺ →３−ケ
トステロイド＋ＮＡＤＨ基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオ
キシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコ
ール酸、リトコール酸に作用する。至適温度：４５℃ 至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１熱安定性：４０℃以下（ｐＨ８．０、１０分間）ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）コール酸に対するＫｍ値：０．０１５ｍＭ

【０００６】また、本発明はシュードモナス属に属し、
上記理化学的性質を有する３α−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、
該培養物より３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼを採取することを特徴とする３α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼの製造法である。

【０００７】本発明の酵素の起源は、上記性質を有する
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを産生す
るものであれば、動物、植物、微生物など如何なる起源
のものを用いても良い。好ましくは、上記性質を有する
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを産生し
うるシュードモナス（Pseudomonas)属細菌であって、好
適な例としては、シュードモナス・プチダ（Pseudomona
s putida）ＴＥ３６２０が挙げられる。シュードモナス
・プチダＴＥ３６２０の菌学的性質は以下の通りであ
る。

【０００８】（ａ）形態（１）菌形：短かん菌（２）細胞の大きさ：２．０〜２．５×１．０μｍ（３）細胞の多形性：無し（４）運動性：有り（５）胞子の有無：無し（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培地：３０℃、２４時間培養で黄白
色のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全縁状（En
tire）であり、クッション状（Pulvinate ）である。表
面は円滑（Smooth）で光沢を有し、半透明である。（２）肉汁液体培養：生育は普通で、一様に混濁する。
沈さはないが、菌環を若干認めた。（３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は普通で上部のみ糸
状（Filiform）に生育する。ゼラチン液化力は弱い。（４）リトマスミルク：アルカリ性に変化する。ミルク
は固化しない。

【０００９】（ｃ）生理学的性質（１）グラム染色性：陰性（−）（２）硝酸塩の還元：陽性（＋）（３）脱窒反応： − （４）ＭＲテスト： − （５）ＶＰテスト： − （６）インドールの生成： − （７）硫化水素の生成： − （８）デンプンの分解： − （９）ゼラチンの分解： − （１０）チロシンの分解＋

【００１０】（１１）クエン酸の利用： koser の培地＋ Christensen の培地＋（１２）無機窒素源の利用硝酸ナトリウム − 硫酸アンモニウム＋グルタミン酸ナトリウム＋（１３）色素の生成：キングＢ培地中で蛍
光色素を生成する。（１４）ウレアーゼ − （１５）オキシダーゼ＋（１６）カタラーゼ＋（１７）β−ガラクトシダーゼ − （１８）アルギニンジヒドロラーゼ＋（１９）リジンカルボキシラーゼ − （２０）オルニチンカルボキシラーゼ − （２１）トリプトファンデアミナーゼ − （２２）β−グルコシダーゼ −

【００１１】（２４）酸素に対する態度：好気性（２５）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：Ｏ（酸化）

【００１２】（２６）糖から酸およびガスの生成酸ガスＬ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース − − Ｄ−ガラクトース − − マルトース − − シュークロース − − ラクトース − − トレハロース − − Ｄ−ソルビトール − − Ｄ−マンニトール − − イノシトール − − グリセリン − − デンプン − − Ｌ−ラムノース − − Ｄ−メリビオース − − Ｄ−アミダクリン − −

【００１３】（２７）有機化合物の利用Ｄ−グルコース＋Ｌ−アラビノース＋Ｄ−マンノース＋Ｄ−マンニトール − Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン − マルトース − グルコン酸カリウム＋ｎ−カプリン酸＋アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸＋酢酸フェニル＋

【００１４】上記菌学的性質同定のための実験法は、主
として長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」
学会出版センター（１９８５年）によって行った。また
分類同定の基準として「バージェーズ・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジー」（１９８４
年）を参考にした。以上の文献および菌学的性質を参考
にすると、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas puti
da）に属すると考えられ、それぞれシュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）ＴＥ３６２０と命名した。
本菌は微生物寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６００７として
寄託されている。

【００１５】本発明の酵素を製造するにあたっては、上
記３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生産菌
を栄養培地に培養し、該培養物から３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼを採取することにより製造で
きる。３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ生
産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株
が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄
養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地
いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例
えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天
然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の
無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リ
ン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等
が使用される。また３α−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼの生産誘導として、コール酸等の３α−ヒド
ロキシステロイドを添加しておくことが望ましい。

【００１６】培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培
養で行う。培養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜
３０℃、培養ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１
０に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用す
る菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７
日で生育し、菌体内および菌体外に３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼが生産蓄積される。本発明の
酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いれば良
い。例えば、菌体除去後の培地を、硫安やぼう硝などの
塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属
凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集
法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セル
ロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなど
のイオン交換クロマト法などにより精製することができ
る。またこれらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液
は、例えば、スプレードライや凍結乾燥により粉末化で
きる。さらには適当な担体に固定化して固定化酵素とし
て使用できる。

【００１７】次に本発明の３α−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼの活性測定法を示す。まず下記反応混
液をキュベットに調製し、２５℃で約５分予備加温す
る。０．９６ｍｌ５０ｍＭグリシン・ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．００．０２ｍｌ２０ｍＭＮＡＤ⁺ ０．０１ｍｌ酵素溶液次に基質溶液（１００ｍＭコール酸ナトリウム）０．
０１ｍｌを加え、緩やかに混和後、水を対照に℃で制御
された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度変化を３〜４分
間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度
変化を求める。盲検は反応混液に酵素溶液の代わりに酵
素希釈液を加え、上記同様に操作を行って１分間当りの
吸光度を求めた。上記条件下で１分間に１マイクロモル
のＮＡＤＨを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。

【００１８】

【発明の効果】本発明によって３α−ヒドロキシステロ
イドに対するＫｍ値の小さい３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼを得ることができる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。実施例１０．２％硝酸ナトリウム、０．２％硫酸アンモニウム、
０．０５％酵母エキス、０．０２％硫酸マグネシウム、
０．２％リン酸二カリウム、０．１％リン酸一カリウ
ム、０．２％コール酸ナトリウムを含む培地１００ｍｌ
を５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５分
間オートクレーブを行った。種菌として、ｐスードモナ
ス・プチダＴＥ３６２０（ＦＥＲＭＰ−１６００７）
を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培養液
とした。次に同培地６Ｌを１０Ｌジャーファーメンター
に移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放
冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気
量２ｌ／分、３０℃で２４時間培養した。得られた菌体
を超音波破砕後、硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースクロ
マトグラフィー、セファデックスＧ−５０によるゲルろ
過により比活性１７．５Ｕ／ｍｇにまで精製した。得ら
れた３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは下
記の特性を有していた。

【００２０】作用：下記の反応を触媒した。３α−ヒドロキシステロイド＋ＮＡＤ⁺ →３−ケ
トステロイド＋ＮＡＤＨ

【００２１】

【表１】

【００２２】本酵素はＮＡＤ⁺のみ利用し、ＮＡＤＰ⁺
は利用しなかった。

【００２３】

【表２】

【００２４】至適ｐＨ：５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８〜９）、５０ｍＭグリシン−ＮＡＯＨ緩衝液
（ｐＨ９〜９．５）、５０ｍＭリン酸二ナトリウム−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８〜１１）、５ｍＭＡＰＢ（ｐ
Ｈ１１〜１１．５）中での酵素活性を測定した。その結
果は第１図に示す通りであって、至適ｐＨは１０〜１１
であった。

【００２５】安定ｐＨ：０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４
〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．２〜７．８）、ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシン−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ８〜１１）中で、酵素を２５℃、１６時間保
存し、残存活性を測定した。その結果は第２図に示す通
りであって、安定ｐＨはｐＨ６〜９であった。

【００２６】至適温度：各温度における酵素活性を測定
した。その結果は第３図に示す通りであって、至適温度
は４５℃であった。

【００２７】熱安定性：本発明の酵素をトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）中で１０分間保温した後、残存する酵
素活性を測定した。その結果は第４図に示す通りであっ
て、４０℃まで安定であった。

【００２８】

【００２９】比較例１本発明の酵素の性質を既知の３α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼの性質と比較した。

【００３０】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を
示すグラフである。

【図２】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフであ
る。

【図３】本発明の酵素の反応温度と相対活性との関係を
示すグラフである。

【図４】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記理化学的性質を有する３α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ。作用：次の反応を触媒する。３α−ヒドロキシステロイド＋ＮＡＤ⁺ →３−ケ
トステロイド＋ＮＡＤＨ基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオ
キシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコ
ール酸、リトコール酸に作用する。至適温度：４５℃ 至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１熱安定性：４０℃以下（ｐＨ８．０、１０分間）ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）コール酸に対するＫｍ値：０．０１５ｍＭ
【請求項２】シュードモナス属に属し、下記理化学的
性質を有する３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、該培養物より
３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを採取す
ることを特徴とする３αーヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼの製造法。作用：次の反応を触媒する。３α−ヒドロキシステロイド＋ＮＡＤ⁺ →３−ケ
トステロイド＋ＮＡＤＨ基質特異性：コール酸、デオキシコール酸、ウルソデオ
キシコール酸、ケノデオキシコール酸、６−ケトリトコ
ール酸、リトコール酸に作用する。至適温度：４５℃ 至適ｐＨ：ｐＨ１０〜１１熱安定性：４０℃以下（ｐＨ８．０、１０分間）ｐＨ安定性：ｐＨ６〜９（２５℃、１６時間）コール酸に対するＫｍ値：０．０１５ｍＭ