JPH0354551B2

JPH0354551B2 -

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Publication number: JPH0354551B2
Application number: JP25421584A
Authority: JP
Priority date: 1984-12-03
Filing date: 1984-12-03
Publication date: 1991-08-20
Also published as: JPS61132178A

Description

【発明の詳細な説明】一般にサイクロデキストリングルカノトラン
スフエラーゼ生産菌として、バチルス
（Bacillus）属やクレブシラ（Klebsiella）属の細
菌などが用いられてきた。しかし、その生産は微
量で、かつ不安定であり、また培地中に含まれる
よう雑物が多く、サイクロデキストリングルカ
ノトランスフエラーゼの分離精製が困難であつ
た。本発明者らは、バチルス・マセランス
（Bacillus macerans）のサイクロデキストリン
グルカノトランスフエラーゼ構造遺伝子をバチ
ルス・ズブチリス内でクローン化することに成功
し、この変異株を培養したところ、安定に短時間
でサイクロデキストリングルカノトランスフエ
ラーゼを生産させることができたものである。本
発明は、バチルス・マセランス由来のサイクロデ
キストリングルカノトランスフエラーゼをコー
ドするDNAを組込んだプラスミドを導入して形
質転換させたバチルス・ズブチリスである。

本発明の変異バチルス・ズブチリスは次のよう
にして創製することができる。

サイクロデキストリングルカノトランスフエ
ラーゼ遺伝子の調製は次のようにする。

バチルス・マセランスIAM1243株はサイクロ
デキストリングルカノトランスフエラーゼを菌
体外に分泌する細菌として知られている。本菌体
からSaito，Miura法（Saito，H.and Miura，
K.，Biochem.Biophys.Acta，72，619、（1964））
により染色体DNAを調製する。これを制限酵素
Sau3AIで部分分解し、分解物からシヨ糖密度勾
配超遠心法により約2kb以上の染色体DNA断片
を分離する。

別に、フアージλD69DNAを制限酵素BamHI
で切断し、これに先の染色体DNA断片を混合し、
更にT4DNAリガーゼを添加して、連結処理をす
る。この処理液を用いてインビトロパツケイ
ジング法（Horn，B.，Methods in
Enzymology，68，299，（1979））によりλフア
ージ粒子を形成し、このλフアージ粒子をエシエ
リヒア・コリ（Escherichia coli）SM32の培養
菌懸濁液に添加してサイクロデキストリングルカ
ノトランスフエラーゼ生産能を保有する特殊形質
導入フアージを得る。得られた特殊形質導入フア
ージ粒子より、サイクロデキストリングルカノ
トランスフエラーゼ遺伝子を含むλフアージ
DNAを調製する。このDNAを制限酵素Sau3AI
で部分分解し、プラスミドpUB110の制限酵素
BamHI切断部分にT4リガーゼを用いて結合し、
ハイブリツドプラスミド混合物を得る。この混
合物を用いてバチルス・ズブチリスヘプロトプラ
スト形質導入法（Chang，S.and Cohen，S.N.，
Mol.Gen.Genet.168，111，（1979））により形質
転換する。形質転換株の中からカナマイシン耐性
（10μｇ／ml）かつサイクロデキストリングルカ
ノトランスフエラーゼ活性のある株を選択する。
この菌株を培養し、培養菌体からプラスミド
pDS10を得た。

プラスミドpDS10のフイジカルマツプ（制限酵
素切断地図）は第４図に示した通りであり、白ぬ
きの部分はベクターpUB110由来、黒塗りの部分
は染色体切断部分で、このクローン化された断片
の大きさは約2.2kbである。ここに得られる形質
転換体はサイクロデキスリングルカノトランス
フエラーゼを菌体外に安定によく分泌する優れた
変異バチルス・ズブチリスである。本菌はバチル
ス・ズブチリスNA64−pDS10（FERM Ｐ−
7959）として微工研に寄託されている。

この変異バチルス・ズブチリスはサイクロデキ
ストリングルカノトランスフエラーゼの生産性
において全く新規であり、サイクロデキストリン
グルカノトランスフエラーゼの工業生産上極めて
有用である。

次に本発明の実施例及び試験例を示す。

実施例変異バチルス・ズブチリスの創製バチルス・マセランスIAM1243株をフスマ培
地（６％フスマ抽出液、0.5％マルトエキスト
ラクト、0.5％イーストエキストラクト、0.5％
ポリペプトン、0.05％塩化カルシウム）で48時間
培養し、遠心分離にて集菌、洗浄して得られた菌
体からSaito，Miuraの方法（Saito，H.and
Miura，K.，Biochim.Biophys.Acta，72，619，
（1964））によつて染色体DNAを分離し、これを
トリス塩酸・EDTA緩衝液に溶解し、制限酵素
Sau3AI（宝酒造社製品）を添加して、37℃で部分
分解した後、分解物からシヨ糖密度勾配超遠心法
で約2kb以上の染色体断片を分離、取得した。

用いたフアージベクターλD69（東京大学医科学
研究所より分譲）の概略開裂地図は第１図に示し
た通りであり、このフアージλD69は38.8kbで制
限酵素BamHIによつて１箇所切断されるもので
ある。

BamHIで１箇所切断したλD69と前記のバチル
ス・マセランスIAM1243株から得られた約2kb以
上の染色体断片を混合し、T4DNAリガーゼを添
加して連結処理した（Weiss，B.，Sablon，A.
J.，Live，T.R.，Fareed，G.C.andRichardson，
C.C.，J.Biol.Chem.，243，4543、（1968））。処理
液を、インビトロパツケイジングキツト
（宝酒造社製品）に添加してインビトロパツ
ケイジング法（Horn，B.，Methods in
Enzymology，68，299，（1979））により当該
DNAをフアージ粒子に導入した。このフアージ
粒子をエシエリヒア・コリSM32の菌体懸濁液に
添加し、１％可溶性澱粉、1.2％の寒天を含むλ
培地（バクトトリプトン10ｇ、NaCl2.5ｇを水１
に溶解）に添加して37℃で培養し、出現したプ
ラークにヨウ素液を噴霧して、ヨウ素反応を起こ
さなかつたフアージをサイクロデキストリング
ルカノトランスフエラーゼ生産フアージとして分
離することができた。

得られたサイクロデキストリングルカノトラ
ンスフエラーゼ生産フアージを単離し、これをエ
シエリヒア・コリSM32とともにλ培地で37℃で
培養した。培養液を遠心分離して宿主菌体を除
き、ポリエチレングリコールを加えてフアージ粒
子を凝集させたのち、遠心分離によつてフアージ
粒子を集め、新規なフアージを得た。このフアー
ジをλCDと名づけた。

このフアージ粒子を、50％ホルムアミドを含む
フアージ懸濁用緩衝液に対して透析し、λCDフ
アージDNAを得た。フアージλCDDNAは49.8kb
の大きさで、そのフイジカルマツプ（制限酵素切
断地図）を第２図に示す。ここで白ぬきの部分は
ベクターλD69由来で、黒塗りの部分は染色体断
片部分である。各略記号はすべて制限酵素であ
る。

このフアージλCDDNAを ³²Pでラベルし、バ
チルス・マセランスIAM1243株染色体DNA、エ
シエリヒア・コリSM32株染色体DNAおよびα
−アミラーゼ高生産株バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）NA64染色体DNAのそれぞ
れのEcoRI分解物とサザンハイブリダイゼーシヨ
ン（Southern，E.M.，J.Mol.Biol.，98，503，
（1975））を行つたところ、エシエリヒア・コリ，
バチルス・ズブチリス染色体DNAとは全くハイ
ブリダイズしなかつたが、バチルス・マセランス
IAM1243株の染色体DNAとは２箇所で特異的に
ハイブリダイズしており、クローン化した遺伝子
はバチルス・マセランスIAM1243株由来である
ことが確かめられた。

ここに得られたλCDフアージDNAをトリス塩
酸・EDTA緩衝液に溶解し、制限酵素Sau3AI
（宝酒造社製品）を添加し、37℃で部分分解した。
分解物からシヨ糖密度勾配超遠心法で約2kb以上
の染色体断片を分離し、取得し、プラスミド
pUB110を用いて再クローン化を図つた。

再クローン化に用いたプラスミドpUB110の概
略開裂地図は第３図に示すが、このプラスミド
pUB110は4.5kbでカナマイシン耐性（Ｋｍ^r）を
有し、制限酵素BamHIによつて１箇所切断され
るものである。

BamHIで１箇所切断したpUB110と前記の
λCDフアージから得られた約2kb以上の染色体断
片を混合し、T4DNAリガーゼを添加して連結処
理した。この処理液を用いてバチルス・ズブチリ
スNA64株を宿主とするプロトプラスト形質転換
法（Chang，S.，Cohen，S.N.，Mol.gen.
Genet.，168，111，（1979））を行い、当該プラス
ミドを導入した。

得られた形質転換処理菌体を選択培地である可
溶性澱粉１％、カナマイシン100μｇ／ml、寒天
0.8％を含むDM3培地（５％バクトカザミノ酸
100ml、1Mクエン酸ナトリウム（PH7.3）500ml、
3.5％リン酸水素二カリウム50ml、1.5％リン酸二
水素カリウム50ml、10％酵母エキス50ml、20％グ
ルコース25ml、1M塩化マグネシウム20ml、２％
牛血清アルブミン５mlを混合）に添加して37℃で
培養し、カナマイシン耐性株を得た。このカナマ
イシン耐性株をカナマイシン10μｇ／ml、１％可
溶性澱粉を含むLG培地（バクトトリプトン10ｇ、
酵母エキス５ｇ、NaCl5ｇ、グリコース２ｇを１
の水に溶解）にて37℃で24時間培養し、培養液
中のサイクロデキストリンの有無をペーパークロ
マトグラフイーおよび高速液体クロマトグラフイ
ーによつて調べた。

ペーパークロマトグラフイーは培養液をｎ−ブ
タノール／ｎ−プロパノール／水（３／５／４）
の溶媒系で60℃、２回上昇展開を行つたのち、90
％アセトンのヨウ素溶液にペーパークロマトグラ
ムを浸してサイクロデキストリンの呈色を検索
し、発色したものをサイクロデキストリングル
カノトランスフエラーゼ分泌株として分離するこ
とができた。

得られたサイクロデキストリングルカノトラ
ンスフエラーゼ生産菌株を単離し、これをカナマ
イシン10μｇ／mlを含むLG培地で37℃で培養し、
培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体
からアルカリ抽出法（Birnboim，H.C.and
Doly，J.，Nucleic Acids Res.，７，1513、
（1979））によつてプラスミドを分離、探索して新
規なプラスミドを得た。このプラスミドをプラス
ミドpDS10と名づけた。

プラスミドpDS10は6.7kbの大きさで、そのフ
イジカルマツプ（制限酵素切断地図）を第４図に
示す。ここで白ぬきの部分はベクターpUB110由
来で、黒塗りの部分は染色体断片部分であり、各
略記号はすべて制限酵素である。

試験例１サイクロデキストリングルカノトランスフエ
ラーゼの生産バチルス・ズブチリスNA64−pDS10をカナマ
イシン10μｇ／mlを含むLG培地を用い、500ml容
の坂口フラスコに100ml分注し、37℃で30時間振
とう培養した。その間培養物を１mlずつ採取し
て、培地中のサイクロデキストリングルカノト
ランスフエラーゼの活性を測定した。

第５図は、サイクロデキストリングルカノト
ランスフエラーゼ活性の経時的変化を示すもので
ある。ここでＡは菌の生育、Ｂはサイクロデキス
トリングルカノトランスフエラーゼ活性を示し
ている。

第５図から明らかなように、サイクロデキスト
リングルカノトランスフエラーゼ活性は培養後
12時間で最高値に達する。

【図面の簡単な説明】

第１図はフアージλD69のフイジカルマツプ
（制限酵素切断地図）、第２図はフアージλCDの
フイジカルマツプ、第３図はプラスミドpUB110
のフイジカルマツプ、第４図はpDS10のフイジカ
ルマツプをそれぞれ示している。第５図は試験例
におけるサイクロデキストリングルカノトランス
フエラーゼ活性の経時変化および菌の生育を示す
グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１バチルス・マセランス由来のサイクロデキス
トリングルカノトランスフエラーゼをコードす
るDNAを組込んだプラスミドを導入して形質転
換させたバチルス・ズブチリス。