JPH03198775A - スタフイロキナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はスタフィロキナーゼ産生遺伝子を含有する新規
な大腸菌の培養によりスタフィロキナーゼを製造する方
法に関する。

スタフィロキナーゼ（以下ＳＡＫと略記する）とは、ス
タフィロコッカス・アウレウス（以下Ｓ・アウレウスと
記す）が産生ずる繊維素溶解酵素であって、血中のプラ
スミノーゲンをプラスミンに変える機能を有する。この
プラスミンがフィブリンに作用してこれを溶解するもの
である。同様の作用を有するものとしてヒトの尿中に存
在するウロキナーゼや連鎖球菌が産生ずるストレプトキ
ナーゼが知られているが、これらはいずれも血液凝固防
止剤、血栓治療剤などのいわゆる線溶剤として医療に供
し得るものである。そのため、これらの物質の生産方法
や抽出・精製方法が種々検討されている。

ＳＡＫの生産に関しては、これまでに、ＳＡＫ産生能は
Ｓ・アウレウスを宿主とする溶原ファージの溶原化に伴
って、宿主に賦与される（これを溶原変換という）形質
であることが知られており、従来、Ｓ・アウレウスの中
からＳＡＫ産生能を有する株を選択するか、あるいはＳ
ＡＫを溶原変換するファージでＳＡＫ非産生のＳ・アウ
レウス株を溶原化し、それらの株を培養することによっ
て、その培養液よりＳＡＫを採取するという方法が行わ
れている。

しかしながら、Ｓ・アウレウスは強い病原性を有する細
菌であり、その取扱いには、極めて慎重な配慮が必要で
あるためかかる方法は、本来工業的なＳＡＫの生産方法
に適さず、しかも、ＳＡＫの収量を上げるためには長時
間の培養が必要であるため、その意味からも工業的方法
としては適性を欠いているものである。

本発明者らは、安全性、効率性の面から、Ｓｌを工業的
に生産し得る適切な方法について鋭意研究した結果、Ｓ
ＡＫ産生情報を担う遺伝子がファージＤＮＡ上に存在す
ることを究明し、Ｓ・アウレウスの溶原ファージＤＮＡ
の断片をベクターを介して大腸菌に導入させることに成
功しｊこ。

本発明は、かかる成果によるものであり、したがって、
本発明はＳＡＫ産生遺伝子を含有する新規な大腸菌を培
養することによるＳＡＫの製造法を提供するものである
。

以下に、本発明の詳細な説明する。

本発明方法において使用する新規な大腸菌は、下記■〜
■の工程により得られるものである。

■　ＤＮＡ供与体であるＳ・アウレウスの溶原ファージ
ＤＮＡを制限酵素で切断する。

■　ＳＡＫ産生遺伝情報を有するＤＮＡ断片をとり出す
。（この工程は省略することもできる）■　ベクターＤ
ＮＡを制限酵素によって開裂させる。

■　ベクターＤＮＡの開裂部位に■又は■で得たＤＮＡ
断片を組み込まぜる。

■　この組み換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に導入する。

■　■によりＳＡＫ産生能を有することとなった大腸菌
を選択分離する。

上記のＤＮＡ供与体としての溶原ファージはＳＡＫ生産
能を有するＳ・アウレウス溶製株から分離された溶原フ
ァージで、かつ、その７アージが溶製変換能を有するフ
ァージであれば、すべて使用可能である。その例として
は４２Ｄ、　Ｌ４２Ｅ。

７７（文献：　Ｍａｓｏｎ、　Ｒ，Ｅ、ａｎｄ　Ａ１１
ｅｎ、　Ｗ、Ｅ、（１９７５）Ｃａｎ、Ｊ、Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、　２１．１１１３−１１１６）　、Ｐｕｌ。

Ｐｄ　２．　Ｔｕ　−４２Ｄ、　ＰＩ−４０６Ｃ文献：
　Ｋｏｎｄｏ、　　１．ａｎｄＦｕｊｉｓｅ、　Ｍ、（
１９７７）Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、１８．２６６−
２７２）、Ｒ５１９，ＳｍＣ（文献：近藤勇ら（１９８
０）東京慈恵会医科大学雑誌９５．１２０３−１２０６
）などがある。溶原ファージＤＮＡの調製に使用される
手段は、常用の手段である。すなわち、溶原ファージを
その宿主菌であるＳ・アウレウスに感染させ、この感染
菌を培養する（この方法は例えば文献：Ｂｌａｉｒ、　
Ｊ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｒ，Ｅ、Ｏ，
（＋９６１）Ｂｕｌｌ−Ｗ、Ｈ，０，２４，７７１〜７
８４に記載されている）。これによって７アージは培地
中に出てくる（菌は溶菌する）ので、このファージを適
当な方法（例えば塩化セシウム平衡密度勾配遠心法２交
献：Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ、　Ｅ、Ｄ、ａｎｄ　Ｔｙｒｏ
ｎｅ、　Ｓ、（１９６４）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
８８．１７３７−１７４２）で集め、この７アージから
さらに公知の方法（例えばフェノール抽出法など）によ
りファージＤＮＡを抽出することができる。

溶原ファージＤＮＡの制限酵素による切断は次のように
して行う。

７アージＤＮＡに適当な制限酵素を加え、適当な反応条
件で反応を行うことによって、ファージＤＮＡは加えら
れた制限酵素によって種々の断片に切断される。

このファージＤＮＡの切断に使用しうる制限酵素は、■
）ファージＤＮＡを切断しうるものであり、かつ２）Ｓ
ＡＫ生産に関する遺伝情報を担うＤＮＡ部分を切断しな
いものでなければならない。これに適する制限酵素とし
ては、Ｈｉｎｄｌ［、Ｐｓｔ　Ｉ　、Ａｃｃ　Ｔ　。

ＡｖａＩＩ　、ＥｃｏＲＩ　、ＨｐａＩ　、ＨｐａＩ［
、）ＩｉｎｄＩＩ　、Ｓｓｔ　Ｉ　、Ｃ１ａｌ。

ＢｓｔＥＩＩ　、５ｓｔＨ、ＸｈｏＩ　、Ｂｃｌ　Ｉ　
、ＢＥＩ　Ｉ［、ＰｖｕＩ［、Ｘｏｒｌ［。

Ｋｐｎ　Ｉ　、Ｓｍａ　Ｉ　、Ｘｂａ　Ｉなどがある。

次に、ファージＤＮＡを制限酵素で切断したＤＮＡ断片
群の中からＳＡＫ産生情報を含むＤＮＡ断片を各種の公
知の方法（例えばアガロースゲル電気泳動法など）によ
り分離する。このためには、ファージＤＮＡの断片群の
うち、どの断片がＳＡＫ産生情報を有しているかを前も
って判定しておかなければならない。この判定方法につ
いては後述する。上記のＤＮＡ断片の分離操作は場合に
より省略することもできる。

一方、ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当
な制限酵素を加え、適当な反応条件下で反応を行うこと
によりベクターＤＮＡを開裂させることができる。

ベクターＤＮＡとしては公知のものが使用できる。それ
には例えばＣｏ１Ｅｌ、　　ｐＭＢ９．　　ｐｓｃｌｏ
ｌ、。

ｐ１５Ａおよびその誘導体（例えばｐＢＲ３２２。

ｐＡｃＹｃ１８４など）やλフアージ由来のシャロンベ
クターなどがある。

次に、ベクターＤＮＡの開裂部位に上述のＤＮＡ断片を
組み込ませるが、その手段自体は、常法によるものであ
り、使用したファージＤＮＡの種類、ベクターＤＮＡの
種類および制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が選
択される。なお、ベクターの複製能を損なわない限り、
上記のファージＤＮＡ断片を挿入する方向及び部位は問
わない。

次いで組み換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に導入させるが、
宿主大腸菌としては大腸菌に特異な制限・修飾系のうち
制限能を欠損した大腸菌株はすべて使用可能である。ま
た、いったん修飾をうけたＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤ
ＮＡを組み込んだプラスミドは制限能を有する大腸菌株
に対しても使用することができる。宿主大腸菌は、用い
たベクターの種類によって限定される場合がある。使用
した大腸菌原株のうちのｒ哀とは制限能を欠損した株を
、またｍｉとは修飾能をもたない株を示す。

導入の手段、自体は公知の方法（例えばＣａｍ−ｅｒｏ
ｎらの方法：文献Ｃａｍｅｒｏｎ、　　Ｊ、Ｒ，ｅｔ　
ａｌ。

（１９７５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、７２．３４１６−３４２０）を用いること
ができる。

前述の■の工程を行った場合においても、溶原ファージ
のＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込まない
場合があり、また、■の工程を省略した場合には、組み
込まない場合の他にＳＡＫ産生能に関するものでないＤ
ＮＡ断片を組み込む場合がある。そのためにＳＡＫ産生
能を有することとなった大腸菌を選択分離することが必
要である。この大腸菌の選択分離には、Ｓ・アウレウス
について用いられている公知の方法（例えば文献：　Ｋ
ｏｎｄｏ、　Ｉ　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓｅ、　Ｋ、　（１
９７７）　Ｉｎ７ ｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　１８．２６６−２７２）を
使用することができる。すなわち、この方法により、加
熱血漿寒天培地を作成し、その上に試験菌をスポットし
、一定期間培養することによりフィブリン分解能をみる
。フィブリン分解能を有するものは集落の周辺をとかし
て、透明なゾーンができるので、この菌だけをとり出す
ことができる。がくしてＳＡＫ産生能を有する大腸菌が
分離されるが、ＳＡＫ産生能を有する大腸菌からのＳＡ
Ｋ産生遺伝情報を担うＤＮＡの解析は次の如くして行う
。

すなわち、ＳＡＫ産生能を有する大腸菌から組換え体プ
ラスミドまたは組換え体７アージを取り出し、ファージ
ＤＮＡの切断およびベクターＤＮＡの開裂に用いた制限
酵素でこの組換え体プラスミドまたは組換え体ファージ
を切断する。この切断されたＤＮＡ断片の分子量（すな
わちＤＮＡとしての長さ）を公知方法（例えば、アガロ
ースゲル電気泳動なと）によって測定することによって
ＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ断片のファージＤＮＡ
上での位置を知ることができる。

解析実験の一例を次に示す。

実験例：ファージＤＮＡとしてＳ〆Ｃを用いた場合１）
制限酵素ＰｓｔＩで切断した時　　　　　　１５．８Ｋ
ｂ２）制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩで切断した時　　　　　
　４．９Ｋｂ３）制限酵素Ｈ４ｎｄｌ１１及びＡｖａ　
Ｉ＋で切断した時　２．０Ｋｂ４）制限酵素Ａｖａｌｌ
及びＡｃｃ　Ｉで切断した時　　１．３Ｋｂ部分にＳＡ
Ｋ産生遺伝情報が存在することが判明しｊこ。

以上述べた如くして得られるＳＡＫ産土産金能する大腸
菌は、その菌学的性質はもとの大腸菌とくらべ、ＳＡＫ
産生能を有していること以外変わるところがない。その
−船釣菌学的性質は、後掲別表に示す（後記実施例によ
り得られたものについて例示）。

本発明により、上記の如くして得られた新規な大腸菌を
用いて、その大腸菌を培養し培養菌体に蓄積したＳＡＫ
を採取することにより、工業的なＳＡＫの製造法が提供
される。

本発明によるＳＡＫの製造法は、上記の如くして得られ
たＳＡ［の産生能を有する大腸菌を常法により培養し、
集菌した後、Ｔａｌｍａｄｇｅ、　Ｋ、　ｅｔａｌ（１
９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、
Ｓ、Ａ、　７７、３３６９〜３３７３に記載されている
方法によりペリプラズム画分をとった。このペリプラズ
ム画分からＳＡＫ活性大部分が回収された。得られた粗
ＳＡＫを、常用のタンパク質の精製法である塩析、ゲル
が過、吸着クロマトグラフィーを用いて精製しｌこ　。

上記の如き本発明方法により、大腸菌を用いてＳＡＫを
生産することが可能となったが、このように、大腸菌に
ＳＡＫを産生せしめることによって従来技術であるＳ・
アウレウスによる場合と異り、安全性、増殖速度、大量
培養（大量生産）等の驚くべき利点がもたらされる。し
かも大腸菌の場合には、ＳＡＫがペリプラズムに蓄積す
るので、従来法によりＳ・アウレウスを使用して上清両
分から取得する場合に比べて１００倍以上という高濃度
が得られ、細胞全体を破砕して抽出する方法に比べ共雑
するタンパク質が少いので、その分離精製が容易に行わ
れるという格別の利点が得られる。

上記のペリプラズムに蓄積する現象は、例えば後に掲げ
る実施例１により得られた大腸菌、エシェリヒア・コリ
Ｋ１２　Ｃ６００ｒ’ｉｍ、（ｐＳＡＫ　３６１）を２
００ｍ１２のし一プロス（ポリペプトンｌＯｇ／Ｑ、イ
ースｉ・エキストラフｈ５ｇ／１２、グルコース１ｇ／
（１゜ＮａＣＱ　５　ｇ／　１２）にて３７°Ｃで５時
間培養した時のＳＡＫ活性の分布とその割合を例示する
ど下表のとおりであり、この場合、ＳＡＫの約６０％が
ペリプラズム画分に存在することがわかる。

総活性（、）　　　％ 上清画分　　９５０　　２３ ペリプラズム画分　　　　２４００　　　　５８ザイト
プラズム画分　　　８００　　　　１９以下に本発明の
例を掲げる。

例　　１ 本例はＤＮＡ供与体としてＳφＣを、ベクターＤＮＡと
してｐＢＲ３２２を、制限酵素きして旧ｎｄｌｌＩを、
宿主大腸菌原株としてエシェリヒア・コリに１２Ｃ６０
０ｒ″Ｋｍｇまたはエシェリヒア・コリに１２　ＷＡ８
０２１ １２ ｒｙ、ｍ灸を用いて行なった例である。

ａ）　　５ＩＣＤＮＡの調製と切断 文献（Ｂｌａｉｒ、　　Ｊ、Ｅ、ａｎｄ　Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ、　Ｒ，Ｅ、Ｏ。

（１９６１）Ｂｕｌｌ、Ｗ、Ｈ，０，２４，７７１−７
８４）の方法に従ってファージＳｐＣを増殖し、得られ
たファージ液ｌＩ２に対し、５Ｍ−ＮａＣ１２１００＋
１１（２を加え、さらに３０％（ｗ／ｗ）ポリエチレン
グリコール（平均分子量７０００−８０００）３００ｍ
４を加え、よく撹拌し、０°Ｃで数時間放置した。その
後１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心して沈殿を集め、
これを２０ｍ（ｌの緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ
、　１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，、５ｍＭ　ＣａＣ（２２，０
，０１％ゼラチン、　ｐＨ７，４）に溶かし、これにＤ
ＮａｓｅおよびＲＮａｓｅをそれぞれ最終濃度で１ｕｇ
／ｍＱとなるように加え、３７℃にて２０分間反応させ
た。反応終了後１０．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心し、
その上清をさらに３０．ＯＯＯｒｐｍで６０分間遠心し
て得られる沈殿を上記と同し緩衝液２．５ｍＱに溶かし
、これに約１．７９の塩化セシウムを加え、２７，００
０ｒｐｍで１８時間平平衡度勾配遠心にかける。このよ
うにして得られるファージのバンドを集め、１０．の上
記２同じ緩衝液に対して透析する。得られたファージ液
Ｑ、５ｍＱに５０ｔｔＱの１．５Ｍ　ＮａＣ（＋−０，
１５Ｍクエン酸ナトリウム、５ｕＱの２５０ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７，０）および５μＱのｌＯ％ＳＤＳを加え
、３７°Ｃに５分間放置後、０．６＋＋ｌＱの０．１５
Ｍ　ＮａＣＱ　−１５ｍＭクエン酸すトリウム溶液飽和
フェノールを加え、室温でおだやかに約ｌＯ分間混合す
る。これを３　、０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上層
（水層）を集める。このフェノール処理を繰り返した後
、等量のエーテルによる洗浄を３回行ない、得られた水
層を０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２−１５ｍＭクエン酸ナトリ
ウム−１ｍＭ　ＥＤＴＡの２００ｍ１２に対して３回透
析する。

ファージＤＮＡを切断するため、１１１ｇのＤＮＡに対
し３ｕのＨｉｎｄｌＩ［を加え、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ２−７ｍＭＭｇＣ（Ｌ　−７ｍＭβ−メルカプト
エタノール−５０ｍＭＮａＣＱ（ｐＨ７，６）の緩衝液
２０μρ中で３７°Ｃにて３時間反応を行わせ、反応終
了時にｌμａの２５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を
加える。この制限酵素で処理したＤＮＡ溶液に５μＱの
１．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，０）を加え、さらに
６０μａのエタノールを加え、−７０°Ｃにて１０分間
放置した後、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し沈殿を
集め、エタノールで再度洗浄する。

これを減圧乾燥させ、１０μｇの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＱ−１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８−０、ＴＥバッファ
）に溶解する。

ｂ）　プラスミドｐＢＲ３２２の開裂 １μｇのｐＢＲ３２２に対し１．　ｕの旧ｎｄｌＩ＋を
加え、前述の緩衝液と同一の緩衝液２０μρ中で３７°
Ｃにて３時間反応させ、反応終了時に１μａの２５０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）を加える。以下、前記ａ）
における反応終了後のＤＮＡ溶液の処理と同様にしてＤ
ＮＡ溶液を洗浄する。

Ｃ）再結合反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ） 結合反応（Ｌｉｇａｔ　１ｏｎ）は５０ｎｇｐＢＲ３２
２ＤＮＡ（上記ｂ）で得られたもの’）　、　１．５μ
ｇｓ＄ｃＤＮＡ（上記ａ）で得られたもの）　、　３０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ｔｃ（２（ｐＨ７，６）、　１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣＱ２．　１０ｍＭジチオスレイ１−−ル、０
．１ｍＭＡＴＰおよび０．１ｕ　　Ｔ４リガーゼを含む
２０μａの反応液中で４°Ｃにて４８時間または２０℃
にて数時間反応させ、ｌ　ＪＩＱの０．２５Ｍ　ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８，０）を加えて反応を止める。その後リガー
ゼを失活させるために６５°Ｃにて５分間加熱し、１８
０μＱのＴＥバッファを加えて一２０°Ｃに保存する。

ｄ）組換え体プラスミドの大腸菌への導入各大腸菌をグ
ルコースを含まないし一ブロス（ポリペプトンｌＯｇ／
　Ｑ、イーストエキストラクｔ・５　ｇ／　Ｑ、　Ｎａ
Ｃｌ２５　ｙ／　１２）の１．Ｑｍ１２に接種して５×
１０　’　／　ｍρに増殖させた後、４°Ｃにて遠心集
菌する。この菌を５ｍ１２の冷やした５０ｍＭ　ＣａＣ
Ｏ２に懸濁し、氷水浴中に５分間放置後再び遠心集菌し
、さらに０．６７ｍＱの冷やした５０ｍＭＣａＣｌ２２
に懸濁し、氷水浴中に５分間放置する。この大腸菌の懸
濁液に再結合したプラスミドＤＮＡ溶液（上記Ｃで得ら
れた）を０．３３ｍ＋２混合し、氷水浴中に５分間保持
する。その後この反応液を４２°Ｃにて２分間保持する
ことにより大腸菌への組換え体プラスミドの導入を止め
る。この懸濁液をそのまままたは１０倍、１００倍に希
釈し、アンピシリン（４０μｇ／ｍＱ）を含むし一ブロ
ス寒天培地（寒天濃度１．３％）に塗布し、３７℃に一
夜培養し、アンピシリン耐性となった大腸菌組換え体を
分離する。

１５ ６ ｅ）　　ＳＡＫ産生能を有する大腸菌の選択分離ヒト血
漿を５ｍｆｌずつ複数の試験管に分注し、５６°Ｃで２
０分間加熱し、別に、溶かした２％寒天入り普通寒天培
地を１０ｍ＋２ずつ複数の容器に分注し、５６℃に温め
ておく。この両者をすばやくシャーレ上で混合し、固ま
るまで放置する。この複数の寒天培地上に上記ｄ）で得
られた大腸菌試験菌の菌懸濁液をスポットし、３７°Ｃ
にて培養する。ＳＡＫ産生能を有する大腸菌はフィブリ
ンを分解し、集落の周辺をとかすので透明なゾーンが出
来る。この時得られた新規大腸菌のそれぞれを宿主大腸
菌原株に応じてエシェリヒア・コリＫ１２　Ｃ６００ｒ
ｘｍ−ｘ（ｐｓＣ６００ｒｘおよびエシェリヒア・コリ
Ｋ１２　ＷＡ８０２ｒ’ｉｉｍ”ｘ（ｐｓＡＫ３６１）
と名付けた。

ｆ）大腸菌プラスミドの解析 上記ｅ）で得られた各大腸菌をアンピシリン（４０μｇ
／　ｍ１２）を含み、グルコースを含まないＬ−ブロス
４００ｍＱにて３７°Ｃで約４　Ｘ１０’ｃｅｌｌｓ／
ｍＱまで増殖させ、培養液にクロラムフェニコールを１
５０Ｍｇ／ｍＱとなるように加え、さらに３７°Ｃで１
５時間で培養した後遠心集菌する。５０ｍ＋２の１０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ８，０）−０，０１５Ｍ
　ＮａＣＱ−１，５ｍＭクエン酸ナトリウムで菌体を洗
浄し、３．２ｍＱの２５％蔗糖−５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＱ（ｐＨ８，０）に懸濁する。これに１．５ｒＡＩ
２の２５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、ｌ＋＋＋α
の５ｍｇ／ｍＱリゾチーム、６ｍＱの２％ブリッジ５８
−６２．５ｍＭＥＤＴＡ−５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（
１（ｐＨ８，０）を加え、３０°Ｃ″ｃｌＳ分間インキ
ュベートし、細胞壁をおだやかに溶解し、高速遠心分離
（４℃にて３０．ＯＯＯｒｐｍ、　３０分間）により菌
体を沈殿させ、上溝を得る。これをエチジウムブロマイ
ド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心（１０’ｃにて３６
．０００ｒｐｍ１４８時間）にかけプラスミドＤＮＡを
精製する。これをｂ）と同様の方法でＨｉｎｄｌＩ＋で
切断し、ＳＡＫ遺伝子を有する断片の長さを１％アガロ
ースを用いたアガロースゲル電気泳動法で測定したとこ
ろ４．９Ｋｂであることが判明した。

ｇ）　　４．９Ｋｂ断片の分離 １００μｇのＳｄＣＤＮＡを０．２ｍＱの反応液（１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ７，６）−７ｍＭ　Ｍ
ｇＣ（ｈ−７ｍＭβ−メルカプトエタノール−５０ｍＭ
　ＮａＣＱ−１００ｕ　　Ｈ４ｎｄｌｌＩを含む）中に
３７°Ｃで２００時間反応ることにより切断し、これを
１％アガロースを用いてアガロースゲル電気泳動にかけ
る。エチジウムブロマイドによってＤＮＡを染色し、目
的とする４、９ＫｂのＤＮＡ断片のある部分のみをゲル
から切り出す。

切り出したゲル断片は、電気泳動法によって透析チュー
ブの中に溶出させる。溶出させたＤＮＡ溶液はＴＥバッ
ファで飽和したフェノールで処理し、水層をさらにエー
テルで処理した後、エタノール沈殿法によってＤＮＡを
集め、ベクターＤＮＡとの再結合反応に供することがで
きる。

ｈ）　　ＳＡＫの生産・抽出・精製 上で得たＳＡＫ産生能を有する大腸菌をＬ−ブロス（ポ
リペプトン１％、イーストエキストラクト０．５％、Ｎ
ａＣ０，０，５％、グルコース０．１％、ｐＨ７，０）
５０＋ｎ（＋に接種し、−夜３７°Ｃで振とう培養する
。

この菌液を同一ブロス５ρに接種し、３７°Ｃで１２時
時間上う培養し、遠心して集菌する。この菌体を１００
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ−２０％蔗糖（ｐＨ８，０）２
００ｔＱに懸濁し、再び遠心して集菌する。これを４５
ｍＱの１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＱ−２０％蔗糖（
ｐＨ８，０）に懸濁し、５ｍＱのリゾチーム溶液（５ｍ
ｇ／　ｍＯリゾチーム−２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８
，０）を加え、氷水浴中に１時間放置する。これを遠心
して上清を集め、ここへ８０％飽和になるように硫安を
加え、４°Ｃで一夜放置する。遠心により沈殿を集め、
１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＯ（ｐＨ７，５）１０ｍＣにと
かし、同バッファに対して透析する。これをセファデッ
クスＧ−７５ゲルクロマトグラフイーにかけ、ｌｏｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＩＣ（１゜（ｐｉ（７，５）で溶出し、
ＳＡに活性画分を集め、ｌＱｍＭＴｒｉｓ−）１ｃ（１
（ｐＨ７，５）で平衡化したＣＭ−セルロースカラムに
吸着させ、０〜０．５Ｍ　ＮａＣＱの直線濃度勾配で溶
出させ、０．３〜０．３２Ｍ　ＮａＣＱによって溶出さ
れるＳＡＫ活性画分を集める。

例　　２ 本例はＤＮＡ供与体としてＳＩＣを、ＳＩＣ切断用制限
酵素として旧ｎｄｌｌ［とＰｓｔＩを、ベクターＤＮＡ
としてｐＢＲ３２２を、ｐＢＲ３２２切断用制限酵素と
してＥｃｏＲＩとＰｓｔ　Ｉを、大腸菌原株として、エ
シエ９ ０ リヒア・コリに１２　　Ｃ６００ｒ’１１ｍ１またはエ
シェリヒア・コリに１２　ＷＡ８０２ｒｉｍ；を用いて
行った例である。

ａ）　ファージ５ＩＣＤＮＡの切断 例１のａ）〜ｆ）に記した方法でＳＩＣＤＮＡからｔ（
ｉｎｄ］ＩＩで切断した時の４．９Ｋｂ断片を分離する
。

この断片の両端にはそれぞれ４塩基から成る一本鎖部分
があるため、この部分を１ｕの７４　ＤＮＡポリメラー
ゼと４種のデオキシリボヌクレオシド−３りン酸（各２
５μＭ）によって６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ２（ｐＨ
８，０）、６．７ｍＭ　１ｉ１ｇｃＩ２２．６．７ｍＭ
β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（２０μＱ）中
で１８°Ｃにて４時間反応させて二本鎖とした。これに
５μａの１．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，０）と７５
μＱのエタノールを加え、−７０℃に１０分間保持した
後、１２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心し、沈殿をエタノ
ールで洗浄する。これを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ（
ｐＨ７，６）　−７ｍＭＭｇ（４２−７ｍＭβ−メルカ
プトエタノール−５０ｍＭＮａＣθを含む緩衝液にとか
し、０．５ｕのＰｓｔｌを加え、３７°Ｃで３時間反応
させることにより、さらに２つの断片に切断する。これ
を再結合反応に供する。

ｂ）　プラスミドｐＢＲ３２２の開裂 １μ９のｐＢＲ３２２ＤＮＡに１ｕのＥｃｏＲＩを加え
て例１のｂ）と同様に反応させ開裂する。この開裂した
ＤＮＡの両端も４塩基からなる一本鎖部分があるので、
ａ）の場合と同様にＴ４　ＤＮＡポリメラーゼと４種の
デオキシリポヌクレオシド−３リン酸によって二本鎖に
する。これをさらにａ）におけると同様にＰＳｔｌで切
断して再結合反応に供する。

Ｃ）再結合反応 ａ）、ｂ）で得られたＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを混
合し、例１のＣ）と同様にして再結合反応を行なわせる
。ただしＴ４　　ＤＮＡリガーゼはｌｕを用しまた。

ｄ）以下例Ｉと同様に新規な大腸菌〔エシェリヒア・コ
リＫ１２　Ｃ６００ｒ’ｉｍｘ（ｐＳＡＫ−ＨＦ２）ま
たはエシェ’）ヒ７−−ｒすに１２　ＷＡ８０２ｒｘｍ
”ｘ　（ｐＳＡＫ−１４Ｐ２）と命名〕を得、プラスミ
ド解析の結果、各大腸菌は、約２．５ＫｂのＳ〆Ｃ由来
のＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡを有していた。

得られた新規な大腸菌を使用し、これを常法により培養
し、集菌した後、Ｔａｌｍａｄｇｅ、　Ｋ、　ｅｔａ１
０９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、７７、３３６９〜３３７３に記載されてい
る方法によりペリプラズム画分をとった。このペリプラ
ズム画分からＳＡＫ活性大部分が回収された。得られた
粗ＳＡＫを、常用のタンパク質の精製法である塩析、ゲ
ルが過、吸着クロマトグラフィーを用いて精製しＩこ。

例　　３ 本例はＤＮＡ供与体としてＰｕｌを、ベクターとしてｐ
ＢＲ３２２を、制限酵素として旧ｎ、ｄＩ［［を大腸菌
原株としてエシェリヒア・コリＫ１２　Ｃ６Ｃ６００ｒ
ｘ　ヲ用いて行なった例である。

ａ）例１と同様の方法でファージＰ〆Ｉ　ＤＮＡを調製
し、Ｈｉｎｄｌｌｌにて切断する。ベクターＤＮＡも同
様にして切断する。

ｂ）再結合反応、大腸菌への導入、組換え体大腸菌の選
択は例１と同様に行なう。

Ｃ）　この結果Ｐｕｔに由来するＳＡＫ産生遺伝情報を
担うＤＮＡ領域を大腸菌に導入させることができた。こ
の新規な大腸菌をエシェリヒア・コリＫ１２　Ｃ６００
ｒｘｍｘ（ｐｓＣ６００ｒｘと命名した。

得られた新規な大腸菌を使用し、これを常法により培養
し、集菌した後、Ｔａｌｍａｄｇｅ、　Ｋ、　ｅｔａ［
１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、７７＋　３３６９〜３３７３に記載されて
いる方法によりペリプラズム画分をとった。このペリプ
ラズム画分からＳＡＫ活性大部分が回収された。得られ
た粗ＳＡにを、常用のタンパク質の精製法である塩析、
ゲルが過、吸着クロマトグラフィーを用いて精製した。

３ ４ 木　Ａはエシェリヒア・コリに１２　ＣＣ６００ｒｘ＋
＋を表わす。

木本　Ｂはエシェリヒア・コリに１２　Ｃ６００ｒｘｍ
ｘ（ｐＳＡＣ６００ｒｘを表わす。

木零木Ｃはエシェリヒア・コリＫ１２　Ｃ６０Ｃ６００
ｒｘ＋）ＳＡＫ３６１）を表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）スタフィロコッカス・アウレウスの溶原ファージＤ
   ＮＡを切断して得たスタフィロキナーゼ産生遺伝情報を
   担うＤＮＡを組み込んだベクターを導入させた大腸菌を
   培養し、その培養菌体に蓄積したスタフィロキナーゼを
   採取することを特徴とするスタフィロキナーゼの製造法
   。