JPH03219881A - 新規な組み換え体ｄｎａ及び生理活性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な組み換え体ＤＮＡ及び生理活性物質、
例えばグルタチオンの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、生理活性物質、例えばグルタチオンは有機合成、
微生物（特に酵母）菌体から抽出する方法及び遺伝子組
み換えにより、グルタチオン合成に関する２種の酵素、
Ｔ−グルタミル−Ｌ−システィン合成酵素（以下ＧＳＨ
−１と略称する）とグルタチオン合成酵素（以下ＧＳＨ
−ｎと略称する）活性が増強された大腸菌により製造す
る方法等で製造されている。

グルタチオンは、グルタミン酸、システィン、グリシン
よりなるトリペプタイドであり、広範な肝疾患の治療薬
として、あるいは、生化学試薬として頻用される重要な
化合物である。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、前二者の方法は、反応工程の長さとその
複雑さにおいて、また、煩雑な操作と菌体内低含量のた
めに必ずしも有利な方法とは言えず、更に後者において
もＧＳＨ−１活性が低いことによりグルタチオン生産が
制限される等の問題があり、より効率の優れたグルタチ
オン等の生理活性物質の生産方法の開発が望まれている
。

〔課題を解決するための手段〕

先に、本発明者等は、上記の問題点を解決すべく種々検
討した結果、ＧＳＨ−１をコードする遺伝子（以下ＧＳ
Ｈ−１遺伝子と略称する）を含有するＤＮＡ及びＣ３Ｈ
−ＩＩをコードする遺伝子（以下ＧＳＨ−ＩＩ遺伝子と
略称する）を含有するＤＮＡをバタテリオファージベク
ターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み
換え体をエッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
に属する菌株に含ませたグルタチオン生産能を有する菌
株を培地に培養し、培養物よりグルタチオンを採取する
が、もしくは、該微生物菌体及び／又は菌体処理物をグ
ルタミン酸、システィン、グリシン、アデノシン−５′
−３リン酸及びマグネシウムイオンと接触作用させるこ
とにより従来法と比較して高収率にグルタチオンを生産
できること等の知見を得、特許出願を行なった。（特願
昭６３−５２６５９号明細書）更に、本発明者等は、検
討を重ねた結果、ＡＴＰをＡＤＰに変換して生理活性物
質を合成せしめる酵素をコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡ　（例えばグルタチオンの場合は、ＧＳＨ−１をコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡ、ＧＳＨ−１１をコー
ドする遺伝子を含有するＤＮＡ）及びアセテート・カイ
ネースをコードする遺伝子（以下ＡＣＫ遺伝子と略称す
る）を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物に含ませた
生理活性物質（例えばグルタチオン）生産能を有する微
生物を培地に培養し、培養物より生理活性物質（グルタ
チオン）を採取することにより高収率で生理活性物質（
グルタチオン）が生産できること、またＴ−グルタミル
し一システィン合成酵素をコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ及びアセテート・カイネースをコードする
遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組
み換え体ＤＮＡを含み、グルタチオン生産能を有するエ
ッシェリシア属に属する微生物を培地に培養して得られ
る微生物菌体及び／又は菌体処理物をグルタミン酸、シ
スティン、グリシン、アデノシン−５′−３リン酸、ア
セチルリン酸及びマグネシウムイオンと接触作用させる
ことにより、上記先願発明と比較して更に高収率にグル
タチオンを生産できること等の知見を得、本発明を完成
した。

アセテート・カイネースは、下記の反応式で示される反
応を触媒する酵素である。

そして、アセテート・カイネースは、ＡＴＰの製造等に
極めて有用なものである。

すなわち本発明は、ＡＴＰをＡＤＰに変換して生理活性
物質を合成せしめる酵素をコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ　（例えばγ−グルタミルし一システィン合成酵
素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ、グルタチオン
合成酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ）及びア
セテート・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規
な組み換え体ＤＮＡであり、また本発明は、ＡＴＰをＡ
Ｄ、Ｐに変換して生理活性物質を合成せしめる酵素をコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡ　（例えばＴ−グルタ
ミル−Ｌ−システイン合成酵素をコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ）及びアセテート・カイネースをコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿
入した組み換え体ＤＮＡを含み、生理活性物質（例えば
グルタチオン）生産能を有するエッシェリシア属に属す
る微生物を、培地に培養し、培養物より生理活性物質（
例えばグルタチオン）を採取する生理活性物質の製造法
もしくは、Ｔ−グルタミル−しシスティン合成酵素を　
コードする遺伝子を含有するＤＮＡ、グルタチオン合成
酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ及びアセテー
ト・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤＮＡを
ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グ
ルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属する微
生物を培地に培養して得られる微生物菌体及び／又は該
微生物菌体処理物を、グルタミン酸、システィン、グリ
シン、アデノシン−５′−３リン酸、アセチルリン酸お
よびマグネシウムイオンと接触作用させてグルタチオン
を生成させることを特徴とするグルタチオンの製造法で
ある。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明において用いられるベクターとしては、如何なる
ものでもよく、例えばバクテリオファージベクター、プ
ラスミドベクター等が挙げられる。

また、本発明において適用することができるＡＴＰをＡ
ＤＰに変換して生理活性物質を合成せしめる酵素をコー
ドする遺伝子としては、例えば、Ｔ−グルタミル−Ｌ−
システイン合成酵素、グルタチオン合成酵素、タレアチ
ンキナーゼ、グリセロールキナーゼ、グルコキナーゼ、
グルタミン合成酵素、ピルビン酸キナーゼ等をコードす
る遺伝子等が挙げられる。

ＡＴＰをＡＤＰに変換して生理活性物質を合成せしめる
酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ１例えばＧＳ
Ｈ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡ。

ＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡ及びＡＣＫ遺伝子を
含有するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入し、宿主細胞に
取り込む方法としては以下の方法が挙げられる。先ず、
ＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡ、ＧＳＨ−ＩＦ遺伝
子を含有するＤＮＡ、ＡＣＫ遺伝子を含有するＤＮＡを
同一のベクターＤＮＡに連結して大腸菌由来の株に含ま
せる方法である。又はＧＳＨ−■遺伝子を含有するＤＮ
Ａ、ＧＳＨ−４遺伝子を含有するＤＮＡ及びＡＣＫの遺
伝子を含有するＤＮＡを夫々側のベクターＤＮＡに連結
するか、ＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡ及びＡＣＫ
遺伝子を含有するＤＮＡを同一のベクターＤＮＡに、Ｇ
ＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡを別のベクターＤＮＡ
に連結するか、ＧＳＨ■遺伝子を含有するＤＮＡ、ＧＳ
Ｈ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡを同一のベクターＤＮＡ
に、ＡＣＫ遺伝子を含有するＤＮＡを別のベクターＤＮ
Ａに連結するか、あるいは、ＧＳＨ−Ｉｎ遺伝子を含有
するＤＮＡ、ＡＣＫ遺伝子を含有するＤＮＡを同一のベ
クターＤＮＡに、ＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡを
別のベクターＤＮＡに連結する方法である。更に、ＧＳ
）［−１遺伝子を含有するＤＮＡ、ＧＳＨ−Ｉｎ遺伝子
を含有するＤＮＡ及びＡＣＫ遺伝子を含有するＤＮＡを
同一のベクターＤＮＡに連結し、大腸菌由来の株に含ま
せたのち、その株に上記いずれかの遺伝子を含有するｐ
ＮＡベクターに連結したＤＮＡを含ませる方法も挙げら
れる。

以下、バクテリオファージベクターを使用し、ＧＳＨ−
ｎ遺伝子を含有するＤＮＡを連結したファージＤＮＡ並
びにＧＳＨ−Ｉｆｎ遺伝子含有するＤＮＡ及びＡＣＫ遺
伝子を含有するＤＮＡを連結したファージＤＮＡを組み
換えることにより、同一ファージＤＮＡ上に、ＧＳＨ−
１遺伝子を含有したＤＮＡ、ＧＳＨ−ＩＦ遺伝子を含有
したＤＮＡ及びＡＣＫ遺伝子を含有したＤＮＡを連結し
た組み換え体ＤＮＡの調製について述べる。ベクターＤ
ＮＡに連結するためには、ＧＳＨ−１遺伝子を含有する
ＤＮＡ、ＧＳＨ−ｎ遺伝子、ＡＣＫ遺伝子を含有するＤ
ＮＡの構造遺伝子を含有するＤＮＡ及び、その上流のプ
ロモーター領域内に切断部位のない制限酵素切断部位な
らば如何なるものでもよいが、例えばＩａｃプロモータ
ーにより発現するＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡで
は、石■切断部位、ＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤＮＡ
及びＡＣＫを含有するＤＮＡ遺伝子では、ＥｃｏＲ１切
断部位が挙げられる。

先ず、ＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡ、例えば、大
腸菌由来の前記ＤＮＡを、強力なプロモーター、例えば
、ｌａｃプロモーターにより発現せしめるように再構築
したＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡの調製について述べる。

バクテリオファージベクターＤＮＡとしては、被膜蛋白
質の遺伝情報部分のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を
有するものであれば如何なるものでもよく、例えば、バ
クテリオファージＥＮ５０１ＳＴｃＤＮＡ等が挙げられ
る。

上記バクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａは、以下の方法で調製することができる。まず、特開
昭５８−２１２７８１号公報記載の実施例と全く同様に
してバクテリオファージλＣｌｌｌ５，１１２１　Ｄ　
Ｎ　Ａを得、このバクテリオファージＤＮＡの分離を容
易にするために、後期プロモーターより上流域又は、下
流域にマーカーを付与する。マーカーは如何なるもので
も良く、例えば、薬剤耐性マーカーが挙げられる。

そして、薬剤耐性マーカーを付与する例としては、例え
ば、後期プロモーターより下流に唯一存在する制限酵素
ＥｃｏＲＩ切断部位に、テトラサイクリン耐性遺伝子（
Ｔｃ’と略称する。）を組み込めばよく、テトラサイク
リン耐性により容易にこのバクテリオファージＤＮＡを
分離することができる。

そしてまた、テトラサイタリン耐性バタテリオファージ
ＤＮＡ、例えば、ＥＮ１１２１Ｔｃ／ｘｂは、下記のよ
うにして調製できる。

プラスミドｐＫＮ２０６　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ティー・マス
ダ（Ｔ。

Ｍａｓｕｄａ）等、アプリ。パイオル、ケム、　（Ａｇ
ｒｉ　、　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、）、第５０巻、第２７１〜２７８頁（１９８
６）記載の方法により得たものである。〕を、例えば、
制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで消化し、ＤＮＡ消化物を得る。

このＤＮＡ消化物にＥｃｏＲＩリンカ−を混合したのち
、Ｔ４バクテリオファージ由来のＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム・山之内・社・製）を作用させて
連結することにより、ＥｃｏＲＩ切断部位を有する組み
換え体プラスミドｐＫＮ３０６　Ｄ　Ｎ　Ａを調製する
ことができる。組み換え体プラスミドｐＫＮ３０６　Ｄ
　Ｎ　Ａによる形質転換は、モレク・ジエン・ジェネン
ト（Ｍｏｌｅｃ、ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）、第１２４巻
、第１〜１０頁（１９７３）記載の塩化カルシウム処理
により行なうことができる。また、ここで用いられる宿
主菌としては、例えば、大腸菌１１００　（Ｍａｘ−Ｐ
ｌａｎｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅ西独、ハイデルベルグより
入手）等が挙げられる。

このようにして得られた形質転換株より、常法により、
例えば、塩化セシウム−エチジウムブロマイド密度勾配
超遠心分離処理により純化されたプラスミドＤ　Ｎ　Ａ
ｐＫＮ３０６を得ることができ、このプラスミドｐＫＮ
３０６　Ｄ　Ｎ　Ａに、例えばＥｃｏＲＩを作用させて
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得
、このＤＮＡ断片を例えば、メンズ・イン・エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）第６８巻、第１７６〜１８２頁（１９７９）に記載の
アガロース電気泳動処理によって単離することができる
。

上記ＤＮＡ断片に、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
したλＣＩａｓｔｌ１２１　Ｄ　Ｎ　Ａと、例えばＸｂ
ａｌを識別する部位を含む５′−ｐＡＡＴＴＧＴＣＴＡ
Ｇ八リンカ−（ヘックマクリンカＰＬＵＳＩのＤＮＡ合
成機により合成したものである）を加え、Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製
）で処理して連結することにより、テトラサイクリン耐
性遺伝子を含有するバクテリオファージλｃＩａｓｖｌ
１２１−Ｔｃ／ｘｂを育種することができる。

次いで、このバクテリオファージλｃＩｓｓｔｌ１２ｔ
Ｔｃ／ｘｂから、ＤＮＡを、常法により、例えば、ティ
ー・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔
モレキュラー・クローニング（Ｍｏ’１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第７６〜８５頁（１９８２年）］に
より精製する。

また、更に、バクテリオファージＤＮＡの被膜蛋白質生
合成の遺伝情報の部分のみにエンドヌクレアーゼ切断部
位を有し、後期プロモーターより下流に薬剤耐性マーカ
ーが付与されたバクテリオファージＤＮＡの調製につい
て述べる。

薬剤耐性マーカーは、如何なるも−のでもよいが、例え
ばＴｃ’マーカーの付与されたバクテリオファージＤＮ
Ａであり、更に、被膜蛋白質生合成の遺伝情報の部分の
みを識別するエンドヌクレアーゼ切断部位も如何なるも
のでもよく、例えば、ＥｃｏＲＩ切断部位ｉｎ切断部位
等が挙げられる。

この被膜蛋白質生合成の遺伝情報の部分のみにエンドヌ
クレアーゼ切断部位を有するバクテリオファージＤＮＡ
は、特公昭６１−３７９１５号公報に記載の方法と全く
同様にして得ることができる。例えば、特開昭５８−２
１２７８１号公報実施例中項目（６）の方法と全く同様
にして得られたバクテリオファージ１２−２ＤＮＡと、
バクテリオファージλｇｔ御ＥＳ、Ｂ　ＤＮＡ（ヘセス
ダ・リサーチ・ラボラトリイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　・社・製〕に
制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩを反応させて消化物を得
、この消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、連結反応
を行ない、このＤＮＡを用いて、大腸菌、例えば、１１
００に形質導入する。形質導入方法は、例えば、デイ−
・エム・モーリソンＣＤ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）〔メ
ソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第３２６〜３３１
頁（１９７９年）］記載の塩化カルシウム処理法により
形質導入できる。この方法により、大腸菌、例えば、大
腸菌１１００株上でプラークを形成するバクテリオファ
ージ１２−２ＷＥを得ることができる。このバクテリオ
ファージ１２−２ＷＥ及び、バクテリオファージφ８０
〔特開昭５８−２１２７８１号公報実施例中の項目（１
）記載の方法により大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｗ３１１
０（φ８０）　（ＡＴＣＣ３１２７７）から得たもので
ある。］を］特開昭５８−２１２７８１号公報実施例中
項目２）記載の方法と全く同様にして、大腸菌に怒染さ
せてプラークを形成するバクテリオファージ１２−２−
３００　Ｄ　Ｎ　Ａを得ることができる。

次に、被膜蛋白質の遺伝情報部分のみにエンドヌクレア
ーゼ切断部位を有する組み換えバクテリオファージＤＮ
Ａと、後期プロモーター下流域に薬剤耐性マーカーの付
与された、バクテリオファージＤＮＡとを例えば、Ｘｈ
ｏｌ等を用い組み換えることにより被膜蛋白質の遺伝情
報部分のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を有し、かつ
後期プロモーター下流域に薬剤耐性マーカーの付与され
たバクテリオファージＤＮＡを得ることができる。

例えば、上記で得られたバクテリオファージ１２２−３
００ＤＮＡ及びλｃｌｓｓｖｌ１２１−Ｔｃ／ｘｂに制
限酵素Ｘｈｏｌ（宝酒造・社・製）を反応させて、消化
物を常法により得、この消化物をＴ４　ＤＮＡリガーゼ
を用いて、連結反応を行なったのち、前記デイ−・エム
・モーリソン（ＤｌＭ、　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法に
より塩化カルシウム処理した大腸菌、例えば、大腸菌０
０５００３株（凡用大学より人手）を形質転換し、この
菌株上でプラークを形成するバクテリオファージＥＮ５
０１Ｓ−Ｔｃを得ることができる。

このようにして、目的とする被膜蛋白質の遺伝情報部分
のみにエンドヌクレアーゼ切断部位を有し、後期プロモ
ーター下流域に薬剤耐性マーカーの付与されたバクテリ
オファージＤＮＡを得ることができる。

一方、大腸菌由来のＧＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡ
は、例えば、特開昭５９−１９２０８８号公報記載の方
法と全く同様にして組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５
−ｇｓｈＩ　−ＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａとして得ることができ
る。

更に、ＧＳＨ−１を発現させるプロモーターとしては、
如何なるものでもよく、例えば、Ｉａｃプロモーターが
好ましい。以下！ａｃプロモーターを用いた例を述べる
。

組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ　Ｉ・ｎ　
ＤＮＡに、例えば、制限酵素ＰｓｔＩを作用させて消化
し、ＤＮＡ消化物を得る。このＤＮＡ消化物と制限酵素
Ｐｓｔｌで切断したプラスミドＤＮＡ、例えば、ｐＢＲ
３２２Ｄ　Ｎ　Ａを混合したものに、例えば、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを作用させて組み換え体ｐＢＲ３２２−ｇｓ
ｈＩＤＮＡを得ることができる。

次いで、組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈｌ
［ＮＡに、例えば、制限酵素影罰Ｉを作用させて消化し
、ＤＮＡ消化物を得る。このＤＮＡ消化物と均匹Ｉリン
カ−を混合し、これに、例えば、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ
を作用させて、組み換え体プラスミＦ’　ｐＢＲ３２２
−ｇｓｈｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ上で、ＧＳＨ−Ｉ遺伝子の両外
側にＰｓｔｌ切断部位を有する組み換え体プラスミド′
を得る。

このようにしで得られた組み換え体プラスミドを常法、
例えば、塩化カルシウム処理法等により大腸菌、例えば
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００を形質転換して得
た形質転換株から常法、例えば、塩化セシウム密度勾配
超遠心法により純化された組み換え体プラスミドＤＮＡ
を得る。

この純化された組み換え体プラスミドＤＮＡとプラスミ
ドベクター、例えば、ｐＵｃ１９とを混合したものに、
例えば、制限酵素Ｐｓｔｌを作用させて、消化したのち
、このＤＮＡ消化物に、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
作用させ、プラスミドｐＵ（Ｊ９ＤＮＡ上にＧＳＨ−Ｉ
遺伝子を有する組み換え体プラスミドを得る。

次いで、ＧＳＨ，Ｉ遺伝子が複数個、組み込まれた組み
換え体プラスミドを作製する。

先ず、プラスミドベクターＤＮＡ、例えば、ｐＢ１’１
３２２ＤＮＡに、制限酵素ＡａｔＩＩ及び影狸旧を作用
させて消化したのち、プラスミドベクターＤＮＡ上に例
えば、拘狙Ｉ、殉徂Ｉ、影世Ｉ及び）匹Ｉの順で切断部
位を有するような合成りＮＡを、このＤＮＡ消化物に添
加し、例えば、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを作用させ、プラ
スミドベクターＤＮＡ上に、七１１力狙ｌ−５ｔｕＩ−
５ａｃＩの順で切断部位を有するプラスミドベクターＤ
ＮＡを得る。

次いで、このようにして得られたプラスミドベクターＤ
ＮＡに、例えば、制限酵素開通１．５ａｃｌを作用させ
て、消化して、ＤＮＡ消化物を得る。更に、前述で得ら
れたプラスミドｐＵｃ１９　ＤＮＡ上にＧＳＨ−Ｉ遺伝
子を有する組み換え体プラスミドに、ｆｆ１ｌ工ば、Ｐ
ｖｕ　Ｕ　＋　５ａｃｆを作用させて消化したのち、こ
のＤＮＡ消化物に、上記ＤＮＡ消化物を混合し、例えば
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、ＧＳＨＩ遺伝子の
上流に外来の強力なプロモーター、例えばＩａｃプロモ
ーターが乗っており、その両外側に七通Ｉ−力狙１．Ｘ
ｂａｌ−組狙Ｉ切断部位を有する組み換え体プラスミド
を得る。

このようにして得られた組み換え体プラスミドを例えば
、制限酵素Ｘｂａｌ及び力咀１（いずれもベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）を作用させて消化しＤ
ＮＡ消化物を得る。

更に、同じプラスミドに例えば、制限酵素力狙Ｉを作用
させて消化したのち、上記ＤＮＡ消化物を添加し、例え
ば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用させてプラスミド自体の
プロモーター又は、外来プロモーター、例えば、ｌａｃ
プロモーターに発現が制御されているＧＳＨ−１遺伝子
が複数個、例えば２個及びその両外側に、Ｋｇｐｌ切断
部位を有する組み換え体プラスミドＤＮＡを得る。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡ及び上記したバクテリオファージベクターＥＮ５
０１ＳＴｃＤ　Ｎ　Ａを混合し、これに例えば、制限酵
素石Ｉを作用させて消化したものにＴ４　ＤＮＡリガー
ゼを作用させて連結し、種々の組み換え体ＤＮＡを得る
。

このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡの混合
物の中から目的とする組み換え体ＤＮＡを採取するには
次の方法による。

まず、組み換え体ＤＮＡの作製に使用したファージと同
じ付着端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄｓ）及び同じ免疫
（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）をもつテンペレートファージをあ
らかじめ溶原化した大腸菌に、同じ付着端及び同じ免疫
をもち、宿主染色体へのアタッチメントサイト（ａｔｔ
ａｃｈｍｅｎｔ　５ｉｔｅ、溶原化する際に宿主細菌の
染色体と組み換えを起す部位）をもたないテンペレート
ファージを大量に感染させた後に、組み換え体ＤＮＡを
混合し、温度２０〜４０°Ｃに保つことにより組み換え
体ＤＮＡを宿主細菌の菌体内にとり込ませることができ
る（ヘルパー法）。

又上記ヘルパー法の他に塩化カルシウム法等によっても
同様に宿主細菌の菌体内に取り込ませることができる。

更に、得られた種々の組み換え体ＤＮＡをインビトロ・
パッケージング（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎ
ｇ）法〔メンズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第６８巻、第２８１
〜２９８頁、１９７９年、アカデミツク・プレス（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）に記載〕によりλバクテリ
オファージの被膜蛋白質で包みバクテリオファージ粒子
を調製したのち、宿主細菌に感染させることにより組み
換え体ＤＮＡを宿主細菌の菌体内に取り込ませることも
できる。

ここで用いられる宿主細菌は、一般的なに１２株に含ま
れる大腸菌であれば、如何なるものでもよく、例えば、
　ＡＢ１１５７（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔ
ｏｃｋＣｅｎｔｅｒ＋Ｙａｌｅ大学、米国）　　、Ｗ３
１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、Ｗ３３５０　（ＡＴＣ
Ｃ２７０２０）、１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎ
ｓｔｌｌｏｏ（。

西独）等の大腸菌は、特に好適なものということが出来
る。

そして、上記菌株よりテトラサイタリン（以下Ｔｃと略
称する）を含有する培地上で生育し、ＧＳＨ−Ｉ生産能
を有する微生物をスクリーニングすることによりＧＳＨ
−１遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、ＧＳＨ−１生産
能を有するエッシェリシア属に属する微生物を得ること
ができる。また、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）、第２０２巻、第１２７９頁（１９７８年）記載の方
法により純化された組み換え体ＤＮＡを得ることができ
る。

なお、バクテリオファージベクターＤＮＡに挿入するＧ
ＳＨ−１遺伝子を含有するＤＮＡの数は、１個以上、好
ましくは、２〜８個である。

次に、ＧＳ）ｌ−ｎ遺伝子及びＡＣＫ遺伝子を含有する
ＤＮＡ、例えば、大腸菌由来の前記ＤＮＡをバクテリオ
ファージベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡの
調製について述べる。

大腸菌由来のＧＳＨ−１１遺伝子を含有するＤＮＡは、
例えば、特開昭６０−１８０５９２号公報記載の方法と
全く同様にして組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２ｇｓ
ｈ　Ｉｆ　Ｄ　Ｎ　Ａとして得ることができる。

次いで、プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ　Ｕ　ｂ　Ｄ
　Ｎ　Ａに、例えば、制限酵素Ｂａｍ旧及びＨｉｎｄ［
を作用させて消化し、ＤＮＡ消化物を得る。このＤＮＡ
消化断片の単離には、ル復旧及びＨＬｎｄＩ［［処理物
をアガロースゲル電気泳動処理して分離したのち、ゲル
より抽出することによって容易に行なえる〔メソズ・イ
ン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）。

餞、１７６〜１８２　（１９７９）参照〕。単離された
ＤＮＡ断片を、例えば加旧及びＨｉｎｄｌｌ［で処理し
たプラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａと混合する。この
混合物を例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理したのち、
これを用いてカルシウム処理でコンピテント化した大腸
菌由来の株、例えば、１１００株を形質転換する。目的
とするプラスミドＤＮＡを有する菌株は、Ａｐ２０μｇ
／ｍｌを含むＴ−Ｙ培地上で生育し、Ｔｃ２０μｇ／ｍ
ｌを含むＴ−Ｙ培地上で生育しない菌株として容易に選
択できる。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡをＢａｍ旧で処理し、ＤＮＡ消化物断片を得、こ
のＤＮＡ消化物を、例えば、モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１１３
〜１１４Ｌコールド・スプリング・バーバー。

ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）記載の方法と
同様にして消化されたＤＮＡ末端を平滑末端にしたもの
とＥｃｏＲＩリンカ−を混合し、これに、例えばＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させてプラスミドＤＮＡを得る。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡをＤｒａ　ＩＩ及びＥｃｏＲＩで処理し、アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、ＤＮＡ断片を分離したのち
、Ｓｍａ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで処理したプラスミドｐＵ
ｃ１９と混合する。この混合物を例えば、Ｔ４　ＤＮＡ
リガーゼで処理したのち、カルシウム処理でコンピテン
ト化した大腸菌由来の株、例えば大腸菌ＪＭＩＯＩ株に
導入する。目的とするプラスミドＤＮＡを有する菌株は
、Ａｐ　２０ｕｇ／ｒｒｄｌを含有するＴ−Ｙ培地上で
生育し、５−フロモー４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノサイド及び、イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノサイドを含有するＴ−Ｙ培地上
で白いコロニーをつくる菌株として容易に選択できる。

このようにしで、Ｉａｃプロモーターにより発現するＧ
ＳＨ−ｎ遺伝子の両外側にハ１ＬＩＩ［切断部位を有す
る組み換え体プラスミドＤＮＡを得る。

次いで、このようにして得られた、プラスミドＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ切断部位の内側にＡＣＫ遺伝子を導入したプ
ラスミＦ’　Ｄ　Ｎ　Ａの調製について述べる。

ＡＣＫ遺伝子を含有するＤＮＡは、例えば、大腸菌Ｊと
１０１　（ｐＡＫ１２２）　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５３
４）　（微工研菌寄第１５３４号）より組み換え体プラ
スミドｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａとして単離できる。

この組み換え体プラスミドｐＡに１２２ＤＮＡをＰｓｔ
ｌ及びＥｃｏＲＩで処理し、アガロースゲル電気泳動よ
り分離したＤＮＡ消化物断片を、例えば、Ｐｓｔｌ及び
ＥｃｏＲＩで処理したプラスミドＤＮＡ、例えば、ｐＢ
Ｒ３２２と混合したのち、例えば、Ｔ４　ＤＮＡリガー
ゼを作用し、連結反応を行ない、カルシウム処理し、コ
ンピテント化した大腸菌由来の株、例えば、大腸菌１１
００株を形質転換する。目的のプラスミドを含む株は、
Ａｐ２０μｇ／ｍを含むＴ−Ｙ培地上で生育する菌株と
して容易に選択できる。このようにして、プラスミドｐ
ＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ上にＡＣＫ遺伝子を含有する組み
換え体ＤＮＡを得る。

次いで、上述のＰｖｕ　Ｕ切断部位の内側にＩａｃプロ
モーターにより発現するＧＳＨ−１１遺伝子を有するプ
ラスミドＤＮＡをハラ■で処理し、アガロースゲル電気
泳動処理によりＤＮＡ消化物断片を得、上述で得られた
ｐＢＲ３２２上にＡＣＫ遺伝子を含有する組み換え体Ｄ
ＮＡを石■で処理したものと混合し、例えば、Ｔ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼで連結反応を行い、カルシウム処理し、コ
ンピテント化した大腸菌由来の株、例えば、大腸菌１１
００株に導入する。目的の組み換え体プラスミドＤＮＡ
は、Ａｐ２０μｇ／−を含むＴ−Ｙ培地上で生育する株
より単離したプラスミドＤＮＡの内で、ＡＣＫ遺伝子の
みが組み込まれたプラスミドＤＮＡより大きい組み換え
体プラスミドＤＮＡとして検出される。このようにして
、ＥｃｏＲＩ切断部位の両内側に、ＡＣＫ遺伝子とＩａ
ｃプロモーターにより発現するＧＳＨ−Ｉｆ遺伝子を含
む組み換え体プラスミドＤＮＡが調製できる。

一方、バクテリオファージベクターＤＮＡとしては、如
何なるものでもよいが、例えば、後述の実施例項目［５
］　（７）記載のバクテリオファージλＣｌ８ｓｔｌ１
２１ＳΔＲｚＫｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ等が挙げられる。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ＤＮＡ及びバクテリオファージベクターλｃｌｓｓｔ　
１１２１ＳΔＲｚＫｍＤ　Ｎ　Ａを混合し、これに例え
ば、制限酵素ＥｃｏＲＩを作用させて消化したものに、
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを作用させて連結し、種々の組み
換え体ＤＮＡを得る。

このようにして得られた種々の組み換え体ＤＮＡの混合
物の中から目的とする組み換え体ＤＮＡを採取するには
次の方法による。

まず、組み換え体ＤＮＡの作製に使用したファージと同
じ付着端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄｓ）及び同じ免疫
（ｉｍｍｕｎｉ　ｔｙ）をもつテンペレートファージを
あらかじめ溶原化した大腸菌に、同じ付着端及び同じ免
疫をもち、宿主染色体へのアタッチメントサイト（ａｔ
ｔａｃｈｍｅｎｔ　５ｉｔｅ、溶原化する際に宿主細菌
の染色体と組み換えを起こす部位）をもたないテンペレ
ートファージを大量に感染させた後に、組み換え体ＤＮ
Ａを混合し、温度２０〜４０’Ｃに保つことにより組み
換え体ＤＮＡを宿主細菌の菌体内に取り込ませることが
できる　（ヘルパー法）。

又上記ヘルパー法の他に塩化カルシウム法等によっても
同様に宿主細菌の菌体内に取り込ませることができる。

更に、得られた種々の組み換え体ＤＮＡをイン・ビトロ
・パッケージング（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉ
ｎｇ）法〔メソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　　第６８巻、第
２８１〜２９８頁、１９７９年、アカデミツク・プレス
（八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）に記載〕によりλバ
クテリオファージの被膜蛋白質で包みバクテリオファー
ジ粒子を調製したのち、宿主細菌に感染させることによ
り組み換え体ＤＮＡを宿主細菌の菌体内に取り込ませる
こともできる。

ここで用いられる宿主細菌は、−船釣なに１２株に含ま
れる大腸菌であれば、如何なるものでもよく、例えば、
ＡＢ１１５７（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏ
ｃｋＣｅｎｔｅｒ、　Ｙａｌｅ大学、米国）　、Ｗ３１
１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、Ｗ３３５０　（八ＴＣＣ
２７０２０）、　１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎ
ｓｔｌｌｏｏ（。

西独）等の大腸菌は、特に好適なものということが出来
る。

そして、上記菌株より１０μｇ／ｒａｉｌのカナマイシ
ン（以下Ｋｍと略称する）を含有するＴ−Ｙ培地上で生
育し、ＧＳＨ−ＩＩ及びＡＣＫ生産能を有する微生物を
スクリーニングすることによりＧＳＨ■遺伝子及びＡＣ
Ｋ遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージベクタ
ーＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、ＧＳＨ−
Ｉｔ及びＡＣＫ生産能を有するエッシェリシア属に属す
る微生物を得ることができる。

このようにして得られた微生物より純化された組み換え
体ＤＮＡを得るには、例えば、組み換え体ＤＮＡを保有
する溶源菌を、４０〜４５°Ｃ１好ましくは、４２〜４
３°Ｃで１０分以上、好ましくは、１５〜３０分で熱誘
導して培養したのち、例えば、クロロホルム等を添加し
て温度０〜４０″Ｃで１０分〜１時間振盪して宿主細菌
菌体を溶菌し、培地中にバクテリオファージを排出させ
たのち、この培養液を、７．０００〜２０．０００乙ρ
８ｍ、で１０〜３０分間遠心分離処理して菌数を除去し
、例えば、２０．０００〜４０．０００ｒ、ｐ。

ｍ、で１〜３時間超遠心分離処理を行なってバクテリオ
ファージを精製し、更に、このようにして精製されたバ
クテリオファージより、例えば、モレキュラー・クロー
ニング（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コー
ルド・スプリング・バーバー・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
）　、第７６″８５頁（１９８２年）記載の方法等によ
り得ることができる。

なお、バクテリオファージベクターＤＮＡに挿入するＧ
ＳＨ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡの数は、１個以上、
好ましくは、１〜２個であり、ＡＣＫ遺伝子を含有する
ＤＮＡの数は１個以上、好ましくは、１〜２個である。

このようにして得たＧＳＨ−ＩＩ遺伝子及びＡＣＫ遺伝
子を含有するＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡ及び強力なプロモーター
、例えばｌａｃプロモーターにより発現するＧＳＨ−１
遺伝子を含有するＤＮＡをバクテリオファージベクター
ＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを混合し、これに、
例えば、制限酵素ＮｈｅＩを作用させて消化したものに
、例えば、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを作用させて連結し、
種々の組み換え体ＤＮＡを得る。

以下、上記ＧＳＨ−ｎ遺伝子及びＡＣＫ遺伝子を含有す
るＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入し
た組み換え体ＤＮＡを含み、ＧＳＨ−ＩＩ及びＡＣＫ生
産能を有するエッシェリシア属に属する微生物及び該組
み換え体ＤＮＡの調製法と同様にしてＧＳＨ−１遺伝子
を含有するＤＮＡ、ＧＳＨ−Ｉｔ遺伝子及びＡＣＫ遺伝
子を含有するＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グルタチオン生
産能を有するエッシェリシア属に属する微生物を得るこ
とができる。また、例えば、上記ＧＳＨＩ遺伝子を含有
するＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入
した組み換え体ＤＮＡの純化法と同様にして純化された
組み換え体ＤＮＡを得ることができる。

次いで、ＧＳＨｉ遺伝子を含有するＤＮＡ、ＧＳＨ−Ｉ
ｆ遺伝子を含有するＤＮＡ及びＡＣＫ遺伝子を含有する
ＤＮＡをバクテリオファージベクターＤＮＡに挿入した
組み換え体ＤＮＡを含み、グルタチオン生産能を有する
エンシエリシア属に属する微生物を、該組み換え体Ｄ’
ＮＡの自己複製が誘発されない条件下、例えば、温度３
０〜３５°Ｃで２〜２４時間培養する。

このときの培地は、−船釣な細菌培養培地が用いられ、
例えばＴ−Ｙ培地が好ましい。

次いで、例えば、ヒートインダクション（温度４０〜４
５°Ｃ）　、ＵＶ処理又はマイトマイシン添加等を行う
ことにより該組み換え体ＤＮＡの自己複製を誘発した後
、更に宿主菌の増殖できる温度で培養する。

このときの温度は必ずしも該組み換え体ＤＮＡの自己複
製を誘発する温度を維持する必要はなく、宿主菌の増殖
できる範囲内の温度を適宜選択して採用することができ
る。

このようにして新規な組み換え体ＤＮＡの自己復製を誘
発したのち、例えば、２〜６時間培養して培養物を得る
。

次に、グルタチオンの製造について述べる。

このようにして培養物より菌体を集めて、−度０．８５
％の生理的食塩水で洗浄後、水懸濁液として、これを１
００°Ｃの沸とう水中で１〜１０分、好適には１分処理
することにより大腸菌菌体内のグルタチオンを抽出でき
る。また、上記培養後の菌体を集菌した後、該菌体を以
下に述べるような処理をし、これをグルタミン酸、シス
ティン、グリシン、マグネシウムイオン、ＡＴＰ及び、
アセチルリン酸と反応せしめることによりグルタチオン
を製造することができる。このような菌体処理物として
は、菌体の有機溶媒処理物、界面活性剤処理物、菌体の
超音波破砕物、超音波処理後に遠心で得られる無細胞抽
出液あるいは、適当な担体に固定した菌体、あるいは酵
素が挙げられる。この場合、利用できる有機溶媒として
は、アセトン、トルエン、エーテルなど、界面活性剤と
しては、トリトンＸ１００、ドデシル硫酸、セチルトリ
メチルアンモニウムプロミドなどが利用される。また、
菌体、あるいは酵素の固定化にはポリアクリルアミドゲ
ル、アルギン酸ゲル、光硬化樹脂などの他ＤＥＡＥ−セ
ルロース、ＤＥＡＥ−セファデックス等も担体として用
いることができる。

グルタチオン生成反応は、酵素含有物を５〜１６０ｍＭ
のグルタミン酸、５〜８０ｍＭのシスティン、５〜１０
０ｍＭのグリシン、１〜３０ｍＭのマグネシウムイオン
、０．０１〜２０ｍＭのＡＴＰ、２００〜ＯｍＭのアセ
チルリン酸を含む反応液で、２０’Ｃ〜４０°Ｃ（好適
には３７°Ｃ）、また反応ｐＨは６〜９　（好適には７
．５）で数時間接触させることによって行える。

上記の様にして、抽出あるいは反応液中に生成したグル
タチオンは、通常のイオン交換樹脂のカラムで容易に単
離される。まず抽出液あるいは反応液のｐＨを硫酸で３
．０に合わせた後、これをカチオン交換樹脂、例えばダ
イアイオンＰＫ−２２８Ｈ”に導通し、０．５Ｍの水酸
化アンモニウムで溶出する。この溶出液のｐＨを硫酸で
４．５に合わせた後、アニオン交換樹脂、例えばデオラ
イトＡ２（ＣＨ３ＣＯＯ型）に導通する。吸着したグル
タチオンを０．５Ｍ硫酸で溶出後、エタノールを５０％
になるように添加することによって結晶グルタチオンを
単離取得できる。

〔発明の効果］ 以上の如く本発明によれば、ＡＴＰをＡＤＰに変換して
生理活性物質を合成せしめる酵素をコードする遺伝子を
含有するＤＮＡ　（例えばグルタチオンの場合、ＧＳＨ
−Ｉ遺伝子を含有するＤＮＡ。

ＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡ）及びＡＣＫ遺伝
子を含有するＤＮＡをハタテリオファージベクターＤＮ
Ａに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、この組み換え体を
エッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する
微生物に含ませた生理活性物質（例えばグルタチオン）
生産能を有する微生物を培地に培養し、アセテート・カ
イネースの生産量を増強せしめることにより培養物より
生理活性物質（例えばグルタチオン）を高収率で採取す
るか、もしくはＴ−グルタミル−Ｌ−システィン合成酵
素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ、グルタチオン
合成酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ及びアセ
テート・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤＮ
ＡをヘクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み
、グルタチオン生産能を有するエッシェリシア属に属す
る微生物を培地に培養して得られる、微生物菌体及び／
又は菌体処理物をグルタミン酸、システィン、グリシン
、アデノシン−５′−３リン酸、アセチルリン酸及びマ
グネシウムイオンと接触作用させ、グルタチオンを生成
せしめると従来法と比較してＡＴＰを低減することがで
き、更に、高収率にグルタチオンを生産することができ
るので本発明は極めて有用である。

〔実施例〕

以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
。

［１］組み換え体プラスミドｐｃｓｌ１０２のＤＮＡ調
製組み換え体プラスミドｐＢＲ３２５−ｇｓｈ　Ｉ　・
Ｉｆ　Ｄ　Ｎ　Ａを保持する大腸菌ＲＣ９１２（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ　ＲＣ９１２）　（ＦＥＲＭＢＰ−３３７）より
組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２ｇｓｈ　　１・ＩＩ
ＤＮＡ（特公平１−４２６７２号公報記載）をテイ−・
マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モレ
キュラー９クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリイ（（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、第８６〜９６頁（１９８２年
）］記載の方法により精製単離し、ＤＮＡ１■を得た。

この組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｉ・
ｌＩＤＮＡ３８ｇをＰｓｔｌ（ベーリンガー・マンハイ
ム・山之内・社・製）５ユニツトを混合し、温度３７°
Ｃで１時間消化したものを、常法によりアガロースゲル
電気泳動処理し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を
含むゲルを切り出し、これを透析チューブに詰め、再度
電気泳動処理し、ゲル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外
に出し、２μｇのＧＳＨ−■遺伝子を含むＤＮＡ断片ｇ
ｓｈＩｐを得た。

次いで、プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　１μｇを
均１１５ユニットと混合して温度３７°Ｃで１時間消化
したものに上記の如（して得られたＤＮＡ断片ｇｓｈｒ
ｐｔμｇを添加し、温度１６°Ｃで１２時間反応させて
連結し、プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ上にＧＳＨ
−■遺伝子を保持する組み換え体プラスミ）”ｐＢＲ３
２２ｇｓｈｌＤＮＡを得た。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａを用い、塩化カ
ルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００　
（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−１ｎｓｔｉｔｕｔｅ、西独、ハ
イデルベルグより入手）を、ジェイ・バクチリオル（Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、）、第１１９巻、第１０７２
−１０７４頁（１９７４年）に記載の方法により形質転
換し、２μｇ／ｒｄのアンピシリン（以下、Ａｐと略称
する。）を含むＴ−Ｙ培地上で生育するが、テトラサイ
クリン（以下、Ｔｃと略称する。）を２０μｇ７ｍｌを
含むＴ−Ｙ培地上では生育できない形質転換株、すなわ
ち大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）１１００（ｐＢＲ３２２−
ｇｓｈＩ）を得た。

次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＢＲ３２
２−ｇｓｈｌ）から組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２
−ｇｓｈ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａを上記の方法により精製単離
し、ＤＮＡ１ｍｇを得た。

この組み換え体プラスミドρＢＲ３２２−ｇｓｈｌ　Ｄ
　Ｎ　Ａ５μｇヲ５ｔｕＩ（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）５ユニツトと混合し、温度３７°Ｃ
で１時間消化したのち、常法によりフェノール処理およ
びエタノール沈澱処理を行って得た沈澱物を２０μｌの
水に溶解し、これをモレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第１１３〜１１
４頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）（１９８２年）記載の方法に従って大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのフレノウ・フラグメント（Ｋｌｅ
ｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮ
Ａｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　）　（全酒造・社・製）
を用いて処理し、更にＰｓｔｌ　リンカ−１０ｕｇを添
加し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイ
ム・山之内・社・製）１ユニツトを温度１６°Ｃで１６
時間作用させて組み換え体Ｄ　Ｎ　ＡｐＢＲ３２２−ｇ
ｓｈ　Ｉ上でｇｓｈ　Ｉ遺伝子の両側にＰｓｔｌ切断部
位を有する組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ
　Ｉ　ｐ　Ｄ　Ｎ　Ａを得た。

この組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｉ　
ｐ　Ｄ　ＮＡを用い塩化カルシウム処理した前記大腸菌
１１００（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓｔｌｌｏｏ（、
西独−ハイデルベルグより入手）を、ジェイ・バクチリ
オル・（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）第１１９巻、第１０
７２〜１０７４頁（１９７４）に記載の方法により形質
転換し、２μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）を含むＴ
−Ｙ培地上で生育するが、テトラサイクリン（Ｔｃ）を
２０μｇ／ｍｌを含むＴ−Ｙ培地上では生育できない形
質転換株、すなわち、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｉ　ｐ）を得た。

（２）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＨｃ１９
−ｇｓｈ　Ｉ　ｋｐ）の調製 次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＢＲ３２
２−ｇｓｈ　Ｉ　ｐ）から組み換え体プラスミドｐＢＲ
３２２−ｇｓｈ　Ｉ　ｐ　Ｄ　Ｎ　Ａを項目［１］　（
１）記載の方法により精製単離し、ＤＮＡ１■を得た。

このようにして得た組み換え体プラスミドρＢＲ３２２
−ｇｓｈ　Ｉｐ　ＤＮＡ　５　ｕｇをＰｓｔｌ（ベーリ
ンガー・マンハイム・山之内・社・製）５ユニツトと混
合し、これを温度３７°Ｃで１時間消化したものを、常
法によりアガロースゲル電気泳動処理し、ＤＮＡ断片を
得た。

このＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、これを透析チュ
ーブに詰め、再度電気泳動処理し、ゲル中に存在するＤ
ＮＡ断片をゲル外に出し、２μｇのＧＳＨ−Ｉ遺伝子を
含むＤＮＡ断片ｇｓｈ　Ｉ　ｐｐを得た。

次いで、プラスミドｐＵｃ１９　ＤＮＡ　（宝酒造・社
・製）　　ｌ　ｕｇヲＰｓｔｌ（ヘーリンガー・マンハ
イム・山之内・社・製）５ユニツトと混合して温度３７
°Ｃで１時間消化したものに上記の如くして得られたＤ
ＮＡ断片ｇｓｈＩｐｐｌμｇを添加し、更に、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ１ユニットを添加し、温度１６°Ｃで１２時
間反応させて連結し、プラスミドｐＵｃ１９　ＤＮＡ上
にＧＳＨ−１遺伝子を保持する組み換え体プラスミドｐ
Ｕｃ１９−ｇｓｈ　Ｔ　ｋｐ　Ｄ　Ｎ　Ａを得た。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＵｃ１９−ｇｓｈ　Ｉ　ｋｐ　Ｄ　Ｎ　Ａを用い、塩
化カルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯ
Ｉ　　（宝酒造■より購入〕を前記項目［１］　（１）
記載の方法により形質転換し、２０μｇ／ｍｌのＡｐを
含むＴ−Ｙ培地上で生育し、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイドおよび
イソプロピル−β−チオガラクトピラノサイドを含有す
るＴ−Ｙ培地上で白いコロニーをつくる形質転換株、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＵｃ１９−ｇｓｈ
　Ｉ　ｋｐ）を得た。

（３）プラスミドベクターｐＢＲ３２２Ｌ−ＡａＢのＤ
ＮＡの作製 プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒造・社・製
）１８ｇをＡａｔＩＩ　　（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）２ユニツト、及びＢａｍＨＩ　（ベ
ーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）２ユニツト
と混合し、温度３７°Ｃで１時間消化したのち、常法に
よりフェノール処理及びエタノール沈澱処理を行なって
得た沈澱物を１７μ！の水に溶解し、これにＤＮＡ合成
機〔ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）・社・製〕を用いて
合成した、５　’　ＣＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＧＴＡＧＧ
ＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧ３　’の２６塩基のオリゴヌクレ
オチド、及び５’　ＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣ
ＴＡＣＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＴ３’の３４塩基
のオリゴヌクレオチドを夫々０．３μｇ添加し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ユニットを温度２０°Ｃで１６時間作用
させてプラスミドＤＮＡ上に、幻＋１［、七通■、力狙
■Σｔｕｌ、　５ａｃＩ及びＢａｍＨＩ切断部位を有す
るプラスミドｐＢＲ３２２Ｌ−＾ａＢＤＮＡを得た。

このプラスミドＤＮＡを用いて、塩化カルシウム処理し
た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　１１００を前記項目［１
］（１）記載の方法により形質転換し、テトラサイタリ
ン（Ｔｃ）を２０μｇ／ｒｔｄｌを含むＴ−Ｙ培地では
生育できず、アンピシリン（Ａ　ｐ）　２０　ｕ　ｇ／
　ｍｌを含むＴ−Ｙ培地では生育する形質転換株、大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００　（ｐＢＲ３２２Ｌ−八
ａＢ）を得た。

このようにして得た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００
（ｐＢＲ３２２Ｌ−八ａＢ）からプラスミドｐＢＲ３２
２Ｌ−ＡａＢ　Ｄ　Ｎ　Ａを、項目［１］　（１）記載
の方法により精製単離し、ＤＮＡ　１　ｍｇを得た。

（４）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００（ｐＧｓｌｌ
ｏｌ）の調製項目［１］　（２）記載により得られた組
み換え体プラスミドｐＵｃ１９−ｇｓｈｌｋｐＤＮＡ２
　ｕｇ　ＸＰｖｕＩ［（ベーリンガー・マンハイム・山
之内・社・製）■ユニット及び５ａｃｌ　（ベーリンガ
ー・マンハイム・山之内・社・製）１ユニントを１０ｍ
Ｍ　）リス−ＦＩＣＩ　（ｐＨ７，５）　／　１０ｍＭ
　ＭｇＣ１ｚ／　１ｍＭジチオエリスリトール１５０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１を含有する溶液２０μρ中で、温度３７°
Ｃで１時間反応させたのち、常法によりアガロースゲル
電気泳動処理を行ってＤＮＡ断片を分離し、該ＤＮＡ断
片を含有するゲルを切り出したものを、透析チューブに
詰め、再度電気泳動処理を行ない、ゲル中に存在するＤ
ＮＡ断片をゲル外に出し、ＧＳＨ−１遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片ｇｓｈ　Ｉ　ｐｓ　０．６μｇを得た。

次いで項目［１］　（３）記載で得られたプラスミドｐ
ＢＲ３２２Ｌ−＾ａＢＤＮＡ１μｇを５ｔｕＩ（ベーリ
ンガー・マンハイム・山之内・社・製）１ユニツト及び
５ａｃＩ　１ユニツトを、１０ｍＭ　）リス−〇ＣＩ　
（ｐ　Ｈ７，５）　／１０ｍＭ　ＭｇＣｈ／　１ｍＭジ
チオエリスリトールを含有する溶液２０μ！中で温度３
７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェノール
処理及びエタノール沈澱処理を行なって得た沈澱物を２
０μｌの水に溶解し、上述の如くして得られたＤＮＡ断
片ｇｓｈ　Ｉ　ｐｓｏ、５μｇ及びＴ４　ＤＮＡリガー
ゼ１ユニ、ットを夫々添加し、温度１６°Ｃで１２時間
作用させ組み換え体プラスミドｐＧｓ１１０１　Ｄ　Ｎ
　Ａを含有する種々の組み換え体プラスミドＤ　Ｎ　Ａ
　１．０μｇを得た。

次いで、このプラスミドＤＮＡを用いて、塩化カルシウ
ム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００を前記項
目［１］　（１）記載の方法により形質転換し、２０μ
ｇ／ｄＡｐを含有するＴ−Ｙ培地上で生育する形質転換
株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００（ｐＧｓｌｌｏ
ｌ）を得た。

（５）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＧｓ１１０
２）の調製次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（
ｐＧｓｌｌｏｌ）から組み換え体プラスミドｐＧｓ１１
０１　ＤＮＡを項目［１］（１）記載の方法により精製
単離し、ＤＮＡ０．９■を得た。

このようにして得た組み換え体プラスミドρＧ５１１０
１ＤＮＡ６μｇ、珈Ｉ　３ユニツト及び鋤Ｉ（いずれも
ヘーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）３ユニツ
トを、５０１ＴＩＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ７，５）／１
０ｍＭ　ＭｇＣｌ２／　１ｍＭジチオエリスリトール／
１００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する溶液６０μｌ中で、温
度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりアガロ
ースゲル電気泳動処理を行なってＤＮＡ断片を分離し、
該ＤＮＡ断片を含有するゲルを切り出したものを、透析
チューブに詰め、再度電気泳動処理を行ない、ゲル中に
存在するＤＮＡ断片をゲル外に出し、ＧＳＨ−Ｉ遺伝子
を含有するＤＮＡ断片ｇｓｈ　Ｉ　（Ｉａｃ−Ｐ）ｘｓ
２μｇを得た。

次いで、ｐＧｓｌｌｏｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１μｇ及び鋤Ｉ
　１ユニツトを、５０１ＩＩＭトリスーＨＣｌ　（ｐ　
Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１ｍＭジチオ
エリスリトール／１００ｍＭ　ＮａＣｌを含有する溶液
２０μ！中で温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常
法によりフェノール処理及びエタノール沈澱処理を行な
って得た沈澱物を２０μ２の水に溶解し、上述の如くし
て得られたＤＮＡ断片ｇｓｈ　１（ｌａｃ−Ｐ）ｘｓ　
２　ＩＩ　ｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットを夫々
添加し、温度１６°Ｃで１２時間作用させ組み換え体プ
ラスミドｐＧｓ１１０２　ＤＮＡを含有する種々の組み
換え体プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　２．０μｇを得た。

この組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて、塩化カルシ
ウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００を項目
［１］　（１）記載の方法により形質転換し、Ａｐ２０
μｇ／１ａｌｌを含有するＴ−Ｙ培地で生育する形質転
換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＧｓ１１０
２）を分離した。

このようにして得た形質転換株より組み換え体プラスミ
ドＤＮＡをニュークレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、第７巻
、第１５１３〜１５２３頁に記載のアルカリ抽出法によ
って単離し、アガロース電気泳動で検出し、検出される
組み換え体プラスミドＤＮＡのうちＧＳＨ−Ｉ遺伝子が
２個組み込まれた組み換え体プラスミドは、ＧＳＨ−１
遺伝子が１個組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮＡ
より大きい組み換え体プラスミドＤＮＡとして検出され
る。すなわち、アガロース電気泳動において泳動距離の
短い組み換え体プラスミドＤＮＡとして検出される。こ
のようにして上皿Ｉ切断部位の内側にラクトース・プロ
モーターにより発現するＧＳＨ−１遺伝子を２個含む組
み換え体プラスミドｐＧｓ１１０２　Ｄ　Ｎ　Ａを得た
。

（６）組み換え体プラスミドｐＧｓ１１０２　ＤＮＡの
単離 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００（ｐＧｓ１１Ｑ２）
から項目［１］（１）記載の方法により組み換え体プラ
スミドｐＧｓ１１０２ＤＮＡ０．７■を得た。

［２１バクテリオフアージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃの育種（
１）バクテリオファージλＣｌｌ５７１１２１の育種特
開昭５８−２１２７８１号公報記載の実施例と全く同様
にしてバクテリオファージλｃｌａｓ７１１２１　　［
このファージは、このファージを常法により大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）１１００　（Ｍａｘ−Ｐｌａｎｋ−Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ西独、ハイデルベルグより入手）に溶原化
して得られる溶源菌、すなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ　１１０
０（λＣｌＢ５？１１２１）　（微工研条寄第１３３号
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１３３））として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。］を調製し、このバ
クテリオファージλＣｌＢ５？１１２１から、ティー・
マニアテス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法［モレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、第７６〜８５頁（１９８２年）〕の方法によ
り、バクテリオファージλｃｌａｓ７１１２１のＤＮＡ
を得た。

（２）バクテリオファージλｃＩａｓ７１１２１−Ｔｃ
／ｘｂの育種 次いで、このようにして得たバクテリオファージλＣｌ
Ｂ５７Ｌ１２１のＤＮＡ１μｇ及び１０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩ　（宝酒造・社・製）を５０ｍＭ　トリス−塩酸
緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１及びｌＯＩＭＭ　ＭｇＳ
Ｏ４含有、ｐ　Ｈ７，４）中で温度３７°Ｃで１時間反
応させたのち、常法によりフェノール抽出及びエタノー
ル沈澱を行ないバクテリオファージλＣｌ１１５７１１
２１　Ｄ　Ｎ　ＡのＥｃｏＲＩ消化物０．８μｇを得た
。

一方、プラスミドｐＫＮ２０６　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃティー
・マスダ（Ｔ、Ｍａｓｕｄａ）等、アクリ。パイオル、
ケム、（Ａｇｒｉ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、第５０巻、第２７１〜２７
Ｂ頁（１９８６）記載の方法により得たものである。］
　１１８ｇびハｔｕ■（全酒造・社・製）１０ユニツト
を、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ１，
１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４及び１ｍＭジチオスレイトール含
有、ｐＨ７，４）中で、温度３７°Ｃで２時間反応させ
たのち、常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱
を行ないプラスミドｐＫＮ２０６ＤＮＡのＰｖｕ　ＩＩ
消化物０．８μｇを得た。

次いで、プラスミドｐＫＮ２０６　Ｄ　Ｎ　ＡのＰｖｕ
　Ｉｆ消化物０．８μｇ１５′末端をリン酸化したＥｃ
ｏＲＩリンカ−〔二ニー・イングランド・バイオラプス
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　　・社
・製］１μｇ及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー
・マンハイム・山之内・社・製）１ユニツトを、６６ｍ
Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（６，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１
０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡＴＰ含有、ｐ
Ｈ７，５）中で、温度４°Ｃで２００時間反応せてプラ
スミドｐＫＮ３０６　Ｄ　Ｎ　Ａ　０．８μｇを得た。

このようにして得たプラスミドｐＫＮ３０６　Ｄ　Ｎ　
Ａでデイ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ）の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、
第３２６〜３３１頁（１９７９年）〕により塩化カルシ
ウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＨｌ　（ＡＴＣ
Ｃ３３８４９）株を形質転換し、大腸菌Ｄ）Ｉ　１　（
ｐＫＮ３０６）を得た。

前記項目［１］　（１）と全く同様にしてプラスミドｐ
ＫＮ３０６　Ｄ　Ｎ　Ａ　１２００μｇを得、このＤＮ
Ａ断片３ｇ及びＥｃｏＲＩ　（全酒造・社・製）５０ユ
ニツトを、５０１トリス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　Ｎ
ａＣ１及び１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ含有、ｐＨ７，４）中
で温度３７°Ｃで２時間反応させたのち、アール・シー
・エイ・ヤング（Ｒ，Ｃ，＾、Ｙａｎｇ）等の方法〔メ
ソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ　ｔｈｏｄｓｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、第６８巻、第１７６〜１
８２頁（１９７９年））により、テトラサイクリン耐性
遺伝子を含有する２、３ＫｂのＤＮＡ断片３．５μｇを
分取した。

上記２．３ＫｂのＤＮＡ断片１μｇ、合成した５′ｐＡ
ＡＴＴＧＴＣＴＡＧリンカ−（ベックマン・社・製のＰ
ＬＵＳＩＤＮＡ合成機により合成したものである。）１
μｇ、　ＥｃｏＲＩで切断したバクテリオファージλＣ
ｌ１１５７１１２１ＤＮＡ１μｇ及びＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）１２
ユニツトを、６６ｍＭ　＋−リス−塩酸緩衝液（６，６
ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１０ｍＭジチオスレイトール及び１
０ｍＭＡＴＰ含有、ｐＨ７，５）中で温度４°Ｃで２０
０時間反応せ、得られたＤＮＡで、塩化カルシウム処理
した大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）１１００を、前記デイ−・エム・モーリソン
（Ｄ。

Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法により形質転換して、大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００　（λｃＩａｓ７１１２
１−Ｔｃ／ｘｂ）を得た。

（３）バクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃの育種大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００　（λｃｌｓｓ７１１２
１−Ｔｃ／ｘｂ）から、ティー・マニアティス（Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）等の方法〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第７６〜
８５頁（１９８２年）］により得られたバクテリオファ
ージλｃＩｅｓ７１１２１−Ｔｃ／ｘｂＤ　ＮＡ　２　
μｇ及びＸｈｏ　１（全酒造・社・製）１０ユニントを
５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ
及び１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｎ含を、ｐＨ７，４）中で混合
し、温度３７“Ｃで１時間反応させたのち、常法により
フェノール抽出及びエタノール沈澱を行い、バクテリオ
ファージλｃＩａｓｔｌｉ２１−Ｔｃ／ｘｂＤＮＡのＸ
ｈｏｌ消化物１．６μｇを得た。

一方、特開昭５８−２１２７８１号公報記載の実施例中
項目（６）の方法と全く同様にして得られたバクテリオ
ファージ１２−２Ｄ　Ｎ　Ａ　１μｇ、バクテリオファ
ージλｇｔ　ＷＥＳ・λＢＤＮＡ　Ｃベセスダ・リサー
チ・ラボラトリイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒい°社・製］１μｇ及びＥｃｏ
ＲＩ（全酒造・社・製）　１０ユニツトを５０ｍＭ　ト
リス−塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１及び１０ｍＭ
　Ｍｇ５Ｏａ含有、ｐＨ７，４）中で、温度３７°Ｃで
１時間反応させたのち、常法によりフェノール抽出エタ
ノール沈澱を行ない消化物１．６μｇを得た。

このようにして得た消化物１．６μｇ及びＴ４　ＤＮＡ
リガーゼ１ユニツトを６６ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（
６，６ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭジチオスレイトール
及び１０ｍＭＡＴＰ含有、ｐＨ７，５）中で温度４°Ｃ
で１６時間反応させ、得られたＤＮＡで、塩化カルシウ
ム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００を、前記デ
イ−・エム・モーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）
の方法により形質転換し、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１
１００上でプラークを形成するバクテリオファージ１２
−２ＷＥを得た。

上述の如くして得られたバクテリオファージ１２２ＷＥ
及びバクテリオファージφ８０〔特開昭５８−２１２７
８１号公報実施例中の項目（１）記載の方法により大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０）　（ＡＴＣＣ
３１２７７）から得た〕を特開昭５８−２１２７８１号
公報実施例中項目（２）記載の方法により大腸菌１１０
０に感染させて溶菌液を得、この溶菌液を、溶源菌であ
る大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｗ３１１０（φ８０）　（Ａ
ＴＣＣ３１２７７）に感染させ、プラークを形成するバ
クテリオファージ１２−２−３００を得た。

次いで、バクテリオファージ１２−２−３００から、前
述したティー・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）
等の方法により調製したバクテリオファージ１２−２−
３００　ＤＮＡ２μｇ及び祖用１２０ユニツトを、５０
ｍＭ　ｌ−リス塩酸緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣ１及び
１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４含有、ｐＨ７，４）中で温度３７
°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりフェノール抽
出及びエタノール沈澱を行ない消化物１．６μｇを得た
。

前記したバクテリオファージ１２−２−３００　Ｄ　Ｎ
　ＡのＸｈｏｌ消化物１μｇ、上述したバクテリオファ
ージλｃｌａｓ、１１２１−Ｔｃ／ｘｂＤ　Ｎ　ＡのＸ
ｈｏＩ消化物ｌｕｇ及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ１ユニツ
トを６６ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（６，６ｍＭ　ＭｇＣ
Ｉｚ、１０ｍＭジチオスレイトール及び１０ｍＭＡ　Ｔ
　Ｐ含有、ｐＨ７，５）中で温度１６°Ｃで１６時間反
応させたのち、得られたＤＮＡで前記デイ−・エム・モ
ーリソン（Ｄ、Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）の方法により塩
化カルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＱＤ５０
０３　（天川大学より入手）を形質転換し、大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌ　１）００５００３株上でプラークを形成する
バクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃを得た。

［３］バクテリオフアージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃのコート
蛋白質製造の遺伝子情報部分に存在するエンドヌクレア
ーゼ切断部位にＧＳＨ−Ｉ遺伝子断片を翻訳に必要なり
ＮＡ配列の制御下に挿入した組み換え体バクテリオファ
ージλＥＮ５０１Ｓ−ＧＩ　（ｌａｃＰ）　２の作製項
目［２］　（３）で得られたバクテリオファージ巳５０
１Ｓ−Ｔｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１０　ＩＩ　ｇおよび項目［
１］　（６）で得られた組み換え体プラスミドｐＧｓ１
１０２　ＤＮＡ３０μｇを混合し、これを１０ｍＭトリ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）／１０ｍＭＭｇＣ１□７１ｍ
Ｍジチオスレイトールの組成の溶液５０μｌに添加し、
更に、５０ユニツトの跡■（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）を添加し、温度３７゛Ｃで２時間作
用させたのち、常法によりフェノール抽出及びエタノー
ル沈澱して沈澱物を得、これを５０ｍＭ　）リス−ＨＣ
ｌ　（ｐ　Ｈ７，４）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２／
　１０ｍＭジチオスレイトール１０．１ｍＭ　Ａ　Ｔ　
Ｐの組成の溶液８μｌに添加し、更に、２ユニツトのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（ヘーリンガー・マンハイム・山之内
・社・製）を添加し、温度４°Ｃで１８時間作用させて
連結反応を行なった。

得られたＤＮＡｌ０μｇをイン・ビトロ・パッケージン
グ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋｅｇｉｎｇ）法〔メソ
ズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第２８１〜２９８
頁、１９７９年、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）に記載）により、λバクテリオファ
ージの被覆蛋白質で包み、バクテリオファージ粒子を調
製し、このファージ粒子溶液５０μｌに、前記大腸菌１
１００（１０９／戒、０．５μりを加え、温度３０”Ｃ
で３時間装置したのち、これを０．１５μｇ／ｌｉｎの
テトラサイタリン（Ｔｃ）を含む寒天培地上に撒き、温
度３２°Ｃで４８時間培養し、Ｔｃ耐性の菌株を選択す
ることにより溶源菌を得た。

この溶源菌を夫々Ｔ−Ｙ培地を用いて温度３２°Ｃで１
６時間振盪培養し、培養液０．５　ｍｌを１５Ｍ容三角
フラスコ中の１０ｒｎｌのＴ−Ｙ培地に接種し、クレッ
ト・ユニツク（Ｋｌｅｔｔ　ｕｎｉｔｓ）が約１００に
なったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５分間振
盪したのち、再度温度を３２°Ｃに降下させて約３時間
振盪を続けた。

このようにして得た培養液のうちｌｄを超音波破砕処理
したものを細胞抽出液とし、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・マイクロバイオロジー（Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、第１２８巻、第１０
４７〜１０５２頁（１９８２年）記載の方法に従い、Ｇ
ＳＨ−１の酵素活性を測定し、活性の高い株を選択した
。この活性の高い溶源菌をｌ０Ｉｎ１のＴ−Ｙ培地を用
い温度３２°Ｃにてクレット・ユニツク（Ｋｌｅｔｔ　
ｕｎｉｔｓ）が約１００になるまで振盪培養したのち温
度４３°Ｃで２０分間加温し、更に温度３７°Ｃで３時
間振盪して培養液を得、該培養液よりそれと等容量のフ
ェノール・クロロホルム混合溶媒を用いてＤＮＡを抽出
し、得られたＤＮＡをエタノール沈澱を行ってＤＮＡを
得た。

このようにして得られたＤＮＡをトリス−塩酸緩衝？Ｆ
９．（ｐ　Ｈ７，５）　／　１ｍＭ　ＥＤＴＡ組成の溶
液２０μ２に溶解し、該溶液４μｌを、１０ｍＭ　）　
’）スー塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　
ＭｇＣ１ｚ／　１ｍＭジチオエリスリトールの組成の溶
液３０μ！に添加したものに、更に、１０ユニントの栴
頃１　（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）
を添加し、温度３７°Ｃで２時間消化し、アガロース電
気泳動処理し、ＤＮＡ断片の大きさを分断した。

その結果、ＧＳＨ−１高活性の溶源菌は、約４゜ＩＫｂ
ｐのｐＧｓ１１０２由来のＤＮＡ断片を保持していた。

以上の如くして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ＥＮ
５０１Ｓ−ＧＩ（ｌａｃＰ）２）を分離し、組み換え体
バクテリオファージＥＮ５０１Ｓ−Ｇｌ　（ｌａｃＰ）
　２の作製を行なった。

し４１組み換え体プラスミドｐＡＫ３２３　Ｄ　Ｎ　Ａ
の調製（１）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００　（ｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈｌｌｂｈ）の調製 組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　ＩＩ　ｂ
　Ｄ　Ｎ　Ａを保持するエッシェリシア・コリＲＣ９１
２（Ｅ、ｃｏｌｉ　ＲＣ９１２）（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３
３６）より組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ
ＩＩｂＤＮＡ（特開昭６０−１８０５９２号公報記載）
を、項目［１］　（１）記載の方法により精製単離し、
組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｕ　ｂ　
Ｄ　Ｎ　Ａ　１■を得た。

この組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｕ　
ｂ　Ｄ　ＮＡ２８ｇ、　ＢａｍＨＩ　１ユニツト及びＨ
ｉｎｄＩＩ［（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社
・製）１ユニツトを、５０ｍＭ　トリス−ＦＩＣＩ　（
ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／　１ｍＭ
ジチオスレイトール／１００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する
溶液２０μ！中で、温度３７°Ｃで１時間反応させたの
ち、常法によりアガロースゲル電気泳動処理を行なって
ＤＮＡ断片を分離し、該ＤＮＡ断片を含有するゲルを切
り出したものを、透析チューブに詰め、再度電気泳動処
理を行ない、ゲル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外に出
し、Ｃ，５Ｈ−Ｉ［遺伝子を含有するＤＮＡ断片ｇｓｈ
ＩＩｂｈｏ、　６　ｔｔｇを得た。

次いで、プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５μ
ｇ、貼馴８１１ユニット及びＨｉｎｄＩＩ［１ユニツト
を、５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，５）　／
　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／　１ｍＭジチオスレイトール
／１００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する溶液２０μ！中で温
度３７゛ｃで１時間反応させたものに、上述の如くして
得られたＤＮＡ断片ｇｓｈ　ＩＩ　ｂｈ　０．５μｇ及
びＴ４ＤＮＡリガーゼｌユニットを夫々添加し、温度１
６°Ｃで１２時間作用させ組み換え体プラスミドｐＢＲ
３２２ｇｓｈＩＩｂｈＤＮＡを含有する種々の組み換え
体プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　０．８μｇを得た。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｉ［ｂｈ　Ｄ　Ｎ　Ａを用い、
塩化カルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１
００を、項目［１１（１）記載の方法により形質転換し
、２０μｇ／ｍｌのＡｐを含有するＴ−Ｙ培地上で生育
し、かつ、Ｔｃ２０μｇ／ｍ１を含有するＴ−Ｙ培地上
で未生育の形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１
００　（ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　ＩＩ　ｂｈ）を得た。

（２）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００　（ｐＢＲ３
２２−ｇｓｈ　ＩＦ　ｅ）の調製 次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　１１００　（ｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈ　Ｉ［ｂｈ）から項目［１］　（１）
に記載の方法により組み換え体プラスミドｐＢＲ３２２
−ｇｓｈ　ＩＩ　ｂｈ　Ｄ　Ｎ　Ａを精製単離してＤＮ
Ａ１■を得た。

このｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　Ｉ［ｂｈＤ　Ｎ　Ａ　１μ
ｇ、ＢａｍＨＩ　２−１−・ントを、５０ｍＭ　）リス
−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣ１
ｚ／１ｍＭジチオエリスリトール／１００ｍＭ　ＮａＣ
１を含有する溶液２０μ！中で温度３７°Ｃで１時間反
応させたのち、常法通り、フェノール処理及びエタノー
ル沈澱を行ない、得られた沈澱物を２０μｌの水に溶解
し、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１１３〜１１４頁、コールド・ス
プリング・バーバー・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９
８２）記載の方法に従い、Ｅ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメレ
ースＩのフレノウ・フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅｌ）（宝酒造・社・製）を用いて処理し、
更に、ＥｃｏＲＩリンカ−０，１μｇを加え、前述の如
くしてＴ４　ＤＮＡリガーゼ１ユニツトで処理し、組み
換え体プラスミドｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　ＩＩ　ｅ　Ｄ
　Ｎ　Ａを含有する種々の組み換え体プラスミドＤＮＡ
０．９μｇを得た。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　ＩＩｅ　Ｄ　Ｎ　Ａを用い、塩
化カルシウム処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
を項目［１］（１）に記載の方法により形質転換し、２
０μｇ／ｍ１のＡｐを含有するＴ−Ｙ培地上で生育する
形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００　（ｐＢ
Ｒ３２２−ｇｓｈＩＩｅ）を得た。

（３）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００（ｐＧｓＢ４
０３）の調製次いで、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（ｐＢＲ３２２−ｇｓｈ　ＩＩｅ）から項目［１］　（
１）に記載の方法により組み換え体プラスミドｐＢＲ３
２２−ｇｓｈ　ＩＩ　ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａを精製単離してＤ
ＮＡ１■を得た。

このｐＢＲ３２２−ｇｓｈＩＩｅ　ＤＮＡ２　Ｍｇ　Ｘ
ＤｒａＩＩ　２ユニツト（ヘーリンガー・マンハイム・
山之内・社・製）及びＥｃｏＲＩ　２ユニツトを３３ｍ
Ｍトリス−酢酸（ｐＨ７，９）　／　１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウム１０．ｓｍＭジチオスレイトール／６６ｍＭ酢
酸カリウムを含有する溶液２０μ！中で温度３７°Ｃで
１時間反応させたのち、常法通り、アガロースゲル電気
泳動処理を行なってＤＮＡ断片を分離し、該ＤＮＡ断片
を含有するゲルを切り出したものを、透析チューブに詰
め、再度電気泳動処理を行ない、ゲル中に存在するＤＮ
Ａ断片をゲル外に出し、ＧＳＨ−ｎ遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片ｇｓｈ　Ｉ［ｄｅ　Ｏ，６１１ｇを得た。

次いで、プラスミドｐＵｃ１９　ＤＮＡ０．５μｇ、加
工（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社、製）１ユ
ニツト、ＥｃｏＲＩ　１ユニツトを、３３ｍＭ）リス−
酢酸（ｐ　Ｈ７，９）　／　１０ｍＭ酢酸マグネシウム
１０．５ｍＭジチオスレイトール／６６ｍＭ酢酸カリウ
ムを含有する溶液２０μ！中で、温度３７°Ｃで１時間
反応させたものに、上述の如くして得られたＤＮＡ断片
ｇＳｈ　ｕ　ｄｅｏ、５μｇ及びＴ４　ＤＮＡリガーゼ
１ユニツトを夫々添加し、温度１６°Ｃで１２時間作用
させ組み換え体プラスミドｐＧｓＢ４０３　ＤＮＡを含
有する種々の組み換え体プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　０．８
μｇを得た。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＧｓＢ４０３　Ｄ　Ｎ　Ａを用い、塩化カルシウム処
理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩを前記項目［
１コ（１）記載の方法により形質転換し、２０μｇ／ｍ
１のＡｐを含むＴ−Ｙ培地上で生育し、５−ブロモ−４
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイ
ド及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイ
ドを含有するＴ−Ｙ培地上で白いコロニーをつくる形質
転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＧｓＢ
４０３）を得た。

（４）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐ八に２２３
）の調製組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　
Ａ保持する大腸菌ＪＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２）　（ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−１５３４）　（微工研条寄第１５３４号）
より組み換え体プラスミドｐＡに１２２ＤＮＡを項目［
１］　（１）記載の方法により精製単離しＤＮＡ１ｍｇ
を得た。

この組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２Ｄ　Ｎ　Ａ　５
μｇ、Ｐｓｔｌ（ヘーリンガー・マンハイム・山之内・
社・製）５ユニツト及びＥｃｏＲＩ　５ユニツトを５０
ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ
　ＭｇＣｌ　ｚ　／　１ｍＭジチオエリスリトール／１
００ｍＭ　ＮａＣｌを含有する溶液２０ｕ１．中で、温
度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によりアガロ
ースゲル電気泳動処理を行なってＤＮＡ断片を分離し、
該ＤＮＡ断片を含有するゲルを切り出したものを、透析
チューブに詰め、再度電気泳動処理を行ない、ゲル中に
存在するＤＮＡ断片をゲル外に出し、アセテート・カイ
ネース（以下ＡＣＫと略称する）遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片ａｃｋ−ｐｅ　２μｇを得た。

次いで、プラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５μ
ｇ、楔■　１ユニツト及びＥｃｏＲＩ　１ユニツトを、
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，５＞　／　１０
ｍＭ　ＭｇＣｈ／　１ｍＭジチオエリスリトール／１０
０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する溶ｉ２０＃ｆｆｉ中で温度
３７°Ｃで１時間反応させたものに、上述の如くして得
られたＤＮＡ断片ａｃｋ−ｐｅ　１　ｕ　ｇ及びＴ４　
ＤＮＡリガーゼ１ユニツトを夫々添加し、温度１６゛Ｃ
で１２時間作用させ組み換え体プラスミドｐＡＫ２２３
　ＤＮＡを含有する種々の組み換え体プラスミドＤＮＡ
１μｇを得た。

この組み換え体プラスミドｐＡＫ２２３　Ｄ　Ｎ　Ａを
用い塩化カルシウム処理した前記大腸菌１１００を項目
［１］　（１）記載の方法により形質転換し、２０μｇ
／ｄのＴｃを含むＴ−Ｙ培地上で生育するが、Ａｐを２
０μｇ７ｍｌ含むＴ−Ｙ培地上では生育できない形質転
換株、すなわち、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐ
ＡＫ２２３）を得た。

（５）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００（ｐＡＫ３２
３）の調製項目［４］　（３）記載により得られた大腸
菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ　（ｐＧｓＢ４０３）及
び、項目［４］　（４）記載により得られた大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＡＫ２２３）から、プラスミ
ドｐＧｓＢ４０３　Ｄ　Ｎ　Ａ及びｐＡＫ２２３　Ｄ　
Ｎ　Ａを夫々、項目［１］　（１）記載の方法により精
製単離し、ＤＮＡをそれぞれ１■を得た。

次いで、この組み換え体プラスミドｐＧｓＢ４０３　Ｄ
ＮＡ　５　ｕｇ　ＸＰｖｕＩＩ　　（ヘーリンガーーマ
ンハイム・山之内・社・製）５ユニツトを１０ｍＭ　ト
リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）／１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／
１ｍＭジチオエリスリトール１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含
有する溶液２０μ！中に温度３７°Ｃで１時間反応させ
たのち、常法によりアガロースゲル電気泳動処理を行な
ってＤＮＡ断片を分離し、該ＤＮＡ断片を有するゲルを
切り出したのち、透析チューブに詰め、再度電気泳動処
理を行ない、ゲル中に存在するＤＮＡ断片をゲル外に出
し、ＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を含有するＤＮＡ断片ｇｓｈＩ
ＩＩ）２μｇを得た。

次いで、プラスミドｐＡＫ２２３　Ｄ　Ｎ　Ａ　１μｇ
ｌｂはＩ（ベーリンガ・マンハイム・山之内社・製）１
ニー１−７トを、３３ｍＭ　）リス−酢酸（ｐ　Ｈ７，
９）　／　１０ｍＭ酢酸マグネシウム１０．５ｍＭジチ
オスレイトール７６６ｍＭ酢酸カリウムを含有する溶液
２０μ！中で、温度３７“Ｃで、１時間反応させたもの
に、上述の如くして得られたＤＮＡ断片ｇｓｈＩｌｐｌ
μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットを夫々添加し、
温度１６°Ｃで１２時間作用させ組み換え体プラスミド
ｐＡＫ３２３　Ｄ　ＮＡを含有する種々の組み換え体プ
ラスミドＤＮＡ１μｇを得た。

この組み換え体プラスミドｐＡＫ３２３　Ｄ　Ｎ　Ａを
用い塩化カルシウム処理した前記大腸菌１１００を項目
［１］　（１）記載の方法により形質転換し、２０μｇ
／ｒｔｄｌのＴｃを含むＴ−Ｙ培地上で生育する形質転
換株、すなわち、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐ
ＡＫ３２３）を得た。

このようにして得た形質転換株より、プラスミドＤＮＡ
を項目［１］　（５）記載の方法に従い、単離、アガロ
ースゲル電気泳動で検出し、検出される組み換え体プラ
スミドＤＮＡのうち、ＡＣＫ遺伝子及びＧＳＨ−１１遺
伝子が同時に組み込まれている組み換え体プラスミドは
、ＡＣＫ遺伝子のみが組み込まれた組み換え体プラスミ
ドＤＮＡより大きい組み換え体プラスミドＤＮＡとして
検出される。

すなわち、アガロースゲル電気泳動において泳動距離の
短いＤＮＡとして検出される。このようにしてＡＣＫ遺
伝子とラクトースプロモーターにより発現するＣ、５Ｈ
−ＩＩ遺伝子の両外側にＥｃｏＲＩ切断部位を有する組
み換え体プラスミドｐＡに３２３ＤＮＡを得た。

（６）組み換え体プラスミドｐＡＫ３２３　Ｄ　Ｎ　Ａ
の単離大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（１）Ａに３２
３）　Ｄ　Ｎ　Ａから項目［１］　（１）記載の方法に
より組み換え体プラスミドρＡＫ３２３ＤＮＡ　０．７
■を得た。

［５１バクテリオフア一ジλＣｌＢ５７１１２１ＳΔＲ
ｚＫｍの育種 （１）　　バクテリオファージλＣＩｏｓ７１１２１の
育種特開昭５８−２１２７８１号公報、実施例に記載の
方法と全く同様にしてバクテリオファージλＣｌＢ５？
１１２１を育種した。

なお、λＣ１１１５７１１２１バタテリオファージは、
該ファージを常法により大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１
００に溶原化して得られた溶源菌、すなわち、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　１１００（λＣｌ１１５７１１２１）　（微工研
条寄第１３３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ１３３）　）として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。

（２）バクテリオファージλｃｌｅｓｔｌ１２１ｓの育
種項目［４］　（１）で得られたバクテリオファージλ
Ｃｌ８Ｓ７１１２１から常法によりＤＮＡを抽出し、こ
のＤＮＡ２．１μｇ　ヲＥｃｏＲＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム・山之内社・製）１０ユニツトで切断して得た
ＤＮＡの断片に、λｃＩＢｓ７ｓａｍ　７　Ｄ　Ｎ　Ａ
　（米国ワシントン社より入手）を予め上記ＥｃｏＲｒ
　　１ユニツトで切断して得たＤＮＡ断片０．４μｇを
添加したのち、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１ユニツトを添加
し、温度７°Ｃで４８時間保持して組み換え体ＤＮＡの
混合物を得、更に該ＤＮＡ混合物を、項目［３コに記載
のイン・ビトロ・パッケージング（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　
ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法によりバクテリオファージの被
膜蛋白質で包みバクテリオファージ粒子を得た。

次いで、このようにして得たバクテリオファージ粒子を
大腸菌ＱＤ５００３　（天川大学より入手、以下、同株
使用）を指示菌としてトリプトン寒天培地上に撒き、温
度３７°Ｃで１６時間培養したのち、生じたプラーク中
より、項目［１］　（１）記載の大腸菌１１００を指示
菌として用いた場合、プラークを形成せず、前記大腸菌
ＱＤ５００３を指示菌として用いた場合、プラークを形
成する性質を有し、かつ後期プロモーターｐ＋１部位よ
り下流域で、その付着末端に至るＤＮＡ部分にのみＥｃ
ｏＲｌによる切断部位が１箇所存在し、かつまた、溶菌
に関与するＳ遺伝子が該遺伝子が変異したＤＮＡ断片（
λｃＩｅｓｙｓａｍ　７　Ｄ　ＮＡ由来）に組み換えら
れたために、宿主細菌を溶解する能力を大田したバクテ
リオファージλｃＴｅｓ７１１２１Ｓを分離して得た。

（３）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ｐＫＲｑ６）
の調製項目［４］　（２）で得られたバクテリオファー
ジλＣｌ５ｓｖｌ１２１Ｓから常法によりＤＮＡを抽出
し、このＤＮＡ合成機ｇをＥｃｏＲＩ及びＣ１ａ！　（
ベーリンガ・マンハイム・山之内社・製）夫々１０ユニ
ツトで切断して、常法により、アガロースゲル電気泳動
処理し、ＤＮＡ断片を得た。

このＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、これを透析チュ
ーブに詰め、再度電気泳動処理し、ゲル中に存在するＤ
ＮＡ断片をゲル外に出し、０．５μｇの溶菌に関与する
Ｒ及びＲｚ遺伝子を含むＤＮＡ断片Ｒｚ−ｃｅを得た。

次いで、このＤＮＡ断片Ｒｚ−ｃｅ　Ｏ，５μｇ及びプ
ラスミドｐＢＲ３２２Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５μｇをは遼Ｒ
Ｉ及びりａＩ夫々１ユニットと混合し、これを温度３７
°Ｃで１時間消化したものに、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１
ユニツトを添加し、温度１６゛Ｃで１２時間反応させて
連結し、プラスミドｐＢＲ３２Ｚ　Ｄ　Ｎ　Ａ上に溶菌
に関する遺伝子Ｒ及びＲｚを保持する組み換え体プラス
ミドρにＲｑ６　ＤＮＡを得た。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐＸＲｑ６ＤＮＡを用い、塩化カルシウム処理した大腸
菌１１００を前記項目［１］　（１）の記載の方法によ
り形質転換し、２０μｇ／ｄのＡｐを含むＴＹ培地上で
生育する形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
　（ｐＫＲｑ６）を得た。

（４）大腸菌１１００　（ｐＫＲｑ９）の調製項目［４
］　（３）で得られた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００
（ｐＫＲｑ　６　’）より組み換え体プラスミドｐＫＲ
ｑ６ＤＮＡを項目［１］　（１）記載の方法により精製
単離し、ＤＮＡ０．７■を得た。

この組み換え体プラスミドｐＫＲｑ６ＤＮＡ５μｇヲＢ
ｃｌＩ　（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製
）５ユニツトと混合し、温度３７°Ｃで１時間処理した
のち、常法によりフェノール処理及びエタノール沈澱処
理を行なって得た沈澱物を２０μｌの水に溶解し、これ
をモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１３５〜１３９頁、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９
８２）記載の方法に従ってＢａ１３１を用いて処理し、
常法によりフェノール／クロロホルム処理及びエタノー
ル沈澱処理を行なって得た沈澱物を２０μ２の水に溶解
し、ｌｎ　　リンカ−（ＤＮＡ合成機（ベックマン・社
・製）により合成）１０μｇを添加し、Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼ１ユニツトを温度１６°Ｃで１６時間作用させた
。この反応物を用い、項目［１］　（１）記載の方法に
従い、塩化カルシウム処理した大腸菌１１００を形質転
換し、２０μｇ／ｍのＡｐを含むＴ−Ｙ培地上で生育す
る形質転換株を得た。

このようにして得た形質転換株より項目［１］（５）記
載の方法に従って組み換え体プラスミドＤＮＡを単離し
、この各プラスミドＤＮＡＩμｇ及び％ＩＩ　　１ユニ
ツトを温度３７°Ｃで１時間処理したのち、アガロース
ゲル電気泳動処理を行なった。アガロースゲル電気泳動
において、泳動距離より、プラスミドＤＮＡの大きさを
測定することにより、溶菌に関するＲｚ遺伝子が約２０
０ｂｐ欠失したプラスミドｐＫＲｑ７０をＤＮＡを単離
した。

次いで、このプラスミドｐＫＲｑ７０　Ｄ　Ｎ　Ａによ
る形質転換株１１００（ｐＫＲｑ７０）より、項目［１
］　（１）記載の方法により組み換え体プラスミドｐＫ
Ｒｑ７０　Ｄ　Ｎ　Ａを精製単離し、ＤＮＡ０．６■を
得た。

次いでコスミドｐＨＣ７９ＤＮＡ　（ベーリンガー・マ
ンハイム・山之内・社・製）２μｇ及び力σ■５ユニッ
トを１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，５）　／
　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１ｍＭジチオエリスリトール
１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する溶液２０μ！中で、温
度３７°Ｃで１時間反応させたのち、項目［１］　（４
）記載の方法に従い、約１．７ＫｂのＤＮＡ断片ｃｏｓ
−ｂｂ　Ｏ，３１ｔｇを得た。

次いで、前述の如くして得られたプラスミドｐＫＲｑ７
０ＤＮＡ　０．５μｇ、壜但旧１ユニット及び地江■１
ユニットを１０ｍＭ　）リス−ＦＩＣＩ　（ｐ　Ｈ７，
５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１ｍＭジチオエリス
リトール１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する溶液２０μｌ
中で、温度３７°Ｃで１時間反応させたのち、常法によ
り、フェノール処理及びエタノール沈澱処理を行なって
得た沈澱物を２０μ！の水に溶解し、上述の如く得られ
たＤＮＡ断片ｃｏｓ−ｂｂＯ５３μｇ及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼｌユニットを夫々添加し、温度１６°Ｃで１２時
間作用させ、組み換え体コスミトｐＫＲｑ８ＤＮＡを含
有する種々の組み換え体コスミドＤＮＡ及びプラスミド
ＤＮＡ０．５μｇを得た。

この組み換え体ＤＮＡを用い項目［１］　（１）記載の
方法に従い、塩化カルシウム処理した大腸菌１１００を
形質転換し、形質転換株を得た。

このようにして得た形質転換株より項目［１］（５）記
載の方法に従って組み換え体コスミドＤＮＡを単離し、
アガロースゲル電気泳動で検出し、ＤＮＡ断片ｃｏｓ−
ｂｂが組み込まれた組み換え体コスミドは、他のプラス
ミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡより大きいコスミドＤＮＡ
として検出される。このようにして、溶菌に関する遺伝
子Ｓ及びＲを保持し、溶菌に関する遺伝子Ｒｚを欠失し
たコスミドｐＫＲｑ８ＤＮＡによる形質転換株大腸菌１
１００　（ｐＫＲｑ８）を得た。

上記で得られた組み換え体コスミドｐＫＲｑ８ＤＮＡ　
０．５μｇを履■１ユニットと混合し、温度３７°Ｃで
１時間消化したのち、常法によりフェノール処理及びエ
タノール沈澱処理を行なって得た沈澱物を２０μ！の水
に溶解し、これを項目［１］　（１）記載の方法に従い
、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ・フラグメン
トを用いて処理し、更にＸｂａ　Ｉリンカ−１μｇを添
加し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１ユニツトを温度１６°Ｃ
で１６時間作用させて、組み換−〔ニュー・イングラン
ド・バイオラプス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）　・社・製：１１μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１
ユニットを添加し、温度４°Ｃで２００時間反応せて、
プラスミドベクターｐＵＣＫｍ　Ｄ　Ｎ　Ａｏ、８μｇ
を得た。

このようにして得たプラスミドベクターｐＵｃＫｍＤＮ
Ａで項目［１］　（１）記載の方法に従い、塩化カルシ
ウム処理した大腸菌１１００を形質転換し、大腸菌１１
ｌ１００（ｐＵＣＫを得た。

（６）大腸菌１１００（ｐＫＲｑｌＯ）の調製項目［５
］　（５）で得られた大腸菌１１ｌ１００（ｐＵｃＫよ
り、前記項目［１］　（１）と全く同様にしてプラスミ
ドベクターｐＵＣ−４Ｋ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１■を得、この
ＤＮＡｌ０μｇ及びＸｂａＩ　２０ユニツトを５０１ト
リス−ＨＣｌ／１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１ｍＭジチオエ
リスリトール／１００ｍＭＮａＣ１を含有する溶液中で
、温度３７゛Ｃで１時間反応させたのち、アガロースゲ
ル電気泳動処理を行ない、項目［１］　（５）記載の方
法と同様にして、カナマイシン耐性遺伝子を含む１．４
　ＫｂのＤＮＡ断片Ｋｍｘｂ　３μｇを得た。

次いで、項目［５］　（４）で得られた大腸菌１１００
（ｐＫＲｑ９）より前記項目［１コ（１）と全く同様に
してコスミドｐＫＲｑ９　ＤＮＡ　０．７■を得、この
ＤＮＡＩＩＩｇ及びυ狙１１ユニットを５０ｆｆ１Ｍト
リスーＨＣｌ／１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１ｍＭジチオエ
リスリトール／１００ｍＭ　ＮａＣｔを含有する溶液中
で、温度３７゛Ｃで１時間反応させたのち、常法により
、フェノール処理及びエタノール沈澱処理を行なって沈
澱物を得た。この沈澱物を２０μｌの水に溶解し、上述
で得られたＤＮＡ断片Ｋｍｘｂ　Ｏ，８μｇを添加し、
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１ユニツトを温度１６°Ｃで１６
時間作用させたのち、前記項目［１］、　（１）記載の
方法に従い、塩化カルシウム処理をした大腸菌１１００
を形質転換し、２０μｇのＫｍを含むＴ−Ｙ寒天培地上
で生育する形質転換株、大腸菌１１００（ｐＫＲｑｌＯ
）を得た。

（７）バクテリオファージλｃＩｓｓｖｌ１２１ｓΔＲ
ｚＸｍの育種 項目［５］　（６）で得られた大腸菌１１００（ｐＫＲ
ｑｌｏ）より、項目［１］　（１）記載の方法に従って
、組み換え体コスミドｐＫＲｑｌＯＤ　Ｎ　Ａを精製単
離し、ＤＮＡ０．７■を得た。

この組み換え体コスミドｐＫＲｑｌＯＤ　Ｎ　Ａ　１０
μｇ、及び項目［５］　（２）で得られたバクテリオフ
ァージλｃｌｓｓ７１１２１ｓ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１０　Ｂ
　ｇを、ＥｃｏＲＩ　５０ユニツトと混合し、温度３７
℃で１時間処理したのち、常法により、フェノール処理
及びエタノール沈澱処理を行なって得た沈澱物を１ｅａ
ｌの水に溶解し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ２ユニツトを添
加し、温度４°Ｃで４８時間反応させた。

得られたＤＮＡｌ０μｇを用い項目［３］記載の方法に
従いイン・ビトロ・パッケージング法により、バクテリ
オファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μ
！に、大腸菌１１００（１０９／厩、０．５μりを加え
、温度３０℃で２時間４置したのち、これを２０μｇ７
ｍｌのＫｍを含むＴ−Ｙ寒天培地上に撒き、温度３２°
Ｃで２４時間培養し、ＫＩ１１耐性の菌株を選択するこ
とにより、溶原菌１１００（λＣｌＢ５７１１２１ＳΔ
）７ｚＫｍ）を得た。

このようにして、後期ブロモ−タール１８部位より下流
域で、その付着末端に至るＤＮＡ部分にのみ、ＥｃｏＲ
Ｉによる切断部位が１箇所存在し、溶菌に関与する遺伝
子が該遺伝子が変異したＤＮＡ断片（λｃＩａｓｔｓａ
ｍ　７　Ｄ　Ｎ　Ａ由来）に組み換えられ、溶菌に関与
するＲｚ遺伝子が、欠失したために、宿主細菌を溶解す
る能力を欠失し、かつまた、カナマイシン耐性の遺伝子
を保持するバクテリオファージλｃＩａｓｔｌ１２１ｓ
ΔＲｚＫｔｎを分離して得た。

［６１バクテリオフア一ジλＣＩａｓ７１１２１ＳΔＲ
ｚＫｍの後期プロモーターより下流域でその付着末端に
至るＤＮＡ部分に存在するエンドヌクレアーゼ切断部位
に、ＡＣＫ及びＧＳＨ−ｎ遺伝子断片を翻訳に必要なり
ＮＡ配列の制御下に挿入した組み換え体バクテリオファ
ージＥＮ１１２１ＳΔＲｚＫｍ−八ＣＫＧＳＨＩＩ　（
１ａｃＰ）の調製 項目［５］　（７）で得られたバクテリオファージから
常法によりＤＮＡを抽出し、このλＣｌｌｌ５７１１２
１ＳΔＲｚＫｍＤ　Ｎ　ＡＩＯｕ　ｇおよび、項目［４
］　（６）で得られた組み換え体プラスミドρ＾に３２
３ＤＮＡ３μｇをイ′昆合し、これを、５０ｍＭ　）リ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）／１００ｍＭＮａＣ１／１０
ｍＭ　ＭｇＳＯ４の組成の溶液５０μ！に添加し、更に
５０ユニツトのＥｃｏＲＩを添加し、温度３７°Ｃで２
時間作用させたのち、常法によりフェノール抽出および
エタノール沈澱処理を行ない沈澱物を得、これを、５０
ＩＴＩＭトリスーＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，４）　／　１０
ｍＭジチオスレイトール／　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／　
０．１ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐの組成溶液８μｌに添加し、温
度４°Ｃで１８時間作用させて連結反応を行なった。

得られたＤＮＡｌ０μｇをイン・ビトロ・パッケージン
グ法（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ）により
、λバクテリオファージの被膜蛋白質で包みバクテリオ
ファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μｌ
に、大腸菌１１００（１０９／ｄ、　　０．５　ｕ　４
２）を加え、温度３０°Ｃで２時間４置したものを、１
０ｕｇ／ｄのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＴ−Ｙ寒天培
地上に撒き、温度３２°Ｃで２４時間培養した。

以上の如くして培養し、生育してきた菌株のうち、バク
テリオファージλＣＩａｓｔｌ１２１ＳΔＲＺＫＩＩＩ
ＤＮＡ上にＡＣＫ及びＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を保持する組
み換え体バクテリオファージＤＮＡによる溶原菌を以下
の方法で検索し、数菌株のバクテリオファ−ジＤＮＡ上
にＡＣＫ及びＧＳＨ−ＩＩ遺伝子を有する溶源菌を得た
。

上記により得られた溶源菌、すなわち、カナマイシン耐
性かつ温度感受性菌を夫々Ｔ−Ｙ培地を用いて温度３２
°Ｃで１６時間振盪培養して得た培養液０．５戚を１５
０ｄ容の三角フラスコ中の１０−のＴＹ培地に接種し、
クレット・ユニフッ（Ｋｌｅｔｔ　ｕｎｉｔｓ）が約１
００になったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５
分間振盪したのち再び温度を３２゛Ｃに降下させて約３
時間振盪を続けた。

このようにして得た培養液のうち１ｄを超音波破砕処理
したものを細胞抽出液とし、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・マイクロバイオロジー（Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、第１２８巻、第１０
４７〜１０５２頁（１９８２）記載の方法に従いＧＳＨ
−ＩＩの酵素活性を測定し、更に、ジャーナル・オブ・
バタテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ）　、第１４４巻、第６７２〜６８２頁
（１９８０）記載の方法によりＡＣＫの酵素活性を測定
し、両酵素活性の高い菌株を選択した。この活性の高い
溶源菌を、１０　ｍｌのＴ−Ｙ培地を用い温度３２°Ｃ
にてクレット・ユニフッ（に１ｅｔｔ　ｕｎｉｔｓ）が
約１００になるまで振盪培養したのち、温度４３°Ｃで
２０分間加温し、更に温度３７°Ｃで３時間振盪培養し
て培養液を得、該培養液よりそれと等容量のフェノール
／クロロホルム混合溶媒を用いてＤＮＡを抽出し、得ら
れたＤＮＡをエタノール沈澱させてＤＮＡを得た。

このように得られたＤＮＡをトリス−［（Ｃｌ　（ｐ　
Ｈ７，５）　／　１ｍＭ　ＥＤＴＡ組成の溶液１ｄに溶
解し、該溶液４ｕｆｌを、１０ｎ＋Ｍ　）リス−）ＩＣ
Ｉ（ｐＨ７，４）／１００ｍＭ　ＮａＣ１／　１０ｍＭ
　ＭｇＳＯ４／　１ｍＭジチオスレイトールノ組成ノ溶
液３０ａｌｌに添加したものに、更に、５０ユニツトの
ＥｃｏＲＩおよび２０ｕｇのＲＮａｓｅ＾（シグマ・社
・製）を添加し、温度３７°Ｃで１時間作用させて消化
し、これをアガロースゲル電気泳動処理し、ＤＮＡ断片
の大きさを分析した。

その結果、ＡＣＫ及びＧＳＨ−ｎ高活性の溶源菌すべて
に、約４　Ｋｂｐの組み換え体プラスミドｐ＾に３２３
ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片が検出された。

以上の如（して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ＥＮ
１１２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＫＧＳＨＩＩ　（１ａｃＰ
）を分離し、所期の組み換え体バクテリオファージＥＮ
１１２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＫＧＳＨＩＩ（１ａｃＰ）
　Ｄ　Ｎ　Ａの調製を行なった。

［７］同−バクテリオフアージＤＮＡ上にＧＳＨ−ＩＡ
ＣＫおよびＧＳＨ−１１遺伝子を保持するバクテリオフ
ァージ５０１ＧＩ　（ＩａｃＰ）２ＡＣＫＩＧ　ＩＩ　
（ＩａｃＰ）　１の作製 （１）　　大腸菌１１００　（５０１ＧＩ（ｌａｃＰ）
２ＡＣＫＩＧＩ［（ｌａｃＰ）１　）の調製 項目［３］記載で得られた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１
１００（ＥＮ５０１ＳＧＩ　（１ａｃＰ）２）より項目
［２］　（３）記載の方法に従い、バクテリオファージ
ＥＮ５０１３ＧＩ　（１ａｃＰ）２　Ｄ　ＮＡを抽出し
た。同様に項目［６］記載で得られた大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）１１００（ＥＮ１１２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＫＧ
ＳＨＩＩ　（ｌａｃＰ））よりバクテリオファージＥＮ
１１２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＸＧＳＨＩＩ　（Ｉａ　ｃ
Ｐ）　Ｄ　ＮＡを抽出した。

次いで、このバクテリオファージＥＮ５０１ＳＧ　Ｉ　
（ｌａｃＰ）２ＤＮＡ１０μｇ及び、バクテリオファー
ジＥＮＩＩ２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＫＧＳＨＩＩ　（１
ａｃＰ）　Ｄ　Ｎ　ＡＩＯ／７　ｇを混合し、これを１
０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０
ｍＭ　ＭｇＣｈ／　１ｍＭジチオエリスリトール１５０
ｍＭ　ＮａＣ１の組成の溶液５０μｌに添加し、更に５
０ユニツトのＮｈｅｌ　（べ−リンガ−・マンハイム・
山之内・社・製）を添加し、温度３７°Ｃで２時間作用
させたのち、常法によりフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱して、沈澱物を得、これを５０ｍＭ　トリス−Ｈ
Ｃｌ　（ｐＨ７，４）　／　１０ｍＭＭｇＣｈ／　１０
ｍＭジチオスレイトール１０４ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐの組成
の溶液８μｌに添加し、更に、２ユニツトのＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼを添加し、温度４°Ｃで１８時間作用させて
、連結反応を行なった。

得られたＤＮＡｌ０μｇをイン・ビトロ・パッケージン
グ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法により
λバクテリオファージの被覆蛋白質で包み、バクテリオ
ファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μ２
に大腸菌１１００（１０９／ｄ、　　０．５　ａ　１．
）を加え、温度３０°Ｃで、２時間瞬間したものを、１
０μｇ／ｄのＫｍを含むＴ−Ｙ寒天培地上に撒き、温度
３２°Ｃで２４時間培養し、溶源菌を得た。

組み換え体ＤＮＡを含有する溶源菌は、１０μｇ／戚の
Ｋｍを含有する培地で生育し、１．５μｇ／ｍ１のＴｃ
を含有する培地で生育せず、プラーク形成能を欠失して
いる株として選択する。この選択された組み換え体ＤＮ
Ａを含有する菌株より組み換え体ＤＮＡを検出する方法
を以下に示した。

選択された組み換え体ＤＮＡを含有する溶源菌をＴ−Ｙ
培地１ｍｌ１に接種して、クレット・ユニツクが約１０
０になったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５分
間振盪したのち再び、温度を３２°Ｃに降下させて約３
時間振盪を続けた。

このようにして得られた培養液にクロロホルム５０μ！
を添加し、更に温度３２°Ｃで２０分間振盪を続け（こ
の操作により溶菌する。）、常法によりフェノール抽出
及びエタノール沈澱を行ないＤＮＡを抽出した。

このようにして得られたＤＮＡを、前記の如くしてＥｃ
ｏＲＩ及びり１で処理し、アガロース電気泳動にかけＤ
ＮＡ断片の大きさを分析した結果、選択された溶源菌の
保持する組み換え体ＤＮＡは、ＧＳＨ−１遺伝子を２個
含むρＧ５１１０２．　ＡＣＫ及びＧＳＨ−Ｉ［遺伝子
を含むｐＡＫ３２３由来のＤＮＡ断片を保持することが
判明した。

以上の如くして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（５０
１ＧＩ　（１ａｃＰ）２ＡＣＫＩＧ　ＩＩ　（１ａｃＰ
）　１を分離した。

なお、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　１１００（５０１Ｇ
Ｉ　（ｌａｃＰ）２ＡＣＫＩＧＵ　（ｌａｃＰ）１は、
工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第２７
３３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７３３）として寄託されて
いる。

（２）組み換え体バクテリオファージ５０１ＧＩ（１ａ
ｃＰ）２ＡＣＫＩＧ　ＩＩ　（ＩａｃＰ）　Ｉ　Ｄ　Ｎ
　Ａの単離上記で得られた溶源菌、すなわち、大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００（５０１ＧＩ　（ｌａｃＰ）
２ＡＣＫＩＧ　ＩＩ　（ｌａｃＰ）　１）を、ＴＹ培地
３ｉに接種し、温度３２°Ｃで１６時間振盪培養して得
た培養液５００μｌを、Ｔ−Ｙ培地３０ｄを含む５００
ｄ容三角フラスコに加え、温度３２°Ｃでクレット・ユ
ニツク（Ｋｌｅｔｔ　ｕｎｉｔｓ）が約１００になるま
で振盪培養を行ない、温度４２°Ｃで１５分間熱誘発を
行なったのち、温度３７°Ｃで２時間振盪培養を行ない
培養液を得た。この培養液に５００μ！のクロロホルム
を添加しくこの操作で溶菌される。）、溶菌液を得、サ
イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第２０２巻、第１２７
９頁（１９７８）記載の方法と同様にして、この溶菌液
２　ｒｒｄｌに、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、５Ｍ　ｌ
−リス−〇ＣＩ　（ｐ　Ｈ９，０）７２．５％Ｆデシル
硫酸ナトリウムを含む溶液４００μρを添加し、温度７
０°Ｃで３０分間加熱したのち、これに８Ｍ酢酸カリウ
ム溶液を５００μ２添加し、氷上で１５分間放置したの
ち、１２０００ｇで２０分間遠心分離処理を行なって、
上清をとり、この上清に、２倍量のエタノールを添加し
、２７０００ｇで３０分間遠心分離処理を行ない、得ら
れた沈澱を常法で乾燥することにより純化された組み換
え体バクテリオファージ５０１ＧＩ（ｌａｑＰ）２ＡＣ
ＫＩＧ　ＩＩ　（１ａｃＰ）　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ　５００
μｇを得た。該組換え体バクテリオファージＤＮＡの制
限酵素開裂地図を第１図に示した。なお、図中に、　Ｅ
、　Ｎ及びＸはそれぞれ制限酵素拘ｍＩ、ＥｃｏＲＩＮ
ｈｅＩ及びＸｂａ　Ｉを示すものである。

（３）組み換え体バクテリオファージＥＮ１１２１ＳΔ
ＲｚＫｍＡＣＫＧＳＨＩ［（ＩａｃＰ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　
、バクテリオファージＥＮ５０１ＳＧＩ　（ＩａｃＰ）
　２　Ｄ　Ｎ　Ａおよびバクテリオファージ５０１ＧＩ
　（ＩａｃＰ）２ＡＣＫＩＧ　Ｕ　（ｌａｃＰ）　Ｉ　
Ｄ　Ｎ　Ａによる溶源菌を培養して得られた菌体のＧＳ
Ｈ−１，ＧＳＨ■及びＡＣＫ活性 かくして得られた溶源菌、すなわち、大腸菌１１００（
ＥＮ１１２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＫＧＳＩＩ　ＩＩ　（
１ａｃＰ））、大腸菌１１００（ＥＮ５０１ＳＧＩ　（
１ａｃＰ）２）及び大腸菌１１００（５０１ＧＩ（ｌａ
ｃＰ）２ＡＣＫＩＧ　ＩＩ　（ｌａｃＰ）　１）の保有
するＧＳＨ−Ｉ、Ｃ，５Ｈ−ＩＩ及びＡＣＫ活性を第１
表に示した。

なお、各酵素活性は、Ｔ−Ｙ培地で前記項目［６］に記
載の方法に従い培養した菌体より調製した菌体抽出液を
用いて行なった。

また、酵素活性は、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マ
イクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１２８巻、第１
０４７〜１０５２頁（１９８２）及び、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇい、第１４４巻、第６７２〜６８２頁（
１９８０）記載の方法で行なった。

（本真以下余白） ［８］グルタチオン生成活性 （１）同一バクテリオファージＤＮＡ上にＧＳＨＩ及び
ｔ？、５Ｈ−Ｉｎ遺伝子を保持するバクテリオファージ
５０１ＧＩ（ＩａｃＰ）２ＧＩＩ　（ｌａｃＰ）１の作
製項目［４］　（３）記載により得られたプラスミドｐ
ＧｓＢ４０３　Ｄ　Ｎ　Ａ　１Ｈｇを１ユニツトのハ世
■で温度３７°Ｃで１時間処理し、次いで、プラスミド
ベクターｐＵＣ１８ＤＮＡ　（宝酒造・社・製）１Ｈｇ
を１ユニツトのＳｍａ　Ｉで温度３７°Ｃで１時間処理
し、常法によりＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を
行ない、項目［１］　（１）記載の方法により形質転換
し、ＧＳＨ−ｎ遺伝子の両性側にＥｃｏＲＩ切断部位を
有するプラスミドｐＧｓＢ４２０　ＤＮＡによる形質転
換株大腸菌ＪＭＩＯＩ　（ｐＧｓＢ４２０）を得た。こ
の大腸菌ＪＭＩＯＩ（］）ＧＳＢ４２０）より項目［１
］　（１）記載の方法に従ってプラスミドｐＧｓＢ４２
０　ＤＮＡを精製単離し、１　ｍｇのＤＮＡを得た。

次いで、項目［６１に記載の方法と同様にして、バクテ
リオファージλＣｌ１１５？１１２１ＳΔＲｚＫｍ　Ｄ
　Ｎ　Ａ及びプラスミドρＧＳＢ４２０　Ｄ　Ｎ　Ａよ
り、バクテリオファージＤＮＡ上にＧＳＨ−ｎ遺伝子を
有する組み換え体バクテリオファージＥＮ１１２１ＳΔ
ｌｆｚＫｍＧｓＨＩＩ　（１ａｃＰ）ＤＮＡの調製を行
なった。

次いで、項目［７１に記載の方法と同様にして、バクテ
リオファージＥＮ１１２１ＳΔＲｚＫｍＧＳＨＩＩ　（
ＩａｃＰ）　ＤＮＡ及びバクテリオファージＥＮ５０１
ＧＩ　（１ａｃＰ）２Ｄ　ＮＡを組み換えて同一ファー
ジＤＮＡ上に、ＧＳＨ−ｎ遺伝子及びＧＳＨ−ｎ遺伝子
を有するバクテリオファージ５０１ＧＩ　（ＩａｃＰ）
２Ｇ　Ｕ　（１ａｃＰ）　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ及び溶源菌大
腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１１００（５０１ＧＩ　（Ｉａ
ｃＰ）２Ｇ　Ｉｆ（ｌａｃＰ）　１）を得た。

（２）組み換え体バクテリオファージ５０１ＧＩ（ｌａ
ｃＰ）２ＡＣＫＩＧ　Ｉ［（ｌａｃＰ）Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ
及びバクテリオファージ５０１ＧＩ（ｌａｃＰ）２Ｇ　
ＩＩ　（１ａｃＰ）ＩＤ　Ｎ　Ａによる溶源菌を培養し
て得られた菌体のＧＳＨ−Ｉ、ＡＣＫ、及びＧＳＨ−Ｉ
［活性並びにグルタチオン生成活性かくして得られた溶
源菌、すなわち、大腸菌１１００　（５０１ＧＩ　（］
ａｃＰ）　２Ａ（ＪＩＧ　ＩＩ　（１ａｃＰ）　１）及
び大腸菌１１００（５０１ＧＩ（１ａｃＰ）２Ｇ　ＩＩ
　（ｌａｃＰ）１）の保有するＧＳＨ−ＩＧＳＨ−Ｉｆ
及びＡＣＫ活性を項目［７］　（３）記載の方法と同様
にして測定した結果を第２表に示した。

（重置以下余白） 溶原菌、大腸菌１１００（５０１ＧＩ（１ａｃＰ）２Ａ
ＣＫＩＧ　ＩＦ　（ｌａｃＰ）１）及び大腸菌１１００
（５０１ＧＩ（ＩａｃＰ）２Ｇ　Ｕ　（ｌａｃＰ）１）
は、Ｔ−Ｙ培地を用い前記項目［６］に記載の方法に従
い培養し、大腸菌１１００は、Ｔ−Ｙ培地で温度３７°
Ｃで２０時間振盪培養し、このようにして得られた菌体
を夫々集菌し、０．８５％（Ｗ／Ｖ）の生理食塩水で１
回洗浄して得た菌体１００■を夫々２ｒｎ！の０．５ｍ
Ｍのし一システィンを含む５ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（
ｐ　Ｈ７，０）緩衝液に懸濁し、更に、常法により超音
波破砕処理し、１■蛋白質を含む粗酵素抽出液に８０＋
ｎＭＬ−グルタミン酸、２０ｍＭ　Ｌ−システィン、２
０ｍＭグリシン、２Ｏｎ＋Ｍ塩化マグネシウム、０．５
又は２０ｍＭ　ＡＴＰ、２０又は３９．５ｍＭアセチル
リン酸および２５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，２）緩
衝液を含む反応液を１雁となる如く加え、温度３７°Ｃ
で１時間振盪培養を行ない、かくして反応液中に生成し
たグルタチオン量より算出したグルタチオン生成活性を
第３表に示した。

（装置以下余白） ［９］組み換え体プラスミドｐＣＫ９−３のＤＮＡ調製
（１）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐｃＫｏ）
の調製ラット脳由来ｃ−Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー〔クロ
ンティク　（ＣＩｏｎ　ｔｅｃｈ）社・製、東洋紡より
入手〕溶液を大腸菌Ｙ１０９０　（同じクロンティク　
（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）社より入手〕を指示菌としてトリ
プトン寒天培地［トリプトン（Ｄｉｆｃｏ（社）製〕　
１％、　　ＮａＣ１ｏ、２５％、寒天１．２％で加圧滅
菌したのち、３０ｄずつ直径９ｃＩ１１のシャーレに分
注したもの］上に撒き、温度３７°Ｃで１４時間静置培
養したのち、約５０．０００個の溶菌斑を得た。

ラット脳クレアチン・キナーゼ（以下ＣＫと略称する）
遺伝子の塩基配列は、ビー・ニー・ペンフィールド（Ｐ
、八、　Ｂｅｎｆｉｅｌｄ）等の報告〔ジーン（Ｇｅｎ
ｅ）、第３９巻、第２６３〜２６７頁、１９８５年〕に
記載されている。このＣＫ遺伝子の塩基配列の一部であ
る５’　−ＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧ−３’
　の１７塩基のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔ベ
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社・製〕を用いて合成した
。この２０ｎｇのオリゴヌクレオチドの５゛末端を（ｒ
−”Ｐ）ＡＴＰ　（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社
・製〕を用いて、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１２２〜１２６Ｌ
　　コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイー
（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）（１９８２年）記載の方法に従って標識し
た。

この３２ｐで標識したオリゴヌクレオチドをプローブと
して用い、上述のｃ−ＤＮＡライブラリーをプラーク・
ハイブリダイゼーション法〔モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）、第３１２
〜３２８Ｎ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ４−　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）〕で検索し、Ｃ
Ｋ遺伝子を有するプラークを得た。該プラークをモレキ
ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ）、第３７１〜３７２頁、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリイー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９８２年
）記載の方法に従い、ＣＫ遺伝子を含むバクテリオファ
ージＤＮＡを精製し、この組み換え体バクテリオファー
ジＤＮＡをλｇｔｌｌ−ＣＫと命名した。

組み換え体バクテリオファージλｇｔｌｌ−ＣＫ　ＤＮ
Ａ５μｇ　ヲＥｃｏＲＩ　（ベーリンガー・マンハイム
・山之内・社・製）　１０ユニツトを５０ｍＭ　　トリ
ス−ＦＩＣＩ（ｐＨ７，５）／１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／
１ｍＭジチオエリスリトール／１００ｍＭ　ＮａＣ１を
含有する溶液３０μ！中、温度３７°Ｃで１時間反応さ
せたのち、常法によりアガロースゲル電気泳動処理を行
い、約１．３Ｋｂ　ＤＮＡ断片を分離し、該ＤＮＡ断片
を含有するゲルを切り出したものを透析チューブに詰め
、再度電気泳動処理を行い、ゲル中に存在するＤＮＡ断
片をゲル外に出し、ＣＫ遺伝子を含有するＤＮＡ断片Ｃ
ＫＥＣ０，５μｇを得た。

このＣＫＥＣｏ、５μｇを２０μ２の水に溶解し、モレ
キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）、第１１３〜１１４Ｎ、コールド・スプリン
グ・バーバー・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２
年）記載の方法に従って大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの
フレノウ・フラグメント（ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅｎ
ｔ　ｏｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ　Ｉ　）（宝酒造・社・製）を用いて処理し、平滑末
端を有するＤＮＡ断片ＣＫＥＣＦ　０．４μｇを得た。

次いで、プラスミドｐＵｃ１１９　Ｄ　Ｎ　Ａ　（宝酒
造・社・製）０．５μｇをＸｂａｌ（ヘーリンガー・マ
ンハイム・山之内・社・製）５ユニツトを５０ｍＭ　ト
リス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１ｚ／　１ｍＭ　ジチオエリスリトール／１００ｍＭ
　ＮａＣｌを含有する溶液２０μ！中、温度３７゛Ｃで
１時間反応させたのち、常法通り、フェノール処理、及
びエタノール沈澱を行った。この沈澱物を上述ＣＫ、Ｃ
ＤＮＡ断片と同じく大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレ
ノウ・フラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ
　ｏｆ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
　り（宝酒造・社・製）を用いて処理し、平滑末端を有
するＤＮＡ断片ρＵＣ１１９ＸＦ　Ｏ，４μｇを得た。

ＣＫ、ｃ、ＤＮＡ断片０．４μｇ及びｐＵｃ１１９ｘｙ
ＤＮＡ断片０．４μｇを１０μ！の水に溶解（モレキュ
ラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、第３９６〜３９７頁、コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年）記
載の方法に従って、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガ
ー・マンハイム・山之内・社・製）を添加し、温度４°
Ｃで２４時間反応させて連結し、プラスミド１１９ＤＮ
Ａ上にｌａｃプロモーター制御下、β−ガラクトシダー
ゼとＣＫとの融合蛋白質を発現させうる組み換え体プラ
スミドｐｃＫＯＤＮＡを得た。

次いで、このようにして得られた組み換え体プラスミド
ｐｃＫＯＤＮＡを用い、塩化カルシウム処理した大腸菌
（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩを項目［１］　（１）記載
の方法により形質転換し、２０ｐｇ／ｍｌのＡｐを含む
Ｔ−Ｙ培地上で生育し、５”−ブロモ−４−クロロ３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノサイド及びイソプ
ロピル−β−チオガラクトピラノサイドを含有するＴ−
Ｙ培地上で白いコロニーをつくる形質転換株、大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐｃＫｏ）を得た。

（２）プラスミドベクターｐＣＫ８ＤＮＡの作製プラス
ミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ　（宝酒造・社・製）１８ｇ　
ヲＥｃｏＲＩ（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社
・製）２ユニツト及び５ａｉｌ　（ヘーリンガー・マン
ハイム・山之内・社・製）３ユニツトを混合し、温度３
７°Ｃで１時間消化したのち、常法によリフエノール処
理及びエタノール沈澱処理を行って得た沈澱物を１７μ
ｌの水に溶解し、これにＤＮＡ合成機〔ヘックマン（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ）社・製〕を用いて合成した５　’　−Ａ
ＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡ
ＣＣＧ−３’の２９塩基のオリゴヌクレオチド及び５’
　−ＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴ
ＧＧＴＡＣＣの２９塩基のオリゴヌクレオチドを夫々０
．３μｇ添加し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼｌユニットを温
度２０″Ｃで１６時間作用させてプラスミドＤＮＡ上に
Ｋｐｎ　Ｉ　、　Ｂｇｌ　Ｕ　、及びＳｍａ　Ｉ切断部
位を有するプラスミドｐ（Ｊ８ＤＮＡを得た。

このプラスミドＤＮＡを用いて、塩化カルシウム処理し
た大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ　（全酒造■より
購入］を項目［１］　（１）記載の方法により形質転換
し、Ａｐを２０μｇ／ｍｌ含むＴ−Ｙ培地で生育し、テ
トラサイタリン（Ｔｃ）２０μｇ７ｍｌを含むＴ−Ｙ培
地では生育できない形質転換株、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ
）ＪＭｌｏｌ　（ｐＣに８）を得た。

このようにして得た大腸菌（Ｅ、　ｃｏ　ｌ　ｉ）　Ｊ
ＭＩＯＩ　（ｐＣＫ８）からプラスミドｐＣＫ８ＤＮＡ
を項目［１］　（１）記載の方法により精製単離し、ｐ
ｃＫ８ＤＮＡ１■を得た。

（３）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＣＫ　９
　）の調製項目［９コ（１）で得られた大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＣＫ　Ｏ）より項目［１］　（
１）記載の方法により組み換え体プラスミドｐｃＫＯＤ
ＮＡを単離・精製し、ｐｃＫＯＤＮＡ　１．１■を得た
。

このようにして得た組み換え体プラスミドｐＣＫ　０ｌ
Ｉｇと、ＰｖｕＩＩ　　（ベーリンガー・マンハイム・
山之内・社・製）　１０ユニツトを１０ｍＭ　　）リス
−口ＣＩ（ｐＨ７，５）／１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１ｍ
Ｍジチオエリスリトール１５０ｍＭ　ＮａＣ１を含有す
る溶液２０μｉ中、温度３７°Ｃで２時間反応させたの
ち、常法によりアガロースゲル電気泳動処理を行って約
１．５Ｋｂ　ＤＮＡ断片を分離し、透析チューブに詰め
、再度電気泳動処理を行い、ゲル中に存在するＤＮＡ断
片をゲル外に出し、ラクトース・プロモーター及びＣＫ
遺伝子を含有する１、５Ｋｂ　ＤＮＡ断片１ａｃ−ＣＫ
を１．２μｇ得た。

次いで項目［９］　（２）記載で得られたプラスミドｐ
ＣＫ８ＤＮＡ　１μｇをＳｍａＩ　（ベーリンガー・マ
ンハイム・山之内・社・製）２ユニツトを３３ｍＭトリ
ス−アセテート（ｐ　Ｈ７，９）　／　１０ｍＭマグネ
シウム・アセテート／６６ｍＭボタシウム・アセテ−）
１０．５ｍＭジチオスレイトールを含有する溶液２０μ
！中で温度３０°Ｃで２時間反応させたのち、常法によ
りフェノール処理及びエタノール沈澱処理を行って得た
沈澱物を２０μｌの水に溶解し、上述の如くして得られ
た１ａｃ−ＣＫ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片１．Ｏｕｇ及びＴ４　
ＤＮＡリガーゼ１ユニツトを夫々添加し、温度４　’Ｃ
で２４時間作用させ組み換え体プラスミドｐＣＫ９ＤＮ
Ａを得た。

このｐＣＫ９ＤＮＡはラクトース・プロモーターとＣＫ
遺伝子のラクトース・プロモーター上流部ににｐｎｌ及
びＢｇｌ　ＩＩ切断部位、ＣＫ遺伝子下流部にＢａｍＨ
Ｉ及びＫｐｎ　Ｉ切断部位を有する組み換え体プラスミ
ドである。

次いでこのプラスミドＤＮＡを用いて、塩化カルシウム
処理した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩを項目［１
］　（１）記載の方法により形質転換し、２０μｇ／ｗ
ｒｌＡｐを含有するＴ−Ｙ培地上で生育する形質転換株
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＣＫ　９　）
を得た。

（４）大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＣＫ９−
３）の調製大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）ＪＭＩＯＩ　（ｐ
Ｃに９）から組み換え体プラスミドｐＣＫ９ＤＮＡを項
目［１］　（１）記載の方法により精製・単離し、ｐＣ
Ｋ９　ＤＮＡ　１．２■を得た。

このようにして得た組み換え体プラスミドｐＣＫ９　Ｄ
ＮＡ　６μｇ、　Ｂａｍ１ｌＩ　６ユニツト及びＢｇｌ
　ＩＩ　（いずれもベーリンガー・マンハイム・山之内
・社・製）６ユー’−７トを１０ｍＭ　　）リス−ＨＣ
ｌ　（ｐ　Ｈ８，０）　／　５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／１０
０ｍＭ　ＮａＣ１を含有する溶液６０−中、温度３７°
Ｃで２時間反応させたのち、常法によりアガロースゲル
電気泳動処理を行ってＤＮＡ断片を分離し、約１．５に
ｂの該ＤＮＡ断片を含有するゲルを切出したものを透析
チューブに詰め、再度電気泳動処理を行いゲル中に存在
するＤＮＡ断片をゲル外に出し、ラクトース・プロモー
ターとＣＫ遺伝子を含有するＤＮＡ断片ＣＫ　（ｌａｃ
−Ｐ）＋＋＋＋　２μｇを得た。

次いで組み換え体プラスミドｐＣに９ＤＮＡ１μｇ及び
ＢａｍＨＩ　（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社
・製）１ユニツトを上述と同様にして溶液２０μ！中で
温度３７°Ｃ１１時間反応させたのち常法によりフェノ
ール処理及びエタノール沈澱を行って得た沈澱物を２０
μｌの水に溶解し、上述のＤＮＡ断片ＣＫ　（Ｉａｃ−
Ｐ）ａｍ　２　／／　ｇ及びＴ４　ＤＮＡリガーゼｌユ
ニットを夫々添加し、温度１６℃で１２時間作用させ、
組み換え体プラスミドｐＣＫ９−３　ＤＮＡを含有する
種々の組み換え体プラスミドＤＮＡ　２μｇを得た。

次いで、このプラスミドＤＮＡを用いて、塩化カルシウ
ム処理しな大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩを項目［
１］　（１）記載の方法により形質転換し、２０ｄｇ７
ｍｌＡｐを含有するＴ−Ｙ培地上で生育する形質転換株
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＬ（ｐＣＫ９−３）
を分離した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＣＫ９−３）株
は、項目［１］（５）記載のようにアガロースゲル電気
泳動により、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭＩＯＩ（ｐＣ
Ｋ　９　）より泳動距離の短い組み換え体プラスミドＤ
ＮＡとして検出される。

このようにしてＫｐｎ　Ｉ切断部位の内側にラクトース
・プロモーター制御下ＣＫ遺伝子を３個直列に並んだ組
み換え体プラスミドｐＣＫ９−３　ＤＮＡを得た。

（５）組み換え体プラスミドｐＣに９−３ＤＮＡの単離
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭｌｏｌ（ｐＣＫ９−３）か
ら項目［１］（１）記載の方法により、組み換え体プラ
スミドｐＣＫ９−３　ＤＮＡ　Ｏ，８■を得た。

［１０］バクテリオフアージＥＮ５０１Ｓ−Ｔｃのコー
ト蛋白質製造の遺伝子情報部位に存在するエンドヌクレ
オチド切断部位にＣＫ遺伝子断片を翻訳に必要なりＮＡ
配列の制御下に挿入した組み換え体バクテリオファージ
λＥＮ５０１Ｓ−ＣＫ（ｌａｃＰ）　３の作製項目［２
］　（３）で得られたバクテリオファージＥＮ５０１Ｓ
−Ｔｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１０　ＩＩ　ｇ及び項目［９］’
（５）で得られた組み換え体プラスミドｐＣＫ９−３　
ＤＮＡ３０μｇを混合し、項目［３］と同様にＫｐｎｌ
（ベーリンガー・マンハイム・山之内・社・製）で切断
した後、常法によりフェノール処理及びエタノール沈澱
処理したのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マ
ンハイム・山之内・社・製）２ユニツトを添加し、温度
４°Ｃで１８時間作用させて連結反応を行った。

得られたＤＮＡＬＯμｇを項目［３１と同様にイン帝ビ
トロ・パッケージング（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａ
ｇｉｎｇ）法により、λバクテリオファージの被覆蛋白
質で包み、バクテリオファージ粒子を調製し、このファ
ージ粒子溶液５０μ！に大腸菌１１００（１０ｑ／ｄ。

０．５μりを加え、温度３０″Ｃで６時間装置したのち
、これを０．１５ｄｇ／ｄのテトラサイタリン（Ｔｃ）
を含む寒天培地上に撒き、温度３２°Ｃで４８時間培養
し、Ｔｃ耐性の菌株を選択することにより溶源菌を得た
。

この溶源菌を夫々Ｔ−Ｙ培地を用いて温度３２°Ｃで１
６時間振盪培養し、培養液０．５　ｄを１５０ｍ１容三
角フラスコ中の１０ｄのＴ−Ｙ培地に接種し、クレット
・ユニツク（Ｋｌｅｔｔ　ｕｎｉｔｓ）が約１００にな
ったところで温度を４３°Ｃに上昇させて２５分間振盪
したのち、温度を３７°Ｃに降下させて約３時間振盪を
続けた。このようにして得た培養液のうち１威を超音波
破砕処理したものを細胞抽出液とし、マービン・エル・
タンザー（Ｍａｒｖｉｎ、Ｌ、Ｔａｎｚｅｒ）等の方法
〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）、第２３４巻、第３２０１〜３２０４頁（１９５９年
））に従い、ＣＫの酵素活性を測定し、活性の高い株を
選択した。

このようにして得られた活性の高い溶源菌を培養し、項
目［３］のようにして組み換え体バクテリオファージＤ
ＮＡを得た。このＤＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（
ｐ　Ｈ７，５）　／　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ組成の溶液２
０１Ｉ！に溶解し、該溶液４μｌを、１１０ｌＴｌトリ
ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）／　１０ｍＭ　ＭｇＣ］ｚ／
　１ｍＭジチオエリスリトールの組成の溶液３０μ尼に
添加したものに、更に、１０ユニツトのＫｐｎｌ（ヘー
リンガー・マンハイム・山之内・社・製）を添加し、温
度３７゛Ｃで２時間消化し、アガロース電気泳動処理し
、ＤＮＡ断片の大きさを分断した。

その結果、ＣＫ高活性の溶源菌は、約４．５　Ｋｂのｐ
ＣＫ９−３由来のＤＮＡ断片を保持していた。

以上の如くして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（ＥＮ
５０１Ｓ−ＣＫ（１ａｃＰ）　３　）を分離し、組み換
え体ハクテリオファ−ジＥＮ５０１Ｓ−ＣＫ（ＩａｃＰ
）　３　）の作製を行った。

［１１］組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２ＨのＤＮＡ
調製組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２　ＤＮＡを保持
する大腸菌ＪＭＩＯＩ（ｐＡＫ１２２）（ＦＥＲＮ　Ｂ
Ｐ−１５３４）より組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２
　ＤＮＡを項目［１］　（１）記載の方法により精製単
離しＤＮＡ１■を得た。

この組み換え体プラスミドｐＡＫ１２２　Ｄ　Ｎ　Ａ　
５μｇ及びＰｓｔｌ（ベーリンガーマンハイム・山之内
・社・製）５ユニツトを５０１１１Ｍ　トリス−ＨＣｌ
　（ｐ　Ｈ７，５）　／１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／　１　
ｍＭジチオエリスリトール／　１００ｍＭＮａＣ１を含
有する溶液２０μ！中で、温度３７°Ｃで１時間反応さ
せたのち、常法によって得た沈澱物を１７μｌの水に溶
解し、ＰｓｔＩリンカ−０，３μｇを添加し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ１ユニットを温度２０”Ｃで１６時間作用さ
せて、プラスミドＤＮＡ上にＥｃｏＲＩ切断部位を２ケ
所有するプラスミドｐＡＫ１２３Ｅ　ＤＮＡを得た。

この組み換え体プラスミドｐＡに２２３ＤＮＡを用い、
塩化カルシウム処理した前記大腸菌１１００を項目［１
］　（１）記載の方法により形質転換し、２Ｏａｇの静
を含むＴ−Ｙ培地上で生育する形質転換株、すなわち、
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（’ｐＡＫ１２３Ｅ）
を得た。

［１２］バタテリオフアージλＣＩ　ａｓｖｌ１２１ｓ
ΔＲｚＫｍの後期プロモーターより、下流域でその付着
末端に到るＤＮＡ部分に存在するエンドヌクレアーゼ切
断部位に、ＡＣＫ遺伝子断片を翻訳に必要なりＮＡ配列
の制御下に挿入した組み換え体バクテリオ７７−ジＥＮ
１１２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＫの調製項目［５］　（７
）で得られたバクテリオファージから常法によりＤＮＡ
を抽出し、この、λＣＩ　ＩＩｓ？１１２１ＳΔＲｚＫ
ｍ　ＤＮＡ１Ｏａｇ及び、項目［３］で得られた組み換
え体プラスミドｐＡＫ１２３Ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａ　３μｇを
混合し、これを、５０ｍＭ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，
４）／１００ｍＭ　ＮａＣ１／１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａの
組成の溶液５０μ！に添加し、更に５０ユニツトのＥｃ
ｏＲＩを添加し、温度３７°Ｃで２時間作用させた後、
常法によりフェノール抽出及びエタノール沈澱処理を行
い沈澱物を得、これを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐ
　Ｈ７，４）　／　１０ｎ＋Ｍジチオスレイトール／　
１０＋ａＭ　ＭｇＣ１ｚ／Ｑ、１ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐの組
成溶液８μｌに添加し、温度４℃で１８時間作用させて
連結反応を行った。

得られたＤＮＡｌ０μｇをイン・ビトロ・パッケージン
グ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ）により、
λバクテリオファージの被膜蛋白質で包みバクテリオフ
ァージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μｌに
、大腸菌１１００　（１０”／ｄ、０．５μりを加え、
温度３０℃で２時間４置したものを、１Ｏａｇ　／　ｍ
ｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＴ−Ｙ寒天培地上に撒
き、温度３２°Ｃで２４時間培養した。

以上の如くして培養し、生育してきた菌株のうち、バク
テリオファージλＣｊ、ｅｓｙｌ１２１ｓΔＲｚＫｍ　
ＤＮＡ上にＡＣＫを保持する組み換え体バクテリオファ
ージＤＮＡによる溶原菌Ｅ、ｃｏｌｉ　１１００（ＥＮ
ｌｌｏｏ（ＥＮ１１２１ＳＯＲｚＫを、項目［６］記載
の方法に従い、選択した。

［１３１同一バタテリオフアージＤＮＡ上にＣＫ及びＡ
ＣＫ遺伝子を保持するバクテリオファージ５０１Ｓ−Ｃ
Ｋ（ｌａｃＰ）　３　ＡＣＫの作製（１）大腸菌１１０
０（５０１ＣＫ（ｌａｃＰ）　３＾ＣＨの調製項目［１
０］記載で得られた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（
ＥＮ５０１Ｓ−（Ｊ（ｌａｃＰ）　３　）より項目［２
］　（３）記載の方法に従いバクテリオファージＥＮ５
０１Ｓ−ＣＫ（１ａｃＰ）　３ＤＮＡを抽出した。同様
に項目［１２１記載で得られた大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）１１００より項目［２］　（３）記載の方法に従いバ
クテリオファージＤＮＡを抽出した。

次いで、このバクテリオファージＥＮ５０１１Ｊ　（Ｉ
ａｃＰ）３ＤＮＡ１Ｏａｇ及びバクテリオファージＥＮ
１１２１ＳΔＲｚＫｍ−ＡＣＫ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１０
　ＩＩ　ｇを混合し、これを１０１トリス−ＨＣｌ　（
ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／　１ｍＭ
ジチオエリスリトール１５０ｍＭ　ＮａＣ１の組成の溶
液５０μｆに添加し、更に５０ユニツトのＮｈｅｌ　　
（べ−ＩＪ　７ガー・マンハイム・山之内・社・製）を
添加し、温度３７℃で２時間作用させたのち、常法によ
りフェノール抽出およびエタノール沈澱して、沈澱物を
得、これを５ＱｍＭ　　トリス−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７，
４）　／　１０ｍＭＭｇＣＩｚ／１０−ジチオスレイト
ール１０．１ｍＭ　ＡＴ　Ｐの組成の溶液８μ！に添加
し、更に、２ユニツトの７４　ＤＮＡリガーゼを添加し
、温度４°Ｃで１８時間作用させて連結反応を行なった
。

得られたＤＮＡｌ０μｇをイン・ビトロ・バッケ−ジン
ク（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ）法により
λバクテリオファージの被覆蛋白質で包み、バクテリオ
ファージ粒子を調製し、このファージ粒子溶液５０μ歪
に大腸菌１１００（１０９／ｄ、　　０．５μりを加え
、温度３０°Ｃで２時間４置したものを、１０μｇａｒ
ｎｅｔのＫｍを含むＴ−Ｙ培地上に撒き、温度３２℃で
２４時間培養し、溶源菌を得た。

組み換え体ＤＮＡを含有する溶源菌は、１０μｇ／ｄの
にｍを含有する培地で生育し、１．５μｇ／戚のＴｃを
含有する培地で生育せず、プラーク形成能を欠失してい
る株として選択する。この選択された溶源菌を［６コ記
載通り培養をし、このようにして得た培養液のうちＣＫ
の酵素活性を測定し、活性の高い株を選択した。

このようにして得られた活性の高い溶源菌を培養し、項
目［３］のようにして組み換え体バクテリオファージＤ
ＮＡを得た。

以上の如くして大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）１１００（５０
１ＣＫ（ｌａｃＰ）３＾ＣＫ）を分離した。なお、該形
質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
菌寄第２７３４号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７３４）として
寄託されている。

（２）組み換え体バクテリオファージλＥＮ５０１５Ｃ
Ｋ（１ａｃＰ）　３　Ｄ　Ｎ　Ａ及びバクテリオファー
ジ５０１Ｃに（１ａｃＰ）　３　ＡＣＫ　Ｄ　Ｎ　Ａに
よる溶源菌を培養して得らｈｆ、：、菌体のＣＫ、ＡＣ
Ｋ活性及びクレアチンリンＭ佳成能。

かくして得られた溶源菌、すなわち大腸菌１１００（Ｅ
Ｎ５０１Ｓ−ＣＫ（ｌａｃＰ）　３及び大腸菌１１００
（ＥＮ５０１Ｓ−ＣＫ（１ａｃＰ）　３八ＣＫの保有す
るＣＫ及びＡＣＫ活性を第４表に示した。

なお、各酵素活性は、Ｔ−Ｙ培地で前記項目［６］に記
載の方法に従い培養した菌体より調製した菌体抽出液を
用いて行なった。

また酵素活性は、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２３４巻、第３２０１
〜３２ｏ４頁（１９５９年）及びジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）、第１４４巻、第６７２〜６８２頁（１９
８０）記載の方法で行なった。

第４表 レアチンからの転換率（％）で第５表に示す。

第５表 大腸菌１１００（ＥＮ５０１Ｓ−ＣＫ（ＩａｃＰ）３）
及び大腸菌１１００（ＥＮ５０１Ｓ−ＣＫ（１ａｃＰ）
３ＡＣＫ１）は、Ｔ−Ｙ培地を用い項目［６］に記載の
方法に従い培養し、このようにして得られた菌体を夫々
凍結、融解後、超音波破裂処理を行い溶菌させたものを
粗酵素液として用いた。

この粗酵素液に２０１クレアチン、２０ｍＭ塩化マグネ
シウム、２０又は０．２ｍＭ　ＡＴＰ　、２０又は３９
．８ｍＭアセチルリン酸および１００ｍＭグリシン−Ｎ
ａＯＨ（ｐＨ９，０）緩衝液を加え、温度３０°Ｃで１
時間反応を行い、かくして反応液中に生成したクレアチ
ンリン酸をり

【図面の簡単な説明】

第１図は組換えバクテリオファージ５０１ＧＩ　（１ａ
ｃＰ）２ＡＣＫＩＧ　ＩＩ　（１ａｃＰ）　Ｉ　Ｄ　Ｎ
　Ａの制限酵素開裂地図を示す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＡＴＰをＡＤＰに変換して生理活性物質を合成せ
   しめる酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ及びア
   セテート・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤ
   ＮＡをベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規
   な組み換え体ＤＮＡ。
2. （２）ＡＴＰをＡＤＰに変換して生理活性物質を合成せ
   しめる酵素がγ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素
   及びグルタチオン合成酵素である請求項１記載の新規な
   組み換え体ＤＮＡ。
3. （３）ＡＴＰをＡＤＰに変換して生理活性物質を合成せ
   しめる酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ及びア
   セテート・カイネースをコードする遺伝子を含有するＤ
   ＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含
   み、生理活性物質生産能を有するエッシェリシア属に属
   する微生物を培地に培養し、培養物より生理活性物質を
   採取することを特徴とする生理活性物質の製造法。
4. （４）ＡＴＰをＡＤＰに変換して生理活性物質を合成せ
   しめる酵素がγ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素
   及びグルタチオン合成酵素であり、生理活性物質がグル
   タチオンである請求項３記載の生理活性物質の製造法。
5. （５）γ−グルタミル−Ｌ−システイン合成酵素をコー
   ドする遺伝子を含有するＤＮＡ、グルタチオン合成酵素
   をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ及びアセテート・
   カイネースをコードする遺伝子を含有するＤＮＡをベク
   ターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、グルタ
   チオン生産能を有するエッシェリシア属に属する微生物
   を培地に培養して得られる微生物菌体及び／又は該微生
   物菌体処理物を、グルタミン酸、システイン、グリシン
   、アデノシン−５′−３リン酸、アセチルリン酸及びマ
   グネシウムイオンと接触作用させてグルタチオンを生成
   させることを特徴とするグルタチオンの製造法。