JPH03210195A - 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 - Google Patents
標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法Info
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- JPH03210195A JPH03210195A JP2003338A JP333890A JPH03210195A JP H03210195 A JPH03210195 A JP H03210195A JP 2003338 A JP2003338 A JP 2003338A JP 333890 A JP333890 A JP 333890A JP H03210195 A JPH03210195 A JP H03210195A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合
方法およびその結合体に関する。さらに、本発明は被検
出核酸と相補的な塩基配列を含有する合成オリゴヌクレ
オチドを用いて被検出核酸を検出する手段に関する。
方法およびその結合体に関する。さらに、本発明は被検
出核酸と相補的な塩基配列を含有する合成オリゴヌクレ
オチドを用いて被検出核酸を検出する手段に関する。
［従来の技術］
ハイブリダイゼーション反応において、同定されるへき
標的核酸と相補的な塩基配列を有し、標識されたオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いたプローブ
核酸は該標的核酸と塩基対を形成しつる。この特性を利
用して、種々のハイブリダイゼーション法か核酸の検出
に用いられている。直接的ハイブリダイゼーション法で
は、試料を溶液中に固定する方法あるいは固体担体に固
定する方法がある。試料中に標的核酸が存在する場合は
、１つの標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼー
ションによって同定される。このうち、近年、短時間か
つ簡便な操作で行うことができる溶液中でのハイブリダ
イゼーション法が注目されている。
標的核酸と相補的な塩基配列を有し、標識されたオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いたプローブ
核酸は該標的核酸と塩基対を形成しつる。この特性を利
用して、種々のハイブリダイゼーション法か核酸の検出
に用いられている。直接的ハイブリダイゼーション法で
は、試料を溶液中に固定する方法あるいは固体担体に固
定する方法がある。試料中に標的核酸が存在する場合は
、１つの標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼー
ションによって同定される。このうち、近年、短時間か
つ簡便な操作で行うことができる溶液中でのハイブリダ
イゼーション法が注目されている。
溶液中でハイブリダイゼーション反応を行なった場合、
標的核酸とプローブ核酸反応生成物を何らかの形で未反
応物から分離し、抽出することが必要である。一般に、
プローブ核酸を不溶性担体に固定したのち標的核酸とハ
イブリッドを形成させ、その後遠心分離法によりハイブ
リッドを分離する方法が知られている。その−例として
は、特開昭６３−１１７２６２などがある。すなわち、
これらの方法では、まず標的核酸の特定の塩基配列に対
して相補的な塩基配列を含む一本鎖の状態の核酸を、有
機高分子物質からなり表面が非多孔質の粒径０．０１〜
５０μｍの粒子の表面に結合させ、不溶性担体に結合し
たハイブリッド形成用プローブ核酸を形成させる。次に
、このプローブ核酸と試料とを反応させ、特定の塩基配
列を含む標的核酸とハイブリッドを形成させる。担体上
のプローブ核酸とハイブリッド形成しなかった核酸およ
びその他の夾雑物を遠心分離法などで除去することによ
り、ハイブリッドを形成している標的核酸を検出する方
法である。
標的核酸とプローブ核酸反応生成物を何らかの形で未反
応物から分離し、抽出することが必要である。一般に、
プローブ核酸を不溶性担体に固定したのち標的核酸とハ
イブリッドを形成させ、その後遠心分離法によりハイブ
リッドを分離する方法が知られている。その−例として
は、特開昭６３−１１７２６２などがある。すなわち、
これらの方法では、まず標的核酸の特定の塩基配列に対
して相補的な塩基配列を含む一本鎖の状態の核酸を、有
機高分子物質からなり表面が非多孔質の粒径０．０１〜
５０μｍの粒子の表面に結合させ、不溶性担体に結合し
たハイブリッド形成用プローブ核酸を形成させる。次に
、このプローブ核酸と試料とを反応させ、特定の塩基配
列を含む標的核酸とハイブリッドを形成させる。担体上
のプローブ核酸とハイブリッド形成しなかった核酸およ
びその他の夾雑物を遠心分離法などで除去することによ
り、ハイブリッドを形成している標的核酸を検出する方
法である。
不溶性担体とプローブ核酸の固定方法としては、次の２
つの方法が知られている。
つの方法が知られている。
その一つの方法として、プローブ核酸の５°又は３′末
端を化学的に修飾し担体に固定化する方法があげられ、
具体的な例としては、特開昭６３−２４３８７５に示さ
れているようにターミナルデオキシヌクレチジルトラン
スフェラーゼ（ＴｅｒｍｉｎａｌＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅ
ｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて不溶性
担体を捕捉する物質をプローブ核酸の３′末端側に結合
させる方法がある。
端を化学的に修飾し担体に固定化する方法があげられ、
具体的な例としては、特開昭６３−２４３８７５に示さ
れているようにターミナルデオキシヌクレチジルトラン
スフェラーゼ（ＴｅｒｍｉｎａｌＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅ
ｔｉｄｙｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて不溶性
担体を捕捉する物質をプローブ核酸の３′末端側に結合
させる方法がある。
第二の方法としては、有機溶媒を用いて核酸全体を固定
する方法がある。これは特開昭５９−１２２４９９など
に詳しく述べられている。
する方法がある。これは特開昭５９−１２２４９９など
に詳しく述べられている。
［発明が解決しようとする課題］
前述のプローブ核酸の末端を化学的に修飾し担体に固定
化する方法では、一般にプローブ核酸として利用される
オリゴヌクレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブ
リダイゼーション時の標的核酸とプローブ核酸の相補的
結合の誤りが防げる。しかし、プローブ核酸の鎖長が長
い場合、そのプローブ核酸中に相補的配列が存在する確
率が高まり、ハイブリダイゼーション反応中にプローブ
核酸自身が反応し高次構造を形成してプローブ核酸の機
能を果たさなくなりハイブリッド形成の効率が著しく減
少することがある。
化する方法では、一般にプローブ核酸として利用される
オリゴヌクレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブ
リダイゼーション時の標的核酸とプローブ核酸の相補的
結合の誤りが防げる。しかし、プローブ核酸の鎖長が長
い場合、そのプローブ核酸中に相補的配列が存在する確
率が高まり、ハイブリダイゼーション反応中にプローブ
核酸自身が反応し高次構造を形成してプローブ核酸の機
能を果たさなくなりハイブリッド形成の効率が著しく減
少することがある。
また、有機溶媒を用いて核酸全体を担持させる方法では
、上記のようなプローブ核酸自身が高次構造を取ること
は避けられるが、極性が異なるため核酸全体の特性を変
えずに核酸を固定化する条件を捜し出すことは容易では
なく実用的ではない。
、上記のようなプローブ核酸自身が高次構造を取ること
は避けられるが、極性が異なるため核酸全体の特性を変
えずに核酸を固定化する条件を捜し出すことは容易では
なく実用的ではない。
本発明は、溶液中におけるハイブリダイゼーション法を
利用する前記の従来技術の問題点を解決するために鋭意
検討した結果なされたものであり、プローブ核酸として
用いるオリゴヌクレオチドを伸展させる過程において、
一端に捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドを複
数個導入することにより不溶性担体とプローブ核酸との
結合接点を増し、さらにプローブ核酸自身のハイブリダ
イゼーションによる高次構造形成を回避することによっ
て、安定性の高いプローブ核酸と不溶性担体との結合体
を形成する方法及びその結合体を提供することを目的と
する。
利用する前記の従来技術の問題点を解決するために鋭意
検討した結果なされたものであり、プローブ核酸として
用いるオリゴヌクレオチドを伸展させる過程において、
一端に捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドを複
数個導入することにより不溶性担体とプローブ核酸との
結合接点を増し、さらにプローブ核酸自身のハイブリダ
イゼーションによる高次構造形成を回避することによっ
て、安定性の高いプローブ核酸と不溶性担体との結合体
を形成する方法及びその結合体を提供することを目的と
する。
［課題を解決するための手段］
本発明は、合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合
方法において、 ａ）末端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつよう
に構成された塩基配列を有する複数種のサブオリゴヌク
レオチドを合成し、該サブオリゴヌクレオチド間で反応
させて部分的に二本鎖で結合したオリゴヌクレオチド鎖
を形成する過程と、ｂ）該オリゴヌクレオチド鎖中の一
本鎖部分を鋳型として、二本鎖形成部分をプライマーと
して利用し、捕捉体を結合しているヌクレオチドを導入
しながら鎖長伸展反応を行ない一本鎖部分を二本鎖化し
、最終的に二本鎖のうち一本鎖が合成オリゴヌクレオチ
ドである二本鎖合成ヌクレオチドを形成する過程と、 Ｃ）該二本鎖合成ヌクレオチドを一本鎖に解離し、一本
鎖の合成オリゴヌクレオチドを形成する過程と、 ｄ）捕捉体に特異的に結合するリガンドを不溶性担体の
表面に結合させ、リガンドと捕捉体との結合を介して該
合成オリゴヌクレオチドを不溶性担体に複数カ所で結合
させる過程と、 を含むことを特徴とする。
方法において、 ａ）末端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつよう
に構成された塩基配列を有する複数種のサブオリゴヌク
レオチドを合成し、該サブオリゴヌクレオチド間で反応
させて部分的に二本鎖で結合したオリゴヌクレオチド鎖
を形成する過程と、ｂ）該オリゴヌクレオチド鎖中の一
本鎖部分を鋳型として、二本鎖形成部分をプライマーと
して利用し、捕捉体を結合しているヌクレオチドを導入
しながら鎖長伸展反応を行ない一本鎖部分を二本鎖化し
、最終的に二本鎖のうち一本鎖が合成オリゴヌクレオチ
ドである二本鎖合成ヌクレオチドを形成する過程と、 Ｃ）該二本鎖合成ヌクレオチドを一本鎖に解離し、一本
鎖の合成オリゴヌクレオチドを形成する過程と、 ｄ）捕捉体に特異的に結合するリガンドを不溶性担体の
表面に結合させ、リガンドと捕捉体との結合を介して該
合成オリゴヌクレオチドを不溶性担体に複数カ所で結合
させる過程と、 を含むことを特徴とする。
また、本発明の合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の
結合体は前記結合方法により得ることができることを特
徴とする。
結合体は前記結合方法により得ることができることを特
徴とする。
サブオリゴヌクレオチドとしては、第１図のように末端
領域の一部が部分的に互いに相補性をもつように構成さ
れた塩基配列を有し、５′末端がヌクレオチドフォスフ
ェートであるオリゴヌクレオチドであればどのようなも
のでも利用できるが合成機で手軽に合成できる短かい鎖
長のサブオリゴヌクレオチドが利用し易い。
領域の一部が部分的に互いに相補性をもつように構成さ
れた塩基配列を有し、５′末端がヌクレオチドフォスフ
ェートであるオリゴヌクレオチドであればどのようなも
のでも利用できるが合成機で手軽に合成できる短かい鎖
長のサブオリゴヌクレオチドが利用し易い。
合成するサブオリゴヌクレオチドの長さは、２０塩基か
ら４０塩基程度が望ましい。各サブオリゴヌクレオチド
の構成としては、該サブオリゴヌクレオチドの３゛末端
および５′末端に互いに相補性をもつ６から８の塩基を
配列するように合成したものが好ましいが、その塩基数
はそれより少なくても多くても利用できる。
ら４０塩基程度が望ましい。各サブオリゴヌクレオチド
の構成としては、該サブオリゴヌクレオチドの３゛末端
および５′末端に互いに相補性をもつ６から８の塩基を
配列するように合成したものが好ましいが、その塩基数
はそれより少なくても多くても利用できる。
合成するサブオリゴヌクレオチドの数はミスマツチしな
い程度に複数個合成するのが望ましし）。
い程度に複数個合成するのが望ましし）。
各サブオリゴヌクレオチドの５゛末端にリン酸基を付け
てヌクレオチドフォスフェートにする方法は、化学的合
成によっても、ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ等の酵素による方法でも良い。
てヌクレオチドフォスフェートにする方法は、化学的合
成によっても、ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ等の酵素による方法でも良い。
また本発明の結合体を用いて、ハイブリダイゼーション
法によって被検出核酸の有無の分析及び被検出核酸を検
出する場合には、被検出核酸の塩基配列に対して相補的
な塩基配列を構成するようにサブオリゴヌクレオチドを
有するとよい。
法によって被検出核酸の有無の分析及び被検出核酸を検
出する場合には、被検出核酸の塩基配列に対して相補的
な塩基配列を構成するようにサブオリゴヌクレオチドを
有するとよい。
各サブオリゴヌクレオチドの相補的な塩基配列部分での
二本鎖の形成はアニーリング反応によって行なうことが
できる。
二本鎖の形成はアニーリング反応によって行なうことが
できる。
アニーリング反応では、該複数個の一本鎖サブオリゴヌ
クレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で１
分間以上、好ましくは、６５度にて１０分間、或は、９
５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷
する。この反応により第２図に示すように、該サブオリ
ゴヌクレオチドは互いに相補的な塩基配列部分で結合し
、部分的に二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を形成
することができる。
クレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で１
分間以上、好ましくは、６５度にて１０分間、或は、９
５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷
する。この反応により第２図に示すように、該サブオリ
ゴヌクレオチドは互いに相補的な塩基配列部分で結合し
、部分的に二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を形成
することができる。
本発明の方法においては、前記のようにして得られた′
オリゴヌクレオチド鎖の非結合部分の鎖長を伸展させ二
本鎖化する際に、側鎖に捕捉体を結合したヌクレオチド
フォスフェートを伸展部分に取り込ませて捕捉体を複数
ケ所に有する二本鎖ヌクレオチドを形成する。この二本
鎖形成の伸展反応では、オリゴヌクレオチド鎖の非結合
部である一本鎖が鋳型となり、その鋳型を有するサブヌ
クレオチドと結合しているサブオリゴヌクレオチドの該
二本鎖形成部分の−がプライマーとなって作用し、５°
側から３°側方向に捕捉体を結合しているヌクレオチド
を導入しながら鎖長を伸展し、合成ヌクレオチドが形成
される。
オリゴヌクレオチド鎖の非結合部分の鎖長を伸展させ二
本鎖化する際に、側鎖に捕捉体を結合したヌクレオチド
フォスフェートを伸展部分に取り込ませて捕捉体を複数
ケ所に有する二本鎖ヌクレオチドを形成する。この二本
鎖形成の伸展反応では、オリゴヌクレオチド鎖の非結合
部である一本鎖が鋳型となり、その鋳型を有するサブヌ
クレオチドと結合しているサブオリゴヌクレオチドの該
二本鎖形成部分の−がプライマーとなって作用し、５°
側から３°側方向に捕捉体を結合しているヌクレオチド
を導入しながら鎖長を伸展し、合成ヌクレオチドが形成
される。
合成試薬としてはヌクレオチドトリフオスフェート、捕
捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドトリフオスフ
ェート及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合の
ための試薬を利用する。ヌクレオチドトリフオスフェー
トとしてはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰおよ
び捕捉体を側鎖に結合したｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドトリフオスフ
ェート及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合の
ための試薬を利用する。ヌクレオチドトリフオスフェー
トとしてはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰおよ
び捕捉体を側鎖に結合したｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰ、ＴＴＰを利用することができる。この場合、
該捕捉体結合のヌクレオチドトリフオスフェートのみを
加えてもよいし、捕捉体の非結合ヌクレオチドトリフオ
スフェートを混在させてもよい。例えば捕捉体非結合の
ヌクレオチドトリフオスフェートを全く加えず、捕捉体
結合のヌクレオチドトリフオスフェートのみを加えて反
応させた場合、作成された合成オリゴヌクレオチドの塩
基配列は、捕捉体結合のヌクレオチドトリフオスフェー
トを取り込んだ領域と取り込んでいない領域が交互にな
るように構成されたものになる。
該捕捉体結合のヌクレオチドトリフオスフェートのみを
加えてもよいし、捕捉体の非結合ヌクレオチドトリフオ
スフェートを混在させてもよい。例えば捕捉体非結合の
ヌクレオチドトリフオスフェートを全く加えず、捕捉体
結合のヌクレオチドトリフオスフェートのみを加えて反
応させた場合、作成された合成オリゴヌクレオチドの塩
基配列は、捕捉体結合のヌクレオチドトリフオスフェー
トを取り込んだ領域と取り込んでいない領域が交互にな
るように構成されたものになる。
重合試薬として用いる酵素には、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのにｌｅｎｏ
ｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、ｅｔ、ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
１０８ 、 Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉＢＨａｒｂａｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ、
Ｔａｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
ＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのにｌｅｎｏ
ｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、ｅｔ、ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
１０８ 、 Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉＢＨａｒｂａｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ、
Ｔａｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
８４．４７６７−４７７１ （１９８７））、熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ，に、 ５ａｉｋｉ、 ｅｔ
、 ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３９゜４８７−４９
１ （１９８８） ）、他の入手可能なりＮＡポリメラ
ーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の
相補的であるブライマー伸展生成物を形成するために適
当な態様でのヌクレオチドの結合を促進する酵素が含ま
れる。
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ，に、 ５ａｉｋｉ、 ｅｔ
、 ａｌ、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３９゜４８７−４９
１ （１９８８） ）、他の入手可能なりＮＡポリメラ
ーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の
相補的であるブライマー伸展生成物を形成するために適
当な態様でのヌクレオチドの結合を促進する酵素が含ま
れる。
連結試薬として用いる酵素としては、ＤＮＡリガーゼ゛
がある。ＤＮＡリガーゼは、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のもので
もファージＴ４由来のものでも良いし、或は、同じ様な
働きをする他の酵素で良い。
がある。ＤＮＡリガーゼは、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のもので
もファージＴ４由来のものでも良いし、或は、同じ様な
働きをする他の酵素で良い。
伸展されたヌクレオチドにニック（切れ目）が入ってい
る場合には、Ｔ４ライゲースなどの酵素により切れ目が
ないように連結することができる。
る場合には、Ｔ４ライゲースなどの酵素により切れ目が
ないように連結することができる。
該反応生成物である二本鎖ヌクレオチドからの末鎖合成
オリゴヌクレオチドの形成は、変成条件下で処理するこ
とによって得られる。変性は熱変性でも、アルカリによ
る方法でも、二本鎖を一本鎖に分離する方法であれば他
の方法でも良い。
オリゴヌクレオチドの形成は、変成条件下で処理するこ
とによって得られる。変性は熱変性でも、アルカリによ
る方法でも、二本鎖を一本鎖に分離する方法であれば他
の方法でも良い。
例えば熱変性であれば９５℃下５分の加熱処理で一本鎖
に解離することができる。
に解離することができる。
方、不溶性担体はその表面上に捕捉体と特異的に結合す
るリガトンを結合させることによって、合成オリゴヌク
レオチドを結合させることができる。表面処理された該
不溶性担体は、捕捉体とリガンドとの結合により一本鎖
にした合成オリゴヌクレオチドと結合する。
るリガトンを結合させることによって、合成オリゴヌク
レオチドを結合させることができる。表面処理された該
不溶性担体は、捕捉体とリガンドとの結合により一本鎖
にした合成オリゴヌクレオチドと結合する。
捕捉体としては、後述する不溶性担体表面に結合するこ
とかできるリガンドと選択特異的に結合可能な物質であ
り、かつヌクレオチドの側鎖に結合できる物質であれば
どのようなものでも利用することができる。
とかできるリガンドと選択特異的に結合可能な物質であ
り、かつヌクレオチドの側鎖に結合できる物質であれば
どのようなものでも利用することができる。
例えば、具体的な捕捉体とリガンドとしてはビオチン−
アビジン、ハブテン−抗体、フラビンアデニンジヌクレ
オチド（ＦＡＤ）−グルコースオキシターゼ、ビオチン
−抗ビオチン抗体等の抗原−抗体があげられる。
アビジン、ハブテン−抗体、フラビンアデニンジヌクレ
オチド（ＦＡＤ）−グルコースオキシターゼ、ビオチン
−抗ビオチン抗体等の抗原−抗体があげられる。
担体に用いられる有機高分子物質としては、芳香族ビニ
ル化合物、不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミ
ド類、不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物
、共役ジエン化合物、並びに低級脂肪酸ビニルエステル
からなるビニル系単量体の一種以上を重合して得られる
水不溶性の有機高分子物質や該有機高分子物質を化学的
に変性して得られる水不溶性の有機高分子物質、もしく
はアガロース、デキストラン、セルロースなどの多糖類
の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン
、カゼインなどの架橋体をあげることができる。
ル化合物、不飽和カルボン酸のエステル類もしくはアミ
ド類、不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物
、共役ジエン化合物、並びに低級脂肪酸ビニルエステル
からなるビニル系単量体の一種以上を重合して得られる
水不溶性の有機高分子物質や該有機高分子物質を化学的
に変性して得られる水不溶性の有機高分子物質、もしく
はアガロース、デキストラン、セルロースなどの多糖類
の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン
、カゼインなどの架橋体をあげることができる。
［実施例］
ａ０合成オリゴヌクレオチドの作製
プラスミドｐＵｃ１９の塩基配列の一部に相補的に対応
する塩基配列を含む下記のような四種類のサブオリゴヌ
クレオチドをＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ）により合成した。
する塩基配列を含む下記のような四種類のサブオリゴヌ
クレオチドをＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ）により合成した。
５°ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧ
ＣＡＧ３゜５°ＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣ八ＴＴＣ八ＧＧＣ
ＴＧＣＧＣＡＡ３ ’５°ＴＴＴＣＧＣＣＡＧ（１：Ｔ
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧ３ ’５°ＧＧ
ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧ３ ’
このうちの３′末端、或は３′末端及び５′末端からの
８塩基はそれぞれ他の各サブオリゴヌクレオチド中に互
いに相補的な塩基配列をもつように合成されている。
ＣＡＧ３゜５°ＧＣＣＡＴＴＣＧＣＣ八ＴＴＣ八ＧＧＣ
ＴＧＣＧＣＡＡ３ ’５°ＴＴＴＣＧＣＣＡＧ（１：Ｔ
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＧ３ ’５°ＧＧ
ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧ３ ’
このうちの３′末端、或は３′末端及び５′末端からの
８塩基はそれぞれ他の各サブオリゴヌクレオチド中に互
いに相補的な塩基配列をもつように合成されている。
これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動を
行ないその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であ）だので、それ以上の精製を行なわずに以下の反応
に用いた。
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動を
行ないその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であ）だので、それ以上の精製を行なわずに以下の反応
に用いた。
各サブオリゴヌクレオチド２μｇ（約１３０ｐｍｏｌｅ
）をエッペンドルフチューブに入れ、１０×キナーゼ緩
衝液（０，５ｘ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ１−ｐＨ８，０−
０，１ＭＭｇＣｌ２Ｏ，１Ｍβ−メルカプトエタン−ル
）１０μｋ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｍ
（１０単位） （ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３７度
にて１時間加温した。
）をエッペンドルフチューブに入れ、１０×キナーゼ緩
衝液（０，５ｘ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ１−ｐＨ８，０−
０，１ＭＭｇＣｌ２Ｏ，１Ｍβ−メルカプトエタン−ル
）１０μｋ、及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｍ
（１０単位） （ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３７度
にて１時間加温した。
次に、１０×アニーリング溶液（１００ｍＭＴｒｉｓ・
ＨＣＩＬ ｐＨ８，０−６０ｍＭ ＭｇＣｆ１２−６０
ｍＭβ−メルカプトエタノール−５００ｍＭ ＮａＣｌ
２ ）を５μｍ加え、蒸留水にて５０μｍに調整した。
ＨＣＩＬ ｐＨ８，０−６０ｍＭ ＭｇＣｆ１２−６０
ｍＭβ−メルカプトエタノール−５００ｍＭ ＮａＣｌ
２ ）を５μｍ加え、蒸留水にて５０μｍに調整した。
これを６５度の温水が入ったビーカー中で１ｏ分間加温
し、その後約１時間かけて室温になるまでゆフくり冷ま
した。この反応で４本のサブオリゴヌクレオチドは下図
のような部分的二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を
形成した。
し、その後約１時間かけて室温になるまでゆフくり冷ま
した。この反応で４本のサブオリゴヌクレオチドは下図
のような部分的二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を
形成した。
３° ５“
５°（ｄ；ＧＡＴＴ−−−ＣＴＧＣＧＣＡＡ ＧＧ
ＧＣＧＡＴＣ：３°ＧＡＣＧＣＧＴＴ −−−ＣＣ（
：ＧＣＴＡＧ５゜ ３゜ −−−［：ＣＴＣＴＴＣＧ ＧＧＡＧＡＡＧＣ ３゛ ＧＣＴＴＴ ５゜ この溶液５０μｍに１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。
ＧＣＧＡＴＣ：３°ＧＡＣＧＣＧＴＴ −−−ＣＣ（
：ＧＣＴＡＧ５゜ ３゜ −−−［：ＣＴＣＴＴＣＧ ＧＧＡＧＡＡＧＣ ３゛ ＧＣＴＴＴ ５゜ この溶液５０μｍに１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。
及びｄＣＴＰをそれぞれ２μｆｌ、 ０．４ｍＭビオチ
ン化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｎ、ＩＯＸアニリン
グ溶液５μｍ、蒸留水３２μ２を加え、よく混和したあ
とＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯ
ＢＯ社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加温し、
オリゴヌクレオチド鎖の一本鎖部分の伸展反応を行なっ
た。反応後６５度で５分間加熱し反応を停止させた後フ
ェノール処理し除タンパクを行なった。
ン化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｎ、ＩＯＸアニリン
グ溶液５μｍ、蒸留水３２μ２を加え、よく混和したあ
とＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯ
ＢＯ社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加温し、
オリゴヌクレオチド鎖の一本鎖部分の伸展反応を行なっ
た。反応後６５度で５分間加熱し反応を停止させた後フ
ェノール処理し除タンパクを行なった。
次に、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、反
応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌＰ ２ ；Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製 ０．５ ｘ ５ ｃｍ）で精製した
。目的の捕捉体修飾合成ヌクレオチドはほとんどカラム
を素通りした分画に回収された。各フラクションを０．
５ ｍｌずつ収集し、それぞわ２μｍをニトロセルロー
スフィルターに吸着させ、ＢＲＬ社のプロトコールに従
フて発色反応を行なフたところ、２番目のフラクション
が強く発色し、目的の二本鎖合成ヌクレオチドがビオチ
ンを含有していることが確認できた。
応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌＰ ２ ；Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製 ０．５ ｘ ５ ｃｍ）で精製した
。目的の捕捉体修飾合成ヌクレオチドはほとんどカラム
を素通りした分画に回収された。各フラクションを０．
５ ｍｌずつ収集し、それぞわ２μｍをニトロセルロー
スフィルターに吸着させ、ＢＲＬ社のプロトコールに従
フて発色反応を行なフたところ、２番目のフラクション
が強く発色し、目的の二本鎖合成ヌクレオチドがビオチ
ンを含有していることが確認できた。
次に得られた捕捉体を含む二本鎖合成ヌクレオチドを含
む溶液を９５度で５分間加熱処理して二本鎖を一本鎖に
解離し、合成オリゴヌクレオチドを得た。
む溶液を９５度で５分間加熱処理して二本鎖を一本鎖に
解離し、合成オリゴヌクレオチドを得た。
ｂ１合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との結合体の
調製 不溶性担体として以下のように処理した約粒径１０μｍ
のゲル粒を用いた。ゲル粒は、アガロースゲルを粉砕し
たもので、その表面を臭化シアンで活性化させたあとア
ビジンと結合させた。このアビジン結合のゲル粒と先の
合成オリゴヌクレオチドを含む溶液とを２０分間混和さ
せた。この時合成オリゴヌクレオチド内に取り込まれた
ビオチンは、ゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する
。
調製 不溶性担体として以下のように処理した約粒径１０μｍ
のゲル粒を用いた。ゲル粒は、アガロースゲルを粉砕し
たもので、その表面を臭化シアンで活性化させたあとア
ビジンと結合させた。このアビジン結合のゲル粒と先の
合成オリゴヌクレオチドを含む溶液とを２０分間混和さ
せた。この時合成オリゴヌクレオチド内に取り込まれた
ビオチンは、ゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する
。
Ｃ０被検出核酸の調製
検出を行なう核酸として、ｐＵｃ１９．ｐＢＲ３２２及
びｐＵｃ１９とｐＢＲ３２２の混合物の３種を用意した
。
びｐＵｃ１９とｐＢＲ３２２の混合物の３種を用意した
。
２μｌの蒸留水に各核酸試料１μｇを含む３種の各々の
試料に２μ２のｌ０ＸＴＡバツフアー１６μにのｄｄＨ
２０を加えた反応液に１０ｕｎｉｔの１１ｊｎｄｍを加
え、３７度２時間で完全加水分解した。この後フェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行ない沈殿物を１０μｍの蒸
留水に溶解した。
試料に２μ２のｌ０ＸＴＡバツフアー１６μにのｄｄＨ
２０を加えた反応液に１０ｕｎｉｔの１１ｊｎｄｍを加
え、３７度２時間で完全加水分解した。この後フェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行ない沈殿物を１０μｍの蒸
留水に溶解した。
これに混合試薬液（０，３３ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
７，９゜３３ ｍＭ ＭｇＣｌ、、 ３３ ｍＭジチオ
スリトール） ６μｕ５ｍＭｄＣＴＰ１μｆ、５ｍＭｄ
ＧＴＰ１μｆｉ、５ｍＭｄＡＴＰ１μｆｆｉ、 ５ｍＭ
ｄＴＴＰ１μｍ、 ［ａ−３２ＰｌｄＧＴＰ （１０
Ｃｉ）１μ２．蒸留水７μｍおよびＴ ４− ＤＮＡポ
リメラーゼ２ μＩ１． （４ｕｎｉｔ）を添加し、３
０分間２０度で反応を行ない放射性標識を施した。
７，９゜３３ ｍＭ ＭｇＣｌ、、 ３３ ｍＭジチオ
スリトール） ６μｕ５ｍＭｄＣＴＰ１μｆ、５ｍＭｄ
ＧＴＰ１μｆｉ、５ｍＭｄＡＴＰ１μｆｆｉ、 ５ｍＭ
ｄＴＴＰ１μｍ、 ［ａ−３２ＰｌｄＧＴＰ （１０
Ｃｉ）１μ２．蒸留水７μｍおよびＴ ４− ＤＮＡポ
リメラーゼ２ μＩ１． （４ｕｎｉｔ）を添加し、３
０分間２０度で反応を行ない放射性標識を施した。
その後、放射性標識を付した各試料の被検出核酸を９５
度で５分間加熱処理することによって一本鎖に解離した
。
度で５分間加熱処理することによって一本鎖に解離した
。
ｄ、ハイブリダイゼーション
ｂ、で調製した合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の
結合体に、Ｃ１で得た一本鎖に解離した検体核酸溶液及
び１０×アニーリング溶液５μｌを加え蒸留水にて５０
μｌに調製した。これを軽く攪拌した後、６５度の温水
が入ったビーカー中で１０分間加温し、その後約１時間
室温になるまでゆっくり冷ました。
結合体に、Ｃ１で得た一本鎖に解離した検体核酸溶液及
び１０×アニーリング溶液５μｌを加え蒸留水にて５０
μｌに調製した。これを軽く攪拌した後、６５度の温水
が入ったビーカー中で１０分間加温し、その後約１時間
室温になるまでゆっくり冷ました。
軽く遠心して上滑を廃棄し、ざらにＴＥ温溶液２度洗浄
した後、沈殿物の強度をシンチレーションカウンターで
数度測定したところｐＵｃ１９をふくむ試料は１０６〜
１１０７Ｃｐの値を示し、ｐＢＲ３２２のみの試料にお
けるその値はバックグランドの２倍に満たなかった。
した後、沈殿物の強度をシンチレーションカウンターで
数度測定したところｐＵｃ１９をふくむ試料は１０６〜
１１０７Ｃｐの値を示し、ｐＢＲ３２２のみの試料にお
けるその値はバックグランドの２倍に満たなかった。
［発明の効果］
本発明の方法では、複数個の捕捉体を均一に含有する合
成オリゴヌクレオチドを得ることができた。このことに
より合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との接点が増
加し、従来法と比較して強固な結合を持ち安定した結合
体を得ることができた。さらに、プローブ自体の高次構
造形成を防ぐこともできた。その結果、ハイブリッド形
成の効率を減少させることなく長い合成オリゴヌクレオ
チドを簡単に不溶性担体に結合させることが可能となっ
た。
成オリゴヌクレオチドを得ることができた。このことに
より合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との接点が増
加し、従来法と比較して強固な結合を持ち安定した結合
体を得ることができた。さらに、プローブ自体の高次構
造形成を防ぐこともできた。その結果、ハイブリッド形
成の効率を減少させることなく長い合成オリゴヌクレオ
チドを簡単に不溶性担体に結合させることが可能となっ
た。
第１図は、部分的に互いに相補性をもつように構成され
た塩基配列を有するサブオリゴヌクレオチドを示す模式
図、第２図は第１図で示したサブオリゴヌクレオチドが
相補性を有する部分で結合した状態を示す模式図である
。
た塩基配列を有するサブオリゴヌクレオチドを示す模式
図、第２図は第１図で示したサブオリゴヌクレオチドが
相補性を有する部分で結合した状態を示す模式図である
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の結合方法に
おいて、 ａ）末端領域の一部が部分的に互いに相補性をもつよう
に構成された塩基配列を有する複数種のサブオリゴヌク
レオチドを合成し、該サブオリゴヌクレオチド間で反応
させて部分的に二本鎖で結合したオリゴヌクレオチド鎖
を形成する過程と、 ｂ）該オリゴヌクレオチド鎖中の一本鎖部分を鋳型とし
て、二本鎖形成部分をプライマーとして利用し、捕捉体
を結合しているヌクレオチドを導入しながら鎖長伸展反
応を行ない一本鎖部分を二本鎖化し、最終的に二本鎖の
うち一本鎖が目的とする合成オリゴヌクレオチドである
二本鎖合成ヌクレオチドを形成する過程と、 ｃ）該二本鎖合成ヌクレオチドを一本鎖に解離し、一本
鎖の合成オリゴヌクレオチドを形成する過程と、 ｄ）捕捉体に特異的に結合するリガンドを不溶性担体の
表面に結合させ、リガンドと捕捉体との結合を介して該
合成オリゴヌクレオチドを不溶性担体に複数カ所で結合
させる過程と、 を含むことを特徴とする合成オリゴヌクレオチドと不溶
性担体の結合方法。 ２）サブオリゴヌクレオチドが、その塩基配列の中に被
検出核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する請求項
１に記載の方法。 ３）ｎ個のオリゴヌクレオチドにおいて、２個のオリゴ
ヌクレオチドについては３’末端、ｎ−２個のオリゴヌ
クレオチドについては３’末端および５’末端の領域の
一部が互いに相補的な塩基配列を有するように構成され
ている請求項１に記載の方法。 ４）サブオリゴヌクレオチドの５’末端がヌクレオチド
フォスフェートである請求項１に記載の方法。 ５）請求項１に記載の方法により結合した結合体。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02003338A JP3122106B2 (ja) | 1990-01-12 | 1990-01-12 | 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 |
| AT90103830T ATE143696T1 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partiell doppelsträngiges oligonukleotid und verfahren zu seiner bildung |
| DE69028725T DE69028725T2 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung |
| EP90103830A EP0385410B1 (en) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide |
| US07/974,303 US5830643A (en) | 1989-02-28 | 1992-11-10 | Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02003338A JP3122106B2 (ja) | 1990-01-12 | 1990-01-12 | 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03210195A true JPH03210195A (ja) | 1991-09-13 |
| JP3122106B2 JP3122106B2 (ja) | 2001-01-09 |
Family
ID=11554572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02003338A Expired - Fee Related JP3122106B2 (ja) | 1989-02-28 | 1990-01-12 | 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3122106B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988010313A1 (en) | 1987-06-26 | 1988-12-29 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Affinity removal of contaminating sequences from recombinant cloned na using capture beads |
-
1990
- 1990-01-12 JP JP02003338A patent/JP3122106B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3122106B2 (ja) | 2001-01-09 |
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