JPH03259082A - イネモミガラパーオキシダーゼの製造方法及びその方法で製造されたイネモミガラパーオキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はイネモミガラより簡単な操作によって純化パー
オキシダーゼを製造する方法及び該方法により得られる
パーオキシダーゼに関する。

［従来の技術］ パーオキシダーゼは、過酸化物たとえば過酸化水素の存
在下で、種々の供与体の酸化反応を触媒する酵素で、動
物あるいは植物に由来する各種のパーオキシダーゼ及び
微生物産生のパーオキシダーゼ等が知られている。その
中で特に西洋ワサビのパーオキシダーゼは古くから研究
が成されている。パーオキシダーゼは、過酸化水素を生
成する酸化酵素と組み合わせて糖類、アミノ酸、有機塩
基、コレステロール、ポリアミン等の微量定量に利用さ
れているほか、抗原あるいは抗体の標識用酵素等、広範
囲の分野にわたって利用されている。

このような広範囲にわたって利用できるパーオキシダー
ゼがイネモミガラ中に存在することは、１９７０年、女
性らによって指摘されている（Ｒｅｐ。

Ｔａｋａｉ　Ｂｒ、　Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ、　Ｓａｃ、　
Ｊａｐａｎ、第５９巻、第６頁）。イネモミガラからパ
ーオキシダーゼを抽出する方法としては、イネモミガラ
を０．０１〜０．１モル濃度の緩衝液、たとえばリン酸
緩衝液中で微粉化する方法が用いられている。しかしイ
ネモミガラは多量のシリカを含有し、堅固な構造を有す
るため、これを微粉化することは機械的にも多大な困難
を伴うばかりでなく、エネルギー的にも経済的な製造法
とは言い難い。

更にリン酸緩衝液等の緩衝液を使用して抽出した粗酵素
液には多量の異種蛋白質が可溶化してくるため、有機溶
剤分画、硫安分画、透析、多種のカラム処理等の複雑な
処理工程を反復して行わなければならず、その操作が極
めて煩雑であり、且つ得られる酵素の収量も決して望ま
しいものではなかった。

またモミガラパーオキシダーゼの製造方法（特願昭６３
−２２２５１６号）では、モミガラより抽出した粗酵素
液を限外濾過装置により直接濃縮を行うが、この方法で
は限外濾過膜が目詰まりを起こし易く、濃縮を行う効率
が低下し易い。また膜の目詰まりを解消するために酸や
アルカリ溶液を用いて頻繁に再生する必要があり、この
ために膜の劣化が激しく、経済的に難点があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

このような欠点を解決し、イネモミガラより簡単な操作
でパーオキシダーゼを安価に製造する方法を種々検討し
た結果、０．０１〜０．１モル濃度のリン酸緩衝液の代
わりに水を使用し、水中で破砕して抽出実験を行ったと
ころ、極めて容易にパーオキシダーゼを抽出でき、更に
膜を利用した精密濾過を行うことによって連続的に効率
よく製造できる方法を見出し、本発明を完成するに至っ
た。本発明の目的は、イネモミガラより簡単な操作によ
りパーオキシダーゼを抽出する方法を提供するにある。

〔課題を解決するだめの手段］ 本発明はイネモミガラ１重量部に対し、１〜１０倍重量
部の水を添加し、イネモミガラを水中で破砕する。その
後遠心分離によって粗酵素液を分離し、膜を利用した精
密濾過によって濾別し清澄な粗酵素液となし、得られた
粗酵素液を限外濾過によって濃縮した後、有機溶剤を用
いて分離、精製することからなるパーオキシダーゼ製造
法である。

〔発明の作用並びに構成〕

本発明に於いて使用される水とは、蒸留水、イオン交換
水はもとより、いかなる水であってもよく、たとえば水
道水、工業用水であってもよい。

そして、その水の使用量はイネモミガラ１重量部に対し
１−１０倍重量部、好ましくは２〜７倍重景部である。

この点について、イネモミガラの水中での破砕によるパ
ーオキシダーゼの抽出量を調べたところ第１図のような
結果が得られた。即ち第１図はモミガラに対する抽出水
量（重量倍）と抽出された酵素の収率（％）と比活性と
の関係を示した図である。図中（イ）は比活性を、（ロ
）は酵素収量を示す。この図より水量が１〜２倍量では
、遠心分離によって得られる粗酵素液量が使用水量に対
して比較的少量になるため酵素収率が少ない。ただ実際
には遠心分離後更に水洗いを行うことで酵素収率は向上
させることができるが、破砕機内での発熱を考えると抽
出水量としては、モミガラの２倍程度がその下限と考え
られる。また抽出水量を多量に増加させることは異種蛋
白質の抽出を促進することになり、抽出されたパーオキ
シダーゼの比活性（ｔｌ／ｍｇ蛋白質）を低下させるこ
とになる。

これらのことから水の使用量はイネモミガラ１重量部に
対し１〜１０倍重量部、好ましくは２〜７倍重量部が適
当である。

次に本発明に於ける第一の特徴は、モミガラを破砕する
ことである。即ち破砕とは、必ずしも微細な粒子まで粉
砕することではなく、モミガラの外皮との内層の蛋白質
層とを適当なズリ応力を加えて剥離させる程度に粉砕す
ることである。

外皮を剥離させることによって水易溶性のパーオキシダ
ーゼは、他の蛋白質に先駆けて容易に水によって抽出さ
れる。使用する破砕機としては、特に限定はないが、ミ
クロカッター（ステファン社製）、マスコロイダー（増
幸産業製）などが好ましい。尚、破砕回数についてはモ
ミガラに対し３倍重量の水を用いミクロカッターでの破
砕を反復したところ、３回の破砕で含有している全活性
の９０％が抽出されることが判った。工業的抽出にあっ
てはモミガラを１回破砕した後遠心分離によって粗酵素
液を回収し、更にモミガラ破砕物を水洗することによっ
て目的を達することができる。

しかしながらこのようにして得た粗酵素液には、非常に
微細な不溶物が混在しており、限外濾過膜による濃縮工
程に於いて限外濾過膜の目詰まりが生じ易く、頻繁に酸
やアルカリ溶液によって再生・洗浄を行わなければなら
ない。そのために膜の劣化が激しく、膜の寿命が短くな
るという困難を伴うことが判った。

そこで本発明の第二の特徴は得られた粗酵素液を膜を利
用した精密濾過によって清澄な粗酵素液となすことであ
る。

即ち精密濾過とは、０．１〜数μｍ位の範囲の各種細菌
を含む微粒子をほぼ１００％近くまで完全に分離除去す
るための特殊な濾過方法で、本発明に於いて使用するの
は、特に膜を利用するものである。

膜を利用した精密濾過には、メンブランフィルタ−法と
ホローファイバー法とがある。前者は、メンブランフィ
ルタ−と言われる膜をホルダーにセットし、濾過原液を
循環させながら濾過を行う方法である。一方後者は中空
糸と言われる細い筒状の膜を数百本から数千本を束にし
た膜を使用する方法である。

これらの精密濾過法は一般にクロスフロー型（十字流型
）と言われるタイプの精密濾過方法で、濾過原液を循環
させながら濾過を行うため、目詰まりが起こりにくく連
続的に濾過できる利点がある。

本発明に用いる精密濾過法としては何れの方法でも良く
、たとえばマイクローザ（旭化成社製、ホローファイバ
ー法）、フィルトロン（富士フィルター工業社製、メン
ブランフィルタ−法）等の装置が用いられる。

このような方法によって得られた粗酵素液は、非常に微
細な不溶物をほとんど含んでいない極めて清澄な液であ
るため、容易に限外濾過によって濃縮され、且つ目詰ま
りを起こしにくい。

次に本酵素液は限外濾過によって約１／１０〜１／１０
０まで濃縮される。ここで得られた濃縮粗酵素液の比活
性（Ｕ／■蛋白質）は従来の多量のリン酸緩衝液を用い
た抽出液に比較して２．５〜２５倍の比活性を有するに
至るが、なお少量の異種蛋白質を含有しているので、該
酵素の工業的使用に対して、なお精製を必要とする場合
もある。

次に本発明の第三の特徴は有機溶剤を使用して粗酵素溶
液よりパーオキシダーゼ以外の異種蛍白質を分離、除去
することである。

本発明に於いて使用される有機溶剤は通常溶剤として使
用されている有機溶剤であればよく、たとえばメタノー
ル、エタノール、アセトン、イソプロパツール等がある
が、特にイソプロパツールが好ましい。

従来のパーオキシダーゼの精製法の基本は粗酵素溶液の
アセトン分画、硫安分画操作であるが、前者は夏期に於
ける操作の危険性から、また後者は大量の硫安を用いる
ため、透析を必要とすることからいずれも工業的精製法
としては適当でないと思われる。

本発明者らは、イネモミガラパーオキシダーゼがイソプ
ロパツールに対して極めて安定であり、室温であれば７
０％イソプロパツール水溶液中に数日間放置してもほと
んど活性を失わないことから、イソプロパツールを異種
蛋白質の分離に使用することを試みた。その結果、イソ
プロパツール濃度３０〜４０％がパーオキシダーゼと異
種蛋白質を分離するのに適した濃度であることを見出し
た。

次にイソプロパツールを使用したパーオキシダーゼの抽
出、分離方法について述べる。即ちイネモミガラを水中
で破砕し、遠心分離によって得られた粗酵素液を膜を用
いた精密濾過によって清澄な粗酵素液となし、続いて限
外濾過によって濃縮した液に、イソプロパツールの濃度
が３０〜４０％になるようにイソプロパツールを加え、
パーオキシダーゼ以外の大部分の蛋白質を沈澱させ、遠
心分離によってこれを除いた上澄みに更にイソプロパツ
ールの濃度が６０〜８０％になるようにイソプロパツー
ルを加え、沈澱した酵素を遠心分離によって分取する。

この際の分離温度としては、常温付近以下であれば良く
、特に冷却する必要はない。

次にイソプロパツールの濃度と蛋白質収量及び該濃度で
の沈澱物中のパーオキシダーゼ相対活性との関係を第２
図に示す。但し第２図中（イ）は蛋白質収量を、（ロ）
は相対活性を示す。この図に見られるように、該酵素は
イソプロパツール３０〜４０％濃度までの沈澱物中には
ほとんど含まれないのに対し、異種蛋白質はその約５０
％がこの濃度までに沈澱することを見出した。従って３
０〜４０％イソプロパツール濃度までに沈澱する蛋白質
を濾別または遠心分離によって除去した後、イソプロパ
ツール濃度を６０〜８０％に高めて得た沈澱物中に存在
する酵素は、イソプロパツール処理を施す前の粗酵素液
に対して約２．５倍の比活性を有することとなり、冷蔵
によって極めて長期の保存に耐えることから、そのまま
でも工業的使用に供することのできるパーオキシダーゼ
が得られたことになる。この酵素沈澱は、更に精製、乾
燥することによって純化酵素粉末として使用することも
可能である。

〔実　施　例〕

以下、実施例によって酵素の製造方法を説明するが、本
発明はその要旨を逸脱しない限り以下の実施例に何隻限
定されるものではない。

実施例１ モミガラ１５０　ｋｇに対して、４００１の水道水を加
え、マスコロイダーによって破砕した後、デコーン型連
続遠心脱水機によりモミガラと抽出液を分離して約３５
０　ｆの粗酵素液を得た。この粗酵素液を高速連続遠心
機（シャープレス、１５００　ｒ、ｐ、ｍ、）により比
較的粒径の大きい不溶残渣を除去しホロファイバー型精
密濾過装置（旭化成社製ＰＳＷ−３０３、公称孔径０．
１μｍ）により清澄粗酵素液約２７０　ｆを得た。

この操作に於いて１回の精密濾過により約６０〜８０％
の酵素が通過し、濃縮された残渣に更に加水することに
より９０％以上の収量があった。この清澄粗酵素液をホ
ロファイバー型限外濾過装置（旭化成社製ＡＣＰ−３０
５３、分画分子量１３，０００）を用いて約２５１！、
に濃縮した。これにインプロパツールを撹拌しながら約
１１加えて１０分間放置した。この時のイソプロパツー
ルの濃度は約４０％となる。

次にこの粗酵素−イツブロバノール混液を高速連続遠心
分離機（１５，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、）により不溶残渣を
除去し、得られた上澄みに対し更にイソプロパツールを
撹拌しながら約４２４２加えて７０％イソプロパツール
濃度とし、１ｏ分間放置した。

粗酵素−イツブロバノール混液がら高速連続遠心分離機
（１５，０００ｒ、ｐ、ｍ、）により沈澱を分取１．ｋ
。

この沈澱を純水に溶解し、凍結乾燥してパーオキシダー
ゼ標品とした。

実施例２ 実施例１と同様の方法でイソプロパツール４０％濃度で
不溶残渣を除去した粗酵素−イツブロバノール混液に更
にインプロパツールを撹拌しながら！−’ｔ４２ｊ２加
えて７０％イソプロパツール濃度とし、工。

分間放置した。粗酵素−イツブロバノール混液がら高速
連続遠心分離機（１５，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、）ニよす沈
澱を分取した。この沈澱を沈澱重量の１０倍重量部の５
０ｍＭ’）ン酸緩衝液に溶解し、同緩衝液で平衡化した
ＤＥＡＥセルロース５（１０ｇと混合した後バケット型
遠心機により通過画分Ｉを得た。遠心機内に残ったＤＥ
ＡＥセルロースケーキは、沈澱重量の１０倍重量部の上
記緩衝液と混合し、再度バケット型遠心機により通過画
分２を得た。

この操作で該酵素は吸着されずに通過するが、不純蛋白
質は吸着される。ここで得られた通過画分Ｉと通過画分
２を混合し、ボロファイバー型限外濾過装置にて脱塩、
濃縮した後凍結乾燥してパーオキシダーゼ標品とした。

実施例３ 実施例２と同様の方法で得られた通過画分工と通過画分
２を混合し、ホロファ・、′パー型限外濾過装置にて脱
塩、濃縮した酵素溶液約１１に８．７７ｇの塩化ナトリ
ウムと５０ｄのＩＭ　リンＭ緩衝液を加えた。この酵素
溶液にコンカナバリンＡ−セルロファイン（チッソ社製
）を加え約１時間撹拌して、パーオキシダーゼを吸着さ
せた後、カラム（内径１１．３ｃｍＸ高さ１０　ｃｍ、
）　ニ充填し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
５Ｍ　　リン酸緩衝液約３１で洗浄した。次に、０．１
５Ｍ　　メチル化グルコースと０．１５Ｍ　　塩化ナト
リウムを含む０．０５Ｍ　　リン酸緩衝液約３ｆでパー
オキシダーゼを溶出させた後、ホロファイバー型限外濾
過装置にて脱塩、濃縮後、凍結乾燥してパーオキシダー
ゼ標品とした。

これらのパーオキシダーゼ標品の収量、並びに粗酵素液
に対する活性収率、精製倍率及びＲＺ値を第１表に示し
た。

第　　１　　表 ＊３　酵素収量は、凍結乾燥標品の重量で示した。

〔効　果］ 以上述べたように本発明は、イネモミガラより水を使用
してパーオキシダーゼを抽出し、得られた粗酵素液から
膜を利用した精密濾過を行うことによって連続的に効率
良く抽出でき、特にイソプロパツールを用いた場合イソ
プロパツール濃度を３０〜８０％の範囲で酵素蛋白質を
分画沈澱するという極めて簡単な操作を基本とする製造
方法で従来の製造方法に比べ、遥かに安価にパーオキシ
ダーゼを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、モミガラに対する抽出水量（重量倍）と抽出
された酵素の収率（％）と比活性との関係を示した図、
第２図はイソプロパツールの濃度とその濃度で沈澱する
蛋白質収量及び、沈澱物中に存在するパーオキシダーゼ
の相対活性との関係を示した図である。 第１図 第２図 ○ ６ 水量（重量倍） ０ イソプロパツール濃ｒ１Ｋ（’／、）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）イネモミガラ１重量部に対し、１〜１０倍重量部
   の水を添加し水中で破砕した後、遠心分離によって粗酵
   素液を分離し、得られた粗酵素液を膜を利用した精密濾
   過によって清澄溶液となし、次いで、限外濾過によって
   濃縮した後、有機溶剤を用いてパーオキシダーゼ以外の
   大部分の蛋白質を析出させ、分離した後、該酵素を分離
   、精製することからなるパーオキシダーゼの製造方法。
2. （２）請求項（１）に記載の製造法により得られるパー
   オキシダーゼ。