JPH03251182A - Ｎａｄ依存性コレステロール脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ｄｎａ、これを含む形質転換体およびこれを用いたコレステロール脱水素酵素の製造法 - Google Patents
Ｎａｄ依存性コレステロール脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ｄｎａ、これを含む形質転換体およびこれを用いたコレステロール脱水素酵素の製造法Info
- Publication number
- JPH03251182A JPH03251182A JP2048901A JP4890190A JPH03251182A JP H03251182 A JPH03251182 A JP H03251182A JP 2048901 A JP2048901 A JP 2048901A JP 4890190 A JP4890190 A JP 4890190A JP H03251182 A JPH03251182 A JP H03251182A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- chdh
- nad
- cholesterol dehydrogenase
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はＮＡＤ依存性コレステロール脱水素酵素（以下
、ＣＨＤＨという、）遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、こ
れを含む形質転換体およびこれを用いたＣＨＤＨの製造
法に関するものである１本発明で得られるＣＨＤＨは補
酵素としてニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチド（
以下、ＮＡＤという）を要求し、コレステａ−ルから水
素を奪い、ＮＡＤに付加する反応を触媒する酵素であり
、臨床試験分野でのコレステロールの定量に利用される
。
、ＣＨＤＨという、）遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ、こ
れを含む形質転換体およびこれを用いたＣＨＤＨの製造
法に関するものである１本発明で得られるＣＨＤＨは補
酵素としてニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチド（
以下、ＮＡＤという）を要求し、コレステａ−ルから水
素を奪い、ＮＡＤに付加する反応を触媒する酵素であり
、臨床試験分野でのコレステロールの定量に利用される
。
［従来技術］
従来より好気性微生物が、コレステロールオキシダーゼ
やコレステロール脱水素酵素を生産することは知られて
いた０例えば、ノカルジア・エリスロポリス［Ａｎｎ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０巻、７９頁。
やコレステロール脱水素酵素を生産することは知られて
いた０例えば、ノカルジア・エリスロポリス［Ａｎｎ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０巻、７９頁。
（１９７３）］、マイコバクテリウム・コレステロール
［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２０６巻、５１１頁
、 （１９５３）］、 ブレビバクテリウム・ステロリ
カム（特公昭４８−１１９０）の各菌株がコレステロー
ルを酸化する酵素を生産するとの報告がなされているが
、いずれも本発明のＣＨＤＨとは異なるものである。つ
まり本発明でいうＣＨＤＨは、例えば特開昭５８−８９
１８３で開示されているＮＡＤ依存性のコレステロール
脱水素酵素である。すなわち、本発明のＣＨＤＨはＮＡ
Ｄの存在下で初めて反応が進行し、コレステロールから
水素を奪いＮＡＤに付加する反応を触媒する酵素であり
、反応系にＮＡＤを必須とする。また、本酵素はＮＡＤ
Ｐの存在下でも非常に僅かではあるが反応は進行する、
しかしＮＡＤと比較したときその反応性は約１０００分
の１程度であり、本酵素は。
［Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２０６巻、５１１頁
、 （１９５３）］、 ブレビバクテリウム・ステロリ
カム（特公昭４８−１１９０）の各菌株がコレステロー
ルを酸化する酵素を生産するとの報告がなされているが
、いずれも本発明のＣＨＤＨとは異なるものである。つ
まり本発明でいうＣＨＤＨは、例えば特開昭５８−８９
１８３で開示されているＮＡＤ依存性のコレステロール
脱水素酵素である。すなわち、本発明のＣＨＤＨはＮＡ
Ｄの存在下で初めて反応が進行し、コレステロールから
水素を奪いＮＡＤに付加する反応を触媒する酵素であり
、反応系にＮＡＤを必須とする。また、本酵素はＮＡＤ
Ｐの存在下でも非常に僅かではあるが反応は進行する、
しかしＮＡＤと比較したときその反応性は約１０００分
の１程度であり、本酵素は。
いわゆるＮＡＤ依存性のコレステロール脱水素酵素であ
る。
る。
［従来技術の問題点］
しかし、従来の方法では生産性に問題があり、より生産
性の高い製造方法の開発が望まれていた。
性の高い製造方法の開発が望まれていた。
［課題を解決するための手段及び作用］本発明者らは上
記の問題点を解決するため、ＣＨＤＨの高生産菌株を遺
伝子組換え技術を用いて創製し、得られた菌株を培養し
、培養物中にＣＨＤＨを著量生産せしめ、該培養物より
回収することによって、ＣＨＤＨをより安価に製造し、
市場に供給することができると考え、鋭意検討した結果
、本発明を完成した。
記の問題点を解決するため、ＣＨＤＨの高生産菌株を遺
伝子組換え技術を用いて創製し、得られた菌株を培養し
、培養物中にＣＨＤＨを著量生産せしめ、該培養物より
回収することによって、ＣＨＤＨをより安価に製造し、
市場に供給することができると考え、鋭意検討した結果
、本発明を完成した。
以下に本発明について詳細に説明する
ＣＨＤＨの生産菌としては、ノカルデイア属菌、アルカ
リ土類金属菌あるいはプロテウス属菌等が挙げられる０
本発明のＣＨＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの給源とし
ては上記のようなＣＨＤＨ生産菌が使用される０例えば
秋葉（特開昭５８−８９１８３号）により分離されたノ
カルデイア・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、）Ｎ
ｎＣｈ２−１と命名された菌株が挙げられる０本菌株の
菌学的性質は特開昭５８−８９１８３号に記載されてお
り、本菌株は微工研菌寄第６２１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
６２１７）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。
リ土類金属菌あるいはプロテウス属菌等が挙げられる０
本発明のＣＨＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの給源とし
ては上記のようなＣＨＤＨ生産菌が使用される０例えば
秋葉（特開昭５８−８９１８３号）により分離されたノ
カルデイア・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、）Ｎ
ｎＣｈ２−１と命名された菌株が挙げられる０本菌株の
菌学的性質は特開昭５８−８９１８３号に記載されてお
り、本菌株は微工研菌寄第６２１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
６２１７）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。
本菌株からの染色体ＤＮＡの分離はストレプトミセス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属からの染色体ＤＮＡの分
離の常法に準じて調製できる［Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ
。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属からの染色体ＤＮＡの分
離の常法に準じて調製できる［Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ
。
Ｃｈｅｍ、、 ４４巻、３６７〜３８１頁（１９８０）
］ 。
］ 。
次に、この染色体ＤＮＡからＣＨＤＨ遺伝子を単離する
目的で大腸菌によるクローニングを行う。
目的で大腸菌によるクローニングを行う。
クローニングのためのプローブにはＣＨＤＨの一部のア
ミノ酸配列から推定した遺伝子の塩基配列を持つ合成り
ＮＡを使い、サザン・ハイブリダイゼーションによって
ＣＨＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの断片集団を限定の
後、大腸菌を使ったコロニー・ハイブリダイゼーション
によりＣＨＤＨ遺伝子を取得する。
ミノ酸配列から推定した遺伝子の塩基配列を持つ合成り
ＮＡを使い、サザン・ハイブリダイゼーションによって
ＣＨＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの断片集団を限定の
後、大腸菌を使ったコロニー・ハイブリダイゼーション
によりＣＨＤＨ遺伝子を取得する。
酵素の一部アミノ酸配列の決定には、例えば公知文献［
Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｊｏｃｈｅｍ、 、 １巻、８０
〜９１頁（１９６７）］に記載の方法を応用した自動ア
ミノ酸シークエンサーを用いることができる。遺伝子の
ＤＮＡ配列を推定するにはアミノ酸に対応する遺伝コー
ドが複数存在する場合は、ストレプトミセス属の使用頻
度を考慮して可能性の高いものを選ぶか、公知文献［Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １３巻。
Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｊｏｃｈｅｍ、 、 １巻、８０
〜９１頁（１９６７）］に記載の方法を応用した自動ア
ミノ酸シークエンサーを用いることができる。遺伝子の
ＤＮＡ配列を推定するにはアミノ酸に対応する遺伝コー
ドが複数存在する場合は、ストレプトミセス属の使用頻
度を考慮して可能性の高いものを選ぶか、公知文献［Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 １３巻。
８９２７頁（１９８５）］に記載の方法に従い、第３文
字にイノシンを使用することで限定できる０合成りＮＡ
は例えば自動ＤＮＡ合成機を使用すれば作ることができ
る６合成りＮＡの標識は、例えば公知文献［Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、
、 ７４巻。
字にイノシンを使用することで限定できる０合成りＮＡ
は例えば自動ＤＮＡ合成機を使用すれば作ることができ
る６合成りＮＡの標識は、例えば公知文献［Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、
、 ７４巻。
５６０〜５６４頁］に記載の方法に従いＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて５′末端をγ−３２Ｐ−ＡＴＰ
でリン酸化することで行うことができる。
オチドキナーゼを用いて５′末端をγ−３２Ｐ−ＡＴＰ
でリン酸化することで行うことができる。
サザン・ハイブリダイゼーションは公知文献［Ｊ、 Ｍ
ｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ９８巻、 ５０３〜５１７頁（
１９７５）］ に記載のサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の
方法に従い、上記染色体ＤＮＡを制限酵素で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動により断片長に応じた分離を与え
た後、ニトロセルロースフィルターへＤＮＡを吸着させ
て標識化合成りＮＡプローブをハイブリダイズさせ、オ
ートラジオグラムを撮ることにより行うことができる。
ｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ９８巻、 ５０３〜５１７頁（
１９７５）］ に記載のサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の
方法に従い、上記染色体ＤＮＡを制限酵素で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動により断片長に応じた分離を与え
た後、ニトロセルロースフィルターへＤＮＡを吸着させ
て標識化合成りＮＡプローブをハイブリダイズさせ、オ
ートラジオグラムを撮ることにより行うことができる。
使用する制限酵素としてはＢａｍＨＩ 、 ＥｃｏＲＩ
などが挙げられる。
などが挙げられる。
次いで、プローブがハイブリダイズする染色体ＤＮＡ断
片を含む一定の長さのＤＮＡ断片集合体を例えば公知文
献［Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０１巻。
片を含む一定の長さのＤＮＡ断片集合体を例えば公知文
献［Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０１巻。
３３９〜３４１頁（１９８０）］に記載のアガロースゲ
ルからのＤＮＡ抽出法に従って回収することができる。
ルからのＤＮＡ抽出法に従って回収することができる。
次にコロニー・ハイブリダイゼーションを行うために、
上記回収ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んで組換えＤ
ＮＡを調製する。染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組
み込みは、公知文献［Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、
９６巻、 １７１〜１８４頁（１９７５）コに記載の
方法に従い染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵素
で切断し、次いでリガーゼを用いて結合することにより
行うことができる。ベクターＤＮＡとしては、例えばプ
ラスミドＤＮＡが挙げられ、特に、ｐＢＲ３２２やｐＵ
ｃ１９が好ましい、 リガーゼとしては、例えばＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼが挙げられる１組換えＤＮＡの大腸菌への
導入は、例えば公知文献［Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、
、 ５３巻、 １５９〜１６２頁（１９７０）］に記載
の塩化カルシウム処理法により行うことができる。尚、
使用する大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株が好ましい
、ＣＨＤＨ遺伝子を含んだ組換えＤＮＡを含有する菌株
の選択は、例えば公知文献［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、、 ７巻、 ２１１５〜２１３６頁（
１９７９）］に記載の方法に従って、前記合成りＮＡを
プローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーションによ
り行うことができる。即ち、組換えＤＮＡを導入された
大腸菌をアンピシリンを含むＬ−ブロス寒天培地にまき
、−晩培養後、ニトロセルロースフィルターにレプリカ
して更に２〜３時間アンピシリンを含むし一ブロス寒天
培地上で培養し、溶菌及びＤＮＡの固定を行って合成り
ＮＡがハイブリダイズする陽性コロニーを検出する。
上記回収ＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んで組換えＤ
ＮＡを調製する。染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組
み込みは、公知文献［Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、
９６巻、 １７１〜１８４頁（１９７５）コに記載の
方法に従い染色体ＤＮＡ及びベクターＤＮＡを制限酵素
で切断し、次いでリガーゼを用いて結合することにより
行うことができる。ベクターＤＮＡとしては、例えばプ
ラスミドＤＮＡが挙げられ、特に、ｐＢＲ３２２やｐＵ
ｃ１９が好ましい、 リガーゼとしては、例えばＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼが挙げられる１組換えＤＮＡの大腸菌への
導入は、例えば公知文献［Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、
、 ５３巻、 １５９〜１６２頁（１９７０）］に記載
の塩化カルシウム処理法により行うことができる。尚、
使用する大腸菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株が好ましい
、ＣＨＤＨ遺伝子を含んだ組換えＤＮＡを含有する菌株
の選択は、例えば公知文献［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ
ｓ Ｒｅｓ、、 ７巻、 ２１１５〜２１３６頁（
１９７９）］に記載の方法に従って、前記合成りＮＡを
プローブとしたコロニー・ハイブリダイゼーションによ
り行うことができる。即ち、組換えＤＮＡを導入された
大腸菌をアンピシリンを含むＬ−ブロス寒天培地にまき
、−晩培養後、ニトロセルロースフィルターにレプリカ
して更に２〜３時間アンピシリンを含むし一ブロス寒天
培地上で培養し、溶菌及びＤＮＡの固定を行って合成り
ＮＡがハイブリダイズする陽性コロニーを検出する。
次に、陽性菌株から、例えば公知文献
［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ５７巻。
Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ５７巻。
１５１４〜１５２１頁（１９６７）］に記載の方法によ
ってプラスミドを抽出・精製し各種制限酵素による分解
を行い、制限酵素地図を作成すると共に、再びサザン・
ハイブリダイゼーションによって複数の合成りＮＡプロ
ーブがハイブリダイズすることを確認する。先ず、合成
りＮＡプローブがハイブリダイズする断片の塩基配列を
決定し、次にその前後の塩基配列も決定し、ＣＨＤＨの
既知のアミノ酸配列をコードする読み取り枠の存在を確
認する。ＤＮＡの塩基配列の決定は、ベクターＭ１３ｍ
ｐ１８゜Ｍ１３ｍｐ１９にクローニングしたＤＮＡ断片
を公知文献［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ７４巻。
ってプラスミドを抽出・精製し各種制限酵素による分解
を行い、制限酵素地図を作成すると共に、再びサザン・
ハイブリダイゼーションによって複数の合成りＮＡプロ
ーブがハイブリダイズすることを確認する。先ず、合成
りＮＡプローブがハイブリダイズする断片の塩基配列を
決定し、次にその前後の塩基配列も決定し、ＣＨＤＨの
既知のアミノ酸配列をコードする読み取り枠の存在を確
認する。ＤＮＡの塩基配列の決定は、ベクターＭ１３ｍ
ｐ１８゜Ｍ１３ｍｐ１９にクローニングしたＤＮＡ断片
を公知文献［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓ
ｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ７４巻。
５４６３〜５４６７頁（１９７７）］に記載のジデオキ
シシーケンス法により行うことができる。上記の操作に
よって決定されたＤＮＡ塩基配列および推定されるアミ
ノ酸配列を第１図に示す。
シシーケンス法により行うことができる。上記の操作に
よって決定されたＤＮＡ塩基配列および推定されるアミ
ノ酸配列を第１図に示す。
尚、塩畜置換、削除、挿入、転移等の変異の入った誘導
配列についても以上に述べた方法の実施により得られる
。
配列についても以上に述べた方法の実施により得られる
。
次に、得られたＣＨＤＨ遺伝子の翻訳開始部位上流に例
えば公知文献［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
えば公知文献［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８２巻、４８８〜４９２頁（１９８５
）コに記載の部位特異的変異法に従いＳＤ配列及び例え
ば旧ｎｄｍのような制限酵素認識部位を創設し、例えば
プラスミドベクターｐｕｃ１９のような大腸菌用ベクタ
ーに結合して大腸菌に導入することにより、高生産能を
有する形質転換株が得られる。即ち、ＳＤ配列及び旧ｎ
ｄＩＩＩ認識部位を創設した遺伝子のＥｃｏＲＩ −Ｈ
ｌｎｄＩ［Ｉ分解物とｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄｍ分解物をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、塩化カルシ
ウム法でニジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を宿主菌として形質転換する
。形質転換体の選択はプラスミドを抽出して各種制限酵
素による切断パターンを調べることにより行うことがで
きる。形質転換株をアンピシリンを含むＬ−ブロス培地
で振盪培養しＩ ＰＴＧで遺伝子の発現を誘導した後培
養を続け、菌体を超音波破砕等の方法により破壊し５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行うと酵素の高生産を確認することができる。た
だし、この場合、封入体の形成のため活性は見られない
、封入体の活性を発現するためには通常の尿素を用いる
方法が適用できる。
）コに記載の部位特異的変異法に従いＳＤ配列及び例え
ば旧ｎｄｍのような制限酵素認識部位を創設し、例えば
プラスミドベクターｐｕｃ１９のような大腸菌用ベクタ
ーに結合して大腸菌に導入することにより、高生産能を
有する形質転換株が得られる。即ち、ＳＤ配列及び旧ｎ
ｄＩＩＩ認識部位を創設した遺伝子のＥｃｏＲＩ −Ｈ
ｌｎｄＩ［Ｉ分解物とｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄｍ分解物をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、塩化カルシ
ウム法でニジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を宿主菌として形質転換する
。形質転換体の選択はプラスミドを抽出して各種制限酵
素による切断パターンを調べることにより行うことがで
きる。形質転換株をアンピシリンを含むＬ−ブロス培地
で振盪培養しＩ ＰＴＧで遺伝子の発現を誘導した後培
養を続け、菌体を超音波破砕等の方法により破壊し５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行うと酵素の高生産を確認することができる。た
だし、この場合、封入体の形成のため活性は見られない
、封入体の活性を発現するためには通常の尿素を用いる
方法が適用できる。
また、得られたＣＨＤＨ遺伝子を例えばプラスミドベク
ターｐｌＪ３８５のような放線菌用ベクターに結合して
ストレプトミセス属菌に導入することにより高生産能を
有する形質転換体が得られる。
ターｐｌＪ３８５のような放線菌用ベクターに結合して
ストレプトミセス属菌に導入することにより高生産能を
有する形質転換体が得られる。
即ち、大腸菌より調製されたプラスミド、例えば制限酵
素Ｐｓｔ Ｉで分解し、ｐｌＪ３８５のＰｓｔＩ切断物
とＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、例えば公知文献［
Ｎａｔｕｒｅ、 ２８６巻、 ５２５〜５２７頁（１９
８０）］に記載の方法に従って、ストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎ
ｓ）ＴＫ２４株などを宿主菌として形質転換する。形質
転換株は、例えばＮＹＭ培地で２〜３日培養後、超音波
等で菌体を破壊し、後に述べる活性測定法を使って確認
することができる。
素Ｐｓｔ Ｉで分解し、ｐｌＪ３８５のＰｓｔＩ切断物
とＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合し、例えば公知文献［
Ｎａｔｕｒｅ、 ２８６巻、 ５２５〜５２７頁（１９
８０）］に記載の方法に従って、ストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎ
ｓ）ＴＫ２４株などを宿主菌として形質転換する。形質
転換株は、例えばＮＹＭ培地で２〜３日培養後、超音波
等で菌体を破壊し、後に述べる活性測定法を使って確認
することができる。
上記の形質転換体としては、前記した方法でｐＵｃ１９
にノカルデイア−ｘスビー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、
）ＮｎＣｈ２−１株の染色体由来のＣＨＤＨ遺伝子を導
入したプラスミドを含有するニジエリチア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤ３
）及びｐｌＪ３８５に同遺伝子を導入したプラスミドを
含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４（ｐＣＤ４
）などが挙げられる。
にノカルデイア−ｘスビー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、
）ＮｎＣｈ２−１株の染色体由来のＣＨＤＨ遺伝子を導
入したプラスミドを含有するニジエリチア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤ３
）及びｐｌＪ３８５に同遺伝子を導入したプラスミドを
含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ １ｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４（ｐＣＤ４
）などが挙げられる。
本発明の微生物によるＣＨＤＨの製造に用いられる培地
としては、一般的に微生物の培養において使用される炭
素源、窒素源、無機物を含有する合成培地もしくは天然
培地のいずれをも使用することができる。微量の添加が
好ましい物質としては、プラスミドの安定保持のための
抗生物質などがある０例えばアンピシリン耐性遺伝子を
有するプラスミドベクターｐＵｃ１９由来の組換え体Ｄ
ＮＡの場合には、アンピシリンが３０〜１００μｇ／Ｉ
の濃度で加えられる。チオストレプトン耐性遺伝子を有
するプラスミドベクターｐｌＪ３８５由来の組換え体Ｄ
ＮＡの場合には、チオストレプトンが３０〜２００μｇ
／ｍｌの濃度で加えられる。本発明の微生物の培養は、
一般の微生物の液体培養と同様の方法で行うことができ
る。ＣＨＤＨは菌体内に蓄積されるので、通常の菌体破
砕法により回収することができる。
としては、一般的に微生物の培養において使用される炭
素源、窒素源、無機物を含有する合成培地もしくは天然
培地のいずれをも使用することができる。微量の添加が
好ましい物質としては、プラスミドの安定保持のための
抗生物質などがある０例えばアンピシリン耐性遺伝子を
有するプラスミドベクターｐＵｃ１９由来の組換え体Ｄ
ＮＡの場合には、アンピシリンが３０〜１００μｇ／Ｉ
の濃度で加えられる。チオストレプトン耐性遺伝子を有
するプラスミドベクターｐｌＪ３８５由来の組換え体Ｄ
ＮＡの場合には、チオストレプトンが３０〜２００μｇ
／ｍｌの濃度で加えられる。本発明の微生物の培養は、
一般の微生物の液体培養と同様の方法で行うことができ
る。ＣＨＤＨは菌体内に蓄積されるので、通常の菌体破
砕法により回収することができる。
得られたＣＨＤＨの酵素化学的性質は特開昭５８−８９
１８３号に記載されているが主要な性質は次のとうりで
ある。
１８３号に記載されているが主要な性質は次のとうりで
ある。
■１作用： コレステロール＋ＮＡＤ
≠コレステノン十ＮＡＤＨ
２゜基質特異性：３β位に水酸基をもつステロイドに反
応し、コレステロールを１００とするとスティグマスチ
ロールが約３５、β−シトステロールが約２５の反応性
を示し、その他デヒドロエピアンドロステロン、エルゴ
ステロール等にわずかに作用する。
応し、コレステロールを１００とするとスティグマスチ
ロールが約３５、β−シトステロールが約２５の反応性
を示し、その他デヒドロエピアンドロステロン、エルゴ
ステロール等にわずかに作用する。
３、安定ｐＨ範囲： ｐＨ５〜９（３７℃）４、至適ｐ
Ｈ範囲： ｐＨ８〜９ ５、作用適温：約３５℃ ６、熱安定性・約４０℃迄安定 ７、補酵素： ＮＡＤを要求する ＣＨＤＨの活性の測定は以下の方法に従って３４０ｎｍ
における吸光度の増加を指標にＮＡＤＨの増加を測るこ
とで行う。
Ｈ範囲： ｐＨ８〜９ ５、作用適温：約３５℃ ６、熱安定性・約４０℃迄安定 ７、補酵素： ＮＡＤを要求する ＣＨＤＨの活性の測定は以下の方法に従って３４０ｎｍ
における吸光度の増加を指標にＮＡＤＨの増加を測るこ
とで行う。
試薬Ａ β−ＮＡＤ” ７５．０ｍｇを０．３Ｍトリス
緩衝液（ｐ１４８．５）２５ｍ ｌに溶解する試薬Ｂ
コレステロール５０．０ｍｇをイソプロパツール４［［
ｌｌに溶解し更にこれを２％トリトンＸ−１００に溶解
し、５０ｍ１とする試薬０２％トリトンＸ−１００５ｍ
ｌを０．０２Ｍリン酸塩（ＫＨ２ＰＯ，−ＮａＨＰＯ４
）緩衝液（ｐＨ７，０）２００ｍｌに溶解する 試薬Ａを１吐 試薬Ｂを２ｍｌおよび試薬Ｃで希釈した
酵素液をＯ，１ｍｌ混合して３０℃で反応させ、 １〜
３分までの２分間の吸光度変化を測定する。対照として
酵素液の代わりに試薬Ｃを０．１ｍｌ加えて同様に測定
する。
緩衝液（ｐ１４８．５）２５ｍ ｌに溶解する試薬Ｂ
コレステロール５０．０ｍｇをイソプロパツール４［［
ｌｌに溶解し更にこれを２％トリトンＸ−１００に溶解
し、５０ｍ１とする試薬０２％トリトンＸ−１００５ｍ
ｌを０．０２Ｍリン酸塩（ＫＨ２ＰＯ，−ＮａＨＰＯ４
）緩衝液（ｐＨ７，０）２００ｍｌに溶解する 試薬Ａを１吐 試薬Ｂを２ｍｌおよび試薬Ｃで希釈した
酵素液をＯ，１ｍｌ混合して３０℃で反応させ、 １〜
３分までの２分間の吸光度変化を測定する。対照として
酵素液の代わりに試薬Ｃを０．１ｍｌ加えて同様に測定
する。
活性は上記条件下で１分間に１μｍｏｌｅのＮＡＤＨを
生成するときを１単位とする。
生成するときを１単位とする。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
ＣＨＤＨ遺伝子の大腸菌によるクローニング（ａ）ＣＨ
ＤＨ生産菌であるノカルデイア・エスピ（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ｓｐ、）ｔｂｃｈ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６２１
７）菌株からの染色体ＤＮＡの調製 ノカルデイア−ｘスビー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、）
隘Ｃｈ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６２１７）菌株をグルコ
ース（国産化学社製） １０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃ
ｏ社製）Ｉｇ、 肉エキス（極東化学社製）Ｉｇ、Ｎ
Ｚ−アミン（和光紬薬製）２ｇを１ｇに含有するｐＨ７
，２の培地で３０℃。
ＤＨ生産菌であるノカルデイア・エスピ（Ｎｏｃａｒｄ
ｉａ ｓｐ、）ｔｂｃｈ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６２１
７）菌株からの染色体ＤＮＡの調製 ノカルデイア−ｘスビー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、）
隘Ｃｈ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６２１７）菌株をグルコ
ース（国産化学社製） １０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃ
ｏ社製）Ｉｇ、 肉エキス（極東化学社製）Ｉｇ、Ｎ
Ｚ−アミン（和光紬薬製）２ｇを１ｇに含有するｐＨ７
，２の培地で３０℃。
７２時間振盪培養して得られた菌体から［Ａｇｒｉｃ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ４４巻、 ３６７〜３８
１頁（１９８０）コに記載の方法に従って染色体ＤＮＡ
の調製を行い、約２ Ｂ／ｍｌのＤＮＡ溶液溶液２奢ｌ
た。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ４４巻、 ３６７〜３８
１頁（１９８０）コに記載の方法に従って染色体ＤＮＡ
の調製を行い、約２ Ｂ／ｍｌのＤＮＡ溶液溶液２奢ｌ
た。
（ｂ）ＣＨＤＨ遺伝子の一部配列を持つと考えられる合
成りＮＡプローブの作成 ＣＨＤＨの精製品または、それを［Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
成りＮＡプローブの作成 ＣＨＤＨの精製品または、それを［Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｗ、、 ２４０巻、 ２４７８〜２４８４頁（１
９６５）コに記載の方法でＣＮＢｒ分解したちの約０．
１ｇｇを自動アミノ酸シークエンサー（アプライド・バ
イオシステム社製）を使ってＮ末端及び途中からのアミ
ノ酸配列を、計３ケ所について調べた。得られたアミノ
酸配列を基に、コドンの第３文字を全てイノシンにする
ことで途中の配列から３２ｍａｒの合成りＮＡ配列（以
下、合成りＮＡという）を作成し、 自動ＤＮＡ合成機
（ベックマン社製）を用いて合成した。
９６５）コに記載の方法でＣＮＢｒ分解したちの約０．
１ｇｇを自動アミノ酸シークエンサー（アプライド・バ
イオシステム社製）を使ってＮ末端及び途中からのアミ
ノ酸配列を、計３ケ所について調べた。得られたアミノ
酸配列を基に、コドンの第３文字を全てイノシンにする
ことで途中の配列から３２ｍａｒの合成りＮＡ配列（以
下、合成りＮＡという）を作成し、 自動ＤＮＡ合成機
（ベックマン社製）を用いて合成した。
決定し人アミノ酸配列及びそれに対応させて作成した合
成りＮＡ配列を第２図に示す。
成りＮＡ配列を第２図に示す。
（Ｃ）サザン・ハイブリダイゼーションノカルデイア・
エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、）Ｉｌ＆１Ｃｈ２
−１ （ＦＥＲＭ Ｐ−６２１７）菌株より調製した上
記染色体ＤＮＡ溶液１０μｌ、 １００倍濃のＢａｍ
Ｈｒ緩衝液２μｌ、 １ｍＭＥＤＴＡを含むｌ０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６） （以下、ＴＥとい
う） ６ μｌ、 ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）２μｍ
を混合し、３７℃、３時間反応を行って完全分解した。
エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、）Ｉｌ＆１Ｃｈ２
−１ （ＦＥＲＭ Ｐ−６２１７）菌株より調製した上
記染色体ＤＮＡ溶液１０μｌ、 １００倍濃のＢａｍ
Ｈｒ緩衝液２μｌ、 １ｍＭＥＤＴＡを含むｌ０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６） （以下、ＴＥとい
う） ６ μｌ、 ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）２μｍ
を混合し、３７℃、３時間反応を行って完全分解した。
この反応液を １．０％アガロースゲルで電気泳動し［
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
９８巻、５０３〜５１７頁（１９７５）］記載の方法に
従ってニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製）にＤ
ＮＡを吸着させた１次に、合成り Ｎ Ａ １０ｐｍｏ
ｌ。
従ってニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ社製）にＤ
ＮＡを吸着させた１次に、合成り Ｎ Ａ １０ｐｍｏ
ｌ。
［７−１２Ｐ］ ＡＴ Ｐ ３０ｐｍｏｌ、 １００倍
濃カイネーション緩衝液３μｍ、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造社製）３μＩおよびＴＥで計４０μｍ
とし、３７℃で１時間反応させた後、セファデックスＧ
−５０（ファルマシア社製）カラムを通して精製した合
成りＮＡプローブを使い、 ６倍濃度のｐＨ７，５のＮ
ＥＴ緩衝液（０，１５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−１５ｍＭ Ｔｒｉｓ）。
濃カイネーション緩衝液３μｍ、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（宝酒造社製）３μＩおよびＴＥで計４０μｍ
とし、３７℃で１時間反応させた後、セファデックスＧ
−５０（ファルマシア社製）カラムを通して精製した合
成りＮＡプローブを使い、 ６倍濃度のｐＨ７，５のＮ
ＥＴ緩衝液（０，１５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−１５ｍＭ Ｔｒｉｓ）。
０．５％ＮＫ４０ （シグマ社製）中、６５℃で一部ハ
イブリダイゼーションを行った。４倍濃度ＳＳＣ溶液を
用い、６５℃で１時間洗浄後、オートラジオグラムによ
り４Ｋｂ前後の位置にプローブがハイブリダイズする事
を確認した。
イブリダイゼーションを行った。４倍濃度ＳＳＣ溶液を
用い、６５℃で１時間洗浄後、オートラジオグラムによ
り４Ｋｂ前後の位置にプローブがハイブリダイズする事
を確認した。
（ｄ）染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ分解物４Ｋｂ前後の断
片のベクターへの挿入 上記（ｃ）で得られる染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ分解物
を多量に作り、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い
、 ［Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０１巻、
３３９〜３４１頁（１９８０）］記載の方法により４
Ｋｂ前後の断片を回収した０回収ＤＮＡ溶液はエタノー
ル沈澱して約０．４μｇのＤＮＡを含む２０μｌの溶液
とした。一方、プラスミドベクターｐＵｃ１９（約４０
０μｇ／ｍ１）１０μｍ、ｌＯ倍濃度のＢａＩＩＩＨＩ
用緩衝液５μ！、 ＴＥ ３３μｌ。
片のベクターへの挿入 上記（ｃ）で得られる染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ分解物
を多量に作り、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い
、 ［Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０１巻、
３３９〜３４１頁（１９８０）］記載の方法により４
Ｋｂ前後の断片を回収した０回収ＤＮＡ溶液はエタノー
ル沈澱して約０．４μｇのＤＮＡを含む２０μｌの溶液
とした。一方、プラスミドベクターｐＵｃ１９（約４０
０μｇ／ｍ１）１０μｍ、ｌＯ倍濃度のＢａＩＩＩＨＩ
用緩衝液５μ！、 ＴＥ ３３μｌ。
ＢａｍＨＩ ２μｌを混合して３７℃、２時間反応さ
せた後、エタノール沈澱を行い、沈澱物をＴＥ４０μｍ
に溶解し大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製
）３μｍを加えて混合し６５℃、１時間脱リン酸化反応
を行った６ 更に、フェノール処理後、エタノール沈澱
を行い、沈澱物をＴＥ２０μｌに溶解してリガーゼ反応
に供した。即ち、リガーゼ反応は先に調製した染色体Ｄ
ＮＡ断片溶液２０μＩ、 ＢａｍＨＩ分解後ＢＡＰ処
理を施したｐＵｃ１９溶液１３μＩ、１００倍濃のりガ
ーゼ緩衝液５μｌ、 １００ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）溶液５μｌ、 １０ｍＭ ＡＴＰ ５μ
ｌ。
せた後、エタノール沈澱を行い、沈澱物をＴＥ４０μｍ
に溶解し大腸菌アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製
）３μｍを加えて混合し６５℃、１時間脱リン酸化反応
を行った６ 更に、フェノール処理後、エタノール沈澱
を行い、沈澱物をＴＥ２０μｌに溶解してリガーゼ反応
に供した。即ち、リガーゼ反応は先に調製した染色体Ｄ
ＮＡ断片溶液２０μＩ、 ＢａｍＨＩ分解後ＢＡＰ処
理を施したｐＵｃ１９溶液１３μＩ、１００倍濃のりガ
ーゼ緩衝液５μｌ、 １００ｍＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ）溶液５μｌ、 １０ｍＭ ＡＴＰ ５μ
ｌ。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）２μｍを混合して４
℃で２４時間反応し、その全量を形質転換に使用した。
℃で２４時間反応し、その全量を形質転換に使用した。
（ｅ）大腸菌の形質転換
形質転換は宿主菌としてニジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を用い、先に
記した塩化カルシウム法により行った。即ち、宿主をＬ
−ブロス１０ｍ１にて対数増殖中期（ＯＤ ６５０ｎａ
＋辷０．４）まで生育させた後、遠心分離により集菌し
、水冷した５０ｍＭ塩化カルシウム溶液５ｍｌを加えて
懸濁し、氷水中に３０分間保存後、再び遠心分離により
集菌し、同塩化カルシウム溶液５００μｍに懸濁し、氷
水中に２時間保存した後、（ｄ）で得たＤＮＡ溶液を加
え、更に１時間保持した後、４２℃で２分間加熱処理を
行った。この処理液にＬ−プロス２ｍｌを加え３７℃、
１時間振盪培養した後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ
、−’ Ｉ ＰＴＧ ２ｍＭ、 Ｘ−ｇａｌ ２
．５ＸＩＯ−’％を含むＬ−プロス寒天培地にまき、３
７℃で一晩培養した。
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を用い、先に
記した塩化カルシウム法により行った。即ち、宿主をＬ
−ブロス１０ｍ１にて対数増殖中期（ＯＤ ６５０ｎａ
＋辷０．４）まで生育させた後、遠心分離により集菌し
、水冷した５０ｍＭ塩化カルシウム溶液５ｍｌを加えて
懸濁し、氷水中に３０分間保存後、再び遠心分離により
集菌し、同塩化カルシウム溶液５００μｍに懸濁し、氷
水中に２時間保存した後、（ｄ）で得たＤＮＡ溶液を加
え、更に１時間保持した後、４２℃で２分間加熱処理を
行った。この処理液にＬ−プロス２ｍｌを加え３７℃、
１時間振盪培養した後、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ
、−’ Ｉ ＰＴＧ ２ｍＭ、 Ｘ−ｇａｌ ２
．５ＸＩＯ−’％を含むＬ−プロス寒天培地にまき、３
７℃で一晩培養した。
（ｆ）コロニー・ハイブリダイゼーション（ｅ）で得ら
れた形質転換体のうち白いコロニー即ち組換えプラスミ
ドを持つものだけを新たなし一ブロス寒天培地上及び別
のし一プロス寒天培地上のニトロセルロースフィルター
に植菌し、［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、
７巻、 ２１１５〜２１３６頁（１９７９）］記
載の方法に従いサザン・ハイブリダイゼーションの時と
同一のプローブを用いコロニ・ハイブリダイゼーション
を行い、陽性株１つを得た。
れた形質転換体のうち白いコロニー即ち組換えプラスミ
ドを持つものだけを新たなし一ブロス寒天培地上及び別
のし一プロス寒天培地上のニトロセルロースフィルター
に植菌し、［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、
７巻、 ２１１５〜２１３６頁（１９７９）］記
載の方法に従いサザン・ハイブリダイゼーションの時と
同一のプローブを用いコロニ・ハイブリダイゼーション
を行い、陽性株１つを得た。
（ｇ）ＣＨＤＨ遺伝子のクローン化の確認上記陽性株か
ら［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ら［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ５７巻、 １５１４〜ｌ５２１頁（１
９６７）］に記載の方法に従いプラスミドを調製し、各
種制限酵素を用いて切断し、 １％アガロースゲル電気
泳動による解析を行うと共に、サザン・ハイブリダイゼ
ーションを行うと、４．４Ｋｂの挿入断片が含まれてお
り、合成りＮＡはＡｃｃｌ−５ｍａｌ ４００ｂｐ断片
にハイブリダイズすることがわかった。各々の断片につ
いてベクターＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９を使っ
たジデオキシシーフェンス法により塩基配列を決定した
ところ、既知のアミノ酸配列をコードする読み取り枠が
見い出された。そこで更にＣＨＤＨ遺伝子の全塩基配列
を同様にして決定した。このプラスミドをｐＣＤＩとす
る。
９６７）］に記載の方法に従いプラスミドを調製し、各
種制限酵素を用いて切断し、 １％アガロースゲル電気
泳動による解析を行うと共に、サザン・ハイブリダイゼ
ーションを行うと、４．４Ｋｂの挿入断片が含まれてお
り、合成りＮＡはＡｃｃｌ−５ｍａｌ ４００ｂｐ断片
にハイブリダイズすることがわかった。各々の断片につ
いてベクターＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９を使っ
たジデオキシシーフェンス法により塩基配列を決定した
ところ、既知のアミノ酸配列をコードする読み取り枠が
見い出された。そこで更にＣＨＤＨ遺伝子の全塩基配列
を同様にして決定した。このプラスミドをｐＣＤＩとす
る。
実施例２
大腸菌形質転換株によるＣＨＤＨの封入体の生産
ノカルデイア°エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ、）
隘Ｃｈ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６２１７）からクローン
化したＣＨＤＨの翻訳開始部位上流には大腸菌リポソー
ムの認識部位いわゆるＳＤ配列が見い出されない、その
ために［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８２巻。
隘Ｃｈ２−１（ＦＥＲＭ Ｐ−６２１７）からクローン
化したＣＨＤＨの翻訳開始部位上流には大腸菌リポソー
ムの認識部位いわゆるＳＤ配列が見い出されない、その
ために［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ
、 Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ８２巻。
４８８〜４９２頁（１９８５）］記載の方法に従って部
位特異的変異法によりＳＤ配列並びに、発現ベクターの
プロモーター直下につなぎやすいよう旧ｎｄｍ認識部位
を創設した。創設した塩基配列を第３図に示す、改変プ
ラスミドをｐＣＤ２とする。
位特異的変異法によりＳＤ配列並びに、発現ベクターの
プロモーター直下につなぎやすいよう旧ｎｄｍ認識部位
を創設した。創設した塩基配列を第３図に示す、改変プ
ラスミドをｐＣＤ２とする。
ｐＣＤ２を約０．２μｇ含む溶液３０μｌ、 １０倍
濃度Ｈｉｎｄｍ緩衝液４ μｌ、 ＲＮａｓｅＡ （
ベーリンガー社製）２ｍｇ／ｍｌ溶液４μｌ、 Ｅｃ
ｏＲＩ （宝酒造社製）１μｍ。
濃度Ｈｉｎｄｍ緩衝液４ μｌ、 ＲＮａｓｅＡ （
ベーリンガー社製）２ｍｇ／ｍｌ溶液４μｌ、 Ｅｃ
ｏＲＩ （宝酒造社製）１μｍ。
Ｈｉｎｄｍ （宝酒造社製）１μｌを混合し３７℃で２
時間反応後、 １％アガロースゲル電気泳動を行った。
時間反応後、 １％アガロースゲル電気泳動を行った。
一方、 プラスミドベクターｐＵｃ１９約ｌμｇを含む
溶液１６μｌ、 ＥｃｏＲＩ １ μｌ、 Ｈｉ
ｎｄｍ ｌ μｌを混合し３７℃で２時間反応を行い
電気泳動を行った。泳動後、前者より遺伝子を含む２．
ｌＫｂの断片、後者より２．７Ｋｂの断片を前記の如
くアガロースゲルより抽出した。各抽出液をエタノール
沈澱後、各々を７μｍのＴＥに溶かし、合わせて、１０
倍濃度のりガーゼ緩衝液２μｌ、 １１０１ＩＩ Ａ
Ｔ Ｐ ２μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを混合し４
℃で一部反応し全量を形質転換に使用した。宿主にはニ
ジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）ＪＭ１０９株を用い、形質転換株からは［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７巻、 １５１３
〜＋５２３頁（１９７９）］記載のアルカリ法によって
プラスミドを分離し、各種制限酵素による分解の後、
１％アガロースゲル電気泳動でｐＵｃ１９に遺伝子断片
２． ｌＫｂが挿入されたｐ、ＣＤ ３を確認した。こ
のニジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤ３）をアンピシリン５０μｇ
／ｍｌを添加したＬ−プロス１０ｍ１で一晩３７℃で種
培養し、そのうちの１００μｌを新たなアンピシリン５
０μｇ／ｍ ｌを含むＬ−プロスｌｏｍｌに植菌し、３
０℃でＯＤ、 ６５０ ＃０．３まで振盪培養し、 Ｉ
ＰＴＧを２ｍＭになるよう添加して遺伝子転写の誘導
をかけて更に２，４．８および１２時間振盪培養した。
溶液１６μｌ、 ＥｃｏＲＩ １ μｌ、 Ｈｉ
ｎｄｍ ｌ μｌを混合し３７℃で２時間反応を行い
電気泳動を行った。泳動後、前者より遺伝子を含む２．
ｌＫｂの断片、後者より２．７Ｋｂの断片を前記の如
くアガロースゲルより抽出した。各抽出液をエタノール
沈澱後、各々を７μｍのＴＥに溶かし、合わせて、１０
倍濃度のりガーゼ緩衝液２μｌ、 １１０１ＩＩ Ａ
Ｔ Ｐ ２μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを混合し４
℃で一部反応し全量を形質転換に使用した。宿主にはニ
ジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
）ＪＭ１０９株を用い、形質転換株からは［Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７巻、 １５１３
〜＋５２３頁（１９７９）］記載のアルカリ法によって
プラスミドを分離し、各種制限酵素による分解の後、
１％アガロースゲル電気泳動でｐＵｃ１９に遺伝子断片
２． ｌＫｂが挿入されたｐ、ＣＤ ３を確認した。こ
のニジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＣＤ３）をアンピシリン５０μｇ
／ｍｌを添加したＬ−プロス１０ｍ１で一晩３７℃で種
培養し、そのうちの１００μｌを新たなアンピシリン５
０μｇ／ｍ ｌを含むＬ−プロスｌｏｍｌに植菌し、３
０℃でＯＤ、 ６５０ ＃０．３まで振盪培養し、 Ｉ
ＰＴＧを２ｍＭになるよう添加して遺伝子転写の誘導
をかけて更に２，４．８および１２時間振盪培養した。
集菌後、０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４−ＫＨ
２ＰＯ４） Ｉ）Ｈ７，０で洗浄後、同緩衝液２１に懸
濁し超音波により菌体を破砕し、１ｏｏ００ｒｐｆｆｌ
、 ２０分の遠心後、上清のＣＨＤＨ活性を測定したが
、活性は全く検出されなかった。
２ＰＯ４） Ｉ）Ｈ７，０で洗浄後、同緩衝液２１に懸
濁し超音波により菌体を破砕し、１ｏｏ００ｒｐｆｆｌ
、 ２０分の遠心後、上清のＣＨＤＨ活性を測定したが
、活性は全く検出されなかった。
一方、遠心上清、遠心残渣について５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行うと、遠心残渣画分では分子量４０Ｋｂのタンパクが
大量に発現していることが示された。このことは、この
系においてＣＨＤＨが封入体として高生産されているこ
とを示す、尚、尿素を用いる活性化法によって、ＣＨＤ
Ｈ活性の発現が確認された。
行うと、遠心残渣画分では分子量４０Ｋｂのタンパクが
大量に発現していることが示された。このことは、この
系においてＣＨＤＨが封入体として高生産されているこ
とを示す、尚、尿素を用いる活性化法によって、ＣＨＤ
Ｈ活性の発現が確認された。
実施例３
ＣＨＤＨ遺伝子のストレプトミセス属菌への導入
（ａ） ｐｃＤｌ由来のＣ）（ＤＨ遺伝子断片のｐＩＪ
３８５への導入 ニジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０９（ｐｃＤｌ）株より得たプラスミドｐＣ
Ｄ ｌを約５μｇ含む溶液５μｍ、ｌＯ倍濃度のＰｓｔ
Ｉ緩衝液４μｌ、ＴＥ２９μｌ、 ＰｓｔＩ ２
μｌを混合し、３７℃、２時間反応後、 １％アガロ
ースゲル電気泳動を行った。一方、プラスミドベクター
ｐｌＪ３８５を約１μｇ含む溶液１６μ＋、 １０倍
濃度のＰｓｔｒ用緩衝液 ２μｌ、 ＰｓｔＩ２μＩ
を混合し、３７℃、２時間反応を行いエタノール沈澱の
後、実施例１のようにアルカリホスファターゼ処理およ
び電気泳動を行った。泳動後ＣＨＤＨ遺伝子断片（３，
１Ｋｂ）とｐｌＪ３８５断片を実施例１の如くゲルから
抽出し、各抽出液をエタノール沈澱し各々を７μＩのＴ
Ｅに溶解して合わせ、更に１０倍濃度のりガーゼ緩衝液
２＋ｎｌ、 ｌｏｏｍＭ ＤＴＴ溶液：２μｌ、ｌｏｍ
Ｍ ＡＴＰ ２μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ １μｍを
混合して４℃で一部反応し、その全量を形質転換に使用
した。
３８５への導入 ニジエリチア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０９（ｐｃＤｌ）株より得たプラスミドｐＣ
Ｄ ｌを約５μｇ含む溶液５μｍ、ｌＯ倍濃度のＰｓｔ
Ｉ緩衝液４μｌ、ＴＥ２９μｌ、 ＰｓｔＩ ２
μｌを混合し、３７℃、２時間反応後、 １％アガロ
ースゲル電気泳動を行った。一方、プラスミドベクター
ｐｌＪ３８５を約１μｇ含む溶液１６μ＋、 １０倍
濃度のＰｓｔｒ用緩衝液 ２μｌ、 ＰｓｔＩ２μＩ
を混合し、３７℃、２時間反応を行いエタノール沈澱の
後、実施例１のようにアルカリホスファターゼ処理およ
び電気泳動を行った。泳動後ＣＨＤＨ遺伝子断片（３，
１Ｋｂ）とｐｌＪ３８５断片を実施例１の如くゲルから
抽出し、各抽出液をエタノール沈澱し各々を７μＩのＴ
Ｅに溶解して合わせ、更に１０倍濃度のりガーゼ緩衝液
２＋ｎｌ、 ｌｏｏｍＭ ＤＴＴ溶液：２μｌ、ｌｏｍ
Ｍ ＡＴＰ ２μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ １μｍを
混合して４℃で一部反応し、その全量を形質転換に使用
した。
（ｂ）ストレプトミセス属菌の形質転換とＣＨＤＨ生産
株の選択 形質転換は、宿主菌として、ストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｓ）
ＴＫ２４株を用い、プロトプラスト法で行った。即ち、
宿主菌をＹＥＭＥ培地２００ｍ ｌで３回生育させ、集
菌後０．３５Ｍショ糖による洗浄を行い、 １ ａ＋ｇ
／ａ＋ｌのリゾチームを含むＰ溶液２５ｍ ｌ中に懸濁
し、３０℃、約１時間静置してプロトプラスト化した６
次に綿を詰めたロートを通して残液を除き、遠心してプ
ロトプラストを集め、Ｐ溶液で洗浄後１ｍｌのＰ溶液に
懸濁した。
株の選択 形質転換は、宿主菌として、ストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｓ）
ＴＫ２４株を用い、プロトプラスト法で行った。即ち、
宿主菌をＹＥＭＥ培地２００ｍ ｌで３回生育させ、集
菌後０．３５Ｍショ糖による洗浄を行い、 １ ａ＋ｇ
／ａ＋ｌのリゾチームを含むＰ溶液２５ｍ ｌ中に懸濁
し、３０℃、約１時間静置してプロトプラスト化した６
次に綿を詰めたロートを通して残液を除き、遠心してプ
ロトプラストを集め、Ｐ溶液で洗浄後１ｍｌのＰ溶液に
懸濁した。
一方、 （ａ）で得たＤＮＡ溶液に２０μｍの０．３５
Ｍショ糖を加え、 １００μｌのプロトプラスト及び、
Ｐ溶液に２０％になるよう溶かしたＰＥＧ１００Ｏを
１．５ｍｌ加え、２分放置後、Ｐ溶液でプロトプラスト
を洗浄後Ｒ２寒天培地に塗布し、３０℃で１６時間培養
後、２００μｇ／ｒｎ Ｉのチオストレプトンを含む寒
天を重層した。引き続いて３０℃で培養を続けると形質
転換体のコロニーが形成されたので、菌をチオストレプ
トン３０μｇ／ｍｌ、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌを含
むＹＥＭＥ寒天培地に植菌し、生育できない菌について
、１０ｍ１のＹＥＭＥ培地に植菌して３０℃で３〜７日
培養し、うち１１からアルカリ法にてＤＮＡを抽出して
Ｐｓｔ Ｉによる切断を行い、ｐｌＪ３８５にＣＨＤＨ
遺伝子断片が含まれているものを選択した。そして、Ｃ
ＨＤＨ遺伝子断片がアミノグリコシドフォスフォトラン
スフェラーゼ（ａｐｈ）遺伝子のプロモーター下流にａ
ｐｈ”遺伝子と同一の向きで挿入されているプラスミド
が見いだされた。このプラスミドをｐＣＤ４とした。
Ｍショ糖を加え、 １００μｌのプロトプラスト及び、
Ｐ溶液に２０％になるよう溶かしたＰＥＧ１００Ｏを
１．５ｍｌ加え、２分放置後、Ｐ溶液でプロトプラスト
を洗浄後Ｒ２寒天培地に塗布し、３０℃で１６時間培養
後、２００μｇ／ｒｎ Ｉのチオストレプトンを含む寒
天を重層した。引き続いて３０℃で培養を続けると形質
転換体のコロニーが形成されたので、菌をチオストレプ
トン３０μｇ／ｍｌ、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌを含
むＹＥＭＥ寒天培地に植菌し、生育できない菌について
、１０ｍ１のＹＥＭＥ培地に植菌して３０℃で３〜７日
培養し、うち１１からアルカリ法にてＤＮＡを抽出して
Ｐｓｔ Ｉによる切断を行い、ｐｌＪ３８５にＣＨＤＨ
遺伝子断片が含まれているものを選択した。そして、Ｃ
ＨＤＨ遺伝子断片がアミノグリコシドフォスフォトラン
スフェラーゼ（ａｐｈ）遺伝子のプロモーター下流にａ
ｐｈ”遺伝子と同一の向きで挿入されているプラスミド
が見いだされた。このプラスミドをｐＣＤ４とした。
（ｃ）ＣＨＤＨ遺伝子含有ストレプトミセス属菌による
ＣＨＤＨの生産 得られた形質転換株ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４
（ｐＣＤ４）を３０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを添
加したＮＹＭ培地１００ｍ１で４５時間振盪培養後集菌
し、０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｎａ２ ｏｐｏａ−ＫＨ２
ｐｅ４）ｐＨ７，０で洗浄し、同緩衝液１０ｍ１に懸濁
して超音波で菌体を破壊した。この液を遠心し上清のＣ
ＨＤＨ活性を測定したところ、１００ｍ ｌ当り約５０
単位の活性が見い出された。尚、ストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ
）ＴＫ２４（ｐｌＪ３８５）では、ＣＨＤＨ活性は全く
検出されなかった。
ＣＨＤＨの生産 得られた形質転換株ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌ１ｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２４
（ｐＣＤ４）を３０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを添
加したＮＹＭ培地１００ｍ１で４５時間振盪培養後集菌
し、０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｎａ２ ｏｐｏａ−ＫＨ２
ｐｅ４）ｐＨ７，０で洗浄し、同緩衝液１０ｍ１に懸濁
して超音波で菌体を破壊した。この液を遠心し上清のＣ
ＨＤＨ活性を測定したところ、１００ｍ ｌ当り約５０
単位の活性が見い出された。尚、ストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ
）ＴＫ２４（ｐｌＪ３８５）では、ＣＨＤＨ活性は全く
検出されなかった。
［発明の効果コ
本発明により、ＣＨＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離
し、該ＤＮＡ断片を有するプラスミドを得、これを使用
して大腸菌あるいはストレプトミセス属菌などを形質転
換し、該形質転換体を培養することにより従来法に比べ
５〜ＩＯ倍という大量のＣＨＤＨを生産せしめこれを採
取することができる。
し、該ＤＮＡ断片を有するプラスミドを得、これを使用
して大腸菌あるいはストレプトミセス属菌などを形質転
換し、該形質転換体を培養することにより従来法に比べ
５〜ＩＯ倍という大量のＣＨＤＨを生産せしめこれを採
取することができる。
第１図は上段にＣＨＤＨ構造遺伝子を含むＤＮＡ塩基配
列及び下段に推定されるアミノ酸配列を示し、第２図の
上段はＣＨＤＨ蛋白質の決定された一部のアミノ酸配列
を示し、下段はそれに対応させて作成した合成りＮＡの
塩基配列を示す、尚、図中で、−＊−は不明の部分を示
す、第３図の上段にはＣＨＤＨの大腸菌での発現のため
の改変プラスミドｐＣＤ２の塩基配列の一部を示し、下
線は新設した旧ｎｄｍ認識部位、波線は新設したＳＤ配
列及び太字は挿入した塩基を示し、下段には翻訳開始部
位のアミノ酸配列を示す。
列及び下段に推定されるアミノ酸配列を示し、第２図の
上段はＣＨＤＨ蛋白質の決定された一部のアミノ酸配列
を示し、下段はそれに対応させて作成した合成りＮＡの
塩基配列を示す、尚、図中で、−＊−は不明の部分を示
す、第３図の上段にはＣＨＤＨの大腸菌での発現のため
の改変プラスミドｐＣＤ２の塩基配列の一部を示し、下
線は新設した旧ｎｄｍ認識部位、波線は新設したＳＤ配
列及び太字は挿入した塩基を示し、下段には翻訳開始部
位のアミノ酸配列を示す。
Claims (6)
- （１）ＮＡＤ依存性コレステロール脱水素酵素をコード
する遺伝子を含有するＤＮＡを大腸菌用プラスミドベク
ターに組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 - （２）ＮＡＤ依存性コレステロール脱水素酵素をコード
する遺伝子を含有するＤＮＡを放線菌用プラスミドベク
ターに組み込んだ組換え体ＤＮＡ。 - （３）特許請求項第１項記載の組換え体ＤＮＡを導入し
た大腸菌。 - （４）特許請求項第２項記載の組換え体ＤＮＡを導入し
た放線菌。 - （５）特許請求項第３項記載の大腸菌を栄養培地で培養
し、培養物にＮＡＤ依存性コレステロール脱水素酵素を
生産せしめた後、該培養物よりＮＡＤ依存性コレステロ
ール脱水素酵素を採取することを特徴とするＮＡＤ依存
性コレステロール脱水素酵素の製造法。 - （６）特許請求項第４項記載の放線菌を栄養培地で培養
し、培養物にＮＡＤ依存性コレステロール脱水素酵素を
生産せしめた後、該培養物よりＮＡＤ依存性コレステロ
ール脱水素酵素を採取することを特徴とするＮＡＤ依存
性コレステロール脱水素酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2048901A JPH03251182A (ja) | 1990-02-28 | 1990-02-28 | Ｎａｄ依存性コレステロール脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ｄｎａ、これを含む形質転換体およびこれを用いたコレステロール脱水素酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2048901A JPH03251182A (ja) | 1990-02-28 | 1990-02-28 | Ｎａｄ依存性コレステロール脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ｄｎａ、これを含む形質転換体およびこれを用いたコレステロール脱水素酵素の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03251182A true JPH03251182A (ja) | 1991-11-08 |
Family
ID=12816172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2048901A Pending JPH03251182A (ja) | 1990-02-28 | 1990-02-28 | Ｎａｄ依存性コレステロール脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ｄｎａ、これを含む形質転換体およびこれを用いたコレステロール脱水素酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03251182A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0709456A3 (de) * | 1994-10-26 | 1999-08-11 | Roche Diagnostics GmbH | Mikrobielle Cholesterin-Dehydrogenase, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung |
-
1990
- 1990-02-28 JP JP2048901A patent/JPH03251182A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0709456A3 (de) * | 1994-10-26 | 1999-08-11 | Roche Diagnostics GmbH | Mikrobielle Cholesterin-Dehydrogenase, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2799380B2 (ja) | 新規酵素 | |
| US5834263A (en) | Method for producing 2-keto-L-gulonic acid | |
| JPH0286779A (ja) | 改良型組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用いた耐熱性グルコースデヒドロゲナーゼの製造法 | |
| Isobe et al. | Purification and some properties of cholesterol oxidase stable in detergents from γ-proteobacterium Y-134 | |
| US5550046A (en) | DNA encoding α-glucosidase and method of producing same by genetic engineering | |
| JP4216719B2 (ja) | ハロゲン化合物耐性新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
| US5229286A (en) | Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus | |
| Clark et al. | Regulation of phospholipid biosynthesis in Escherichia coli. Cloning of the structural gene for the biosynthetic sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase. | |
| JPH03251182A (ja) | Ｎａｄ依存性コレステロール脱水素酵素遺伝子を含む組換え体ｄｎａ、これを含む形質転換体およびこれを用いたコレステロール脱水素酵素の製造法 | |
| JPWO2002046427A1 (ja) | 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
| JP2960775B2 (ja) | ノカルジオフォーム微生物由来のｄｎａ配列の発現 | |
| JPH10248574A (ja) | 新規な乳酸酸化酵素 | |
| EP0206595B1 (en) | Thermally stable tryptophanase process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism | |
| US5306625A (en) | Process for terminal hydroxylation of ethyl groups on aromatic 5- or 6-ring heterocycles | |
| JPS63157986A (ja) | 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法 | |
| JP3399685B2 (ja) | コレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素 | |
| JP2004504025A (ja) | 大腸菌における、コマモナスのシクロペンタノン１，２−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子 | |
| Lee et al. | Identification and characterization of the genes encoding carbon monoxide dehydrogenase in Terrabacter carboxydivorans | |
| CA2138516A1 (en) | Gene for vitamin d hydroxylase | |
| JPH04218367A (ja) | 新規コレステロール・オキシダーゼ | |
| US5585255A (en) | Bile acid sulfate sulfatase gene, plasmid containing said gene and method of producing bile acid sulfate sulfatase | |
| JPS63109774A (ja) | α−グリセロ−ル−３−リン酸オキシダ−ゼ活性を有する酵素、その製法及び用途 | |
| WO1991013156A1 (en) | Method for enhancing recovery of recombinant proteins | |
| JPH0698778A (ja) | プトレッシン酸化酵素遺伝子を含む組換え体ｄｎａ、これを含む形質転換体およびこれを用いたプトレッシン酸化酵素の製造法 | |
| JPH04258293A (ja) | 組換えｄｎａ、それを含む形質転換体及びそれを用い たグルコースデヒドロゲナーゼの製造法 |