JPH0479640B2 - - Google Patents
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- JPH0479640B2 JPH0479640B2 JP2295382A JP29538290A JPH0479640B2 JP H0479640 B2 JPH0479640 B2 JP H0479640B2 JP 2295382 A JP2295382 A JP 2295382A JP 29538290 A JP29538290 A JP 29538290A JP H0479640 B2 JPH0479640 B2 JP H0479640B2
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はスタフイロキナーゼ産生遺伝子を含有
する新規な大腸菌の培養によりスタフイロキナー
ゼを製造する方法に関する。 スタフイロキナーゼ（以下SAKと略記する）
とは、スタフイロコツカス・アウレウス（以下
Ｓ・アウレウスと記す）が産生する繊維素溶解酵
素であつて、血中のプラスミノーゲンをプラスミ
ンに変える機能を有する。このプラスミンがフイ
ブリンに作用してこれを溶解するものである。同
様の作用を有するものとしてヒトの尿中に存在す
るウロキナーゼや連鎖球菌が産生するストレプト
キナーゼが知られているが、これらはいずれも血
液凝固防止剤、血栓治療剤などのいわゆる線溶剤
として医療に供し得るものである。そのため、こ
れらの物質の生産方法や抽出・精製方法が種々検
討されている。 SAKの生産に関しては、これまでに、SAK産
生能はＳ・アウレウスを宿主とする溶原フアージ
の溶原化に伴つて、宿主に賦与される（これを溶
原変換という）形質であることが知られており、
従来、Ｓ・アウレウスの中からSAK産生能を有
する株を選択するか、あるいはSAKを溶原変換
するフアージでSAK非産生のＳ・アウレウス株
を溶原化し、それらの株を培養することによつ
て、その培養液よりSAKを採取するという方法
が行われている。 しかしながら、Ｓ・アウレウスは強い病原性を
有する細菌であり、その取扱いには、極めて慎重
な配慮が必要であるためかかる方法は、本来工業
的なSAKの生産方法に適さず、しかも、SAKの
収量を上げるためには長時間の培養が必要である
ため、その意味からも工業的方法としては適性を
欠いているものである。 本発明者らは、安全性、効率性の面から、
SAKを工業的に生産し得る適切な方法について
鋭意研究した結果、SAK産性情報を担う遺伝子
がフアージDNA上に存在することを究明し、
Ｓ・アウレウスの溶原フアージDANの断片をベ
クターを介して大腸菌に導入させることに成功し
た。 本発明は、かかる成果によるものであり、した
がつて、本発明はSAK産生遺伝子を含有する新
規な大腸菌を培養することによるSAKの製造法
を提供するものである。 以下に、本発明を詳細に説明する。 本発明方法において使用する新規な大腸菌は、
下記〜の工程により得られるものである。 DNA供与体であるＳ・アウレウスの溶原フ
アージDNAを制限酵素で切断する。 SAK生遺伝情報を有するDNA断片をとり出
す。（この工程は省略することもできる） ベクターDNAを制限酵素によつて開裂させ
る。 ベクターDNAの開裂部位に又はで得た
DNA断片を組み込ませる。 この組み換え体DNAを宿主大腸菌に導入す
る。 によりSAK産生能を有することとなつた
大腸菌を選択分離する。 上記のDNA供与体としての溶原フアージは
SAK生産能を有するＳ・アウレウス溶原株から
分離された溶原フアージで、かつ、そのフアージ
が溶原変換能を有するフアージであれば、すべて
使用可能である。その例としては42D、L42E、
77（文献：Mason，R.E.and Allen，W.E.（1975）
Can.J.Microbiol、21，1113〜1116）、Pφ1、
Pφ2、Tφ−42D、Pφ−406（文献：Kondo，I.and
Fujise，K.（1977）Infect.Immun.18、266〜272）、
Rφ19、SφC（文献：近藤勇ら（1980）東京慈恵会
医科大学雑誌95、1203〜1206）などがある。溶原
フアージDNAの調製に使用される手段は、常用
の手段である。すなわち、溶原フアージをその宿
主菌であるＳ・アウレウスに感染させ、この感染
菌を培養する（この方法は例えば文献：Blair，
J.E.and Williams，R.E.O.（1961）Bull.W.H.O.
24、771〜784に記載されている）。これによつて
フアージは培地中に出てくる（菌は溶菌する）の
で、このフアージを適当な方法（例えば塩化セシ
ウム平衡密度勾配遠近法、文献：Rosenblum，
E.D.and Tyrone，S.（1964）J.Bacteriol.88，
1737〜1742）で集め、このフアージからさらに公
知の方法（例えばフエノール抽出法など）により
フアージDNAを抽出することができる。 溶原フアージDNAの制限酵素による切断は次
のようにして行う。 フアージDNAに適当な制限酵素を加え、適当
な反応条件で反応を行うことによつて、フアージ
DNAは加えられた制限酵素によつて種々の断片
に切断される。 このフアージDNAの切断に使用しうる制限酵
素は、(1)フアージDNAを切断しうるものであり、
かつ(2)SAK生産に関する遺伝情報を担うDNA部
分を切断しないものでなければならない。これに
適する制限酵素としては、Hind、Pst、Acc
、Ava、EcoR、Hpa、Hpa、Hind
、Sst、Cla、BstE、Sst、Xho、
Bcl、Bgl、Pvu、Xor、Kpn、Sma
、Xbaなどがある。 次に、フアージDNAを制限酵素で切断した
DNA断片群の中からSAK産生情報を含むDNA
断片を各種の公知の方法（例えばアガロースゲル
電気泳動法など）により分離する。このために
は、フアージDNAの断片群のうち、どの断片が
SAK産生情報を有しているかを前もつて判定し
ておかなければならない。この判定方法について
は後述する。上記のDNA断片の分離操作は場合
により省略することもできる。 一方、ベクターDNAの開裂は、ベクターDNA
に適当な制限酵素を加え、適当な反応条件下で反
応を行うことによりベクターDNAを開裂させる
ことができる。 ベクターDNAとしては公知のものが使用でき
る。それには例えばColel、pMB9、pSC101、
p15Aおよびその誘導体（例えばpBR322、
pACYC184など）やλフアージ由来のシヤロン
ベクターなどがある。 次に、ベクターDNAの開裂部位に上述のDNA
断片を組み込ませるが、その手段自体は、常法に
よるものであり、使用したフアージDNAの種類、
ベクターDNAの種類および制限酵素の種類に応
じて適当な反応条件が選択される。なお、ベクタ
ーの複製能を損なわない限り、上記のフアージ
DNA断片を挿入する方向及び部位は問わない。 次いで組み換え体DNAを宿主大腸菌に導入さ
せるが、宿主大腸菌としては大腸菌に特異な制
限・修飾系のうち制限能を欠損した大腸菌株はす
べて使用可能である。また、いつたん修飾をうけ
たSAK産生遺伝情報を担うDNAを組み込んだプ
ラスミドは制限能を有する大腸菌株に対しても使
用することができる。宿主大腸菌は、用いたベク
ターの種類によつて限定される場合がある。使用
した大腸菌原株のうちのr- Kとは制限能を欠損した
株を、またm- Kとは修飾能をもたない株を示す。 導入の手段、自体は公知の方法（例えば
Comeronらの方法：便県Cameron，J.R.et al.
（1975）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72，3416〜
3420）を用いることができる。 前述のの工程を行つた場合においても、溶原
フアージのSAK産生遺伝情報を担うDNA断片を
組み込まない場合があり、また、の工程を省略
した場合には、組み込まない場合の他にSAK産
生能に関するものでないDNA断片を組み込む場
合がある。そのためにSAK産生能を有すること
となつた大腸菌を選択分離することが必要であ
る。この大腸菌の選択分離には、Ｓ・アウレウス
について用いられている公知の方法（例えば文
献：Kondo，Ｉ and Fujise，K.（1977）Infect.
Immun.18、266〜272）を使用することができ
る。すなわち、この方法により、加熱血漿寒天培
地を作成し、その上に試験菌をスポツトし、一定
期間培養することによりフイブリン分解能をみ
る。フイブリン分解能を有するものは集落の周辺
をとかして、透明なゾーンができるので、この菌
だけをとり出すことができる。かくしてSAK産
生能を有する大腸菌が分離されるが、SAK産生
能を有する大腸菌からのSAK産生遺伝情報を担
うDNAの解析は次の如くして行う。すなわち、
SAK産生能を有する大腸菌から組換え体プラス
ミドまたは組換え体フアージを取り出し、フアー
ジDNAの切断およびベクターDNAの開裂に用い
た制限酵素でこの組換え体プラスミドまたは組換
え体フアージを切断する。この切断されたDNA
断片の分子量（すなわちDNAとしての長さ）を
公知方法（例えば、アガロースゲル電気泳動な
ど）によつて測定することによつてSAK産生遺
伝情報を担うDNA断片のフアージDNA上での位
置を知ることができる。 解析実験の一例を次に示す。 実験例：フアージDNAとしてSφCを用いた場合 (1) 制限酵素Pstで切断した時 15.8kb (2) 制限酵素Hindで切断した時 4.9kb (3) 制限酵素Hind及びAvaで切断した時
2.0kb (4) 制限酵素Ava及びAccで切断した時
1.3kb 部分にSAK産生遺伝情報が存在することが判明
した。 以上述べた如くして得られるSAK産生能を有
する大腸菌は、その菌学的性質はもとの大腸菌と
くらべ、SAK産生能を有していること以外変わ
るところがない。その一般的菌学的性質は、後掲
別表に示す（後記実施例により得られたものにつ
いて例示）。 本発明により、上記の如くして得られた新規な
大腸菌を用いて、その大腸菌を培養し培養菌体に
蓄積したSAKを採取することにより、工業的な
SAKの製造法が提供される。 本発明によるSAKの製造法は、上記の如くし
て得られたSAKの産生能を有する大腸菌を常法
により培養し、集菌した後、Talmadge，K.et
al（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77、3369〜
3373に記載されている方法によりペリプラズム画
分をとつた。このペリプラズム画分からSAK活
性大部分が回収された。得られた粗SAKを、常
用のタンパク質の精製法である塩析、ゲル過、
吸着クロマトグラフイーを用いて精製した。 上記の如き本発明方法により、大腸菌を用いて
SAKを生産することが可能となつたが、このよ
うに、大腸菌にSAKを産生せしめることによつ
て従来技術であるＳ・アウレウスによる場合と異
り、安全性、増殖速度、大量培養（大量生産）等
の驚くべき利点がもたらされる。しかも大腸菌の
場合には、SAKがペリプラズムに蓄積するので、
従来法によりＳ・アウレウスを使用して上清画分
から取得する場合に比べて100倍以上という高濃
度が得られ、細胞全体を破砕して抽出する方法に
比べ共雑するタンパク質が少いので、その分離精
製が容易に行われるという格別の利点が得られ
る。 上記のペリプラズムに蓄積する現象は、例えば
後に掲げる実施例１により得られた大腸菌、エシ
エリヒア・コリK12 C600r- Km- K（pSAK 361）を
200mlのＬ−ブロス（ポリペプトン10ｇ／、イ
ーストエキストラクト５ｇ／、グルコース１
ｇ／、NaCl5ｇ／）にて37℃で５時間培養し
た時のSAK活性の分布とその割合を例示すると
下表のとおりであり、この場合、SAKの約60％
がペリプラズム画分に存在することがわかる。 総括性（ｕ） ％ 上清画分 950 23 ペリプラズム画分 2400 58 サイトプラズム画分 800 19 以下に本発明の例を掲げる。 例 １ 本例はDNA供与体をとしてSφCを、ベクター
DNAとしてpBR322を、制限酵素としてHind
を、宿主大腸菌原株としてエシエリヒア・コリ
K12C600r- Kｍ- Kまたはエシエリヒア・コリK12
WA802r- Kｍ+ Kを用いて行なつた例である。 (a) SφCDNAの調製と切断 文献（Blair，J.E.and Williams，R.E.O.
（1961）Bull.W.H.O.24，771〜784）の方法に
従つてフアージSφCを増殖し、得られたフアー
ジ液１に対し、5M−NaCl 100mlを加え、さ
らに30％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール
（平均分子量7000〜8000）300mlを加え、よく攪
拌し、０℃で数時間放置した。その後
10000rpmで15分間遠心して沈殿を集め、これ
を20mlの緩衝液（10ｍＭ Tris−HCl、10ｍＭ
MgSO4、５ｍＭ CaCl2、0.01％ゼラチン；
PH7.4）に溶かし、これにDNaseおよびRNase
をそれぞれ最終濃度で1μｇ／mlとなるように
加え、37℃にて20分間反応させた。反応終了後
10000rpmで10分間遠心し、その上清をさらに
30000rpmで60分間遠心して得られる沈殿を上
記と同じ緩衝液2.5mlに溶かし、これに約1.7ｇ
の塩化セシウムを加え、27000rpmで18時間平
衡密度勾配遠心にかける。このようにして得ら
れるフアージのバンドを集め、１ｇの上記と同
じ緩衝液に対して透析する。得られたフアージ
液0.5mlに50μの1.5M NaCl−0.15Mクエン酸
ナトリウム、5μの250ｍＭ EDTA（PH7.0）
および5μの10％SDSを加え、37℃に５分間
放置後、0.6mlの0.15M NaCl−15ｍＭクエン酸
ナトリウム溶液飽和フエノールを加え、室温で
おだやかに約10分間混合する。これを3000rpm
で10分間遠心し、上層（水層）を集める。この
フエノール処理を繰り返した後、等量のエーテ
ルによる洗浄を３回行ない、得られた水層を
0.15M NaCl−15ｍＭクエン酸ナトリウム−１
ｍＭ EDTAの200mlに対して３回透析する。 フアージDNAを切断するため、1μｇのDNA
に対し3μのHindを加え、10ｍＭ Tris−
HCl−７ｍＭ MgCl2−７ｍMβ−メルカプト
エタノール−50ｍＭ NaCl（PH7.6）の緩衝液
20μ中で37℃にて３時間反応を行わせ、反応
終了後に1μの250ｍＭ EDTA（PH8.0）を加
える。この制限酵素で処理したDNA溶液に5μ
の1.5M酢酸ナトリウム（PH7.0）を加え、さ
らに60μのエタノールを加え、−70℃にて10
分間放置した後、12000rpmで５分間遠心し沈
殿を集め、エタノールで再度洗浄する。これを
減圧乾燥させ、10μの10ｍＭ tris−HCl−
１ｍＭ EDTA（PH8.0、TEバツフア）に溶解
する。 (b) プラスミドpBR322の開裂 1μｇのpBR322に対し1μのHindを加え、
前述の緩衝液と同一の緩衝液20μ中で37℃に
て３時間反応させ、反応終了後に1μの250ｍ
Ｍ EDTA（PH8.0）を加える。以下、前記(a)に
おける反応終了後のDNA溶液の処理と同様に
してDNA溶液を洗浄する。 (c) 再結合反応（Ligation） 結合反応（Ligation）は50nｇ pBR322
DNA（上記(b)で得られたもの）、1.5μｇ SφC
DNA（上記(a)で得られたもの）、30ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭジチ
オスレイトール、0.1mMATPおよび0.1μ T4
リガーゼを含む20μの反応液中で４℃にて48
時間または20℃にて数時間反応させ、1μの
0.25M EDTA（PH8.0）を加えて反応を止める。
その後リガーゼを失活させるために65℃にて５
分間加熱し、180μのTEバツフアを加えて−
20℃に保存する。 (d) 組換え体プラスミドの大腸菌への導入 各大腸菌をグルコースを含まないＬ−ブロス
（ポリペプトン10ｇ／、イーストエキストラ
クト５ｇ／、NaCl5ｇ／）の10mlに接種し
て５×108／mlに増殖させた後、４℃にて遠心
集菌する。この菌を５mlの冷やした50ｍＭ
CaCl2に懸濁し、氷水浴中に５分間放置後再び
遠心集菌し、さらに0.67mlの冷やした50ｍＭ
CaCl2に懸濁し、氷水浴中に５分間放置する。
この大腸菌の懸濁液に再結合したプラスミド
DNA溶液（上記ｃで得られた）を0.33ml混合
し、氷水浴中に５分間保持する。その後この反
応液を42℃にて２分間保持することにより大腸
菌への組換え体プラスミドの導入を止める。こ
の懸濁液をそのまままたは10倍、100倍に希釈
し、アンピシリン（40μｇ／ml）を含むＬ−ブ
ロス寒天培地（寒天濃度1.3％）に塗布し、37
℃に一夜培養し、アンピシリン耐性となつた大
腸菌組換え体を分離する。 (e) SAK産生能を有する大腸菌の選択分離 ヒト血漿を５mlずつ複数の試験官に分注し、
56℃で20分間加熱し、別に、溶かした２％寒天
入り普通寒天培地を10mlずつ複数の容器に分注
し、56℃に温めておく。この両者をすばやくシ
ヤーレ上で混合し、固まるまで放置する。この
複数の寒天培地上に上記(d)で得られた大腸菌試
験菌の菌懸濁液をスポツトし、37℃にて培養す
る。SAK産生能を有する大腸菌はフイブリン
を分解し、集落の周辺をとかすので透明なゾー
ンが出来る。この時得られた新規大腸菌のそれ
ぞれを宿主大腸菌原株に応じてエシエリヒア・
コリK12 C600r- Kｍ- K（pSAK361）およびエシ
エリヒア・コリK12 WA802r- Kｍ+ K（pSAK361）
と名付けた。 (f) 大腸菌プラスミドの解析 上記(e)で得られた各大腸菌をアンピシリン
（40μｇ／ml）を含み、グリコースを含まない
Ｌ−ブロス400mlにて37℃で約４×108cells／ml
まで増殖させ、培養液にクロラムフエニコール
を150μｇ／mlとなるように加え、さらに37℃
で15時間で培養した後遠心集菌する。50mlの10
ｍMTris−HCl（PH8.）−0.015M NaCl−1.5ｍ
Ｍクエン酸ナトリウムで菌体を洗浄し、3.2ml
の25％蔗糖−50ｍＭ Tris−HCl（PH8.0）に懸
濁する。これに1.6mlの250ｍＭ EDTA（PH
8.0）、１mlの５mg／mlリゾチーム、６mlの２％
ブリツジ58−62.5ｍMEDTA−50ｍＭ Tris−
HCl（PH8.0）を加え、30℃で15分間インキユベ
ートし、細胞壁をおだやかに溶解し、高速遠心
分解（４℃にて30000rpm、30分間）により菌
体を沈殿させ、上清を得る。これをエチジウム
ブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心
（10℃にて36000rpm、48時間）にかけプラスミ
ドDNAを精製する。これを(b)と同様の方法で
Hindで切断し、SAK遺伝子を有する断片の
長さを１％アガロースを用いたアガロースゲル
電気泳動法で測定したところ4.9Kbであること
が判明した。 (g) 4.9kb断片の分離 100μｇのSφC DNAを0.2mlの反応液（10ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH7.6）−７ｍＭ MgCl2−７
ｍMβ−メルカプトエタノール−50ｍＭ NaCl
−100u Hindを含む）中に37℃で20時間反応
することにより切断し、これを１％アガロース
を用いてアガロースゲル電気泳動にかける。エ
チジウムブロマイドによつてDNAを染色し、
目的とする4.9kbのDNA断片のある部分のみを
ゲルから切り出す。切り出したゲル断片は、電
気泳動法によつて透析チユーブの中に溶出させ
る。溶出させたDNA溶液はTEバツフアで飽和
したフエノールで処理し、水層をさらにエーテ
ルで処理した後、エタノール沈殿法によつて
DNAを集め、ベクターDNAとの再結合反応に
供することができる。 (h) SAKの生産・抽出・精製 上で得たSAK産生能を有する大腸菌をＬ−
ブロス（ポリペプトン１％、イーストエキスト
ラクト0.5％、NaCl0.5％、グルコース0.1％、
PH7.0）50mlに接種し、一夜37℃で振とう培養
する。この菌液を同一ブロス５に接種し、37
℃で12時間振とう培養し、遠心して集菌する。
この菌体を100ｍＭ Tris−HCl−20％蔗糖
（PH8.0）200mlに懸濁し、再び遠心して集菌す
る。これを45mlの100ｍＭ Tris−HCl−20％
蔗糖（PH8.0）に懸濁し、５mlのリゾチーム溶
液（５mg／mlリゾチーム−20ｍＭ EDTA、
PH8.0）を加え、氷水溶中に１時間放置する。
これを遠心して上清を集め、ここへ80％飽和に
なるように硫安を加え、４℃で一夜放置する。
遠心により沈殿を集め、10ｍＭ Tris−HCl
（PH7.5）10mlにとかし、同バツフアに対して透
析する。これをセフアデツクスＧ−75ゲルクロ
マトグラフイーにかけ、10ｍＭ Tris−HCl
（PH7.5）で溶出し、SAK活性画分を集め、10
ｍMTris−HCl（PH7.5）で平衡化したCM−セ
ルロースカラムに吸着させ、０〜0.5M NaCl
の直線濃度勾配で溶出させ、0.3〜0.32M NaCl
によつて溶出されるSAK活性画分を集める。 例 ２ 本例はDNA供与体としてSφCを、SφC切断用
制限酵素としてHindとPstを、ベクター
DNAとしてpBR322を、pBR322切断用制限酵素
としてEcoRとPstを、大腸菌原株として、エ
シエリヒア・コリK12 C600r- Kｍ- Kまたはエシエリ
ヒア・コリK12 WA802r- Kｍ+ Kを用いて行つた例
である。 (a) フアージSφC DNAの切断 例１の(a)〜(f)に記した方法でSφC DNAから
Hindで切断した時の4.9Kb断片を分離する。
この断片の両端にはそれぞれ４塩基から成る一
本鎖部分があるため、この部分を1uのT4
DNAポリメラーゼと４種のデオキシリボヌク
レオシド−３リン酸（各25μM）によつて67ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH8.0）、6.7ｍＭ MgCl2、6.7
ｍMβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液
（20μ）中で18℃にて４時間反応させて二本
鎖とした。これに5μの1.5M酢酸ナトリウム
（PH7.0）と75μのエタノールを加え、−70℃に
10分間保持した後、12000rpmで５分間遠心し、
沈殿をエタノールで洗浄する。これを10ｍＭ
Tris−HCl（PH7.6）−７ｍＭ MgCl2−７ｍMβ
−メルカプトエタノール−50ｍMNaClを含む
緩衝液にとかし、0.5uのPstを加え、37℃で
３時間反応させることにより、さらに２つの断
片に切断する。これを再結合反応に供する。 (b) プラスミドpBR322の開裂 1μｇのpBR322 DNAに1uのEcoRを加え
て例１の(b)と同様に反応させ開裂する。この開
裂したDNAの両端も４塩基からなる一本鎖部
分があるので、(a)の場合と同様にT4 DNAポ
リメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオシド
−３リン酸によつて二本鎖にする。これをさら
に(a)におけると同様にPstで切断して再結合
反応に供する。 (c) 再結合反応 (a)、(b)で得られたDNA断片とベクターDNA
を混合し、例１の(c)と同様にして再結合反応を
行なわせる。ただしT4 DNAリガーゼは1uを
用いた。 (d) 以下例１と同様に新規な大腸菌〔エシエリヒ
ア・コリK12 K600r- Kｍ- K（pSAK−HP2）また
はエシエリヒア・コリK12 WA802r- Kｍ+ K
（pSAK−HP2）と命名〕を得、プラスミド解
析の結果、各大腸菌は、約2.5KbのSφC由来の
SAK産生遺伝情報を担うDNAを有していた。 得られた新規な大腸菌を使用し、これを常法に
より培養し、集菌した後、Talmadge，K.et al
（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77、3369〜
3373に記載されている方法によりペリプラズム画
分をとつた。このペリプラズム画分からSAK活
性大部分が回収された。得られた粗SAKを、常
用のタンパク質の精製法である塩析、ゲル過、
吸着クロマトグラフイーを用いて精製した。 例 ３ 本例はDNA供与体としてPφlを、ベクターと
してpBR322を、制限酵素としてHindを大腸菌
原株としてエシエリヒア・コリK12 C600r- Kｍ- Kを
用いて行なつた例である。 (a) 例１と同様の方法でフアージPφlDNAを調
製し、Hindにて切断する。ベクターDNAも
同様にして切断する。 (b) 再結合反応、大腸菌への導入、組換え体大腸
菌の選択は例１と同様に行なう。 (c) この結果Pφlに由来するSAK産生遺伝情報を
担うDNA領域を大腸菌に導入させることがで
きた。この新規な大腸菌をエシエリヒア・コリ
K12 C600r- Kｍ- K（pSAK601）と命名した。 得られた新規な大腸菌を使用し、これを常法に
より培養し、集菌した後、Talmadge，K.et al
（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77、3369〜
3373に記載されている方法によりペリプラズム画
分をとつた。このペリプラズム画分からSAK活
性大部分が回収された。得られた粗SAKを、常
用のタンパク質の精製法である塩析、ゲル過、
吸着クロマトグラフイーを用いて精製した。 【表】 【表】
する新規な大腸菌の培養によりスタフイロキナー
ゼを製造する方法に関する。 スタフイロキナーゼ（以下SAKと略記する）
とは、スタフイロコツカス・アウレウス（以下
Ｓ・アウレウスと記す）が産生する繊維素溶解酵
素であつて、血中のプラスミノーゲンをプラスミ
ンに変える機能を有する。このプラスミンがフイ
ブリンに作用してこれを溶解するものである。同
様の作用を有するものとしてヒトの尿中に存在す
るウロキナーゼや連鎖球菌が産生するストレプト
キナーゼが知られているが、これらはいずれも血
液凝固防止剤、血栓治療剤などのいわゆる線溶剤
として医療に供し得るものである。そのため、こ
れらの物質の生産方法や抽出・精製方法が種々検
討されている。 SAKの生産に関しては、これまでに、SAK産
生能はＳ・アウレウスを宿主とする溶原フアージ
の溶原化に伴つて、宿主に賦与される（これを溶
原変換という）形質であることが知られており、
従来、Ｓ・アウレウスの中からSAK産生能を有
する株を選択するか、あるいはSAKを溶原変換
するフアージでSAK非産生のＳ・アウレウス株
を溶原化し、それらの株を培養することによつ
て、その培養液よりSAKを採取するという方法
が行われている。 しかしながら、Ｓ・アウレウスは強い病原性を
有する細菌であり、その取扱いには、極めて慎重
な配慮が必要であるためかかる方法は、本来工業
的なSAKの生産方法に適さず、しかも、SAKの
収量を上げるためには長時間の培養が必要である
ため、その意味からも工業的方法としては適性を
欠いているものである。 本発明者らは、安全性、効率性の面から、
SAKを工業的に生産し得る適切な方法について
鋭意研究した結果、SAK産性情報を担う遺伝子
がフアージDNA上に存在することを究明し、
Ｓ・アウレウスの溶原フアージDANの断片をベ
クターを介して大腸菌に導入させることに成功し
た。 本発明は、かかる成果によるものであり、した
がつて、本発明はSAK産生遺伝子を含有する新
規な大腸菌を培養することによるSAKの製造法
を提供するものである。 以下に、本発明を詳細に説明する。 本発明方法において使用する新規な大腸菌は、
下記〜の工程により得られるものである。 DNA供与体であるＳ・アウレウスの溶原フ
アージDNAを制限酵素で切断する。 SAK生遺伝情報を有するDNA断片をとり出
す。（この工程は省略することもできる） ベクターDNAを制限酵素によつて開裂させ
る。 ベクターDNAの開裂部位に又はで得た
DNA断片を組み込ませる。 この組み換え体DNAを宿主大腸菌に導入す
る。 によりSAK産生能を有することとなつた
大腸菌を選択分離する。 上記のDNA供与体としての溶原フアージは
SAK生産能を有するＳ・アウレウス溶原株から
分離された溶原フアージで、かつ、そのフアージ
が溶原変換能を有するフアージであれば、すべて
使用可能である。その例としては42D、L42E、
77（文献：Mason，R.E.and Allen，W.E.（1975）
Can.J.Microbiol、21，1113〜1116）、Pφ1、
Pφ2、Tφ−42D、Pφ−406（文献：Kondo，I.and
Fujise，K.（1977）Infect.Immun.18、266〜272）、
Rφ19、SφC（文献：近藤勇ら（1980）東京慈恵会
医科大学雑誌95、1203〜1206）などがある。溶原
フアージDNAの調製に使用される手段は、常用
の手段である。すなわち、溶原フアージをその宿
主菌であるＳ・アウレウスに感染させ、この感染
菌を培養する（この方法は例えば文献：Blair，
J.E.and Williams，R.E.O.（1961）Bull.W.H.O.
24、771〜784に記載されている）。これによつて
フアージは培地中に出てくる（菌は溶菌する）の
で、このフアージを適当な方法（例えば塩化セシ
ウム平衡密度勾配遠近法、文献：Rosenblum，
E.D.and Tyrone，S.（1964）J.Bacteriol.88，
1737〜1742）で集め、このフアージからさらに公
知の方法（例えばフエノール抽出法など）により
フアージDNAを抽出することができる。 溶原フアージDNAの制限酵素による切断は次
のようにして行う。 フアージDNAに適当な制限酵素を加え、適当
な反応条件で反応を行うことによつて、フアージ
DNAは加えられた制限酵素によつて種々の断片
に切断される。 このフアージDNAの切断に使用しうる制限酵
素は、(1)フアージDNAを切断しうるものであり、
かつ(2)SAK生産に関する遺伝情報を担うDNA部
分を切断しないものでなければならない。これに
適する制限酵素としては、Hind、Pst、Acc
、Ava、EcoR、Hpa、Hpa、Hind
、Sst、Cla、BstE、Sst、Xho、
Bcl、Bgl、Pvu、Xor、Kpn、Sma
、Xbaなどがある。 次に、フアージDNAを制限酵素で切断した
DNA断片群の中からSAK産生情報を含むDNA
断片を各種の公知の方法（例えばアガロースゲル
電気泳動法など）により分離する。このために
は、フアージDNAの断片群のうち、どの断片が
SAK産生情報を有しているかを前もつて判定し
ておかなければならない。この判定方法について
は後述する。上記のDNA断片の分離操作は場合
により省略することもできる。 一方、ベクターDNAの開裂は、ベクターDNA
に適当な制限酵素を加え、適当な反応条件下で反
応を行うことによりベクターDNAを開裂させる
ことができる。 ベクターDNAとしては公知のものが使用でき
る。それには例えばColel、pMB9、pSC101、
p15Aおよびその誘導体（例えばpBR322、
pACYC184など）やλフアージ由来のシヤロン
ベクターなどがある。 次に、ベクターDNAの開裂部位に上述のDNA
断片を組み込ませるが、その手段自体は、常法に
よるものであり、使用したフアージDNAの種類、
ベクターDNAの種類および制限酵素の種類に応
じて適当な反応条件が選択される。なお、ベクタ
ーの複製能を損なわない限り、上記のフアージ
DNA断片を挿入する方向及び部位は問わない。 次いで組み換え体DNAを宿主大腸菌に導入さ
せるが、宿主大腸菌としては大腸菌に特異な制
限・修飾系のうち制限能を欠損した大腸菌株はす
べて使用可能である。また、いつたん修飾をうけ
たSAK産生遺伝情報を担うDNAを組み込んだプ
ラスミドは制限能を有する大腸菌株に対しても使
用することができる。宿主大腸菌は、用いたベク
ターの種類によつて限定される場合がある。使用
した大腸菌原株のうちのr- Kとは制限能を欠損した
株を、またm- Kとは修飾能をもたない株を示す。 導入の手段、自体は公知の方法（例えば
Comeronらの方法：便県Cameron，J.R.et al.
（1975）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72，3416〜
3420）を用いることができる。 前述のの工程を行つた場合においても、溶原
フアージのSAK産生遺伝情報を担うDNA断片を
組み込まない場合があり、また、の工程を省略
した場合には、組み込まない場合の他にSAK産
生能に関するものでないDNA断片を組み込む場
合がある。そのためにSAK産生能を有すること
となつた大腸菌を選択分離することが必要であ
る。この大腸菌の選択分離には、Ｓ・アウレウス
について用いられている公知の方法（例えば文
献：Kondo，Ｉ and Fujise，K.（1977）Infect.
Immun.18、266〜272）を使用することができ
る。すなわち、この方法により、加熱血漿寒天培
地を作成し、その上に試験菌をスポツトし、一定
期間培養することによりフイブリン分解能をみ
る。フイブリン分解能を有するものは集落の周辺
をとかして、透明なゾーンができるので、この菌
だけをとり出すことができる。かくしてSAK産
生能を有する大腸菌が分離されるが、SAK産生
能を有する大腸菌からのSAK産生遺伝情報を担
うDNAの解析は次の如くして行う。すなわち、
SAK産生能を有する大腸菌から組換え体プラス
ミドまたは組換え体フアージを取り出し、フアー
ジDNAの切断およびベクターDNAの開裂に用い
た制限酵素でこの組換え体プラスミドまたは組換
え体フアージを切断する。この切断されたDNA
断片の分子量（すなわちDNAとしての長さ）を
公知方法（例えば、アガロースゲル電気泳動な
ど）によつて測定することによつてSAK産生遺
伝情報を担うDNA断片のフアージDNA上での位
置を知ることができる。 解析実験の一例を次に示す。 実験例：フアージDNAとしてSφCを用いた場合 (1) 制限酵素Pstで切断した時 15.8kb (2) 制限酵素Hindで切断した時 4.9kb (3) 制限酵素Hind及びAvaで切断した時
2.0kb (4) 制限酵素Ava及びAccで切断した時
1.3kb 部分にSAK産生遺伝情報が存在することが判明
した。 以上述べた如くして得られるSAK産生能を有
する大腸菌は、その菌学的性質はもとの大腸菌と
くらべ、SAK産生能を有していること以外変わ
るところがない。その一般的菌学的性質は、後掲
別表に示す（後記実施例により得られたものにつ
いて例示）。 本発明により、上記の如くして得られた新規な
大腸菌を用いて、その大腸菌を培養し培養菌体に
蓄積したSAKを採取することにより、工業的な
SAKの製造法が提供される。 本発明によるSAKの製造法は、上記の如くし
て得られたSAKの産生能を有する大腸菌を常法
により培養し、集菌した後、Talmadge，K.et
al（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77、3369〜
3373に記載されている方法によりペリプラズム画
分をとつた。このペリプラズム画分からSAK活
性大部分が回収された。得られた粗SAKを、常
用のタンパク質の精製法である塩析、ゲル過、
吸着クロマトグラフイーを用いて精製した。 上記の如き本発明方法により、大腸菌を用いて
SAKを生産することが可能となつたが、このよ
うに、大腸菌にSAKを産生せしめることによつ
て従来技術であるＳ・アウレウスによる場合と異
り、安全性、増殖速度、大量培養（大量生産）等
の驚くべき利点がもたらされる。しかも大腸菌の
場合には、SAKがペリプラズムに蓄積するので、
従来法によりＳ・アウレウスを使用して上清画分
から取得する場合に比べて100倍以上という高濃
度が得られ、細胞全体を破砕して抽出する方法に
比べ共雑するタンパク質が少いので、その分離精
製が容易に行われるという格別の利点が得られ
る。 上記のペリプラズムに蓄積する現象は、例えば
後に掲げる実施例１により得られた大腸菌、エシ
エリヒア・コリK12 C600r- Km- K（pSAK 361）を
200mlのＬ−ブロス（ポリペプトン10ｇ／、イ
ーストエキストラクト５ｇ／、グルコース１
ｇ／、NaCl5ｇ／）にて37℃で５時間培養し
た時のSAK活性の分布とその割合を例示すると
下表のとおりであり、この場合、SAKの約60％
がペリプラズム画分に存在することがわかる。 総括性（ｕ） ％ 上清画分 950 23 ペリプラズム画分 2400 58 サイトプラズム画分 800 19 以下に本発明の例を掲げる。 例 １ 本例はDNA供与体をとしてSφCを、ベクター
DNAとしてpBR322を、制限酵素としてHind
を、宿主大腸菌原株としてエシエリヒア・コリ
K12C600r- Kｍ- Kまたはエシエリヒア・コリK12
WA802r- Kｍ+ Kを用いて行なつた例である。 (a) SφCDNAの調製と切断 文献（Blair，J.E.and Williams，R.E.O.
（1961）Bull.W.H.O.24，771〜784）の方法に
従つてフアージSφCを増殖し、得られたフアー
ジ液１に対し、5M−NaCl 100mlを加え、さ
らに30％（ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール
（平均分子量7000〜8000）300mlを加え、よく攪
拌し、０℃で数時間放置した。その後
10000rpmで15分間遠心して沈殿を集め、これ
を20mlの緩衝液（10ｍＭ Tris−HCl、10ｍＭ
MgSO4、５ｍＭ CaCl2、0.01％ゼラチン；
PH7.4）に溶かし、これにDNaseおよびRNase
をそれぞれ最終濃度で1μｇ／mlとなるように
加え、37℃にて20分間反応させた。反応終了後
10000rpmで10分間遠心し、その上清をさらに
30000rpmで60分間遠心して得られる沈殿を上
記と同じ緩衝液2.5mlに溶かし、これに約1.7ｇ
の塩化セシウムを加え、27000rpmで18時間平
衡密度勾配遠心にかける。このようにして得ら
れるフアージのバンドを集め、１ｇの上記と同
じ緩衝液に対して透析する。得られたフアージ
液0.5mlに50μの1.5M NaCl−0.15Mクエン酸
ナトリウム、5μの250ｍＭ EDTA（PH7.0）
および5μの10％SDSを加え、37℃に５分間
放置後、0.6mlの0.15M NaCl−15ｍＭクエン酸
ナトリウム溶液飽和フエノールを加え、室温で
おだやかに約10分間混合する。これを3000rpm
で10分間遠心し、上層（水層）を集める。この
フエノール処理を繰り返した後、等量のエーテ
ルによる洗浄を３回行ない、得られた水層を
0.15M NaCl−15ｍＭクエン酸ナトリウム−１
ｍＭ EDTAの200mlに対して３回透析する。 フアージDNAを切断するため、1μｇのDNA
に対し3μのHindを加え、10ｍＭ Tris−
HCl−７ｍＭ MgCl2−７ｍMβ−メルカプト
エタノール−50ｍＭ NaCl（PH7.6）の緩衝液
20μ中で37℃にて３時間反応を行わせ、反応
終了後に1μの250ｍＭ EDTA（PH8.0）を加
える。この制限酵素で処理したDNA溶液に5μ
の1.5M酢酸ナトリウム（PH7.0）を加え、さ
らに60μのエタノールを加え、−70℃にて10
分間放置した後、12000rpmで５分間遠心し沈
殿を集め、エタノールで再度洗浄する。これを
減圧乾燥させ、10μの10ｍＭ tris−HCl−
１ｍＭ EDTA（PH8.0、TEバツフア）に溶解
する。 (b) プラスミドpBR322の開裂 1μｇのpBR322に対し1μのHindを加え、
前述の緩衝液と同一の緩衝液20μ中で37℃に
て３時間反応させ、反応終了後に1μの250ｍ
Ｍ EDTA（PH8.0）を加える。以下、前記(a)に
おける反応終了後のDNA溶液の処理と同様に
してDNA溶液を洗浄する。 (c) 再結合反応（Ligation） 結合反応（Ligation）は50nｇ pBR322
DNA（上記(b)で得られたもの）、1.5μｇ SφC
DNA（上記(a)で得られたもの）、30ｍＭ Tris
−HCl（PH7.6）、10ｍＭ MgCl2、10ｍＭジチ
オスレイトール、0.1mMATPおよび0.1μ T4
リガーゼを含む20μの反応液中で４℃にて48
時間または20℃にて数時間反応させ、1μの
0.25M EDTA（PH8.0）を加えて反応を止める。
その後リガーゼを失活させるために65℃にて５
分間加熱し、180μのTEバツフアを加えて−
20℃に保存する。 (d) 組換え体プラスミドの大腸菌への導入 各大腸菌をグルコースを含まないＬ−ブロス
（ポリペプトン10ｇ／、イーストエキストラ
クト５ｇ／、NaCl5ｇ／）の10mlに接種し
て５×108／mlに増殖させた後、４℃にて遠心
集菌する。この菌を５mlの冷やした50ｍＭ
CaCl2に懸濁し、氷水浴中に５分間放置後再び
遠心集菌し、さらに0.67mlの冷やした50ｍＭ
CaCl2に懸濁し、氷水浴中に５分間放置する。
この大腸菌の懸濁液に再結合したプラスミド
DNA溶液（上記ｃで得られた）を0.33ml混合
し、氷水浴中に５分間保持する。その後この反
応液を42℃にて２分間保持することにより大腸
菌への組換え体プラスミドの導入を止める。こ
の懸濁液をそのまままたは10倍、100倍に希釈
し、アンピシリン（40μｇ／ml）を含むＬ−ブ
ロス寒天培地（寒天濃度1.3％）に塗布し、37
℃に一夜培養し、アンピシリン耐性となつた大
腸菌組換え体を分離する。 (e) SAK産生能を有する大腸菌の選択分離 ヒト血漿を５mlずつ複数の試験官に分注し、
56℃で20分間加熱し、別に、溶かした２％寒天
入り普通寒天培地を10mlずつ複数の容器に分注
し、56℃に温めておく。この両者をすばやくシ
ヤーレ上で混合し、固まるまで放置する。この
複数の寒天培地上に上記(d)で得られた大腸菌試
験菌の菌懸濁液をスポツトし、37℃にて培養す
る。SAK産生能を有する大腸菌はフイブリン
を分解し、集落の周辺をとかすので透明なゾー
ンが出来る。この時得られた新規大腸菌のそれ
ぞれを宿主大腸菌原株に応じてエシエリヒア・
コリK12 C600r- Kｍ- K（pSAK361）およびエシ
エリヒア・コリK12 WA802r- Kｍ+ K（pSAK361）
と名付けた。 (f) 大腸菌プラスミドの解析 上記(e)で得られた各大腸菌をアンピシリン
（40μｇ／ml）を含み、グリコースを含まない
Ｌ−ブロス400mlにて37℃で約４×108cells／ml
まで増殖させ、培養液にクロラムフエニコール
を150μｇ／mlとなるように加え、さらに37℃
で15時間で培養した後遠心集菌する。50mlの10
ｍMTris−HCl（PH8.）−0.015M NaCl−1.5ｍ
Ｍクエン酸ナトリウムで菌体を洗浄し、3.2ml
の25％蔗糖−50ｍＭ Tris−HCl（PH8.0）に懸
濁する。これに1.6mlの250ｍＭ EDTA（PH
8.0）、１mlの５mg／mlリゾチーム、６mlの２％
ブリツジ58−62.5ｍMEDTA−50ｍＭ Tris−
HCl（PH8.0）を加え、30℃で15分間インキユベ
ートし、細胞壁をおだやかに溶解し、高速遠心
分解（４℃にて30000rpm、30分間）により菌
体を沈殿させ、上清を得る。これをエチジウム
ブロマイド−塩化セシウム平衡密度勾配遠心
（10℃にて36000rpm、48時間）にかけプラスミ
ドDNAを精製する。これを(b)と同様の方法で
Hindで切断し、SAK遺伝子を有する断片の
長さを１％アガロースを用いたアガロースゲル
電気泳動法で測定したところ4.9Kbであること
が判明した。 (g) 4.9kb断片の分離 100μｇのSφC DNAを0.2mlの反応液（10ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH7.6）−７ｍＭ MgCl2−７
ｍMβ−メルカプトエタノール−50ｍＭ NaCl
−100u Hindを含む）中に37℃で20時間反応
することにより切断し、これを１％アガロース
を用いてアガロースゲル電気泳動にかける。エ
チジウムブロマイドによつてDNAを染色し、
目的とする4.9kbのDNA断片のある部分のみを
ゲルから切り出す。切り出したゲル断片は、電
気泳動法によつて透析チユーブの中に溶出させ
る。溶出させたDNA溶液はTEバツフアで飽和
したフエノールで処理し、水層をさらにエーテ
ルで処理した後、エタノール沈殿法によつて
DNAを集め、ベクターDNAとの再結合反応に
供することができる。 (h) SAKの生産・抽出・精製 上で得たSAK産生能を有する大腸菌をＬ−
ブロス（ポリペプトン１％、イーストエキスト
ラクト0.5％、NaCl0.5％、グルコース0.1％、
PH7.0）50mlに接種し、一夜37℃で振とう培養
する。この菌液を同一ブロス５に接種し、37
℃で12時間振とう培養し、遠心して集菌する。
この菌体を100ｍＭ Tris−HCl−20％蔗糖
（PH8.0）200mlに懸濁し、再び遠心して集菌す
る。これを45mlの100ｍＭ Tris−HCl−20％
蔗糖（PH8.0）に懸濁し、５mlのリゾチーム溶
液（５mg／mlリゾチーム−20ｍＭ EDTA、
PH8.0）を加え、氷水溶中に１時間放置する。
これを遠心して上清を集め、ここへ80％飽和に
なるように硫安を加え、４℃で一夜放置する。
遠心により沈殿を集め、10ｍＭ Tris−HCl
（PH7.5）10mlにとかし、同バツフアに対して透
析する。これをセフアデツクスＧ−75ゲルクロ
マトグラフイーにかけ、10ｍＭ Tris−HCl
（PH7.5）で溶出し、SAK活性画分を集め、10
ｍMTris−HCl（PH7.5）で平衡化したCM−セ
ルロースカラムに吸着させ、０〜0.5M NaCl
の直線濃度勾配で溶出させ、0.3〜0.32M NaCl
によつて溶出されるSAK活性画分を集める。 例 ２ 本例はDNA供与体としてSφCを、SφC切断用
制限酵素としてHindとPstを、ベクター
DNAとしてpBR322を、pBR322切断用制限酵素
としてEcoRとPstを、大腸菌原株として、エ
シエリヒア・コリK12 C600r- Kｍ- Kまたはエシエリ
ヒア・コリK12 WA802r- Kｍ+ Kを用いて行つた例
である。 (a) フアージSφC DNAの切断 例１の(a)〜(f)に記した方法でSφC DNAから
Hindで切断した時の4.9Kb断片を分離する。
この断片の両端にはそれぞれ４塩基から成る一
本鎖部分があるため、この部分を1uのT4
DNAポリメラーゼと４種のデオキシリボヌク
レオシド−３リン酸（各25μM）によつて67ｍ
Ｍ Tris−HCl（PH8.0）、6.7ｍＭ MgCl2、6.7
ｍMβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液
（20μ）中で18℃にて４時間反応させて二本
鎖とした。これに5μの1.5M酢酸ナトリウム
（PH7.0）と75μのエタノールを加え、−70℃に
10分間保持した後、12000rpmで５分間遠心し、
沈殿をエタノールで洗浄する。これを10ｍＭ
Tris−HCl（PH7.6）−７ｍＭ MgCl2−７ｍMβ
−メルカプトエタノール−50ｍMNaClを含む
緩衝液にとかし、0.5uのPstを加え、37℃で
３時間反応させることにより、さらに２つの断
片に切断する。これを再結合反応に供する。 (b) プラスミドpBR322の開裂 1μｇのpBR322 DNAに1uのEcoRを加え
て例１の(b)と同様に反応させ開裂する。この開
裂したDNAの両端も４塩基からなる一本鎖部
分があるので、(a)の場合と同様にT4 DNAポ
リメラーゼと４種のデオキシリボヌクレオシド
−３リン酸によつて二本鎖にする。これをさら
に(a)におけると同様にPstで切断して再結合
反応に供する。 (c) 再結合反応 (a)、(b)で得られたDNA断片とベクターDNA
を混合し、例１の(c)と同様にして再結合反応を
行なわせる。ただしT4 DNAリガーゼは1uを
用いた。 (d) 以下例１と同様に新規な大腸菌〔エシエリヒ
ア・コリK12 K600r- Kｍ- K（pSAK−HP2）また
はエシエリヒア・コリK12 WA802r- Kｍ+ K
（pSAK−HP2）と命名〕を得、プラスミド解
析の結果、各大腸菌は、約2.5KbのSφC由来の
SAK産生遺伝情報を担うDNAを有していた。 得られた新規な大腸菌を使用し、これを常法に
より培養し、集菌した後、Talmadge，K.et al
（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77、3369〜
3373に記載されている方法によりペリプラズム画
分をとつた。このペリプラズム画分からSAK活
性大部分が回収された。得られた粗SAKを、常
用のタンパク質の精製法である塩析、ゲル過、
吸着クロマトグラフイーを用いて精製した。 例 ３ 本例はDNA供与体としてPφlを、ベクターと
してpBR322を、制限酵素としてHindを大腸菌
原株としてエシエリヒア・コリK12 C600r- Kｍ- Kを
用いて行なつた例である。 (a) 例１と同様の方法でフアージPφlDNAを調
製し、Hindにて切断する。ベクターDNAも
同様にして切断する。 (b) 再結合反応、大腸菌への導入、組換え体大腸
菌の選択は例１と同様に行なう。 (c) この結果Pφlに由来するSAK産生遺伝情報を
担うDNA領域を大腸菌に導入させることがで
きた。この新規な大腸菌をエシエリヒア・コリ
K12 C600r- Kｍ- K（pSAK601）と命名した。 得られた新規な大腸菌を使用し、これを常法に
より培養し、集菌した後、Talmadge，K.et al
（1980）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77、3369〜
3373に記載されている方法によりペリプラズム画
分をとつた。このペリプラズム画分からSAK活
性大部分が回収された。得られた粗SAKを、常
用のタンパク質の精製法である塩析、ゲル過、
吸着クロマトグラフイーを用いて精製した。 【表】 【表】
Claims (1)
- １ スタフイロコツカス・アウレウスの溶原フア
ージ、SφCをAva及びAccで切断して得られ
る1.3Kbの断片と同じ塩基配列を含む、スタフイ
ロキナーゼ産生遺伝情報を担うDNA断片を組み
込んだベクターを導入させた大腸菌を培養し、そ
の培養菌体に蓄積したスタフイロキナーゼを採取
することを特徴とするスタフイロキナーゼの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2295382A JPH03198775A (ja) | 1981-10-16 | 1990-11-02 | スタフイロキナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56164064A JPS5867181A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 |
| JP2295382A JPH03198775A (ja) | 1981-10-16 | 1990-11-02 | スタフイロキナーゼの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56164064A Division JPS5867181A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03198775A JPH03198775A (ja) | 1991-08-29 |
| JPH0479640B2 true JPH0479640B2 (ja) | 1992-12-16 |
Family
ID=26489308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2295382A Granted JPH03198775A (ja) | 1981-10-16 | 1990-11-02 | スタフイロキナーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03198775A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113416722A (zh) * | 2021-08-24 | 2021-09-21 | 迈威(上海)生物科技股份有限公司 | 一种重组葡激酶突变体纯化制备工艺 |
-
1990
- 1990-11-02 JP JP2295382A patent/JPH03198775A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03198775A (ja) | 1991-08-29 |
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