JPH03232486A - ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼの製造法 - Google Patents
ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼの製造法Info
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- JPH03232486A JPH03232486A JP2027740A JP2774090A JPH03232486A JP H03232486 A JPH03232486 A JP H03232486A JP 2027740 A JP2027740 A JP 2027740A JP 2774090 A JP2774090 A JP 2774090A JP H03232486 A JPH03232486 A JP H03232486A
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＥＣ
２，３，２，２）の製造法に関する。
２，３，２，２）の製造法に関する。
γ−グルタミルトランスベブチダーセ：ま、グルタチオ
ンを加水分解してグルタミン酸をｒｆ離する反応（１）
あるいはグルタチオンのＴ−グルタミル基をアミノ酸ま
たはペプチドに転移する反応（２）を触媒する酵素であ
る。
ンを加水分解してグルタミン酸をｒｆ離する反応（１）
あるいはグルタチオンのＴ−グルタミル基をアミノ酸ま
たはペプチドに転移する反応（２）を触媒する酵素であ
る。
加水分解反応
ｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ＋ＬＯ→Ｇｌｕ ＋ ’Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ（２）転移反応 本酵素をパン生地に添加することにより、パン比容の増
大、パン内相の改善およびパンの老化抑制ｌ；どの諸効
果が得られ、本酵素は製パン改良剤として有用な酵素で
ある（特開昭６０−２１３５＞。
ｙｓ−Ｇｌｙ（２）転移反応 本酵素をパン生地に添加することにより、パン比容の増
大、パン内相の改善およびパンの老化抑制ｌ；どの諸効
果が得られ、本酵素は製パン改良剤として有用な酵素で
ある（特開昭６０−２１３５＞。
従来の技術
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼは、高等動物から
細菌に５）たるまで広く存在することが知られているｊ
Ａ、Ｍｅｉｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓ Ｔａｔｅ ： Ａｎ
ｎ ＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ、、 ４５ 、５５９（１９
７６）） ａ該酵素は専ら研究用試薬として高等動物の
臓器などから分離、精製されてきた。細菌起源のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼにつし）では、プロテウ
ス・ミラピリ件および精製方法の研究ＪＨ，Ｋｕｍａｇ
ａ＋ ｅｔ ａｌ、 ：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、 １６０ 、３４１（１９８４）およびｌ（５ｕｚｕ
ｋ＋ｅｔ ａｌ、、：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１
６８ 、 １３２５（１９８６）〕がなされている。大
大腸由由のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子
のクローニング〔Ｈ，５ｕｚｕｋｉｅｔ ａｌ、
： Ｂ＋ｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃ
ｏｍｍｕｎ、、 １５０ 。
細菌に５）たるまで広く存在することが知られているｊ
Ａ、Ｍｅｉｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓ Ｔａｔｅ ： Ａｎ
ｎ ＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ、、 ４５ 、５５９（１９
７６）） ａ該酵素は専ら研究用試薬として高等動物の
臓器などから分離、精製されてきた。細菌起源のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼにつし）では、プロテウ
ス・ミラピリ件および精製方法の研究ＪＨ，Ｋｕｍａｇ
ａ＋ ｅｔ ａｌ、 ：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
、 １６０ 、３４１（１９８４）およびｌ（５ｕｚｕ
ｋ＋ｅｔ ａｌ、、：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１
６８ 、 １３２５（１９８６）〕がなされている。大
大腸由由のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子
のクローニング〔Ｈ，５ｕｚｕｋｉｅｔ ａｌ、
： Ｂ＋ｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃ
ｏｍｍｕｎ、、 １５０ 。
３３ （１９８８） ： もなされている。食品へ添加
するという該酵素の用途から、これら菌種に由来するｒ
−グルタミルトランスペプチダーゼは安全性の面で必
ずしも好ましくなし）。安全性が極めて高い納豆菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ） ［Ｄｅｂａｂｏ
ｖ、ν、Ｇ１１Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ＋ｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ＋ｌｌ＋″１３３１、＾
ｃａｄｅｍ＋ｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８２）コおよびバ
チルス・リチェニフォルミス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）がＴ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼを生産するという報告Ｊ原および上田
：発酵と工業 ４３゜９１０（１９８５） 、浅田ら：
１９８９年度日本農芸化学会大会講演要旨集、ｐ、
１２５：がある。納豆菌と極めて近縁のバチルス・ズブ
チリス（Ｂａｃ＋１ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ）がＴ−
グルタミルラジカルの転移活性を有する酵素を生産する
という報告ＣＶＩ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓａｎｄ Ｃ，Ｂ
、 Ｔｈｒｏｎｅ ： Ｊ、 Ｂ＋ｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
、 ２１０ 、２０３（１９５４）二 もある。これら
バチルス＠閑：二よる該酵素の生産性は低く、実用性は
乏しい。
するという該酵素の用途から、これら菌種に由来するｒ
−グルタミルトランスペプチダーゼは安全性の面で必
ずしも好ましくなし）。安全性が極めて高い納豆菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ） ［Ｄｅｂａｂｏ
ｖ、ν、Ｇ１１Ｔｈｅ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂ＋ｏｌ
ｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃ＋ｌｌ＋″１３３１、＾
ｃａｄｅｍ＋ｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８２）コおよびバ
チルス・リチェニフォルミス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）がＴ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼを生産するという報告Ｊ原および上田
：発酵と工業 ４３゜９１０（１９８５） 、浅田ら：
１９８９年度日本農芸化学会大会講演要旨集、ｐ、
１２５：がある。納豆菌と極めて近縁のバチルス・ズブ
チリス（Ｂａｃ＋１ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ）がＴ−
グルタミルラジカルの転移活性を有する酵素を生産する
という報告ＣＶＩ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓａｎｄ Ｃ，Ｂ
、 Ｔｈｒｏｎｅ ： Ｊ、 Ｂ＋ｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
、 ２１０ 、２０３（１９５４）二 もある。これら
バチルス＠閑：二よる該酵素の生産性は低く、実用性は
乏しい。
プソイドモナス属、プロテウス属あるいはアルトロバク
ター属微生物およびバチルス・ズブチリスの培養菌体か
ら該酵素を取得する方法が開示されてし）る（特開昭６
３−１８１９９６）が、生産性は低く、また、バチルス
・ズブチリスを除し）では、安全性の点から食品用酵素
を製造する方法としては、好ましく−一い。また、いず
れの微生物の場合も菌体を破砕する操作および破砕菌体
に由来する夾雑タンパク質を除く精製接作が必要である
ために、工業的利用には適さｔ；い。
ター属微生物およびバチルス・ズブチリスの培養菌体か
ら該酵素を取得する方法が開示されてし）る（特開昭６
３−１８１９９６）が、生産性は低く、また、バチルス
・ズブチリスを除し）では、安全性の点から食品用酵素
を製造する方法としては、好ましく−一い。また、いず
れの微生物の場合も菌体を破砕する操作および破砕菌体
に由来する夾雑タンパク質を除く精製接作が必要である
ために、工業的利用には適さｔ；い。
本発明力（解決しようとする課題
本発明：ま、製パン改良剤として有用な酵素であるＴ−
グルタミルトランスペプチダーゼについて、優れた主産
性および安全性を有する細菌菌株を提供することを１つ
の目的とし、さろに、該菌株を用′５）で、安価で簡便
な該酵素の製造法を提供することをもう１つの目的とし
ている。
グルタミルトランスペプチダーゼについて、優れた主産
性および安全性を有する細菌菌株を提供することを１つ
の目的とし、さろに、該菌株を用′５）で、安価で簡便
な該酵素の製造法を提供することをもう１つの目的とし
ている。
課題を解決するたｔの手段
任意の蛋白質あるし）は有用酵素を生産する菌株を育種
するため、これらの蛋白質あるいは酵素をコードする遺
伝子を生産菌株中で増幅し、遺伝子産物を大量に生産さ
せる手法が、近年、分子生物学の発展によって普遍的な
技術となりつつある。
するため、これらの蛋白質あるいは酵素をコードする遺
伝子を生産菌株中で増幅し、遺伝子産物を大量に生産さ
せる手法が、近年、分子生物学の発展によって普遍的な
技術となりつつある。
このような生産方法を採用しようとするとき、蓄積した
蛋白質を簡便に精製する手段および安全な宿主菌の選定
が重要な問題となる。バチルス属細菌は多量の蛋白質を
菌体外へ分泌する性質を有し、バチルス・ズブチリスは
、納豆菌と近縁な安全性の高い非病原性菌種である。
蛋白質を簡便に精製する手段および安全な宿主菌の選定
が重要な問題となる。バチルス属細菌は多量の蛋白質を
菌体外へ分泌する性質を有し、バチルス・ズブチリスは
、納豆菌と近縁な安全性の高い非病原性菌種である。
本発明者らは、バチルス・ズブチリスに属する菌株群の
中からγ−グルタミルトランスペプチダーゼを分泌生産
する菌株を検索し、生産菌として、例えば、バチルス・
ズブチリス５Ｊ１３８株を見出した。５ＪＬ３８株のＴ
−グルタミルトランスペプチダーゼ生産性は低いので、
生産性の改善を目的として研究を行った。すなわち該菌
株からＴグルタミルトランスペプチダーゼの遺伝子をり
ローニングし、さらに、この遺伝子をバチルス・ズブチ
リスのプラスミドベクター、例えば、プラスミドｐＵＢ
１１０あるいはその誘導体にセルフクローニングして、
組換え体プラスミドを作製した。繊組換え体プラスミド
を用５）で、バチルス属細菌、例えば、γ−グルタミル
トランスペプチダーゼ生産菌Ｓ 、Ｊ ｌ ３８株ある
いはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ非生産菌バチ
ルス・ズブチリス−マーバーブ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ）ＢＲ，１５１株〔
＾ＴＣＣ３３６７７、Ｄ Ｍ １ｌｉｉｌｌ＋ａｍｓ
ｅｔ ａＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４６ 、１１
６２（１９８１）：を形質転換することによって、Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を１輻させた菌
株を造成した。γグルタミルトランスペプチダーゼ遺伝
子増幅株を培養した培養物からは、もとのγ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ生産菌５Ｊ１３８株の培養物と
比べて、高収率で該酵素を取得できることを見出し、本
発明を完成する至った。
中からγ−グルタミルトランスペプチダーゼを分泌生産
する菌株を検索し、生産菌として、例えば、バチルス・
ズブチリス５Ｊ１３８株を見出した。５ＪＬ３８株のＴ
−グルタミルトランスペプチダーゼ生産性は低いので、
生産性の改善を目的として研究を行った。すなわち該菌
株からＴグルタミルトランスペプチダーゼの遺伝子をり
ローニングし、さらに、この遺伝子をバチルス・ズブチ
リスのプラスミドベクター、例えば、プラスミドｐＵＢ
１１０あるいはその誘導体にセルフクローニングして、
組換え体プラスミドを作製した。繊組換え体プラスミド
を用５）で、バチルス属細菌、例えば、γ−グルタミル
トランスペプチダーゼ生産菌Ｓ 、Ｊ ｌ ３８株ある
いはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ非生産菌バチ
ルス・ズブチリス−マーバーブ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ）ＢＲ，１５１株〔
＾ＴＣＣ３３６７７、Ｄ Ｍ １ｌｉｉｌｌ＋ａｍｓ
ｅｔ ａＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４６ 、１１
６２（１９８１）：を形質転換することによって、Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を１輻させた菌
株を造成した。γグルタミルトランスペプチダーゼ遺伝
子増幅株を培養した培養物からは、もとのγ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ生産菌５Ｊ１３８株の培養物と
比べて、高収率で該酵素を取得できることを見出し、本
発明を完成する至った。
本発明はバチルス属に、属し、バチルス属に嘱する微生
物由来のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
え体ＤＮＡを保有する微生物を培地に培養し、培養物中
にＴ−グルタミルトランスペプチダーゼを生成蓄積させ
、該培養物からＴ−グルタミルトランスペプチダーゼを
採取することを特徴とするＴ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの製造法を提併する。
物由来のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換
え体ＤＮＡを保有する微生物を培地に培養し、培養物中
にＴ−グルタミルトランスペプチダーゼを生成蓄積させ
、該培養物からＴ−グルタミルトランスペプチダーゼを
採取することを特徴とするＴ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの製造法を提併する。
以下に本発明の詳細な説明する。
バチルス属に属する微生物由来のＴ−グルタミルトラン
スペプチダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ；よ、バチルス属に
属しγ−グルタミルトランスペプチダーセ分泌生産性を
示す微生物の染色体ＤＮＡをＤ Ｎ Ａ供給源とし、通
常の組換えＤＮＡ技法を用いて、バチルス属菌種中で自
律複製可能なベクターＤＮＡに該ＤＮＡ断片を組み込む
ことにより作製することができる。
スペプチダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片と
ベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ；よ、バチルス属に
属しγ−グルタミルトランスペプチダーセ分泌生産性を
示す微生物の染色体ＤＮＡをＤ Ｎ Ａ供給源とし、通
常の組換えＤＮＡ技法を用いて、バチルス属菌種中で自
律複製可能なベクターＤＮＡに該ＤＮＡ断片を組み込む
ことにより作製することができる。
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ分泌生産性を示す
微生物の具体例と１−では、バチルス・ズブチリスＳ
Ｊ １３８ （ＦＥＲＭ ［１Ｐ−２６９４） 、バ
チルス・ズブチリスＡＴＣＣ９３７２、バチルス・プレ
ビスＡＴＣＣ１００２７などがあげられる。このような
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ分泌生産性を示す
菌株は、各種バチルスｌｌｌ５株の培養土浦中のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定することによ
り、検索できる。、Ｔ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性は、Ｔ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質
として酵素反応を行い、反応により生成するｐ−ニトロ
アニリンの量を波長４１０ｎｍで比色定置する二とによ
り測定できる。
微生物の具体例と１−では、バチルス・ズブチリスＳ
Ｊ １３８ （ＦＥＲＭ ［１Ｐ−２６９４） 、バ
チルス・ズブチリスＡＴＣＣ９３７２、バチルス・プレ
ビスＡＴＣＣ１００２７などがあげられる。このような
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ分泌生産性を示す
菌株は、各種バチルスｌｌｌ５株の培養土浦中のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定することによ
り、検索できる。、Ｔ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ活性は、Ｔ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質
として酵素反応を行い、反応により生成するｐ−ニトロ
アニリンの量を波長４１０ｎｍで比色定置する二とによ
り測定できる。
以下にγ−グルタミルトランスペプチダーゼ分泌生産性
を有するバチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株をＤＮＡ供
与株として用いたＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ
遺伝子のクローニングについて説明する。−；お、バチ
ルス・ズブテグス５Ｊ１３８株は、ブダペスト条約に基
づいて平成元年１２月２１日イ寸でバチルス・ズブチリ
スＳＪ１３８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９４）として、工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されて
いる。
を有するバチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株をＤＮＡ供
与株として用いたＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ
遺伝子のクローニングについて説明する。−；お、バチ
ルス・ズブテグス５Ｊ１３８株は、ブダペスト条約に基
づいて平成元年１２月２１日イ寸でバチルス・ズブチリ
スＳＪ１３８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９４）として、工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されて
いる。
５Ｊ１３８株由来のＴ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ遺伝子をクローニングするために、以下のようにして
て一グルタミルトランスペプチダーゼを１ｌｔｌｕし、
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼのアミノ酸配列を
決定して、該アミノ酸配列に対応する合成りＮＡプロー
ブを作製する。談合成りＮＡプローブとハイブリダイズ
するＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、５Ｊ１３８株の染色体
ＤＮＡ上よりクローニングすることにより、５Ｊ１３８
株由来のγ−グルタミルトランスベブチダーセ遺伝子を
得ることができる。
ゼ遺伝子をクローニングするために、以下のようにして
て一グルタミルトランスペプチダーゼを１ｌｔｌｕし、
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼのアミノ酸配列を
決定して、該アミノ酸配列に対応する合成りＮＡプロー
ブを作製する。談合成りＮＡプローブとハイブリダイズ
するＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、５Ｊ１３８株の染色体
ＤＮＡ上よりクローニングすることにより、５Ｊ１３８
株由来のγ−グルタミルトランスベブチダーセ遺伝子を
得ることができる。
（１）バチルス・ズブチリス由来のＴ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼのｆｉｉ製 合成りＮＡプローブを作製するためには、Ｔグルタミル
トランスペプチダーゼのアミノ酸配列を知る必要がある
。アミノ酸配列を決定するには、Ｔ−グルタミルトラン
スペプチダーゼを精製しておくことが望ましい。精製に
は、通常の酵素Ｍ製に用いられる手法が適用される。例
えば、中性塩類、有機溶媒による分別沈澱、イオン交換
カラムクロマトグラフィーなどの手法によりＴ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼを含む培養上清を分画し、各
分画のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定
して、活性画分を分取してくればよい。
ンスペプチダーゼのｆｉｉ製 合成りＮＡプローブを作製するためには、Ｔグルタミル
トランスペプチダーゼのアミノ酸配列を知る必要がある
。アミノ酸配列を決定するには、Ｔ−グルタミルトラン
スペプチダーゼを精製しておくことが望ましい。精製に
は、通常の酵素Ｍ製に用いられる手法が適用される。例
えば、中性塩類、有機溶媒による分別沈澱、イオン交換
カラムクロマトグラフィーなどの手法によりＴ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼを含む培養上清を分画し、各
分画のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定
して、活性画分を分取してくればよい。
すなわち、５Ｊ１３８株の培養上清からエタノール沈澱
、凍結乾煙、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラ
フィー、およびヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィーによって、夾雑タンパク質が認められないＴ−
グルタミルトランスペプチダーセ標品を取得することが
できる。精製したγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
の分子量を、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で比較した結果から、５Ｊ１３８株
由来のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼは約４１Ｋ
Ｄａ（キロダルトン）および約２３ＫＤａのサブユニッ
トが１：１に会合したダイマー構造を有していると推定
される。
、凍結乾煙、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラ
フィー、およびヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィーによって、夾雑タンパク質が認められないＴ−
グルタミルトランスペプチダーセ標品を取得することが
できる。精製したγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
の分子量を、ゲル濾過法および５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で比較した結果から、５Ｊ１３８株
由来のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼは約４１Ｋ
Ｄａ（キロダルトン）および約２３ＫＤａのサブユニッ
トが１：１に会合したダイマー構造を有していると推定
される。
（２）Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼのアミノ酸
配列の決定 上記の工程で得られたＴ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼの標品はさらに、逆層高速液体クロマトグラフィー
を用いて、２つのサブユニットに分離、精製することが
できる。各サブユニットをプロテアーゼ、例えば、トリ
プシンにより消化し、消化物を高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて分画することによって、プロテアーゼ消化
断片が得られる。各消化断片のアミノ酸配列は、アミノ
酸シーケンサ−を用いる通常の手法によって分析できる
。
配列の決定 上記の工程で得られたＴ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼの標品はさらに、逆層高速液体クロマトグラフィー
を用いて、２つのサブユニットに分離、精製することが
できる。各サブユニットをプロテアーゼ、例えば、トリ
プシンにより消化し、消化物を高速液体クロマトグラフ
ィーを用いて分画することによって、プロテアーゼ消化
断片が得られる。各消化断片のアミノ酸配列は、アミノ
酸シーケンサ−を用いる通常の手法によって分析できる
。
（３）Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼのアミノ酸
配列に対応するオリゴヌクレオチドＤＮＡの合成 上記の操作によって決定されたγ−グルタミルトランス
ペプチダーゼの部分アミノ酸配列をもとに、ＤＮＡプロ
ーブの設計をすることができる。
配列に対応するオリゴヌクレオチドＤＮＡの合成 上記の操作によって決定されたγ−グルタミルトランス
ペプチダーゼの部分アミノ酸配列をもとに、ＤＮＡプロ
ーブの設計をすることができる。
ＤＮＡプローブをコロニーハイブリダイゼーション法に
よる遺伝子クローニングに適用するためには、連続する
５個〜６個程度のアミノ酸配列に対応する塩基配列をも
つ、１５個〜１８個程度の塩基長の１重鎮オリゴヌクレ
オチドを合成することが望ましい。ただし、１つのアミ
ノ酸に対応するコドンはアミノ酸の種類に応じて１個〜
６個存在するので、通常、目的とするプローブの取得に
は、複数種類のオリゴヌクレオチドを合成する必要があ
る。従って、決定されたＴ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼの部分アミノ酸配列の中から、対応するオリゴヌ
クレオチドの種類がなるべく少なくなるような領域を選
ぶことが望ましい。例えば、５Ｊ１３８株のＴ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼの分子量的４１にのサブユニ
ットの部分アミノ酸配列（Ａｌａ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−ＧｌｕＧｌｙ
−５ｅｒ−＾１ａ−Ａｓｎ＞の５番目から１０番、目の
アミノ酸残基に対応する３２種の１７塩基のオリゴヌク
レオチド混合物（プローブＬ） ５’ −ＴＧＧＧＣ〜
ＴＡＹＣＡＲＧＡＲＧＩ、−３’ （ただし、Ｎ ＋！
Ａ、 Ｔ、 ＧまたはＣ，ＹはＴまたはＣ，ＲはＡま
たはＧを示す）ちよび分子量的２３にのサブユニットの
部分アミノ酸配列（Ｖａｔ−ＧｌｕＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍ
ｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ）の２番目から７番目の
アミノ酸残基に対応する塩基配列５′−ＧＡＲＴＡＹＧ
ＧＮＡＴＧＧ、ＡＹＹＴ ３’と相補的な６４種の１
７塩基のオリゴヌクレオチド混合物（プローブＳ） ５
’−ＡＲＲＴＣＣＡＴんＣＣＲＴＡＹＴＣ−３’をあげ
ることができる。
よる遺伝子クローニングに適用するためには、連続する
５個〜６個程度のアミノ酸配列に対応する塩基配列をも
つ、１５個〜１８個程度の塩基長の１重鎮オリゴヌクレ
オチドを合成することが望ましい。ただし、１つのアミ
ノ酸に対応するコドンはアミノ酸の種類に応じて１個〜
６個存在するので、通常、目的とするプローブの取得に
は、複数種類のオリゴヌクレオチドを合成する必要があ
る。従って、決定されたＴ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼの部分アミノ酸配列の中から、対応するオリゴヌ
クレオチドの種類がなるべく少なくなるような領域を選
ぶことが望ましい。例えば、５Ｊ１３８株のＴ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼの分子量的４１にのサブユニ
ットの部分アミノ酸配列（Ａｌａ−Ｇｌｙ−＾５ｐ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−ＧｌｕＧｌｙ
−５ｅｒ−＾１ａ−Ａｓｎ＞の５番目から１０番、目の
アミノ酸残基に対応する３２種の１７塩基のオリゴヌク
レオチド混合物（プローブＬ） ５’ −ＴＧＧＧＣ〜
ＴＡＹＣＡＲＧＡＲＧＩ、−３’ （ただし、Ｎ ＋！
Ａ、 Ｔ、 ＧまたはＣ，ＹはＴまたはＣ，ＲはＡま
たはＧを示す）ちよび分子量的２３にのサブユニットの
部分アミノ酸配列（Ｖａｔ−ＧｌｕＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｍ
ｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ）の２番目から７番目の
アミノ酸残基に対応する塩基配列５′−ＧＡＲＴＡＹＧ
ＧＮＡＴＧＧ、ＡＹＹＴ ３’と相補的な６４種の１
７塩基のオリゴヌクレオチド混合物（プローブＳ） ５
’−ＡＲＲＴＣＣＡＴんＣＣＲＴＡＹＴＣ−３’をあげ
ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は市販のＤＮＡ合成機を用い
るか、公知の固相ホスホトリエステル法〔Ｈ，ｌｔｏ
ｅｔ ａｌ、：＼ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、 １０．１７５５（１９８２）〕などによって行う
ことができる。合成されたオリゴヌクレオチドは、高速
液体クロマトグラフィーなどによって精製することがで
きる。
るか、公知の固相ホスホトリエステル法〔Ｈ，ｌｔｏ
ｅｔ ａｌ、：＼ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、、 １０．１７５５（１９８２）〕などによって行う
ことができる。合成されたオリゴヌクレオチドは、高速
液体クロマトグラフィーなどによって精製することがで
きる。
（４）合成りＮＡＡｃ−ブを用いたサザンハイプリダイ
ゼーション法による５Ｊ１３８株の染色体ＤＮ Ａの解
析 Ｓ Ｊ 、１３８株由来のＴ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの各サブユニットのアミノ酸配列にそれぞれ対
応する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、５Ｊ
１３８株の染色体ＤＮＡとのサザンハイプリダイゼーシ
ョンＣＥ、 Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ：Ｊ、 Ｍｏｌ。
ゼーション法による５Ｊ１３８株の染色体ＤＮ Ａの解
析 Ｓ Ｊ 、１３８株由来のＴ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの各サブユニットのアミノ酸配列にそれぞれ対
応する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、５Ｊ
１３８株の染色体ＤＮＡとのサザンハイプリダイゼーシ
ョンＣＥ、 Ｍ、 ５ｏｕｔｈｅｒｎ：Ｊ、 Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、、 ９８ 、５０３（１９７５）コを行い、
各サブユニットのコード配列が近接して存在するかどう
かを推定することができる。すなわち、適当な制限酵素
で切断した染色体ＤＮＡをアガロースゲル電気泳Ｄテ分
画シタ（Ｉｔ、ニトロセルロースフィルター上に分画Ｄ
ＮＡ断片を移して固定化し、該フィルター上のＤＮＡと
ラベルした合５ｉＤＮＡプローブとのハイブリダイゼー
ションを行って、それぞれのプローブが同じ大きさのＤ
ＮＡ断片と近接してハイブリダイズするかどうかを調べ
ればよい。
各サブユニットのコード配列が近接して存在するかどう
かを推定することができる。すなわち、適当な制限酵素
で切断した染色体ＤＮＡをアガロースゲル電気泳Ｄテ分
画シタ（Ｉｔ、ニトロセルロースフィルター上に分画Ｄ
ＮＡ断片を移して固定化し、該フィルター上のＤＮＡと
ラベルした合５ｉＤＮＡプローブとのハイブリダイゼー
ションを行って、それぞれのプローブが同じ大きさのＤ
ＮＡ断片と近接してハイブリダイズするかどうかを調べ
ればよい。
５Ｊ１３８株の染色体ＤＮＡは５Ｊ１３８株の培１！閑
体から、Ｎ膿および三浦の方法［ＨｏＳａｉｔ、。
体から、Ｎ膿および三浦の方法［ＨｏＳａｉｔ、。
ａｎｄ Ｋ ！わｕｒａ ： ８ｉｏｃｈ＋ｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２． ６１９（
１９６３） 〕により調製することができる。染色体Ｄ
ＮＡの制限酵素による切断、アガロースゲル電気体動な
どは常法ＥＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ、 ａｌ、
： ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ｌ、ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ（１９８２Ｎにより行うことができる。
、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ７２． ６１９（
１９６３） 〕により調製することができる。染色体Ｄ
ＮＡの制限酵素による切断、アガロースゲル電気体動な
どは常法ＥＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ、 ａｌ、
： ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１
ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ｌ、ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ（１９８２Ｎにより行うことができる。
上記の実験の結果、Ｔ−グルタミルトランスペプチダー
ゼの各々、４１ＫＤａおよ乙”２３ＫＤａのサブユニッ
トに対応するプローブしおよびプローブＳは、ともに２
．８Ｋｂ（キロベース）の旧ｎ［１１１片および２．９
ＫｂのＥｃｏＲｌ断片に近接してハイブリダイズする
ことが判明し、２つのサブユニットのコード配列が近接
して存在すると推定される。
ゼの各々、４１ＫＤａおよ乙”２３ＫＤａのサブユニッ
トに対応するプローブしおよびプローブＳは、ともに２
．８Ｋｂ（キロベース）の旧ｎ［１１１片および２．９
ＫｂのＥｃｏＲｌ断片に近接してハイブリダイズする
ことが判明し、２つのサブユニットのコード配列が近接
して存在すると推定される。
（５）バチルス・ズブチリスの宿主ベクター系における
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーセ遺伝子のクローニ
ング バチルス・ズブチリスの宿主ベクター系において、Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーセ遺伝子をショットガン
クローニングするた釣には、Ｔグルタミルトランスペブ
チダーセ遺伝子供与株の染色体ＤＮＡとバチルス属細菌
で複製可能なプラスミドベクターＤＮＡとを試験管内で
切断、再連結したＤＮＡを用いて、バチルス・ズブチリ
ス・マーバーブ株のコンピテント細胞あるいはバチルス
・ズブチリスのプロトプラストを形質転換二ｊＳｐｌｚ
＋ｚｅｎ ｅし ａｌ、：＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏ１．、 ２０． ３７１（１９６６）＋Ｔ
、Ａｋａｍａｔｓｕ ａｎｄ 、Ｊ、Ｓｅｋ＋ｇｕ
ｃｈ１ ＋ ＡＢｒ＋ｃＢ＋ｏｌ 口ｈｅｍ、、
４６ 、 １６１７＜１９ｇ２１１ｒ し、Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーゼ活性を示す形質転換体
を検索すればよい。目的株の検索方法として：よ、例え
ば、寒天平板培地上にニトロセルロースフィルターを敷
き、同フィルターの上に形質転換体σ）コロニーを形成
させてから、フィルターをＴ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの基質であるＴグルタミル−ｐ−ニトロアニリ
ドを含ませた濾紙に移し、酵素反応により生成する黄色
のｐ−ニトロアニリンの呈色がコロニー周辺に見みれる
株を探す簡便な方法を用し）ることができる。
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーセ遺伝子のクローニ
ング バチルス・ズブチリスの宿主ベクター系において、Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーセ遺伝子をショットガン
クローニングするた釣には、Ｔグルタミルトランスペブ
チダーセ遺伝子供与株の染色体ＤＮＡとバチルス属細菌
で複製可能なプラスミドベクターＤＮＡとを試験管内で
切断、再連結したＤＮＡを用いて、バチルス・ズブチリ
ス・マーバーブ株のコンピテント細胞あるいはバチルス
・ズブチリスのプロトプラストを形質転換二ｊＳｐｌｚ
＋ｚｅｎ ｅし ａｌ、：＾ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏ１．、 ２０． ３７１（１９６６）＋Ｔ
、Ａｋａｍａｔｓｕ ａｎｄ 、Ｊ、Ｓｅｋ＋ｇｕ
ｃｈ１ ＋ ＡＢｒ＋ｃＢ＋ｏｌ 口ｈｅｍ、、
４６ 、 １６１７＜１９ｇ２１１ｒ し、Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーゼ活性を示す形質転換体
を検索すればよい。目的株の検索方法として：よ、例え
ば、寒天平板培地上にニトロセルロースフィルターを敷
き、同フィルターの上に形質転換体σ）コロニーを形成
させてから、フィルターをＴ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの基質であるＴグルタミル−ｐ−ニトロアニリ
ドを含ませた濾紙に移し、酵素反応により生成する黄色
のｐ−ニトロアニリンの呈色がコロニー周辺に見みれる
株を探す簡便な方法を用し）ることができる。
バチルス・ズブチリス・マーハーグ株のコンピテント細
胞のプラスミドＤＮＡによる形質転換頻度は、染色体Ｄ
ＮＡによる形質転換頻度に比べ低いことが知られてし）
る二Ｔ、Ｊ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｒ ａｌ、 ：Ｊ
Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ１．、 １３４．３１８（１９７８
）、 Ｓ、Ｃｏｎｔ、ｅｎｔｅ ａｎｄＯＤｕｂｎａｕ
： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃ＋、
１．ｓ＾７５．１４２８（１９７８）：”が、コンテン
テとデュノーのマーカーレスキュー法二Ｓ８口ｏｎｔｅ
ｒ＋ｔｅａｎｄ Ｄ、Ｄｕｂｎａｕ ： Ｐｌａｓｍ＋
ｄ２ ．５５５（１９７９） ｌを適用して、バチルス
・ズブチリス・マーバーブ株のコンピテント細胞に、あ
らかじめプラスミドベクターと一部相同なプラスミドを
保有させ、形質転換に用しまた組換え体ＤＮＡとの間で
相同組換えを起こさせ、より高頻度で形質転換株を取得
することができる。得られたＴグルタミルトランスペプ
チダーゼ活性を示す形質転換体の培養菌体から、グリッ
ツアンらの方法ＣＴ、Ｊ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａ
ｌ、 ： Ｊ、 Ｂａｃｔ、ｅｒ＋ｏ１．、１３４３
１Ｂ（１９７８） 〕に従って組換え体プラスミドを精
製することができる。糾換え体プラスミドとプローブし
およびＳとのハイブリダイゼーンヨン活性をサザンハイ
プリダイゼーション法により調べることにより、クロー
ン化断片中に、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼの
各サブユニットのコード配列が含まれてし）るかどうか
を検定することができる。さらに、組換え体プラスミド
中のクローン化断片をニックトランスレーション法ＩＰ
、ｌｌＩ、、ｈＲｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ、 ：
Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂ＋ｏ１．、１１３．２３７＜１９７
７）：により放射標識（−１遺伝子供与株の染色体ＤＮ
Ａとのサザンハイプリダイセーションを行うことにより
、クローン化遺伝子の由来を５１ｉ認することもできる
。
胞のプラスミドＤＮＡによる形質転換頻度は、染色体Ｄ
ＮＡによる形質転換頻度に比べ低いことが知られてし）
る二Ｔ、Ｊ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｒ ａｌ、 ：Ｊ
Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ１．、 １３４．３１８（１９７８
）、 Ｓ、Ｃｏｎｔ、ｅｎｔｅ ａｎｄＯＤｕｂｎａｕ
： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃ＋、
１．ｓ＾７５．１４２８（１９７８）：”が、コンテン
テとデュノーのマーカーレスキュー法二Ｓ８口ｏｎｔｅ
ｒ＋ｔｅａｎｄ Ｄ、Ｄｕｂｎａｕ ： Ｐｌａｓｍ＋
ｄ２ ．５５５（１９７９） ｌを適用して、バチルス
・ズブチリス・マーバーブ株のコンピテント細胞に、あ
らかじめプラスミドベクターと一部相同なプラスミドを
保有させ、形質転換に用しまた組換え体ＤＮＡとの間で
相同組換えを起こさせ、より高頻度で形質転換株を取得
することができる。得られたＴグルタミルトランスペプ
チダーゼ活性を示す形質転換体の培養菌体から、グリッ
ツアンらの方法ＣＴ、Ｊ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａ
ｌ、 ： Ｊ、 Ｂａｃｔ、ｅｒ＋ｏ１．、１３４３
１Ｂ（１９７８） 〕に従って組換え体プラスミドを精
製することができる。糾換え体プラスミドとプローブし
およびＳとのハイブリダイゼーンヨン活性をサザンハイ
プリダイゼーション法により調べることにより、クロー
ン化断片中に、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼの
各サブユニットのコード配列が含まれてし）るかどうか
を検定することができる。さらに、組換え体プラスミド
中のクローン化断片をニックトランスレーション法ＩＰ
、ｌｌＩ、、ｈＲｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ、 ：
Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂ＋ｏ１．、１１３．２３７＜１９７
７）：により放射標識（−１遺伝子供与株の染色体ＤＮ
Ａとのサザンハイプリダイセーションを行うことにより
、クローン化遺伝子の由来を５１ｉ認することもできる
。
Ｂａｍｆｌ Ｉで切断したｐＢ０６４ Ｊ、Ｄｕｂｎ
ａｕ ｅｔ ａｌ、 ：Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、 １４１ 、 ２４６（１９８０）〕 プラ
スミド・ベクターＤＮＡを５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡの
５ａｕ３＾部分切断産物お連結し、ρＢＤ６４と−８相
同なｐＵＢ１１０プラスミドＣＴ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅ
ｔ ａｌ、：Ｊ、 Ｂａｃｊｅｒ＋。
ａｕ ｅｔ ａｌ、 ：Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、 １４１ 、 ２４６（１９８０）〕 プラ
スミド・ベクターＤＮＡを５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡの
５ａｕ３＾部分切断産物お連結し、ρＢＤ６４と−８相
同なｐＵＢ１１０プラスミドＣＴ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅ
ｔ ａｌ、：Ｊ、 Ｂａｃｊｅｒ＋。
１３４ ３１８（１９７８）３を保有させたバチルス・
ズブチリス・マーバーブ株を尼質転換することにより、
５Ｊ１３８株由来のＴ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ遺伝子含有断片を含む組換え体プラスミドｐＧ３１を
取得することができる（１１図参照）上記のようにして
クローン化されたγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
遺伝子の塩基配列を決定することによって、該遺伝子の
構造を詳細に調べることができる。塩基配列の決定は、
サブクローン化によるクローン化断片の小断片化、サブ
クローン化生断片の１重鎖化および得られた１本鎖につ
いてジデオキシチエインターミネーション法ＣＪ、！、
Ｉｅｓｓ＋ｎｇ ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ＋ｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、 １０１２０ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ（１９８３） Ｅを適用することによって行うこ
とができる。
ズブチリス・マーバーブ株を尼質転換することにより、
５Ｊ１３８株由来のＴ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ遺伝子含有断片を含む組換え体プラスミドｐＧ３１を
取得することができる（１１図参照）上記のようにして
クローン化されたγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
遺伝子の塩基配列を決定することによって、該遺伝子の
構造を詳細に調べることができる。塩基配列の決定は、
サブクローン化によるクローン化断片の小断片化、サブ
クローン化生断片の１重鎖化および得られた１本鎖につ
いてジデオキシチエインターミネーション法ＣＪ、！、
Ｉｅｓｓ＋ｎｇ ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ＋ｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ、 １０１２０ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ（１９８３） Ｅを適用することによって行うこ
とができる。
クローン化Ｄ Ｎ Ａ断片のサブクローン化は、例えば
、ベクターとしてつ゛イエイラおよびメッシングろの開
発した大腸菌プラスミドｐＵｃ１１８あるいはｐＵＣ１
１９［ＪＪｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｊ、ＭｅｓｓｉｎｇＭ
ｅｔｈｏｄｓ ＋ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １５
３ 、３ ＜１９８７） 〕を用いて行うことができる
。サブクローン化断片は、エキソヌクレアー七ｍを用い
て、さらに縮小化することもできるＣ３．Ｈｅｎ１ｋｏ
ｆｆ ：Ｇｅｎｅ、 ２８ 、３５］（１９８４）］。
、ベクターとしてつ゛イエイラおよびメッシングろの開
発した大腸菌プラスミドｐＵｃ１１８あるいはｐＵＣ１
１９［ＪＪｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｊ、ＭｅｓｓｉｎｇＭ
ｅｔｈｏｄｓ ＋ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １５
３ 、３ ＜１９８７） 〕を用いて行うことができる
。サブクローン化断片は、エキソヌクレアー七ｍを用い
て、さらに縮小化することもできるＣ３．Ｈｅｎ１ｋｏ
ｆｆ ：Ｇｅｎｅ、 ２８ 、３５］（１９８４）］。
ベクターに用いたｐＵＣ１１８およびｐＵｃ１１９は、
Ｍ１３ファージのインタージェニック（ｉｎｔｅｒｇｅ
ｎ＋ｃ）領域（ＩＧ） ＣＤ、 Ｍｅａｄ ａｎｄ８
、Ｋｅｍｐｅｒ ＋ｎ ”Ｖｅｃｔｏｒｓ ： Ａ ５
ｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎ＋ｎｇ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ １ｊｓｅｓ、
”Ｂｕｔｔ、ｅｒｗｏｒｔｈ。
Ｍ１３ファージのインタージェニック（ｉｎｔｅｒｇｅ
ｎ＋ｃ）領域（ＩＧ） ＣＤ、 Ｍｅａｄ ａｎｄ８
、Ｋｅｍｐｅｒ ＋ｎ ”Ｖｅｃｔｏｒｓ ： Ａ ５
ｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎ＋ｎｇ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ １ｊｓｅｓ、
”Ｂｕｔｔ、ｅｒｗｏｒｔｈ。
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、 （１９８６）〕を含ん
でいるので、これらのサブクローン化プラスミドを保有
する大ｌｌＡ１菌ＭＶ１１８４株にヘルバーブアージＭ
１３に０７を感染させれば、ＩＧの機能によりこれらの
プラスミドの■二本鎖Ｄ Ｎ Ａの複製、■複製後の（
−）鎖を鋳型とした（↓）鎖の一本鎖ＤＮＡ合成、■−
一本鎖ＮＡのＭ１３ファージコートタンパク質への包み
込みが起こり、−重鎮ＤＮＡを包み込んだ粒子が細胞外
に放出される。このようにして得られたファージ溶菌液
から、ジデオキシチエインターミネーション法に供する
１本鎖ＤＮＡを調製することができるＣＪＪｉｅｉｒａ
ａｎｄ Ｊ、−１ｅｓｓ＋ｎｇ ： Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎεｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １５３ 、３． Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７） 〕。
でいるので、これらのサブクローン化プラスミドを保有
する大ｌｌＡ１菌ＭＶ１１８４株にヘルバーブアージＭ
１３に０７を感染させれば、ＩＧの機能によりこれらの
プラスミドの■二本鎖Ｄ Ｎ Ａの複製、■複製後の（
−）鎖を鋳型とした（↓）鎖の一本鎖ＤＮＡ合成、■−
一本鎖ＮＡのＭ１３ファージコートタンパク質への包み
込みが起こり、−重鎮ＤＮＡを包み込んだ粒子が細胞外
に放出される。このようにして得られたファージ溶菌液
から、ジデオキシチエインターミネーション法に供する
１本鎖ＤＮＡを調製することができるＣＪＪｉｅｉｒａ
ａｎｄ Ｊ、−１ｅｓｓ＋ｎｇ ： Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎεｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １５３ 、３． Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７） 〕。
１本鎮重鎮Ｎ Ａは、クローン化ＤＮＡ断片を制限酵素
で小断片化し、Ｍ１３ｍｐ１８あるいは！Ｊ１３ｍｐ１
９〔Ｃ，Ｙａｎ＋５ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａ
ｌ、 ： Ｇｅｎｅ、 ３３ 、 １０３（１９８５
） ］の２本鎖ＤＮＡと連結し、これを形貢転喚法によ
り大腸菌にＤＮＡ＠染させてプラークを得た後、プラー
クに含まれる組換えファージをさろに増殖させて得られ
るファージ溶菌液から調製することもできる。
で小断片化し、Ｍ１３ｍｐ１８あるいは！Ｊ１３ｍｐ１
９〔Ｃ，Ｙａｎ＋５ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ｅｔ ａ
ｌ、 ： Ｇｅｎｅ、 ３３ 、 １０３（１９８５
） ］の２本鎖ＤＮＡと連結し、これを形貢転喚法によ
り大腸菌にＤＮＡ＠染させてプラークを得た後、プラー
クに含まれる組換えファージをさろに増殖させて得られ
るファージ溶菌液から調製することもできる。
このようにして決定された塩基配列および前述のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼのアミノ酸配列をもとに
、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードするオ
ーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定すること
ができる。
ルタミルトランスペプチダーゼのアミノ酸配列をもとに
、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードするオ
ーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定すること
ができる。
ｐＧ３１プラスミド中のクローン化断片の塩基配列を、
以下に示す。
以下に示す。
ｕｗ＋、、ｕｕＡｓｕｗｓ ｌＬＪ＋１−１１？ＬＩ
ＬＡ １．、ｕｌ−ＩＬ＾−１，＋ＬＩ ＡＡ（ｊ
＾Ａ八Ｌへｃｃ ｃａ丁ＴＴＴＣＣＴＡ ＴＧＡＣ
ＧＡＣＴＡＣ＋３０ １４０ １
５０ １６０ １．７０
１１１０＾ＡＡＣＡＧｆｌ；ＴＡＧ Ａ丁ＧＴＣＧ
ＧＣＡＡ ＡＧＡＣＧＧＣＡＴＧ ＧＴＴＧＣＣ＾
ＣＣＧ ＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴ ＣＧＣＴＴＣＡＣ
Ａ八３１０ へ ３２０ ３３０
３４０ ３５０ ３８０ＧＴＴＴ
ＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡ ＡＧＡＣＡＣＣ
ＡＣＣＡＴ丁ＡＴＣＧＡＣＡ ＧＣＡＧＧＧＡＡＣＧ
ＣＧＣＡＣＣＧＧＣＡ５５０ ５６０
Ｓ１０ ３８０ ５９
０ ５００ＡＡＡＧＧＣＴＴＴＣＣＧＡＴＣ
ＧＡＴ丁ＣＧＧＴＴＴ丁ＡＧＣ丁 ＧＡ丁ＧＣＣ＾丁Ｃ
Ｔ ＣＡＧＡＴＴＡ丁ＡＡ ＡＧＡＣＡＡＡＴ丁Ａ
６１０ ６２０ ６３０
６４０ ｆ＋５０ ６６０
ＴＣＡＣＡＣＡＣＴＧ Ｃ丁ＧＣＡＡＡＡＧＡ Ｃ
０７０７７７０丁丁 ＣＣＧＯＡＣＧＯＡＯＡＡＣＣＴ
ＣＴＧＡＡ ＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴ
ＣＣＡＡ＾＾＾ＧＡＣＴＴ ＡＧＣＣＡＡＡＡＣＡ Ｔ
ＴＴＡＣＡＧＣＴＡ ＴτＡＡＧＴＡＣＡＡ ＡＧＧＣ
ＡＣＡ＾＾＾ｓｓｏ ａｓｏ
ａ）０ ８８０
１１９０ ９００ＧＡＴＴＡＣＣ
ＡＧＧ Ｃ１ＣＴＡＴＣＡＴＡＴ ＣＧＣＡＡＣＴ
ＣＣ丁 ＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡ ＧＣＴＣＧＧＧＣＧ
Ｇ ＴＧＴＴＴＴＣＣＴＧ９１０ ９２０
９３０ ９４０ ９５
Ｑ ９５０ＴＴＯＣＡ＾＾丁ＧＣ丁Ｇ＾＾Ｃ
ＣＴＣＣＴ ＧＧＡＴＧＡＴＴＴ丁 ＡＡＧＣＴＴ丁
ＣＴＣＡＡＴＡ丁ＧＡＴＡＴ ＣＣＧＴＴＣＴＴＧＧ
９フ０ ９８０ ９９０
１０００ １０１０
１０２０ＣＡＡ＾＾ＡＴＡＴＣＡＯＣＴＴＣτ
ＣＧＣＡＧＡＡＡＣＧＡＴＧ ＣＡＴＴＴＧＧＣＴＴ
ＡτＧＣＴＧＡＣＣＧ ＣＧＣＣＧＣＡＴＴτＣ
ｉＣＣＧＧＧＧＡＣＣＣＡ（ｉ＾＾ＴＴＣＧＴ ＣＡ
ＡＣＧＴＣＣＣ丁 ＣＴＣＡＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＧ＾
＾ＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＡＴＣＡＡＴＧＣＣＣＧＣＡ
ＧＡＣＡＧＣＴＧＡ丁 ＡＧＡＴＡ丁ＴＧＡＴ Ａ
＾＾ＧＴＣＡＡＴＡ ＾＾ＡＡＡＣＣＧ＾＾ ＾ＧＣ
ＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＴＧｆｌ：ＧＣＣＴ ＡＴＣＡ
ＧＧＡＡＧＧ Ｔ丁ＣＴＧＣＡＡＡ（： ＴＡＡＡ
ＡＡＣＡＡＧ ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＣ丁ＧＡＣ
＾＾＾ＣＡＡＧＡＡＧＧ丁ＣＡＡＡＣＧＡＣＴ（Ａ
Ｃ丁ＴＣＡＣＧＧＴＡ ＡＣＣＧＡＣＣＧＣＴ Ｔ
ＣＧＧＣＡＡＴＧＴ ＣＧＴＡＴＣＴＴＡＴＡＣＧＡ
ＣＡＡＣＡＡ ＴＴＧＡＡＣＡＧＣＴ ＧＴＴＣＧＧＴ
ＴＣＣＧＧＣＡＴＴＡＴＧＧ ＴＴＣＣＣＧＧＡＴＡ
ＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧ上記の塩基配列を解析し、クロー
ン化断片内にただ１つのＯＲＦを見出すことができる。
ＬＡ １．、ｕｌ−ＩＬ＾−１，＋ＬＩ ＡＡ（ｊ
＾Ａ八Ｌへｃｃ ｃａ丁ＴＴＴＣＣＴＡ ＴＧＡＣ
ＧＡＣＴＡＣ＋３０ １４０ １
５０ １６０ １．７０
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ＧＣＡＡ ＡＧＡＣＧＧＣＡＴＧ ＧＴＴＧＣＣ＾
ＣＣＧ ＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴ ＣＧＣＴＴＣＡＣ
Ａ八３１０ へ ３２０ ３３０
３４０ ３５０ ３８０ＧＴＴＴ
ＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡ ＡＧＡＣＡＣＣ
ＡＣＣＡＴ丁ＡＴＣＧＡＣＡ ＧＣＡＧＧＧＡＡＣＧ
ＣＧＣＡＣＣＧＧＣＡ５５０ ５６０
Ｓ１０ ３８０ ５９
０ ５００ＡＡＡＧＧＣＴＴＴＣＣＧＡＴＣ
ＧＡＴ丁ＣＧＧＴＴＴ丁ＡＧＣ丁 ＧＡ丁ＧＣＣ＾丁Ｃ
Ｔ ＣＡＧＡＴＴＡ丁ＡＡ ＡＧＡＣＡＡＡＴ丁Ａ
６１０ ６２０ ６３０
６４０ ｆ＋５０ ６６０
ＴＣＡＣＡＣＡＣＴＧ Ｃ丁ＧＣＡＡＡＡＧＡ Ｃ
０７０７７７０丁丁 ＣＣＧＯＡＣＧＯＡＯＡＡＣＣＴ
ＣＴＧＡＡ ＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴ
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９３０ ９４０ ９５
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１０００ １０１０
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ＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧ上記の塩基配列を解析し、クロー
ン化断片内にただ１つのＯＲＦを見出すことができる。
ｌ０ＲＦ内には、上流から分泌シグナル配列ロ山根二日
本農芸化学会誌、６１．６４（１９８７）］ 、大サブ
ユニットコード配列および小サブユニットコード配列が
同一フレームで含まれている。さろに、取得断片内にあ
る制ｙａ酵ｓＢ位Ｓｐｈ ＩおよびＮ、ｒ ｕ １での
二重切断により生成する約２．４ ｋｂ断片をサブクロ
ーニングすることにより、外来性ＤＮＡを含まないセル
フ型組換え体プラスミドを作製できる。
本農芸化学会誌、６１．６４（１９８７）］ 、大サブ
ユニットコード配列および小サブユニットコード配列が
同一フレームで含まれている。さろに、取得断片内にあ
る制ｙａ酵ｓＢ位Ｓｐｈ ＩおよびＮ、ｒ ｕ １での
二重切断により生成する約２．４ ｋｂ断片をサブクロ
ーニングすることにより、外来性ＤＮＡを含まないセル
フ型組換え体プラスミドを作製できる。
外来性Ｄ Ｎ Ａを含まないセルフ型γ−グルタミルト
ランスペプチダーゼ遺伝子増幅株は、以下のようにして
造成する。
ランスペプチダーゼ遺伝子増幅株は、以下のようにして
造成する。
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含む組換
え体プラスミドｐＧ３１のベクターＤＮＡ部分は、非セ
ルフ型のｐＢＤ６４プラスミドに由来するため、Ｔ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子含有断片をバチル
ス・ズブチリスのセルフ型プラスミドにサブクローニン
グする。セルフ型プラスミドには、例えば、バチルス・
ズブチリスのプラスミドｐＵＢ１１０あるいはその誘導
体を用いることができる。実施例ではｐＵＢＩＩＯの誘
導体プラスミドｐＥＸ６５３を用いた。
え体プラスミドｐＧ３１のベクターＤＮＡ部分は、非セ
ルフ型のｐＢＤ６４プラスミドに由来するため、Ｔ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子含有断片をバチル
ス・ズブチリスのセルフ型プラスミドにサブクローニン
グする。セルフ型プラスミドには、例えば、バチルス・
ズブチリスのプラスミドｐＵＢ１１０あるいはその誘導
体を用いることができる。実施例ではｐＵＢＩＩＯの誘
導体プラスミドｐＥＸ６５３を用いた。
ｐＥＸ６５３は、ｐＵＢ１１０プラスミドＤＮＡをＥｃ
ｏＲｌおよびＸｂａＩで二重切断して得られる約４．１
ｋｂのＤＮＡに、大腸菌プラスミドｐＵＣ１９から分離
した合成りＮＡ白未来オリゴリンカの−品、 ５’ −ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧ
ＡＧＣＴＣＧ −３’３’ −ＴＣＣＴＡＧＧＧＧＣＣ
ＣＡＴＧＧ［ＴＣＧＡＧＣＴＴＡＡ −５’なる配列を
持つＤＮＡを連結させたベクタープラスミドである。γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含有する多
コピー型セルフプラスミドｐＵＧ５５は、バチルス・ズ
ブチリス・マーバーグＢＲ１５１株を宿主とし、ｐＧ３
１プラスミドの約２．４ ｋｂのＳｐｈ Ｉ−＼ｒｕｌ
二重切断ｆ）ＮＡ断片をｐＥＸ６５３のＳｐｈ Ｉ −
５ｍａ に型切断産物と連結することにより作製できる
（第２図参照）。さらに、プロトプラスト形質転換法口
Ｔ、＾ｋａｍａｔｓｕ ａｎｄＪ、 Ｓｅｋｉｇｕｃｈ
＋：＾ｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、４６．１
６１７（１９８２）］により、ｐＵＧ５５を５Ｊ１３８
株へ導入することができる。
ｏＲｌおよびＸｂａＩで二重切断して得られる約４．１
ｋｂのＤＮＡに、大腸菌プラスミドｐＵＣ１９から分離
した合成りＮＡ白未来オリゴリンカの−品、 ５’ −ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧ
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持つＤＮＡを連結させたベクタープラスミドである。γ
−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含有する多
コピー型セルフプラスミドｐＵＧ５５は、バチルス・ズ
ブチリス・マーバーグＢＲ１５１株を宿主とし、ｐＧ３
１プラスミドの約２．４ ｋｂのＳｐｈ Ｉ−＼ｒｕｌ
二重切断ｆ）ＮＡ断片をｐＥＸ６５３のＳｐｈ Ｉ −
５ｍａ に型切断産物と連結することにより作製できる
（第２図参照）。さらに、プロトプラスト形質転換法口
Ｔ、＾ｋａｍａｔｓｕ ａｎｄＪ、 Ｓｅｋｉｇｕｃｈ
＋：＾ｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、４６．１
６１７（１９８２）］により、ｐＵＧ５５を５Ｊ１３８
株へ導入することができる。
上記のようにして得られるバチルス、礪菌種由来のＴ−
グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含む組換え体
プラスミドを保有するバチルス属菌種の具体例としては
、バチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株由来のＴ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含む組換え体プラス
ミドｐＵＧ５５保有株であるバチルス・ズブチリス５Ｊ
１３９があげられる。該菌株は、バチルス・ズブチリス
５Ｊ１３９ （ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９５）として、
ブダペスト条約に基づいて平成元年１２月２１日付で微
工研に寄託されている。
グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含む組換え体
プラスミドを保有するバチルス属菌種の具体例としては
、バチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株由来のＴ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含む組換え体プラス
ミドｐＵＧ５５保有株であるバチルス・ズブチリス５Ｊ
１３９があげられる。該菌株は、バチルス・ズブチリス
５Ｊ１３９ （ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９５）として、
ブダペスト条約に基づいて平成元年１２月２１日付で微
工研に寄託されている。
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子を含む組換
え体プラスミドを保有するバチルス属細菌を培養するこ
とにより、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼを生産
することができる。該微生物の培養は、通常の細菌の培
養方法に従って行う。
え体プラスミドを保有するバチルス属細菌を培養するこ
とにより、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼを生産
することができる。該微生物の培養は、通常の細菌の培
養方法に従って行う。
すなわち該微生物を、炭素源、窒素源、無機物、アミノ
酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中に右いて、好
気的条件下にて温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行え
ばよい。
酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中に右いて、好
気的条件下にて温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行え
ばよい。
培地に用いる炭素源としては、例えばグルコース、フラ
クトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分
解物などの炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビ
トールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸な
どの有機酸、グリンン、アラニン、グルタミン酸、アス
パラギン酸などのアミノ酸など、該微生物が資化可能な
ものであればいずれでも使用できる。これらの使用濃度
は５〜３０％が好ましい。
クトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分
解物などの炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビ
トールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸な
どの有機酸、グリンン、アラニン、グルタミン酸、アス
パラギン酸などのアミノ酸など、該微生物が資化可能な
ものであればいずれでも使用できる。これらの使用濃度
は５〜３０％が好ましい。
窒素源としては、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
、リン酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモ
ニウム塩、尿素、ペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵
母エキス、コーンステイープリカー、カセイン加水分解
物、フィッシュミルまたはその消化物などの窒素含有有
機物、グリシン、グルタミン酸などの各種アミノ酸など
種々のものが使用できる。その使用濃度は通常０．１〜
１０％である。
、リン酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモ
ニウム塩、尿素、ペプトン、ＮＺアミン、肉エキス、酵
母エキス、コーンステイープリカー、カセイン加水分解
物、フィッシュミルまたはその消化物などの窒素含有有
機物、グリシン、グルタミン酸などの各種アミノ酸など
種々のものが使用できる。その使用濃度は通常０．１〜
１０％である。
無機物としては、リン酸第−カリウム、リン酸第二カリ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸
カルシウムなどを用いることができる。用いる微生物が
アミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄養物質を生育に
要求する場合には、培地にこれらの物質を適当量添加す
る。
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナ
トリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸
カルシウムなどを用いることができる。用いる微生物が
アミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄養物質を生育に
要求する場合には、培地にこれらの物質を適当量添加す
る。
培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適であ
る。培養期間は、通常１０〜７２時間である。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化す） ＋Ｊウム溶液など
で中性付近に保つことが望まし５）。
下に行う。培養温度は、一般に２０〜４０℃が好適であ
る。培養期間は、通常１０〜７２時間である。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化す） ＋Ｊウム溶液など
で中性付近に保つことが望まし５）。
培養終了後、培養物中に生成蓄積したＴ−グルタミルト
ランスペプチダーゼを回収することにより、Ｔ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼを得ることができる。培養液
からのＴ−グルタミルトランスペプチダーゼの回収は、
常法により行うことができる。すなわち、培養終了後、
遠心分離などの方法で菌体を除去した上清に、エタノー
ルやアセトンなどの有機溶媒あるいは硫酸アンモニウム
などの無機塩類を加えて、生ずる沈澱を回収すればよい
。
ランスペプチダーゼを回収することにより、Ｔ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼを得ることができる。培養液
からのＴ−グルタミルトランスペプチダーゼの回収は、
常法により行うことができる。すなわち、培養終了後、
遠心分離などの方法で菌体を除去した上清に、エタノー
ルやアセトンなどの有機溶媒あるいは硫酸アンモニウム
などの無機塩類を加えて、生ずる沈澱を回収すればよい
。
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこの実施例により限定されるものではない。
本発明はこの実施例により限定されるものではない。
実施例Ｉ Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼを分
泌生産するバチルス属菌株の検索バチルス属に属する菌
株１２１株をそれぞれＢＹ寒天培地二粉末ブイヨン（極
東製薬工業社製）２％、酵母エキストラフ）（大五栄養
化学社９Ａ）０．５％、寒天１，５％、ｐＨ７，２（＼
ａＯＨ） Ｅに塗布し、３０℃で一晩培養した。培養菌
体を１白菌耳とり、５ゴのＢＹＧ培地＝粉末ブイヨン２
％、粉末酵母エキストラクト （大工栄養化学社製）０
．５％、ブドウ糖２％、Ｉ） Ｈ７，２（Ｎａｌｌｌ）
”、に植菌し、３０ｔで１６時間、振盪培養した。−
晩培養液０．２５ｍ＆を５ｍｌのＤＧＹＰ培地二培地上
グリセロール２％酵母エキス、トラクト０．３％、ペプ
トン２％、リン酸１カリウム０．０５％、す７！２カリ
ウム０．１５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、
硫酸第１鉄７水塩０．００２％、硫酸マンガン４６水塩
０１００２％、チアミン塩酸塩１００μｇ／β、ｐＨ７
，２（〜ａＯＨ）−、に植え継ぎ、３０℃で４８時間培
養した。
泌生産するバチルス属菌株の検索バチルス属に属する菌
株１２１株をそれぞれＢＹ寒天培地二粉末ブイヨン（極
東製薬工業社製）２％、酵母エキストラフ）（大五栄養
化学社９Ａ）０．５％、寒天１，５％、ｐＨ７，２（＼
ａＯＨ） Ｅに塗布し、３０℃で一晩培養した。培養菌
体を１白菌耳とり、５ゴのＢＹＧ培地＝粉末ブイヨン２
％、粉末酵母エキストラクト （大工栄養化学社製）０
．５％、ブドウ糖２％、Ｉ） Ｈ７，２（Ｎａｌｌｌ）
”、に植菌し、３０ｔで１６時間、振盪培養した。−
晩培養液０．２５ｍ＆を５ｍｌのＤＧＹＰ培地二培地上
グリセロール２％酵母エキス、トラクト０．３％、ペプ
トン２％、リン酸１カリウム０．０５％、す７！２カリ
ウム０．１５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、
硫酸第１鉄７水塩０．００２％、硫酸マンガン４６水塩
０１００２％、チアミン塩酸塩１００μｇ／β、ｐＨ７
，２（〜ａＯＨ）−、に植え継ぎ、３０℃で４８時間培
養した。
培養液を３０００ｒρｍ、１５分間の遠心にかけ、遠心
土浦を分取し、土浦中のＴ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ活性を以下のように定量した。
土浦を分取し、土浦中のＴ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ活性を以下のように定量した。
＜ｒ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定法〉
適宜に希釈した培養上清１−を３０℃で２分間予備加温
した後、同じく３０℃で予備加温した基質ｃ１０ｄγ−
グルタミルーｐ−ニトロアニリド１０．２Ｍ）リス・塩
酸緩衝液（ｐＨ８，５） 〕 ｌｎｆを加え、３０℃で
酵素反応を進行させる。１０分後、２０％酢酸２ｍｌを
加えて反応を停止させ、遠心分離後、土浦中のｐ−ニト
ロアニリン量を波長４１０ｎｍで比色定量する。対照に
は、希釈した培養上清１ｇに２０％酢酸２飯を加えてか
ら基質１ｍｌを加えたものを用いる。
した後、同じく３０℃で予備加温した基質ｃ１０ｄγ−
グルタミルーｐ−ニトロアニリド１０．２Ｍ）リス・塩
酸緩衝液（ｐＨ８，５） 〕 ｌｎｆを加え、３０℃で
酵素反応を進行させる。１０分後、２０％酢酸２ｍｌを
加えて反応を停止させ、遠心分離後、土浦中のｐ−ニト
ロアニリン量を波長４１０ｎｍで比色定量する。対照に
は、希釈した培養上清１ｇに２０％酢酸２飯を加えてか
ら基質１ｍｌを加えたものを用いる。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性は、１分間に
１Ｍモルのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素量を１単
位（Ｕ）として算出する。４１０ｎｍの吸光度をＥ、対
照の吸光度をＥ Ｉ）とすると、希釈した培養上清１ｍ
ｌ中のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性量（Ｕ
）は次の式で与えられる。
１Ｍモルのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素量を１単
位（Ｕ）として算出する。４１０ｎｍの吸光度をＥ、対
照の吸光度をＥ Ｉ）とすると、希釈した培養上清１ｍ
ｌ中のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性量（Ｕ
）は次の式で与えられる。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性量（［ｊ）＝
０．５２３ｘ （Ｅ−Ｅｂ） ＸＩ／１０第１表に
、上記条件下でγ−グルタミルトランスペプチダーゼ生
産性が認められた株のＴ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性（Ｌｉ／ｍ＆）を示す。
０．５２３ｘ （Ｅ−Ｅｂ） ＸＩ／１０第１表に
、上記条件下でγ−グルタミルトランスペプチダーゼ生
産性が認められた株のＴ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ活性（Ｌｉ／ｍ＆）を示す。
第１表
菌 株 Ｔ −グルタミルトランス
ペプチダーゼ ＜ＩＪ／ｍ＆）バチルス・ズブチリス Ｊ１３８ １．４ バチルス・ズブチリス ＡＴ［：Ｃ９３７２ ０，７ 実施例２ バチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株由来の
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子のクローニ
ング （１）バチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株由来のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼの精製バチルス・ズブチ
リス５Ｊ１３８株を、ＢＹ寒天培地に塗布し、３０℃で
一晩培養した。培養菌体を１白金耳とり、５ｍｌのＢＹ
Ｇ培地に植菌し、３０℃で１６時間、振盪培養した。０
．８−の培養液を４０−のＢＹＧ培地に植え継ぎ、３０
℃で１０時間、振盪培養した後、全量を８００ｍ１のＧ
ＹＰ培地Ｃグリセロール８％、酵母エキストラクト０．
３％、ペプトン２％、リン酸１カリウム０．０５％、リ
ン酸２カリウム０，１５％、硫酸マグネシウム７水塩０
９０５％、硫酸第１鉄７水塩０、００２％、硫酸マンガ
ン４−６水塩０．００２％、チアミン塩酸塩１００．／
ｆ１． ｐＨ７，２（＼ａ（］Ｈ） 〕・を仕込んだ２
１ジャーファーメンタ−に加え、３０℃、Ｉ ＶＶｊ４
．７００ ｒｐｍで２０時間培養した。
ペプチダーゼ ＜ＩＪ／ｍ＆）バチルス・ズブチリス Ｊ１３８ １．４ バチルス・ズブチリス ＡＴ［：Ｃ９３７２ ０，７ 実施例２ バチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株由来の
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子のクローニ
ング （１）バチルス・ズブチリス５Ｊ１３８株由来のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼの精製バチルス・ズブチ
リス５Ｊ１３８株を、ＢＹ寒天培地に塗布し、３０℃で
一晩培養した。培養菌体を１白金耳とり、５ｍｌのＢＹ
Ｇ培地に植菌し、３０℃で１６時間、振盪培養した。０
．８−の培養液を４０−のＢＹＧ培地に植え継ぎ、３０
℃で１０時間、振盪培養した後、全量を８００ｍ１のＧ
ＹＰ培地Ｃグリセロール８％、酵母エキストラクト０．
３％、ペプトン２％、リン酸１カリウム０．０５％、リ
ン酸２カリウム０，１５％、硫酸マグネシウム７水塩０
９０５％、硫酸第１鉄７水塩０、００２％、硫酸マンガ
ン４−６水塩０．００２％、チアミン塩酸塩１００．／
ｆ１． ｐＨ７，２（＼ａ（］Ｈ） 〕・を仕込んだ２
１ジャーファーメンタ−に加え、３０℃、Ｉ ＶＶｊ４
．７００ ｒｐｍで２０時間培養した。
全量を８００ Ｏｒｐｍ、 １５分間の遠心にかけ、遠
心上清を分取した。遠心上清に等量のエタノールを加え
、氷上に１時間放置した後、８０００ｒρｍ。
心上清を分取した。遠心上清に等量のエタノールを加え
、氷上に１時間放置した後、８０００ｒρｍ。
１５分間の遠心にかけ、沈澱を回収した。沈澱を８０−
の水に懸濁し、リジンｌ塩酸塩８００ｍｇを加え、−２
０℃に凍結後、真空下に凍結乾煙した。
の水に懸濁し、リジンｌ塩酸塩８００ｍｇを加え、−２
０℃に凍結後、真空下に凍結乾煙した。
得られた約１．４ｇの標品を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１
ｔｃＡ（ｐＨ７，５）ｉｌｌ液＜ＴＢ）ｌ：１％ｆｆｉ
した後、ＴＢに対して透析した。透析サンプルをＴＢで
平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（Ｓｅｒｖａ社！りカ
ラム（１６０−担体容）にのせた後、５００ｍ１のＴＢ
で洗浄した。ＯＭから０．５ ＭのＳａｃβ濃度勾配を
かけたＴＢ ５００ｍ１！で溶出し、各分画のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ活性を、実施例１８己載
の方法で比色定量した。活性画分を膜濃縮し、５＋ｙ＋
ＭＩＪン酸媛衝液（ｐ Ｈ６，８）に透析した。
ｔｃＡ（ｐＨ７，５）ｉｌｌ液＜ＴＢ）ｌ：１％ｆｆｉ
した後、ＴＢに対して透析した。透析サンプルをＴＢで
平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（Ｓｅｒｖａ社！りカ
ラム（１６０−担体容）にのせた後、５００ｍ１のＴＢ
で洗浄した。ＯＭから０．５ ＭのＳａｃβ濃度勾配を
かけたＴＢ ５００ｍ１！で溶出し、各分画のＴ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ活性を、実施例１８己載
の方法で比色定量した。活性画分を膜濃縮し、５＋ｙ＋
ＭＩＪン酸媛衝液（ｐ Ｈ６，８）に透析した。
同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（６
０ｍｌ担体容）に吸着させ、２００ｍＭ、３００ｍＭお
よび４００ｍＭリンＭ緩衝液（ｐＨ６，８）各１２０ｍ
１で溶出させた。４００ｍ！Ｊ’Ｊン酸緩衝液溶出画分
にＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が見出され
た。この分画をＴＢに対して透析し、膜濃縮を行った後
、さらにＴＢに対して透析することによって、精製Ｔ−
グルタミルトランスベプチダーセが得ろれた。精製Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーゼは、５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動法によって、分子量約４１におよび
約２３Ｋに相当する蛋白質バンドを与えた。これらはＴ
−グルタミルトランスベプチダーゼの大、小サブ＾１ａ ユニットに←目当する。また、夾雑タンパク質は見られ
ないことが確認された。
０ｍｌ担体容）に吸着させ、２００ｍＭ、３００ｍＭお
よび４００ｍＭリンＭ緩衝液（ｐＨ６，８）各１２０ｍ
１で溶出させた。４００ｍ！Ｊ’Ｊン酸緩衝液溶出画分
にＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性が見出され
た。この分画をＴＢに対して透析し、膜濃縮を行った後
、さらにＴＢに対して透析することによって、精製Ｔ−
グルタミルトランスベプチダーセが得ろれた。精製Ｔ−
グルタミルトランスペプチダーゼは、５ＤＳ−ポリアク
リルアミド電気泳動法によって、分子量約４１におよび
約２３Ｋに相当する蛋白質バンドを与えた。これらはＴ
−グルタミルトランスベプチダーゼの大、小サブ＾１ａ ユニットに←目当する。また、夾雑タンパク質は見られ
ないことが確認された。
（２）Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼのアミノ酸
配列の決定 精製Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼの大、小サブ
ユニットを逆相高速液体クロマトグラフィーで分取し、
各サブユニットを常法によりトリプシン分解した。トリ
プシン分解産物を逆相斉速液体クロマトグラフィーで分
画し、分取した各）・リブシンペプチドを４７ＯＡシー
ケンサ−＜ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
で分析した。この分析で得られた大、小サブユニットに
由来する各々１つのトリプシンペプチドのアミノ酸配列
を以下に示す。
配列の決定 精製Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼの大、小サブ
ユニットを逆相高速液体クロマトグラフィーで分取し、
各サブユニットを常法によりトリプシン分解した。トリ
プシン分解産物を逆相斉速液体クロマトグラフィーで分
画し、分取した各）・リブシンペプチドを４７ＯＡシー
ケンサ−＜ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
で分析した。この分析で得られた大、小サブユニットに
由来する各々１つのトリプシンペプチドのアミノ酸配列
を以下に示す。
大サブユニット由来トリプシンペプチドＧｌｙ−Ａｓｐ
−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ａｓｎ小サブユニット由来ト
リプシンペプチドＶａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−！
＋１ｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（３） γ−グル
タミルトランスペプチダーゼのアミノ酸配列に対応する
オリゴヌクＩ／オチドの合成２種のオリゴヌクレオチド
混合物 プローブＬ ： ５’−ＴＧＧＧＣ’１ＴＡＹＣＡＲＧ
ＡＲＧＧ−３’プローブＳ ： ５’−ＧＡＲＴＡＹＧ
ＧＮＡＴＧＧＡＹＹＴ−３’（ただし、ＮはＡ、 Ｔ、
ＧまたはＣ，ＹはＴまたハｃ、ＲはＡまたはＧを示す
）を３８０Ａ ＤＮＡ合成機＜Ａｐｐｉｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社！Ｉｆりを用いて合成した。
−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−＾１ａ−Ａｓｎ小サブユニット由来ト
リプシンペプチドＶａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−！
＋１ｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（３） γ−グル
タミルトランスペプチダーゼのアミノ酸配列に対応する
オリゴヌクＩ／オチドの合成２種のオリゴヌクレオチド
混合物 プローブＬ ： ５’−ＴＧＧＧＣ’１ＴＡＹＣＡＲＧ
ＡＲＧＧ−３’プローブＳ ： ５’−ＧＡＲＴＡＹＧ
ＧＮＡＴＧＧＡＹＹＴ−３’（ただし、ＮはＡ、 Ｔ、
ＧまたはＣ，ＹはＴまたハｃ、ＲはＡまたはＧを示す
）を３８０Ａ ＤＮＡ合成機＜Ａｐｐｉｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社！Ｉｆりを用いて合成した。
得みれたオリコ゛ヌクレオチド３０ ｎｇｉ： ｒ −
３２Ｐ＾ＴＰ３０μｃｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｍ）、Ｔ
４ポリヌク１７オチドキナーセ（宝酒芭社製）１単位お
よびキナーセ緩衝液（０，５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ、１
００ｍＭ ＭｇＣＡ 、、１００ｍＭ ジチオス１ノ
イトール、ｐＨ７，５：１３ｕｃを加えた反応液３０μ
Ｑを３７℃で３０分間保ち、５′末端を３２Ｐで標識し
た。反応液に１０μｇのサケ精子ＤＮＡを加えて、フェ
ノール抽出を行い、水溶性画分から２０ｍＭ Ｔｒ
ｉ ５−ＨＣｆ （ｐＨ７，５）１００ｍ’、ｌ Ｎ
ａＣ１−１ｍＭ ＥＤＴＡ！：平衡化したＤＥＡＥセ
ファデックスＧ −５０＜Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カ
ラムにより標識オリゴヌクレオチドを分取した。
３２Ｐ＾ＴＰ３０μｃｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社Ｍ）、Ｔ
４ポリヌク１７オチドキナーセ（宝酒芭社製）１単位お
よびキナーセ緩衝液（０，５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ、１
００ｍＭ ＭｇＣＡ 、、１００ｍＭ ジチオス１ノ
イトール、ｐＨ７，５：１３ｕｃを加えた反応液３０μ
Ｑを３７℃で３０分間保ち、５′末端を３２Ｐで標識し
た。反応液に１０μｇのサケ精子ＤＮＡを加えて、フェ
ノール抽出を行い、水溶性画分から２０ｍＭ Ｔｒ
ｉ ５−ＨＣｆ （ｐＨ７，５）１００ｍ’、ｌ Ｎ
ａＣ１−１ｍＭ ＥＤＴＡ！：平衡化したＤＥＡＥセ
ファデックスＧ −５０＜Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カ
ラムにより標識オリゴヌクレオチドを分取した。
（４）サザンハイプリダイゼーンヨン法による５Ｊ１３
８染色体のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼコード
領域の構造解析 Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ分泌生産菌バチル
ス・ズブチリス５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡとプローブし
およびＳとのサザンハイプリダイゼーションを以下のよ
う行った。
８染色体のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼコード
領域の構造解析 Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ分泌生産菌バチル
ス・ズブチリス５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡとプローブし
およびＳとのサザンハイプリダイゼーションを以下のよ
う行った。
５Ｊ１３８株を４０−のＢＹＧ培地に植菌し、３０℃−
晩培養した菌体から、斎藤および三浦の方法二ｆ１．ｓ
ａ＋ｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉｕｒａ ： Ｂ＋ｏｃｈ＋
ｍ、 日ｔｏｐｈｙｓＡｃｔａ ７２．６１９＜１９
６３） ：により、染色体ＤＮＡを調製した。得られた
染色体ＤＮＡ２■をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
Ｈｉ ｎ ｄ ＩＵで切断後、分子量マーカーであるλ
ＤＮＡ （宝酒造社製）のＨｉｎｄｌＩ［切断物ととも
にアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動は３連で
行った。電気原動後、１枚のゲルは、エチジウムブロマ
イドで染色し、ＤＮＡの移動度比較のための物差しとと
もに写真を撮った。残りのゲル２枚を１０倍容の０．５
Ｎ Ｎ ａ ＯＨ−Ｉ Ｍ Ｎ ａ Ｃｆおよび０
．５ＭＴ ｒｉｓ −ＨＣβ （ｐＨ７，５）
−２，５Ｍ ＮａＣｆに３０分間ずつ順次浸漬
して、ＤＮＡを変性させた。このゲルにそれぞれニトロ
セルロースフィルターを密着させ、濾紙越しにゲルの下
から２０×ＥＳＣ二３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエ
ン酸三ナトリウム（ｐＩ−１７，０）：を供給しながろ
１６時間放置することにより、ニトロセルロースフィル
ター上に変性Ｄ Ｎ Ａを移した。フィルターを乾煙後
、８０℃で２時間処理してＤ Ｎ Ａをフィルター：こ
固定した。
晩培養した菌体から、斎藤および三浦の方法二ｆ１．ｓ
ａ＋ｔｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｉｕｒａ ： Ｂ＋ｏｃｈ＋
ｍ、 日ｔｏｐｈｙｓＡｃｔａ ７２．６１９＜１９
６３） ：により、染色体ＤＮＡを調製した。得られた
染色体ＤＮＡ２■をそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよび
Ｈｉ ｎ ｄ ＩＵで切断後、分子量マーカーであるλ
ＤＮＡ （宝酒造社製）のＨｉｎｄｌＩ［切断物ととも
にアガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動は３連で
行った。電気原動後、１枚のゲルは、エチジウムブロマ
イドで染色し、ＤＮＡの移動度比較のための物差しとと
もに写真を撮った。残りのゲル２枚を１０倍容の０．５
Ｎ Ｎ ａ ＯＨ−Ｉ Ｍ Ｎ ａ Ｃｆおよび０
．５ＭＴ ｒｉｓ −ＨＣβ （ｐＨ７，５）
−２，５Ｍ ＮａＣｆに３０分間ずつ順次浸漬
して、ＤＮＡを変性させた。このゲルにそれぞれニトロ
セルロースフィルターを密着させ、濾紙越しにゲルの下
から２０×ＥＳＣ二３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエ
ン酸三ナトリウム（ｐＩ−１７，０）：を供給しながろ
１６時間放置することにより、ニトロセルロースフィル
ター上に変性Ｄ Ｎ Ａを移した。フィルターを乾煙後
、８０℃で２時間処理してＤ Ｎ Ａをフィルター：こ
固定した。
このフィルター２枚にプレハイブリダイゼーション溶液
二〇、０２％フィコール、０．０２％牛血清アルブミン
、００２％ポリビニルピロリドン、０．９〜１ 塩化ナ
トリウム、０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム、５０
ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｆ （ｐＨ７，０）、５
０μｇ／ｍＲ熱変性化サケ精液ＤＮＡ〕・ ６ヅを加え
て、６５℃で３時間ビニル袋中でプレハイブリダイセー
ンヨンを行った。ビニル袋からフィルターを取出し、そ
れぞれのフィルターにつき新しいプレハイブリダイセー
ンヨン溶液３ゴを加え、さらに９５℃で５分間処理した
３２ｐ標識化プローブＬおよびＳの２μＣ１相当を各々
加え、ビニル袋を密封した。３４℃で１６時間のハイブ
リダイゼーションを行った後、フィルターを取出し、約
１００ｍ１の６ Ｘ ＳＳ ＣＣｏ、 ９ Ｍ塩化ナト
リウム、０．０９Ｍクエン酸三ナトリウム（ｐＨ７，０
）：ｌ中、２０℃で１０分間ずつ３回洗浄した。フィル
ターを風乾し、−８０℃で２日間Ｘ線フィルムを感光さ
せた。Ｘ線フィルムを現像し、黒化したバンド部分に対
応するＤＮＡの分子量を、先に撮影したゲルの写真から
求めた。プローブしおよびＳともに２．９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ切断産物および２．８ ｋｂのＨｉｎｄ■切断産物
にハイブリダイズすることが判明した。
二〇、０２％フィコール、０．０２％牛血清アルブミン
、００２％ポリビニルピロリドン、０．９〜１ 塩化ナ
トリウム、０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム、５０
ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣｆ （ｐＨ７，０）、５
０μｇ／ｍＲ熱変性化サケ精液ＤＮＡ〕・ ６ヅを加え
て、６５℃で３時間ビニル袋中でプレハイブリダイセー
ンヨンを行った。ビニル袋からフィルターを取出し、そ
れぞれのフィルターにつき新しいプレハイブリダイセー
ンヨン溶液３ゴを加え、さらに９５℃で５分間処理した
３２ｐ標識化プローブＬおよびＳの２μＣ１相当を各々
加え、ビニル袋を密封した。３４℃で１６時間のハイブ
リダイゼーションを行った後、フィルターを取出し、約
１００ｍ１の６ Ｘ ＳＳ ＣＣｏ、 ９ Ｍ塩化ナト
リウム、０．０９Ｍクエン酸三ナトリウム（ｐＨ７，０
）：ｌ中、２０℃で１０分間ずつ３回洗浄した。フィル
ターを風乾し、−８０℃で２日間Ｘ線フィルムを感光さ
せた。Ｘ線フィルムを現像し、黒化したバンド部分に対
応するＤＮＡの分子量を、先に撮影したゲルの写真から
求めた。プローブしおよびＳともに２．９ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ切断産物および２．８ ｋｂのＨｉｎｄ■切断産物
にハイブリダイズすることが判明した。
（５）バチルス・ズブチリスの宿主ベクター系における
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子のクローニ
ング ５Ｊ１３８株由来のＴ−グルタミルトランスペプチダー
ゼの２つのサブユニットコード配列を、１つのＤＮＡ断
片としてクローニングできる可能性が示されたので、バ
チルス・ズブチリスの宿主ベクター系を用いて、Ｔ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼの活性発現を目安にショ
ットガンクロニングを行った。マーカーレスキュー法に
おける受容菌としては、バチルス・ズブチリス・マーバ
ーグＢＲ１５１株にバチルス・ズブチリスのプラスミド
ｐＵＢ１１０をコンピテント法により導入してｌたＢＲ
１５１／ｐＵＢ １１０株を用いた。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子のクローニ
ング ５Ｊ１３８株由来のＴ−グルタミルトランスペプチダー
ゼの２つのサブユニットコード配列を、１つのＤＮＡ断
片としてクローニングできる可能性が示されたので、バ
チルス・ズブチリスの宿主ベクター系を用いて、Ｔ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼの活性発現を目安にショ
ットガンクロニングを行った。マーカーレスキュー法に
おける受容菌としては、バチルス・ズブチリス・マーバ
ーグＢＲ１５１株にバチルス・ズブチリスのプラスミド
ｐＵＢ１１０をコンピテント法により導入してｌたＢＲ
１５１／ｐＵＢ １１０株を用いた。
一方、バチルス・ズブチリスのプラスミドｐＢＤ６ ４
（Ｄ、Ｄｕｂｎａｕ ｅｔ、 ａｌ、
： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ＋ｏｌ。
（Ｄ、Ｄｕｂｎａｕ ｅｔ、 ａｌ、
： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ＋ｏｌ。
１４１ 、２４６ （１９８０）Ｊを制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで切断し、Ｔ−グルタミルトランスベプチダーセ生
産菌５Ｊ１３８株の染色体ＤＮＡの５ａｕ３Ａ部分切断
産物とＴ４ ＤＮＡＩＪガーセ（宝酒造社製）を用い
て連結した。同連結物を用いて、ＢＲ１５１／ｐＵ８１
１０株のコンピテント細胞を形質転換した。形質転換し
た菌液を５■／−のクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含
むＧＴ寒天平板培地コマルトース０．２％、グルタミン
Ｍｌナトリウム０．２５％、トリプトファン５０μｇ／
ｎＷ、リン酸１カリウム０．０５％、リンｒｌ！２カリ
ウム０．４５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、
硫酸第１鉄マ水塩０、 ＯＯ２％、硫酸マンガン４−６
水塩０．００２％、チアミン塩酸塩１００仏ｇ／β、寒
天１．５％、ｐＨ７，２（ＮａＯＨ）］に敷いたニトロ
セルロースフィルター上に塗布し、３０℃で３日間保温
した。
ＨＩで切断し、Ｔ−グルタミルトランスベプチダーセ生
産菌５Ｊ１３８株の染色体ＤＮＡの５ａｕ３Ａ部分切断
産物とＴ４ ＤＮＡＩＪガーセ（宝酒造社製）を用い
て連結した。同連結物を用いて、ＢＲ１５１／ｐＵ８１
１０株のコンピテント細胞を形質転換した。形質転換し
た菌液を５■／−のクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含
むＧＴ寒天平板培地コマルトース０．２％、グルタミン
Ｍｌナトリウム０．２５％、トリプトファン５０μｇ／
ｎＷ、リン酸１カリウム０．０５％、リンｒｌ！２カリ
ウム０．４５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、
硫酸第１鉄マ水塩０、 ＯＯ２％、硫酸マンガン４−６
水塩０．００２％、チアミン塩酸塩１００仏ｇ／β、寒
天１．５％、ｐＨ７，２（ＮａＯＨ）］に敷いたニトロ
セルロースフィルター上に塗布し、３０℃で３日間保温
した。
形質転換体のコロニーの出現したフィルターを、５ｍＭ
ｒ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド１０、２ Ｍ
）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）を浸漬させた濾紙
上に置き、３７℃で保温することによって、コロニーの
周辺にＴ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドの加水分解
物であるｐ−ニトロアニリンの黄色の呈色が見られる株
を検出した。
ｒ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド１０、２ Ｍ
）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）を浸漬させた濾紙
上に置き、３７℃で保温することによって、コロニーの
周辺にＴ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドの加水分解
物であるｐ−ニトロアニリンの黄色の呈色が見られる株
を検出した。
このような株のうちの１株から、グリッツアンらの方法
［、Ｔ、Ｊ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ、： Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ１１３４ 、３１８（１９７８） １
に従って分離したプラスミドｐＧ３１について、実施例
２（３）の方法で”Ｐ標識したプローブしおよびＳを用
いて、実施例２（４）に記載した方法でサザンハイプリ
ダイゼーションを行った結果、ｐＧ３１プラスミド上に
は、これら両プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片
が含まれることが判明し、ｐｃ３１プラスミド上にγグ
ルタミルトランスペプチダーゼの大・小サブュニントを
コードする配列がクローン化されていることが示唆され
た。
［、Ｔ、Ｊ、Ｇｒｙｃｚａｎ ｅｔ ａｌ、： Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒ＋ｏ１１３４ 、３１８（１９７８） １
に従って分離したプラスミドｐＧ３１について、実施例
２（３）の方法で”Ｐ標識したプローブしおよびＳを用
いて、実施例２（４）に記載した方法でサザンハイプリ
ダイゼーションを行った結果、ｐＧ３１プラスミド上に
は、これら両プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片
が含まれることが判明し、ｐｃ３１プラスミド上にγグ
ルタミルトランスペプチダーゼの大・小サブュニントを
コードする配列がクローン化されていることが示唆され
た。
さらに、クローン化断片の由来を確古忍するため、該ク
ローン化断片中のり、Ｏｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を月参
で、５Ｊ１３８株の染色体ＤＮＡとのサザンハイブリダ
イセーションを行った。１．０ ｋｂ ＥｃｏＲ（断
片を精製するため、ＥｃｏＲＩで切断した５■のｐＧ３
１ ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分画し、この
１． Ｏｋｂ Ｅ ｃ ｏ ＲＩ断片を含むゲル片を
切り出した。ゲル片を透析膜に入れ、トリス・ホウ酸緩
衝液（９０ｍ！Ｊ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ、 ４ｍ
ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）０．３ｍを満たして密封した
後、同トリス・ホウ酸緩衝液中で５０ｍＡ、１０分間の
電気泳動を行ってＤＮＡをゲルから溶出した。
ローン化断片中のり、Ｏｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を月参
で、５Ｊ１３８株の染色体ＤＮＡとのサザンハイブリダ
イセーションを行った。１．０ ｋｂ ＥｃｏＲ（断
片を精製するため、ＥｃｏＲＩで切断した５■のｐＧ３
１ ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分画し、この
１． Ｏｋｂ Ｅ ｃ ｏ ＲＩ断片を含むゲル片を
切り出した。ゲル片を透析膜に入れ、トリス・ホウ酸緩
衝液（９０ｍ！Ｊ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ、 ４ｍ
ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）０．３ｍを満たして密封した
後、同トリス・ホウ酸緩衝液中で５０ｍＡ、１０分間の
電気泳動を行ってＤＮＡをゲルから溶出した。
２０秒間電流を逆流させ、透析膜からＤＮＡを剥離させ
た後、溶出液を取出し、１／１０容の３Ｍ酢酸すｌ−＋
Ｊウム（ｐ Ｈ５，６＞および３倍量の冷エタノールを
加えて遠心分離し、沈澱したＤＮＡを回収した。ＤＮＡ
を乾燥させた後、１０通のＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔ
ｒｙｓ−ＨＣＩＩ、 １ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐ［１７，５
）に溶解した。
た後、溶出液を取出し、１／１０容の３Ｍ酢酸すｌ−＋
Ｊウム（ｐ Ｈ５，６＞および３倍量の冷エタノールを
加えて遠心分離し、沈澱したＤＮＡを回収した。ＤＮＡ
を乾燥させた後、１０通のＴＥ緩衝液（２０ｍＭ Ｔ
ｒｙｓ−ＨＣＩＩ、 １ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐ［１７，５
）に溶解した。
このＤＮ、’ｌｉをニックトランスレーンヨンに供し、
放射標識したＣＰ、ｌ１１．Ｊ、Ｒ＋ｇｂｙ ｅｔ
ａｌ、 ：Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、、 １１３
、２３７ （１９７７） ］ ｏ［識ＤＮＡをプローブ
に用１７）で、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ生
産菌５Ｊ１３８株およびバチルス・ズブチリス・マーハ
ーグＢＲ１５１株の各染色体ＤＮＡの制限酵素Ｂｇβ■
切断物とのサザンハイプリダイゼーションを行った。標
ｍＤＮＡは、５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡの９．５ ｋｂ
のＢｇβ■切断産物と強くハイブリダイズしたが、ＢＲ
１５１株染色体ＤＮＡとはほとんどハイブリダイズしな
かった。このことから、クローン化断片は、γ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ生産菌５Ｊ１３８株の染色体
に由来することが判明した。
放射標識したＣＰ、ｌ１１．Ｊ、Ｒ＋ｇｂｙ ｅｔ
ａｌ、 ：Ｊ、 Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ、、 １１３
、２３７ （１９７７） ］ ｏ［識ＤＮＡをプローブ
に用１７）で、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ生
産菌５Ｊ１３８株およびバチルス・ズブチリス・マーハ
ーグＢＲ１５１株の各染色体ＤＮＡの制限酵素Ｂｇβ■
切断物とのサザンハイプリダイゼーションを行った。標
ｍＤＮＡは、５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡの９．５ ｋｂ
のＢｇβ■切断産物と強くハイブリダイズしたが、ＢＲ
１５１株染色体ＤＮＡとはほとんどハイブリダイズしな
かった。このことから、クローン化断片は、γ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ生産菌５Ｊ１３８株の染色体
に由来することが判明した。
さらに、前述の標識ＤＮＡをプローブに用いて、ｐＧ３
１ ＤＮＡと５Ｊ１３８株由来の染色体ＤＮＡの各種
制限酵素切断物とのサザンハイプリダイゼーションを行
い、５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡ上の制限酵素ＥｃｏＲＩ
切断部位からＮｒｕｌ切断部位までの少なくとも２．１
ｋｂにわたる連続した領域が、ｐＧ３１上にクローン化
されているＤＮＡ断片と同構造であることが判明した（
第３図参照）。
１ ＤＮＡと５Ｊ１３８株由来の染色体ＤＮＡの各種
制限酵素切断物とのサザンハイプリダイゼーションを行
い、５Ｊ１３８株染色体ＤＮＡ上の制限酵素ＥｃｏＲＩ
切断部位からＮｒｕｌ切断部位までの少なくとも２．１
ｋｂにわたる連続した領域が、ｐＧ３１上にクローン化
されているＤＮＡ断片と同構造であることが判明した（
第３図参照）。
実施例３ γ−グルタミルトランスペプテダーゼ遺伝子
のＤＮＡ塩基配列の決定 Ｔ−グルタミルトランスベブチダーゼ遺伝子の塩基配列
を決定するために、ｐＧ３１を各種制限酵素で切断し、
大陽菌プラスミドｐＬ’ｃｌ１８およびｐＵｃ１１９へ
のサブクローニングを行った。
のＤＮＡ塩基配列の決定 Ｔ−グルタミルトランスベブチダーゼ遺伝子の塩基配列
を決定するために、ｐＧ３１を各種制限酵素で切断し、
大陽菌プラスミドｐＬ’ｃｌ１８およびｐＵｃ１１９へ
のサブクローニングを行った。
必要に応じ、エキソヌクレアーゼ■を用いるデリーショ
ンキット（宝酒造社製）を使用して、さらにサブクロー
ンの縮小化を行った。
ンキット（宝酒造社製）を使用して、さらにサブクロー
ンの縮小化を行った。
これらのサブクローン化ブラスミドを保有する大１１［
Ｋ １ ２株亜株ＭＶ１１８４を、１００μｇ／ｍ＆の
アンピシリン（Ａｐ）を含む２ＸＴＹ培地（バタトトリ
プトン１．６％、酵母エキストラクト１％、Ｎ ａ Ｃ
Ｒ Ｏ． ５％、ｐ Ｈ ７． ４ ）中で３７℃で
一晩培養した。この前培養液３０μＱを１００ｔＬｇ／
ｍ＆のＡｐを含む２ＸＴＹ培地３−に植菌して、３７℃
で３時間培養した後、ヘルバーファージＭ１３ＫＯ７を
感染多重度３で感染させ、カナマイシン（ Ｋｍ）を終
濃度７０ｇ／ｍｃとなるように添加して３７℃で一晩培
養した。得られたファージ粒子から１本鎖Ｄ Ｎ Ａを
抽出しｌ：ＪＪｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．
１５３ ．３，＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９
８７）〕、ジデ才キシチェインターミネーション法によ
って塩基配列を決定した。以下に決定されたＳｐｈ Ｉ
認識配列からＮｒｕＩ認識配列までの２３８２塩基の配
列を示す。
Ｋ １ ２株亜株ＭＶ１１８４を、１００μｇ／ｍ＆の
アンピシリン（Ａｐ）を含む２ＸＴＹ培地（バタトトリ
プトン１．６％、酵母エキストラクト１％、Ｎ ａ Ｃ
Ｒ Ｏ． ５％、ｐ Ｈ ７． ４ ）中で３７℃で
一晩培養した。この前培養液３０μＱを１００ｔＬｇ／
ｍ＆のＡｐを含む２ＸＴＹ培地３−に植菌して、３７℃
で３時間培養した後、ヘルバーファージＭ１３ＫＯ７を
感染多重度３で感染させ、カナマイシン（ Ｋｍ）を終
濃度７０ｇ／ｍｃとなるように添加して３７℃で一晩培
養した。得られたファージ粒子から１本鎖Ｄ Ｎ Ａを
抽出しｌ：ＪＪｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．
１５３ ．３，＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９
８７）〕、ジデ才キシチェインターミネーション法によ
って塩基配列を決定した。以下に決定されたＳｐｈ Ｉ
認識配列からＮｒｕＩ認識配列までの２３８２塩基の配
列を示す。
ＣＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＴＴＴＧ＾＾ＡＡＡ
ＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＧＡＡ
ＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡ＾丁ＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣ
ＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＧＡＧ
ＧＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＴＡ＾ＡＴＧＡＧ
ＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＴＴ
ＴＴＴＴＴＧＡＧＣ＾＾ＣＴＧＧＡＴＣＧＴＴ＾＾ＡＴ
ＡＣＴＧ（ｉＣＴＣＡＣＧＴ丁ＣＣＴＴＣＡＴＡＴＧＴ
ＣＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴ
ＡＴＴＧＴＡＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＡＴ
ＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣ
ＧＧＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＴＴＧＣＣＡ
ＣＴＯＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＣＣＣＣ
ＡＡＣＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＣＣＧＧＡＣＴＡＴＴＣＣ
ＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＬ．ｅｌｕＡｊｎＡＳｎＩ．Ｉ
ｌｕＬ＠ｕｌｎｒＡｓｐＩ”ｎｅ＾ｓｐＡｉａｖａｌＰ
ｒｏＧＩ．ｙＧｉｙＡｌａＡａｎＧＩｕｖａ１ＧｌｎＰ
ｒ●＾ｓｎｓｅｒＭａｒＴｈｒｓｅｒＴｙｒＡｒｇ丁ｙ
ｒＧｌｕＬｙｓＧ］ｙＶａｌＰｒｏＧＩｕＧｌｕ＾Ｉ
ａＡｒｇＴｈｒＬｙｓＬｅｕ略記号 −３５および・１０． ｊｌ定ブａモーター領域ＲＩＩ
Ｓ、 Ｍｉ定ＩＪ、ｌ？／−ムｉｉ合ｕ位：−−−−噂
−−−、唯定転写終結配ダリＳｐｈ ｌ認識配列からＮ
ｒｕＩ認識配列までの配列中には、５９１アミノ酸残基
をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｌ
、）が見出された。ＯＲＦｌの上流にはリポソーム結合
８位と考えられる、バチルス・ズブチリス１６ｓリポソ
ームＲＮＡの３′末端配列と相補的な配列（ＡＡＡＧＧ
八ＧＧ）へ認められた。さらにはその上流には、３５領
域および一１０領域と考えられる配列（ＡＡＡＡＣ＾）
および（ＴＡＴＡＡＴ）が見出された。ＯＲ，Ｆｌの下
流には転写終結に関与すると考えられる、ステム・ルー
プ構造をとりつる配列（＾ＡＡＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣ
ＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴ）が
見られた。また０ＲＦ１内邪には発現制御配列は見出さ
れなかった。
ＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡＣＧＡＡ
ＣＧＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡ＾丁ＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣ
ＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＧＡＧ
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ａＡｒｇＴｈｒＬｙｓＬｅｕ略記号 −３５および・１０． ｊｌ定ブａモーター領域ＲＩＩ
Ｓ、 Ｍｉ定ＩＪ、ｌ？／−ムｉｉ合ｕ位：−−−−噂
−−−、唯定転写終結配ダリＳｐｈ ｌ認識配列からＮ
ｒｕＩ認識配列までの配列中には、５９１アミノ酸残基
をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｌ
、）が見出された。ＯＲＦｌの上流にはリポソーム結合
８位と考えられる、バチルス・ズブチリス１６ｓリポソ
ームＲＮＡの３′末端配列と相補的な配列（ＡＡＡＧＧ
八ＧＧ）へ認められた。さらにはその上流には、３５領
域および一１０領域と考えられる配列（ＡＡＡＡＣ＾）
および（ＴＡＴＡＡＴ）が見出された。ＯＲ，Ｆｌの下
流には転写終結に関与すると考えられる、ステム・ルー
プ構造をとりつる配列（＾ＡＡＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＣ
ＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴ）が
見られた。また０ＲＦ１内邪には発現制御配列は見出さ
れなかった。
０ＲＦＩの１番目から３００番目アミノ酸配列は、バチ
ルス属細菌で知られている典型的な分泌シグナル配列ロ
山根：日本農芸化学会誌、６１．［１４（１９８７）：
の特徴を有していた。しかし、これ以外にＯＲＦｌ内部
には分泌シグナル様の配列は見られなかった。３７８番
目から３９０番目のアミン酸配列は、先に解読した大サ
ブユニットの部分アミノ酸配列と一致し、５０３番目か
ら５１０番目のアミノ酸配列は、小サブユニットの部分
アミノ酸配列と一致していた。これらのことから、バチ
ルス・ズブチリス５Ｊ１３８株のＴ−グルタミルトラン
スペプチダーゼ遺伝子は、Ｔ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの大、小サブユニットを１つのポリペプチドと
してコードして′−ると考えられる。
ルス属細菌で知られている典型的な分泌シグナル配列ロ
山根：日本農芸化学会誌、６１．［１４（１９８７）：
の特徴を有していた。しかし、これ以外にＯＲＦｌ内部
には分泌シグナル様の配列は見られなかった。３７８番
目から３９０番目のアミン酸配列は、先に解読した大サ
ブユニットの部分アミノ酸配列と一致し、５０３番目か
ら５１０番目のアミノ酸配列は、小サブユニットの部分
アミノ酸配列と一致していた。これらのことから、バチ
ルス・ズブチリス５Ｊ１３８株のＴ−グルタミルトラン
スペプチダーゼ遺伝子は、Ｔ−グルタミルトランスペプ
チダーゼの大、小サブユニットを１つのポリペプチドと
してコードして′−ると考えられる。
ｐＧ３１プラスミドのＳｐｈ ｌ認識配列から２３４塩
基の配列は、ｐｔゴＢ１１０プラスミドの１０２３０２
３番目８９番目までの２３５塩基の配列二Ｔ、Ｍｃｋｅ
ｎｚ＋ｅ ｅｔ ａｔ、 ： Ｐｌａｓｍｉｄ、
１５．９３（！９８６）１のうちの８６０番目のＧを除
いた配列と致して５また。２３０番目かろ２３４番目ま
での配列：ま、Ｂ ａ ｍ Ｈｌ ！、（２Ｘｌａ配列
と５ａｕ３ＡＤ識配列の連結部位と考えろれた。この連
結部位の下流から１１０ヌクレオチドの間隔を置いてＥ
ＣＯＲ，［認識配列が存在し、２１４２ヌクレオチド
の間隔を置−）て、Ｎｒｕｌ認識配列が見出された。
基の配列は、ｐｔゴＢ１１０プラスミドの１０２３０２
３番目８９番目までの２３５塩基の配列二Ｔ、Ｍｃｋｅ
ｎｚ＋ｅ ｅｔ ａｔ、 ： Ｐｌａｓｍｉｄ、
１５．９３（！９８６）１のうちの８６０番目のＧを除
いた配列と致して５また。２３０番目かろ２３４番目ま
での配列：ま、Ｂ ａ ｍ Ｈｌ ！、（２Ｘｌａ配列
と５ａｕ３ＡＤ識配列の連結部位と考えろれた。この連
結部位の下流から１１０ヌクレオチドの間隔を置いてＥ
ＣＯＲ，［認識配列が存在し、２１４２ヌクレオチド
の間隔を置−）て、Ｎｒｕｌ認識配列が見出された。
Ｎ ｒ ｕ Ｉ 認識配列から１４ヌクレオチド離れて
５ａｕ３Ａ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の連結部位と
考えられる配列、さらにはｐＵＢ１１０プラスミドの７
８８番目から上流の配列が見出された。
５ａｕ３Ａ認識配列とＢａｍＨＩ認識配列の連結部位と
考えられる配列、さらにはｐＵＢ１１０プラスミドの７
８８番目から上流の配列が見出された。
これらのことおよび実施例２（５）のサザンハイプリダ
イゼーション実験の結果から、少なくとも、Ｓｐｈ ｌ
認識配列からＮ ｒ ｕ Ｉ 認識配列間での２３８２
塩基長のＤＮＡ配列はｐＵＢ １１０のＤＮＡ七５Ｊ１
３８株染色体ＤＮＡのみに由来すると考えられ、この領
域より内側の配列をバチルス・ズブチリスプラスミドベ
クターに再連結すれば、Ｔ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ遺伝子のセルフクローニングが可能である。
イゼーション実験の結果から、少なくとも、Ｓｐｈ ｌ
認識配列からＮ ｒ ｕ Ｉ 認識配列間での２３８２
塩基長のＤＮＡ配列はｐＵＢ １１０のＤＮＡ七５Ｊ１
３８株染色体ＤＮＡのみに由来すると考えられ、この領
域より内側の配列をバチルス・ズブチリスプラスミドベ
クターに再連結すれば、Ｔ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ遺伝子のセルフクローニングが可能である。
実施例４ Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子
を増幅したバチルス・ズブチリス株の造成ｐＧ３１から
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子をセルフク
ローニングするため、バチルス・ズブチリスプラスミド
ｐＵＢ１１０の誘導体プラスミドｐＥＸ６５３にｐＧ３
１に由来するＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝
子を含むｓｐｈ ［認識配列からＮｒｕｔ認諏配列の断
片を移した。ｐＥＸ６５３は次のようにして作製したく
第２図参照）。バチルス・ズブチリスのプラスミドｐＵ
ＢｌｌｏのＤＮＡ ５μｇと大腸菌プラスミドｐＵｃ１
９Ｄ＼Δ（宝酒造社１４）５ｇｇをＥｃｏＲｌとＸｂａ
Ｉでそれぞれ二重切断し、Ｔ４ Ｄ Ｎ Ａ ＋１
ガーセで連結後、バチルス・ズブチＩＩス・マーハーグ
ＢＲ１５１株のコンピテント細胞を形質転換して、５＋
ｚｇ／眼のＫ ｍを含むＢＹ寒天平板培地：こ生育した
形質転換体を選択した。
を増幅したバチルス・ズブチリス株の造成ｐＧ３１から
Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子をセルフク
ローニングするため、バチルス・ズブチリスプラスミド
ｐＵＢ１１０の誘導体プラスミドｐＥＸ６５３にｐＧ３
１に由来するＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝
子を含むｓｐｈ ［認識配列からＮｒｕｔ認諏配列の断
片を移した。ｐＥＸ６５３は次のようにして作製したく
第２図参照）。バチルス・ズブチリスのプラスミドｐＵ
ＢｌｌｏのＤＮＡ ５μｇと大腸菌プラスミドｐＵｃ１
９Ｄ＼Δ（宝酒造社１４）５ｇｇをＥｃｏＲｌとＸｂａ
Ｉでそれぞれ二重切断し、Ｔ４ Ｄ Ｎ Ａ ＋１
ガーセで連結後、バチルス・ズブチＩＩス・マーハーグ
ＢＲ１５１株のコンピテント細胞を形質転換して、５＋
ｚｇ／眼のＫ ｍを含むＢＹ寒天平板培地：こ生育した
形質転換体を選択した。
得られたＫｒｎ耐性株の培養菌体からプラスミドを実施
例２（５）記載の方法で調製し、ＥｃｏＲｌ、５Ｘ１〔
：ｌ、Ｋｐｎ ｌ、Ｓｍａ ｌ、ＢａｍＨＩおよびＸ
ｔ〕。〕Ｉによりそれぞれ切断し、アガロースゲル電気
、水動にかけ、ｐＥＸ６５３はｐＵＢＩＩ。
例２（５）記載の方法で調製し、ＥｃｏＲｌ、５Ｘ１〔
：ｌ、Ｋｐｎ ｌ、Ｓｍａ ｌ、ＢａｍＨＩおよびＸ
ｔ〕。〕Ｉによりそれぞれ切断し、アガロースゲル電気
、水動にかけ、ｐＥＸ６５３はｐＵＢＩＩ。
のＥ ｃ ｏ Ｆ？ ｌ −Ｘ ｂ ａ ［断片の代わ
りにｐｉ；Ｃ１９に由来するマルチリンカ−サイ）・の
−邪、ＥｃｏＲｌ−５ａｃｌ−Ｋｐｎｌ−Ｓｍａｌ−Ｂ
ａｍｔｌｌＸｂａ ｌが組み込まれたＭ４造を有するこ
とを確認した。
りにｐｉ；Ｃ１９に由来するマルチリンカ−サイ）・の
−邪、ＥｃｏＲｌ−５ａｃｌ−Ｋｐｎｌ−Ｓｍａｌ−Ｂ
ａｍｔｌｌＸｂａ ｌが組み込まれたＭ４造を有するこ
とを確認した。
ｐＥＸ６５３へのＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ
遺伝子のサブクローニングは、次のようにして行った。
遺伝子のサブクローニングは、次のようにして行った。
ｐＥＸ６５３ ＤＮＡ ５μｇをＳｐｈ ｉおよび
Ｓｍａｌで完全切断後、フェノール抽出し、エタノール
沈澱してＤＮＡを回収した。
Ｓｍａｌで完全切断後、フェノール抽出し、エタノール
沈澱してＤＮＡを回収した。
一方、ｐＧ３１ ＤＮＡ ５μｇを５ ｐ ｈ Ｉ
およびへｒｕｌて完全切断後、フェノール抽出し、エタ
ノール沈殿してＤ Ｎ Ａを回収した。両ＤＮＡの切断
物をそれぞれＴＥ緩緩衝液口溶解、混合し、Ｔ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼを用いて連結した。この連結物を用し）で、
バチルス・ズブチリス・マーバーグＢＲ１５１株をコン
ピテント法により形質転換した。
およびへｒｕｌて完全切断後、フェノール抽出し、エタ
ノール沈殿してＤ Ｎ Ａを回収した。両ＤＮＡの切断
物をそれぞれＴＥ緩緩衝液口溶解、混合し、Ｔ４ＤＮＡ
ＩＪガーゼを用いて連結した。この連結物を用し）で、
バチルス・ズブチリス・マーバーグＢＲ１５１株をコン
ピテント法により形質転換した。
５ｇに７ｍｌのＫ ｒｎを含むＧＴ寒天平板培地に敷′
７）だニトロセルロースフィルター上に形成させた形質
転換体のコロニーの中から、実施例２（５）に記載の方
法により、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を
示すコロニーを選択した。Ｔ−グルタミルトランスペプ
チダーゼ生産性の形質転換体の培養菌体から、プラスミ
ドを実施例２（５）記載の方法て、２袈し、制服酵素切
断とてガロ−スゲルミ気泳動法によりプラスミドの構造
を解析した。
７）だニトロセルロースフィルター上に形成させた形質
転換体のコロニーの中から、実施例２（５）に記載の方
法により、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を
示すコロニーを選択した。Ｔ−グルタミルトランスペプ
チダーゼ生産性の形質転換体の培養菌体から、プラスミ
ドを実施例２（５）記載の方法て、２袈し、制服酵素切
断とてガロ−スゲルミ気泳動法によりプラスミドの構造
を解析した。
このようにして得られたプラスミドの一つ、ｐＵＣ５５
：よｐＥＸ６５３のｓｐｈ ｌ切断部位とＳｍａｌ切断
邪位の間にＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子
を含有する約２．４ ｋｂの５ｐｈＮｒｕｌ二重切断片
が挿入した構造を有して、ゾニｔ′＄、２図参照）。
：よｐＥＸ６５３のｓｐｈ ｌ切断部位とＳｍａｌ切断
邪位の間にＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子
を含有する約２．４ ｋｂの５ｐｈＮｒｕｌ二重切断片
が挿入した構造を有して、ゾニｔ′＄、２図参照）。
τ−クルタミルトランスベプチダーセ生産閃であるバチ
ルス・ズブチリスＳ Ｊ １３８株のプロトプラストへ
、赤松および関口の方法：Ｔ、 Ａｋａｍａｔｓｕｔｐ
：Ｉ ；、Ｓｅｋ＋ｇｕｃｌ＋＋ ： Ａｇｒ＋ｃ、
［ｌｌ＋ｏ１． Ｃｈｅｍ、 ４６３．５１”（ｉ８！
８２：ｌ二重こよりｐし“Ｇ、１５プラスミドを導入し
た。１（）０μｇ／―のＫｍを含む再生平板培地に生育
した形質転換株の培養菌体からプラスミドを実施例２
（ＥＩＬｊ己載の方法て調製し、制限酵素切断とアガロ
−スゲルミ気泳動法により、導入されたプラスミドが形
質転換に用−）たプラスミドと同じ構造を有することを
確認した。
ルス・ズブチリスＳ Ｊ １３８株のプロトプラストへ
、赤松および関口の方法：Ｔ、 Ａｋａｍａｔｓｕｔｐ
：Ｉ ；、Ｓｅｋ＋ｇｕｃｌ＋＋ ： Ａｇｒ＋ｃ、
［ｌｌ＋ｏ１． Ｃｈｅｍ、 ４６３．５１”（ｉ８！
８２：ｌ二重こよりｐし“Ｇ、１５プラスミドを導入し
た。１（）０μｇ／―のＫｍを含む再生平板培地に生育
した形質転換株の培養菌体からプラスミドを実施例２
（ＥＩＬｊ己載の方法て調製し、制限酵素切断とアガロ
−スゲルミ気泳動法により、導入されたプラスミドが形
質転換に用−）たプラスミドと同じ構造を有することを
確認した。
実施例５ Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子
増幅株を用し）たＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ
の生産 バチルス・ズブチリス・マーμ−りＢＲ１５１株および
ＢＲ１５１株にｐＧ３１、ｐＥＸ６５３およびｐＵＧ５
５の各プラスミドを保有させたＢＲ１，５１／ｐ０３１
株、ＢＲ１５１／ｐＥＸ６５３株およびＢＲ１５１／Ｉ
Ｉ）ＵＣ２５株ならびに、バチルス・ズブチリスＳ Ｊ
１．３８株およびＳ Ｊ １３８株のプラスｉ Ｉ’
導入株、ＳＪ １３８／ｐＥＸ６５３株およびＳＪ ｌ
３８／ｐＵＧ５５株（バチルス・ズブチリスＳＪ１．
３９）のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ生産試験
を行った。各様をＢＹ寒天平板培地に植え、３０℃で一
晩培養（、た。培養菌体を３ｍｌのＩＢＹＧ培地に１白
金耳植え、３０℃で一晩培養した。この培養液０２５ｍ
１を５ｍｌのＧＹＰ培地が入った試験管に植え継ぎ、３
０℃で７２時間培養した。ただし、プラスミドを保有す
る菌株につ咥ては、ＢＹＧ培地、ＧＹＰ培地ともにＫｍ
を終濃度５■／ｍｌとなるように添加した。
増幅株を用し）たＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ
の生産 バチルス・ズブチリス・マーμ−りＢＲ１５１株および
ＢＲ１５１株にｐＧ３１、ｐＥＸ６５３およびｐＵＧ５
５の各プラスミドを保有させたＢＲ１，５１／ｐ０３１
株、ＢＲ１５１／ｐＥＸ６５３株およびＢＲ１５１／Ｉ
Ｉ）ＵＣ２５株ならびに、バチルス・ズブチリスＳ Ｊ
１．３８株およびＳ Ｊ １３８株のプラスｉ Ｉ’
導入株、ＳＪ １３８／ｐＥＸ６５３株およびＳＪ ｌ
３８／ｐＵＧ５５株（バチルス・ズブチリスＳＪ１．
３９）のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼ生産試験
を行った。各様をＢＹ寒天平板培地に植え、３０℃で一
晩培養（、た。培養菌体を３ｍｌのＩＢＹＧ培地に１白
金耳植え、３０℃で一晩培養した。この培養液０２５ｍ
１を５ｍｌのＧＹＰ培地が入った試験管に植え継ぎ、３
０℃で７２時間培養した。ただし、プラスミドを保有す
る菌株につ咥ては、ＢＹＧ培地、ＧＹＰ培地ともにＫｍ
を終濃度５■／ｍｌとなるように添加した。
培養終了後、遠心接作により菌体を除き、遠心上清のγ
−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を実施例１に記
載した方法で比色定量した。
−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を実施例１に記
載した方法で比色定量した。
第２表に各様のＴ−グルタミルトランスペプチダーゼの
生産能を調べた結果を示す。
生産能を調べた結果を示す。
以下余白
第 ２ 表
バチルス・ズブチリス・マーバーブ
ＢＲ１５１０
ＢＲ１５１，／ｐＧ３ Ｌ ４５．６ＢＲ１
５１／ｐＥＸ６５３ ０ ＢＲ１５１／ｐＵＧ５５ ４８．５バチルス・ズ
ブチリス Ｓ Ｊ １３８ （ＦＥＲｌ、Ｉ ＢＰ−２６９４）
３．０ＳＪ １３８／ｐＥＸ６５３
２．８ＳＪ １３８／ｐＵＧ５５ ７３．５（Ｓ
Ｊ１３９ 、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９５）第２表に示し
た結果から、γ−グルタミル）・ランスペプチダーゼ遺
伝子を含有する組換え体プラスミドの導入により、Ｔ−
グルタミル）・ランスペプチダーゼ非生産菌にＴ−グル
タミルトランスペプチダーゼ生産性が付与され、またＴ
−グルタミルトランスペプチダーゼ生産菌の生産性が増
強されることが明らかである。
５１／ｐＥＸ６５３ ０ ＢＲ１５１／ｐＵＧ５５ ４８．５バチルス・ズ
ブチリス Ｓ Ｊ １３８ （ＦＥＲｌ、Ｉ ＢＰ−２６９４）
３．０ＳＪ １３８／ｐＥＸ６５３
２．８ＳＪ １３８／ｐＵＧ５５ ７３．５（Ｓ
Ｊ１３９ 、ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９５）第２表に示し
た結果から、γ−グルタミル）・ランスペプチダーゼ遺
伝子を含有する組換え体プラスミドの導入により、Ｔ−
グルタミル）・ランスペプチダーゼ非生産菌にＴ−グル
タミルトランスペプチダーゼ生産性が付与され、またＴ
−グルタミルトランスペプチダーゼ生産菌の生産性が増
強されることが明らかである。
発明の効果
本発明により、Ｔ−グルタミルトランスペプチダーゼ生
産性の優れた菌株が造成され、さろにこの菌株を使用し
て、該酵素の生産を有利に行う方法が提供できる。
産性の優れた菌株が造成され、さろにこの菌株を使用し
て、該酵素の生産を有利に行う方法が提供できる。
篤１図は、バチルス・ズブチリス宿主ベクター系におけ
るＴ−グルタミルトランスペプチダーセ遺伝子のクロー
ニングの社格およびプラスミドｐＧ３１の作製方法を示
す。 篤２図は、プラスミドｐＥＸ６５３および１）ＵＧ５５
の作製方法を示す。 篤３図は、ｐＧ３１に含まれるクローン化γ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ遺伝子の制限酵素切新地図を示
す。 図中、ＥはＥｃｏＲｌ、χはＸｂａｌ、ＢはＢａｍＨＩ
、Ｓは５ｐｈＴ、Ｂ／ＳａはＢａｍＨＩと５ａｕ３Ａの
連結部位、ＳｃはＳａｃ Ｔ、ＫはＫｐｎ Ｉ、Ｓｍは
Ｓｍａ Ｉ、ＳβはＳａｆ Ｉ、ＰｉｔＰ ｓ ｔ ｉ
、 ＨはＨｉ ｎｄｌＩｌ、 Ｎ／ＳｍはＮｒｕ ｌと
５ｒｎａ Ｉの連結部位、Ｃ！′ｉＣＡ’ ａ Ｉ １
ＨｃはＨｉｎｃ！Ｉ、Ｋｍはカナマイシン耐法マーカ
Ｎ Ｃｍ１ｔクロラムフエニコール耐性マーカーＡｐは
アンピシリン耐性マーカーをそれぞれ示す。 区画の浄書（内容に変更なし） 第３図 ＰＯ２１プラスミド内クロ一ン化断片の制限酵素切断点
地図５Ｊ１３Ｂ染色体と同構造 手続補正音（方式） 平成２年６月 ８日
るＴ−グルタミルトランスペプチダーセ遺伝子のクロー
ニングの社格およびプラスミドｐＧ３１の作製方法を示
す。 篤２図は、プラスミドｐＥＸ６５３および１）ＵＧ５５
の作製方法を示す。 篤３図は、ｐＧ３１に含まれるクローン化γ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ遺伝子の制限酵素切新地図を示
す。 図中、ＥはＥｃｏＲｌ、χはＸｂａｌ、ＢはＢａｍＨＩ
、Ｓは５ｐｈＴ、Ｂ／ＳａはＢａｍＨＩと５ａｕ３Ａの
連結部位、ＳｃはＳａｃ Ｔ、ＫはＫｐｎ Ｉ、Ｓｍは
Ｓｍａ Ｉ、ＳβはＳａｆ Ｉ、ＰｉｔＰ ｓ ｔ ｉ
、 ＨはＨｉ ｎｄｌＩｌ、 Ｎ／ＳｍはＮｒｕ ｌと
５ｒｎａ Ｉの連結部位、Ｃ！′ｉＣＡ’ ａ Ｉ １
ＨｃはＨｉｎｃ！Ｉ、Ｋｍはカナマイシン耐法マーカ
Ｎ Ｃｍ１ｔクロラムフエニコール耐性マーカーＡｐは
アンピシリン耐性マーカーをそれぞれ示す。 区画の浄書（内容に変更なし） 第３図 ＰＯ２１プラスミド内クロ一ン化断片の制限酵素切断点
地図５Ｊ１３Ｂ染色体と同構造 手続補正音（方式） 平成２年６月 ８日
Claims (7)
- （１）バチルス属に属し、バチルス属に属する微生物由
来のγ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクタ−ＤＮＡとの組換え体
ＤＮＡを保有する微生物を培地に培養し、培養物中にγ
−グルタミルトランスペプチダーゼを生成蓄積させ、該
培養物からγ−グルタミルトランスペプチダーゼを採取
することを特徴とするγ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼの製造法。 - （２）該遺伝子が、バチルス・ズブチリス由来であり、
分子量３８，０００から４４，０００の範囲のサブユニ
ットおよび分子量２０，０００から２５，０００の範囲
のサブユニットからなるγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼをコードする遺伝子である請求項１記載の製造法
。 - （３）該遺伝子が、下記の塩基配列で表されるγ−グル
タミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子である
請求項１または２記載の製造法。 【遺伝子配列が有ります】 - （４）下記の塩基配列で表されるγ−グルタミルトラン
スペプチダーゼをコードする遺伝子。 【塩基配列が有ります】 - （５）バチルス・ズブチリス由来のγ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片
とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ。 - （６）バチルス属に属し、バチルス・ズブチリス由来の
γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮ
Ａを保有する微生物。 - （７）該微生物が、バチルス・ズブチリスＳＪ１３９（
ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９５）である請求項５記載の微生
物。
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