JPH0322945B2 - - Google Patents
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- JPH0322945B2 JPH0322945B2 JP59196523A JP19652384A JPH0322945B2 JP H0322945 B2 JPH0322945 B2 JP H0322945B2 JP 59196523 A JP59196523 A JP 59196523A JP 19652384 A JP19652384 A JP 19652384A JP H0322945 B2 JPH0322945 B2 JP H0322945B2
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- antibody
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description
産業上の利用分野
本発明は、免疫複合体病の患者の血液、血漿あ
るいは、その他の体液中に存在する免疫複合体
（抗原抗体複合物）の測定に有用な、抗C3抗体−
Facbフラグメントを固定した免疫複合体測定用
試薬、及びそれを用いた免疫複合体の免疫学的測
定法に関するものである。 従来の技術 免疫複合体病は、慢性関節リウマチ（RA）、
全身性エリテマト−デス（SLE）、慢性糸球体腎
炎、腫瘍等の内因性の自己抗原による疾病と、急
性糸球体腎炎、白血病等の外来性抗原による疾病
に分けられる。免疫複合体の形成は生体の防御反
応の１つであり、健康人では免疫複合体の形成
後、網内系細胞やその他の食細胞にとり込まれて
速やかに処理されるわけである。しかし抗原刺激
が持続して免疫複合体が大量に発生したり、網内
系等に処理されえない性状になると、免疫複合体
は血液血清あるいは体液中に残存し、組織に沈着
し、組織の破壊へと導びくことになる。それ故に
血液血清あるいは体液中の免疫複合体の定量は、
これらの疾患の診断および治療法に重要な情報を
提供することになる。 現在、血液中または体液中の免疫複合体を定量
的に測定しうる種々の方法が知られており、これ
らは以下にに示すごとく、物理化学的方法および
生物学的特徴に基ずく方法の二種類に大きく分類
しうる。 １ 物理化学的方法 分析用超遠心分離、庶糖密度勾配遠心法、ゲ
ルロ過、限外ロ過、電気泳動、PEG沈殿法、
低温沈降法。 ２ 免疫複合体の生物学的特徴に基づく方法 (a) 補体関連技術 C1q沈降法、C1q−PEG沈殿法、C1q−偏差
試験、C1q−固相法、C3沈降分析、Kg固相
法、抗C3−Ｆ（ab′）2固相法。 (b) 抗グロブリン技術 pRF法、mRF法。 (c) 細胞技術 血小板凝集試験、ヒト赤血球ロゼツト形全
試験。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、物理化学的方法は特異性が低い
という欠点があり、また、生物学的特徴に基づく
方法は、原料蛋白の入手の困難性や安定性が悪い
という問題がある。これらの方法の中では、抗
C3−Ｆ（ab′）2固相法が比較的優れた方法である
が、この方法は以下に述べる様な問題を有してい
る。 即ち、抗C3−Ｆ（ab′）2固相法（Pereira、A.B.、
J.Immunol.125、763−770）（特表昭57−500207
号参照）は、その抗C3の入手容易性からC3を結
合している免疫複合体の検出に広く用いられてお
り、この方法は、リウマチ因子（RF）との関与
を測定系から排除するために抗C3抗体のＦ
（ab′）2フラグメントを使用している（RFはFcと
結合する）。しかし、この方法は、RA、SLE等
の患者血清中に存在する自己抗体であるペプシン
アグルチネータ（Ｆ（ab′）2を認識する自己抗体）
（Osterland、C.K.Vox Sang.、８，133、1963）
により、しばしば検査成績が修飾されるという欠
点を有している。 問題点を解決するための手段（その１） 本発明者は、かかる事情に鑑みて免疫複合体を
特異的に定量する方法を開発すべく鋭意研究の結
果、抗C3抗体のCH3ドメインを除去したFacbフ
ラグメント（M.Colomb、R.R.Porter、
Biochem.J.145，177（1975）参照）を用いると、
患者血清中のRFおよびペプシンアグルチネータ
の関与を排除することができ、そして免疫複合体
を特異的に測定することが可能であることを確認
し、本発明に到達した。 即ち、本発明は、抗C3抗体−Facbフラグメン
トを固定化せしめた免疫複合体測定用試薬および
抗C3抗体−Facbフラグメントを固定化した試薬
を、ヒトの血清あるいは体液と接触せしめ、試薬
と結合した免疫複合体に、酵素標識または放射性
物質標識若しくは螢光標識した抗イムノグロブリ
ン抗体またはブドウ球菌蛋白Ａ（プロテインＡ、
Feを認識）を作用させることにより、血清中あ
るいは体液中の免疫複合体を測定する方法であ
る。 本発明の抗C3抗体Facbフラグメントを得るた
めに用いる抗C3抗体は、兎、山羊、羊、馬、ラ
ツト、マウス、ブタ等に、ヒトC3またはヒトC3
由来分画あるいは他の動物のC3またはC3由来分
画を免疫して得られたイムノグロブリン分画であ
る。特に、ヒトのC3で免疫して得られた兎イム
ノグロブリンＧが好ましい。C3由来分画とは、
C3a、3b、3c、3dや兎免疫原性を有するさらに小
さな分画をいう。また、抗C3抗体として、モノ
クローナル抗体を用いることもできる。 抗C3抗体−Facbフラグメントは次のようにし
て得られる。 即ち、抗C3抗体のイムノグロブリン分画を採
取し、酸処理後、プラスミンやトリプシン等の蛋
白分解酵素により加水分解し、次いでゲルロ過、
イオン交換、電気泳動、クロマトフオーカシン
グ、プロテインＡ固定Sepharose4Bのアフイニテ
イカラム等を用いて精製し、抗C3抗体Facbフラ
グメントを得る。かくして、抗C3抗体のCH3ド
メインが除去された抗C3抗体−Facbフラグメン
トが得られる。 かくして得られた抗C3抗体−Facフラグメント
は、、測定用試薬とするために適当な担体に固定
される。固定化の方法は公知の方法を採用でき、
担体としては固相の、例えば、ポリスチレン、ポ
リエチレン、ポリアクリレート、テフロンポリア
セタール等を用いた、ボール、ビーズ、ギヤ、マ
イクロプレートが好ましく使用される。 作 用 本発明の固定化抗C3抗体Facbフラグメントは、
免疫複合体病の患者の血液、血清あるいはその他
の体液に存在するリウマチ因子およびペプシンア
グルチネータの本測定系への関与を排除し、免疫
複合体に対して特異的に反応し、免疫複合体の定
量に極めて有用である。 本発明における抗C3抗体Facbフラグメントが
リウマチ因子と反応しない理由の１つとしては、
リウマチ因子のイムノグロブリンＧ上の認識部位
が、IgＧのCH3ドメインないしCH2−CH3ドメイ
ンの接続部と考えられており、抗C3抗体Facbフ
ラグメントは、これらの部分を有さないからであ
る。 一方、ペプシンアグルチネータのイムノグログ
ロブリンＧ上の認識部位は、ペプシンを用いたイ
ムノグロブリンＧの切断にて新たにあらわれた切
断部位（Ｆ（ab′）2の切断部位）、または立体構造
であり、Facbは、切断部位においてＦ（ab′）2と
明らかに異なる構造を有することが、抗C3抗体
Facbフラグメントがペプシンアグルチネータと
反応しない理由の１つであると推定される。 従つて、本発明では抗C3抗体Facbフラグメン
トを１つの構成成分とする免疫複合体の測定用試
薬およびそれを用いた免疫複合体の測定方法が提
供される。 問題点を解決するための手段（その２） 免疫複合体の測定法としては、抗C3抗体Facb
フラグメントを好ましく固相に固定し、これとヒ
ト血清あるいは体液試料中の免疫複合体とが相互
作用するようにし、免疫複合体中のC3部分と抗
C3抗体Facbフラグメントとの反応で固相に結合
された免疫複合体の量を、免疫複合体中の免疫グ
ロブリンと結合する、放射性物質又は酵素若しく
は螢光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体ま
たはブドウ球菌蛋白Ａとの２次反応により測定す
る。標識剤としては、酵素を用いる方法（EIA）
ではホースラデイシユパーオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、アルカリフオスフアターゼ
等の酵素が放射性物質を用いる方法（RIA）では
125I、 3H等が、螢光物質を用いる方法（FIA）
ではフルオレセンイソチオサイアネート等が通常
使用されるが、その標識剤の活性が設定可能であ
れば、その他のものであつてもよい。 標識剤が酵素である場合にはその活性を測定す
るために基質が用いられる。基質としては例え
ば、ホースラデイツシユパーオキシダーゼの基質
として、２−2′アジノジ−〔３−エチルベンズチ
アゾリンスルホン酸(6)〕アンモニウム塩
（ABTS）−H2O2、５−アミノサリチル酸−
H2O2、Ｏ−フエニレンジアミン−H2O2、４−ア
ミノアンチピリン−H2O2などがβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの基質として、フルオレセイン−ジ−
（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、Ｏ−ニトロフエ
ノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを挙げ
ることが出来る。測定のためには、これらの試薬
以外にも溶解剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の
試薬が使用される。 本発明を以下実施例によつて説明するが、これ
によつて限定されるものではない。 実施例 １ (1) 兎抗ヒトC3抗体−Facbフラグメントの製造 ヒト血漿から精製したC3とフロイント完全
アジユバントを１：１に混合しＷ／Ｏエマルジ
ヨンを作成し、これを２週間毎に２mlずつ家兎
に免疫した。４回目の免疫から10日後、全採血
を行ない抗血清を採取した。採取した抗血清に
同量のPBSを加え、次いで２倍量の飽和硫安
を除々に加え沈殿物を遠沈し、PBSにて再溶
解させ0.01MPB（PH8.0）にて透析後、
0.01MPBにて平衡化したDEAEカラムにより、
IgＧ分画を採取した（兎ヒトC3−IgＧ）。 IgＧ分画（５mg／ml）２mlを、1NHClによ
りPH2.5に調節し、30℃で15分インキユベート
し、1NNaOHによりPH7.0にもどし、直ちにプ
ラスミン5casein unitを加え、30℃で10分間反
応させた。反応後直ちに氷冷し、リジン
Sepharoseカラムにてプラスミンを除去し、プ
ロテインＡセフアロースカラムにて未反応IgＧ
を除去し、PBSにて一昼夜４℃にて透析を行
ない、抗C3抗体Facbフラグメントを得た。 (2) イムノアツセイ試薬の調整 (2‐1) 抗C3抗体Facbフラグメントをボール又
はプレートに固定する方法 前記(1)により得られた抗ヒト−C3抗体
Facbフラグメントを、タンパク濃度30μｇ／
mlになるようにリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）にて調整し、これにポリスチレンボ
ールを加えて３昼夜浸漬し、抗ヒトC3抗体
Facbフラグメント固定ポリスチレンボール
を得た。次に、これを0.5％BSA−PBSにて
１昼夜浸漬した。 前記(1)により得られた抗ヒトC3抗体Facb
フラグメントを、タンパク濃度20μｇ／mlに
なるように0.1M炭酸緩衝液（PH9.6）にて調
整し、これをEIA用マイクロプレートに各
200μ／well加え、３昼夜浸漬し、抗ヒト
C3抗体Facbフラグメント固定マイクロプレ
ートを得た。 (2‐2) その他の試薬の調整 HRP（ホース ラデイシユ パーオキシダ
ーゼ）用基質液は、0.1Mリン酸／クエン酸
緩衝液（PH4.5）中に、ABTS50mg／dlと
2MH2O250μ／dlを含む。 HRP用停止液は、0.2Mシユウ酸を用い
た。 実施例 ２ EIAによるIgＡクラス免疫複合体の測定 実施例１により得られた抗ヒトC3抗体Facbフ
ラグメント固定ポリスチレンボールに、患者血清
200倍希釈液500μを加え、37℃で１時間反応さ
せた。PBSにて洗浄後、HRP標識抗ヒトイムノ
グロブリンＡを加え、37℃１時間反応させた。洗
浄後、HRP用基質液400μにて37℃30分発色さ
せ、停止液にて反応を停止した。ヒトIgＡとヒト
C3の化学結合物を検量線用標準物質として、血
清中の免疫複合体を定量した。抗ヒトC3−Ｆ
（ab′）2および抗ヒトC3−IgＧを固定したボールに
よる測定も同時に行なつた。 患者血清の測定値は第１表に示した。第１表よ
り明らかな通り、本発明による抗C3−Facb固相
法が、RF、ペプシンアグルチネータによる測定
値の修飾を回避している。
るいは、その他の体液中に存在する免疫複合体
（抗原抗体複合物）の測定に有用な、抗C3抗体−
Facbフラグメントを固定した免疫複合体測定用
試薬、及びそれを用いた免疫複合体の免疫学的測
定法に関するものである。 従来の技術 免疫複合体病は、慢性関節リウマチ（RA）、
全身性エリテマト−デス（SLE）、慢性糸球体腎
炎、腫瘍等の内因性の自己抗原による疾病と、急
性糸球体腎炎、白血病等の外来性抗原による疾病
に分けられる。免疫複合体の形成は生体の防御反
応の１つであり、健康人では免疫複合体の形成
後、網内系細胞やその他の食細胞にとり込まれて
速やかに処理されるわけである。しかし抗原刺激
が持続して免疫複合体が大量に発生したり、網内
系等に処理されえない性状になると、免疫複合体
は血液血清あるいは体液中に残存し、組織に沈着
し、組織の破壊へと導びくことになる。それ故に
血液血清あるいは体液中の免疫複合体の定量は、
これらの疾患の診断および治療法に重要な情報を
提供することになる。 現在、血液中または体液中の免疫複合体を定量
的に測定しうる種々の方法が知られており、これ
らは以下にに示すごとく、物理化学的方法および
生物学的特徴に基ずく方法の二種類に大きく分類
しうる。 １ 物理化学的方法 分析用超遠心分離、庶糖密度勾配遠心法、ゲ
ルロ過、限外ロ過、電気泳動、PEG沈殿法、
低温沈降法。 ２ 免疫複合体の生物学的特徴に基づく方法 (a) 補体関連技術 C1q沈降法、C1q−PEG沈殿法、C1q−偏差
試験、C1q−固相法、C3沈降分析、Kg固相
法、抗C3−Ｆ（ab′）2固相法。 (b) 抗グロブリン技術 pRF法、mRF法。 (c) 細胞技術 血小板凝集試験、ヒト赤血球ロゼツト形全
試験。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、物理化学的方法は特異性が低い
という欠点があり、また、生物学的特徴に基づく
方法は、原料蛋白の入手の困難性や安定性が悪い
という問題がある。これらの方法の中では、抗
C3−Ｆ（ab′）2固相法が比較的優れた方法である
が、この方法は以下に述べる様な問題を有してい
る。 即ち、抗C3−Ｆ（ab′）2固相法（Pereira、A.B.、
J.Immunol.125、763−770）（特表昭57−500207
号参照）は、その抗C3の入手容易性からC3を結
合している免疫複合体の検出に広く用いられてお
り、この方法は、リウマチ因子（RF）との関与
を測定系から排除するために抗C3抗体のＦ
（ab′）2フラグメントを使用している（RFはFcと
結合する）。しかし、この方法は、RA、SLE等
の患者血清中に存在する自己抗体であるペプシン
アグルチネータ（Ｆ（ab′）2を認識する自己抗体）
（Osterland、C.K.Vox Sang.、８，133、1963）
により、しばしば検査成績が修飾されるという欠
点を有している。 問題点を解決するための手段（その１） 本発明者は、かかる事情に鑑みて免疫複合体を
特異的に定量する方法を開発すべく鋭意研究の結
果、抗C3抗体のCH3ドメインを除去したFacbフ
ラグメント（M.Colomb、R.R.Porter、
Biochem.J.145，177（1975）参照）を用いると、
患者血清中のRFおよびペプシンアグルチネータ
の関与を排除することができ、そして免疫複合体
を特異的に測定することが可能であることを確認
し、本発明に到達した。 即ち、本発明は、抗C3抗体−Facbフラグメン
トを固定化せしめた免疫複合体測定用試薬および
抗C3抗体−Facbフラグメントを固定化した試薬
を、ヒトの血清あるいは体液と接触せしめ、試薬
と結合した免疫複合体に、酵素標識または放射性
物質標識若しくは螢光標識した抗イムノグロブリ
ン抗体またはブドウ球菌蛋白Ａ（プロテインＡ、
Feを認識）を作用させることにより、血清中あ
るいは体液中の免疫複合体を測定する方法であ
る。 本発明の抗C3抗体Facbフラグメントを得るた
めに用いる抗C3抗体は、兎、山羊、羊、馬、ラ
ツト、マウス、ブタ等に、ヒトC3またはヒトC3
由来分画あるいは他の動物のC3またはC3由来分
画を免疫して得られたイムノグロブリン分画であ
る。特に、ヒトのC3で免疫して得られた兎イム
ノグロブリンＧが好ましい。C3由来分画とは、
C3a、3b、3c、3dや兎免疫原性を有するさらに小
さな分画をいう。また、抗C3抗体として、モノ
クローナル抗体を用いることもできる。 抗C3抗体−Facbフラグメントは次のようにし
て得られる。 即ち、抗C3抗体のイムノグロブリン分画を採
取し、酸処理後、プラスミンやトリプシン等の蛋
白分解酵素により加水分解し、次いでゲルロ過、
イオン交換、電気泳動、クロマトフオーカシン
グ、プロテインＡ固定Sepharose4Bのアフイニテ
イカラム等を用いて精製し、抗C3抗体Facbフラ
グメントを得る。かくして、抗C3抗体のCH3ド
メインが除去された抗C3抗体−Facbフラグメン
トが得られる。 かくして得られた抗C3抗体−Facフラグメント
は、、測定用試薬とするために適当な担体に固定
される。固定化の方法は公知の方法を採用でき、
担体としては固相の、例えば、ポリスチレン、ポ
リエチレン、ポリアクリレート、テフロンポリア
セタール等を用いた、ボール、ビーズ、ギヤ、マ
イクロプレートが好ましく使用される。 作 用 本発明の固定化抗C3抗体Facbフラグメントは、
免疫複合体病の患者の血液、血清あるいはその他
の体液に存在するリウマチ因子およびペプシンア
グルチネータの本測定系への関与を排除し、免疫
複合体に対して特異的に反応し、免疫複合体の定
量に極めて有用である。 本発明における抗C3抗体Facbフラグメントが
リウマチ因子と反応しない理由の１つとしては、
リウマチ因子のイムノグロブリンＧ上の認識部位
が、IgＧのCH3ドメインないしCH2−CH3ドメイ
ンの接続部と考えられており、抗C3抗体Facbフ
ラグメントは、これらの部分を有さないからであ
る。 一方、ペプシンアグルチネータのイムノグログ
ロブリンＧ上の認識部位は、ペプシンを用いたイ
ムノグロブリンＧの切断にて新たにあらわれた切
断部位（Ｆ（ab′）2の切断部位）、または立体構造
であり、Facbは、切断部位においてＦ（ab′）2と
明らかに異なる構造を有することが、抗C3抗体
Facbフラグメントがペプシンアグルチネータと
反応しない理由の１つであると推定される。 従つて、本発明では抗C3抗体Facbフラグメン
トを１つの構成成分とする免疫複合体の測定用試
薬およびそれを用いた免疫複合体の測定方法が提
供される。 問題点を解決するための手段（その２） 免疫複合体の測定法としては、抗C3抗体Facb
フラグメントを好ましく固相に固定し、これとヒ
ト血清あるいは体液試料中の免疫複合体とが相互
作用するようにし、免疫複合体中のC3部分と抗
C3抗体Facbフラグメントとの反応で固相に結合
された免疫複合体の量を、免疫複合体中の免疫グ
ロブリンと結合する、放射性物質又は酵素若しく
は螢光物質で標識された抗免疫グロブリン抗体ま
たはブドウ球菌蛋白Ａとの２次反応により測定す
る。標識剤としては、酵素を用いる方法（EIA）
ではホースラデイシユパーオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、アルカリフオスフアターゼ
等の酵素が放射性物質を用いる方法（RIA）では
125I、 3H等が、螢光物質を用いる方法（FIA）
ではフルオレセンイソチオサイアネート等が通常
使用されるが、その標識剤の活性が設定可能であ
れば、その他のものであつてもよい。 標識剤が酵素である場合にはその活性を測定す
るために基質が用いられる。基質としては例え
ば、ホースラデイツシユパーオキシダーゼの基質
として、２−2′アジノジ−〔３−エチルベンズチ
アゾリンスルホン酸(6)〕アンモニウム塩
（ABTS）−H2O2、５−アミノサリチル酸−
H2O2、Ｏ−フエニレンジアミン−H2O2、４−ア
ミノアンチピリン−H2O2などがβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの基質として、フルオレセイン−ジ−
（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、Ｏ−ニトロフエ
ノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどを挙げ
ることが出来る。測定のためには、これらの試薬
以外にも溶解剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の
試薬が使用される。 本発明を以下実施例によつて説明するが、これ
によつて限定されるものではない。 実施例 １ (1) 兎抗ヒトC3抗体−Facbフラグメントの製造 ヒト血漿から精製したC3とフロイント完全
アジユバントを１：１に混合しＷ／Ｏエマルジ
ヨンを作成し、これを２週間毎に２mlずつ家兎
に免疫した。４回目の免疫から10日後、全採血
を行ない抗血清を採取した。採取した抗血清に
同量のPBSを加え、次いで２倍量の飽和硫安
を除々に加え沈殿物を遠沈し、PBSにて再溶
解させ0.01MPB（PH8.0）にて透析後、
0.01MPBにて平衡化したDEAEカラムにより、
IgＧ分画を採取した（兎ヒトC3−IgＧ）。 IgＧ分画（５mg／ml）２mlを、1NHClによ
りPH2.5に調節し、30℃で15分インキユベート
し、1NNaOHによりPH7.0にもどし、直ちにプ
ラスミン5casein unitを加え、30℃で10分間反
応させた。反応後直ちに氷冷し、リジン
Sepharoseカラムにてプラスミンを除去し、プ
ロテインＡセフアロースカラムにて未反応IgＧ
を除去し、PBSにて一昼夜４℃にて透析を行
ない、抗C3抗体Facbフラグメントを得た。 (2) イムノアツセイ試薬の調整 (2‐1) 抗C3抗体Facbフラグメントをボール又
はプレートに固定する方法 前記(1)により得られた抗ヒト−C3抗体
Facbフラグメントを、タンパク濃度30μｇ／
mlになるようにリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）にて調整し、これにポリスチレンボ
ールを加えて３昼夜浸漬し、抗ヒトC3抗体
Facbフラグメント固定ポリスチレンボール
を得た。次に、これを0.5％BSA−PBSにて
１昼夜浸漬した。 前記(1)により得られた抗ヒトC3抗体Facb
フラグメントを、タンパク濃度20μｇ／mlに
なるように0.1M炭酸緩衝液（PH9.6）にて調
整し、これをEIA用マイクロプレートに各
200μ／well加え、３昼夜浸漬し、抗ヒト
C3抗体Facbフラグメント固定マイクロプレ
ートを得た。 (2‐2) その他の試薬の調整 HRP（ホース ラデイシユ パーオキシダ
ーゼ）用基質液は、0.1Mリン酸／クエン酸
緩衝液（PH4.5）中に、ABTS50mg／dlと
2MH2O250μ／dlを含む。 HRP用停止液は、0.2Mシユウ酸を用い
た。 実施例 ２ EIAによるIgＡクラス免疫複合体の測定 実施例１により得られた抗ヒトC3抗体Facbフ
ラグメント固定ポリスチレンボールに、患者血清
200倍希釈液500μを加え、37℃で１時間反応さ
せた。PBSにて洗浄後、HRP標識抗ヒトイムノ
グロブリンＡを加え、37℃１時間反応させた。洗
浄後、HRP用基質液400μにて37℃30分発色さ
せ、停止液にて反応を停止した。ヒトIgＡとヒト
C3の化学結合物を検量線用標準物質として、血
清中の免疫複合体を定量した。抗ヒトC3−Ｆ
（ab′）2および抗ヒトC3−IgＧを固定したボールに
よる測定も同時に行なつた。 患者血清の測定値は第１表に示した。第１表よ
り明らかな通り、本発明による抗C3−Facb固相
法が、RF、ペプシンアグルチネータによる測定
値の修飾を回避している。
【表】
実施例 ３
兎抗ヒトC3b抗体−Facbフラグメントの製造
J.O.Minta等の方法（J.Immunol.118、2192
（1977））で調整したヒトC3bを抗原に用いて、実
施例１と同様の方法で兎に免疫することによつて
兎ヒトC3b抗体を調整し、酵素による消化処理を
施して、兎抗ヒトC3b抗体Facbフラグメントを
得た。これを用いて、実施例１と同様にして、免
疫複合体測定用試薬のポリスチレンボールを作成
した。 実施例 ４ RIAによる免疫複合体の測定 実施例３で得られた抗ヒトC3b抗体Facbフラ
グメント固定ポリスチレンボールに、患者血清
200倍希釈PBSを500μ加え、37℃で１時間反応
させた。PBSにて洗浄した後 125I標識抗ヒトイ
ムノグロブリンを加え、37℃で１時間反応させ
た。洗浄後、γ−カウンターにて測定し、熱凝集
IgＧを検量線用標準物質として定量を行なつた。
比較実験として、抗ヒトC3−Ｆ（ab′）2および抗ヒ
トC3−IgＧを固定したボールによる測定も同時に
行なつた。 患者血清の測定結果を第２表に示した。第２表
より明らかなように、本発明による抗C3b−
Facb固相法が、RF、ペプシンアグルチネータに
よる測定値の修飾を回避している。
（1977））で調整したヒトC3bを抗原に用いて、実
施例１と同様の方法で兎に免疫することによつて
兎ヒトC3b抗体を調整し、酵素による消化処理を
施して、兎抗ヒトC3b抗体Facbフラグメントを
得た。これを用いて、実施例１と同様にして、免
疫複合体測定用試薬のポリスチレンボールを作成
した。 実施例 ４ RIAによる免疫複合体の測定 実施例３で得られた抗ヒトC3b抗体Facbフラ
グメント固定ポリスチレンボールに、患者血清
200倍希釈PBSを500μ加え、37℃で１時間反応
させた。PBSにて洗浄した後 125I標識抗ヒトイ
ムノグロブリンを加え、37℃で１時間反応させ
た。洗浄後、γ−カウンターにて測定し、熱凝集
IgＧを検量線用標準物質として定量を行なつた。
比較実験として、抗ヒトC3−Ｆ（ab′）2および抗ヒ
トC3−IgＧを固定したボールによる測定も同時に
行なつた。 患者血清の測定結果を第２表に示した。第２表
より明らかなように、本発明による抗C3b−
Facb固相法が、RF、ペプシンアグルチネータに
よる測定値の修飾を回避している。
【表】
実施例 ５
兎抗ヒトC3d抗体−Facbフラグメントの製造
DAKO社製抗ヒトC3d抗体IgＧを用いて、実施
例１と同様の方法で、兎抗ヒトC3d抗体Facbフ
ラグメントを得た。これを用いて、実施例１と同
様にして、免疫複合体測定用試薬のマイクロプレ
ートを得た。 実施例 ６ EIAによる免疫複合体の測定 実施例５で得られた抗ヒトC3d抗体Facbフラ
グメント固定マイクロプレートに、患者血清100
倍希釈PBSを200μ加え、37℃で１時間反応さ
せた。PBSにて洗浄後、HRP標識抗ヒトイムノ
グロブリンを加え、37℃で１時間反応させた。洗
浄後、HRP用基質液200μにて37℃で20分発色
させ、マイクロイライザ用リーダを用い405nｍ
にて測定した。ヒトIgＧとヒトC3の化学結合物を
検量線用標準物質として定量を行なつた。比較実
験として、抗C3−Ｆ（ab′）2、および抗C3−IgＧを
固定したマイクロプレートによる測定も同時に行
なつた。 患者血清の測定結果を第３表に示した。第３表
より明らかなように、本発明による抗C3d−
Facb固相法が、リウマチ因子、ペプシンアグル
チネータによる測定値の修飾を回避している。
例１と同様の方法で、兎抗ヒトC3d抗体Facbフ
ラグメントを得た。これを用いて、実施例１と同
様にして、免疫複合体測定用試薬のマイクロプレ
ートを得た。 実施例 ６ EIAによる免疫複合体の測定 実施例５で得られた抗ヒトC3d抗体Facbフラ
グメント固定マイクロプレートに、患者血清100
倍希釈PBSを200μ加え、37℃で１時間反応さ
せた。PBSにて洗浄後、HRP標識抗ヒトイムノ
グロブリンを加え、37℃で１時間反応させた。洗
浄後、HRP用基質液200μにて37℃で20分発色
させ、マイクロイライザ用リーダを用い405nｍ
にて測定した。ヒトIgＧとヒトC3の化学結合物を
検量線用標準物質として定量を行なつた。比較実
験として、抗C3−Ｆ（ab′）2、および抗C3−IgＧを
固定したマイクロプレートによる測定も同時に行
なつた。 患者血清の測定結果を第３表に示した。第３表
より明らかなように、本発明による抗C3d−
Facb固相法が、リウマチ因子、ペプシンアグル
チネータによる測定値の修飾を回避している。
【表】
発明の効果
以上、詳記したように、本発明によりリウマチ
因子及びペプシンアグルチネータの干渉を排除し
て、患者血清中等の免疫複合体の濃度を、正確に
測定することが初めて可能になつた。従つて、患
者血清中等の免疫複合体量と病態との関係につい
て妨害因子なしに正確な対応を知ることが可能に
なり、本発明は、免疫疾患等の診断及び病理研究
等に有用な方法を提供しうるものである。
因子及びペプシンアグルチネータの干渉を排除し
て、患者血清中等の免疫複合体の濃度を、正確に
測定することが初めて可能になつた。従つて、患
者血清中等の免疫複合体量と病態との関係につい
て妨害因子なしに正確な対応を知ることが可能に
なり、本発明は、免疫疾患等の診断及び病理研究
等に有用な方法を提供しうるものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗C3抗体−Facbフラグメントを固定化せし
めた免疫複合体測定用試薬。 ２ 抗C3抗体−Facbフラグメントが抗ヒトC3抗
体−Facbフラグメントである、特許請求の範囲
第１項記載の免疫複合体測定用試薬。 ３ 抗C3抗体−Facbフラグメントが兎抗ヒトC3
抗体−Facbフラグメントである特許請求の範囲
第１項記載の免疫複合体測定用試薬。 ４ 抗C3抗体−Facbフラグメントを固定化した
免疫複合体測定用試薬を、ヒトの血清あるいは体
液と接触せしめ、試薬と結合した免疫複合体に、
酵素標識または放射性物質標識若しくは螢光標識
した抗イムノグロフリン抗体またはブドウ球菌蛋
白Ａを作用させることを特徴とする血清中あるい
は体液中の免疫複合体の測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59196523A JPS6175262A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | 免疫複合体測定用試薬及びそれを用いた免疫複合体の測定法 |
| EP85306451A EP0178779B1 (en) | 1984-09-21 | 1985-09-11 | Reagents for measurement of immune complexes and method for measurement of immune complexes by use thereof |
| DE8585306451T DE3572034D1 (en) | 1984-09-21 | 1985-09-11 | Reagents for measurement of immune complexes and method for measurement of immune complexes by use thereof |
| US06/778,097 US4978611A (en) | 1984-09-21 | 1985-09-20 | Reagents for measurement of immune complexes and method for measurement of immune complexes by use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59196523A JPS6175262A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | 免疫複合体測定用試薬及びそれを用いた免疫複合体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6175262A JPS6175262A (ja) | 1986-04-17 |
| JPH0322945B2 true JPH0322945B2 (ja) | 1991-03-27 |
Family
ID=16359154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59196523A Granted JPS6175262A (ja) | 1984-09-21 | 1984-09-21 | 免疫複合体測定用試薬及びそれを用いた免疫複合体の測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4978611A (ja) |
| EP (1) | EP0178779B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6175262A (ja) |
| DE (1) | DE3572034D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991013352A1 (en) * | 1990-03-02 | 1991-09-05 | Brigham And Women's Hospital | Complement components and binding ligands in fertility |
| US6277975B1 (en) * | 1992-10-23 | 2001-08-21 | Genetics Institute, Inc. | Fusions of P-selectin ligand protein and polynucleotides encoding same |
| EP0767377A1 (en) * | 1995-10-04 | 1997-04-09 | Dr. Fooke Laboratorien GmbH | Diagnosis of pneumococcal infection by measurement of antigen specific immune complexes |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2013211B (en) * | 1978-01-26 | 1982-06-30 | Technicon Instr | Immunoassays using f(ab')2 fragments |
| US4342566A (en) * | 1980-02-22 | 1982-08-03 | Scripps Clinic & Research Foundation | Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes |
| JPS56162056A (en) * | 1980-05-19 | 1981-12-12 | Eiken Kagaku Kk | Method for determining immunity using immunoglobulin fragment mixture sensitizing latex particles |
| GB2117514B (en) * | 1982-03-29 | 1985-08-29 | East Anglian Regional Health | Polyvalent antiglobulin reagent |
| DE3364347D1 (en) * | 1982-04-09 | 1986-08-07 | Fujirebio Kk | Anti immune complex antibody and preparation thereof |
-
1984
- 1984-09-21 JP JP59196523A patent/JPS6175262A/ja active Granted
-
1985
- 1985-09-11 DE DE8585306451T patent/DE3572034D1/de not_active Expired
- 1985-09-11 EP EP85306451A patent/EP0178779B1/en not_active Expired
- 1985-09-20 US US06/778,097 patent/US4978611A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3572034D1 (en) | 1989-09-07 |
| JPS6175262A (ja) | 1986-04-17 |
| EP0178779B1 (en) | 1989-08-02 |
| EP0178779A1 (en) | 1986-04-23 |
| US4978611A (en) | 1990-12-18 |
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