JPH03267760A - 梅毒抗原の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔卒業上の利用分野〕 本発明は梅毒感染の診断を行う診断試薬に用いられる梅
毒トレポネーマ（病原性Ｔｒｅｐｏｎｅ＋ｍａＰａｌｌ
ｉｄｕｍ　Ｎ１ｃｏｌｓ、以下ＴＰと略する。）−抗原
の製造法に関する。更に詳しくは、特異性が高く、梅毒
初期感染を高感度に検出しうる梅毒検査用試薬の製造を
可能とする抗原の製造法に関する。

〔従来の技術〕

ＴＰ菌を直接抗原として用いて患者血清中の抗梅毒トレ
ポネーマ抗体（以下ＴＰ抗体）との抗原抗体反応を利用
する検査法が行われており、その中では冨沢らによって
開発されたＴＰＨＡテストが鋭敏性、特異性、操作の簡
便性等の利点から現在広く用いられており、梅毒の代表
的な臨床検査法として行われている。

上記方法において用いられているＴＰ菌由来抗原は、従
来はＴＰ菌を家兎毫丸で培養したものから採取した菌体
を適当な緩衝液に懸濁し、ホモジナイザー処理、超音波
処理などによってＴＰ菌体を破砕し、直接あるいはこれ
を可溶化して抗原感作用抗原液として用いていた。

しかしながら、従来技術には以下のような問題点がある
。

従来の梅毒トレボネーマ菌由来の抗原を感作した担体を
用いた梅毒検査用試薬には初期梅毒の診断が不確実であ
る欠点があった。即ち、梅毒感染後２〜３力月まではＴ
ＰＨＡテスト等の検査用試薬では陽性にならないことが
多いため、初期梅毒をも確実に診断するためには、非特
異反応は多くても初期梅毒に対する鋭敏性の高い脂質抗
原法を併用しなければならないという実用上の大きな問
題点があった。

ＴＰＨＡのような抗原抗体反応を利用した梅毒抗体検出
法において、後期抗体（Ｉｇ−Ｇ）に比較して初期抗体
（Ｉｇ−Ｍ）に対する抗原感作担体の感度が低かったの
は担体に感作する抗原の純度が原因であった。即ち、従
来のＴＰＨＡテストにおいて動物赤血球の感作に用いら
れていたＴＰ抗原原液は製法上必然的に不純物が多く、
不純蛋白の９０％以上がＴＰ菌を培養した家兎組織由来
の不純物や抗原性のないＴＰ菌体由来の蛋白である。そ
のため、不純物画分が抗原画分に比べかなり高い分量で
混入しているので、従来の抗原では初期抗体（Ｉｇ−Ｍ
）を検出できなかった。

従来のＴＰＨＡテストに用いていた抗原は、その製法上
非特異反応の原因となる家兎組織由来の成分の混入を避
けることはできない。そのためＴＰＨＡテストでは非特
異反応を抑えるために、ＴＰＨＡテストの緩衝液に家兎
組織由来成分を添加することにより、圧検血清中の異好
抗体を吸収するようにしなければならなかった。

上記の問題点を解決するための技術として、特開昭５８
〜７１４５７号公報に梅毒トレポネーマ菌培養物のうち
比重１．０１以下の画分を除去した抗原含有物を用いる
例が記載されている。

しかし、上記の比重の差による分画法では兎組織とＴＰ
菌体由来の抗原分画を厳密に分けることは困難であり、
上記の方法で抗原を精製してもかなりの兎組織由来の不
純物が混入してくる。また、上記の方法は、ＴＰ菌体破
砕後であっても、通用可能であると述べられているが、
この方法では密度勾配に用いているジアドリゾエイトナ
トリウムなどの抗原液への混入は避けられず、またその
後これを除去する工程が必要であり、菌体破砕後にはこ
の方法は適用できない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、梅毒トレポネーマ菌由来の抗原の製造法にお
いて、上記担体に担持する抗原の中に不純物分画が多く
共存するという問題点を解決するものであり、その目的
とするところは、後期梅毒と同様に初期梅毒も検出でき
、非特異的反応の起こらない梅毒検査用試薬の製造を可
能にする梅毒抗原の製造法を従供することを目的として
いる。

〔課題を解決するための手段］ 本発明の梅毒抗原の製造法は梅毒トレポ不−マ菌由来の
抗原の製造法において、梅毒トレボネーマ菌体由来抽出
物を溶液中においてハイドロキシアパタイトゲルに吸着
させ、溶出させることを特徴とするものであり、そのこ
とにより上記目的が達成される。

上記の目的を達成するために本発明のＴＰ菌由来抗原精
製方法は以下のような手段をとった。即ち、まず公知の
方法によりＴＰ菌体を培養し、集菌する。次に菌体を緩
衝液に懸濁し、冷却破砕したものを可溶化することによ
りＴＰ菌体由来抽出物を得る。そして本発明を効果的に
実施するために、あらかじめ不純物を除去するのが好ま
しい。

それから本発明によるＴＰ抗原精製を実施する。

本発明法においては、まずＴＰ菌体由来抽出物より、好
ましくはｐＨ５，０〜８．０、イオン強度２ｍＭ〜３０
１Ｍで、更に好ましくはｐＨ５，５〜７．０、イオン強
度１０ｍＭ〜２０ｍＭでハイドロキシアパタイトゲルに
抗原を含む蛋白を吸着させる。

次いで、好ましくはｐＨ５，０〜１１．０、イオン強度
１０〜３６０ｍＭ　、更に好ましくはｐＨ５，５〜１０
．０．５０〜１２０Ｃの範囲で溶出させることにより得
られる分画を梅毒抗原とする。

ハイドロキシアパタイトゲルは製法、またはメーカーに
よってその特性が異なることがある。したがって本発明
を効果的に実施するには、使用するゲルの特性に応じて
適当な条件を選択する必要がある。

即ち、本発明はハイドロキシアパタイトゲルによって抗
原蛋白以外の蛋白を除去する工程を付加して、精製した
ＴＰ抗原を感作用原液に用いたところに特徴がある。

本発明に用いるＴＰ菌体由来抽出物の取得方法は次の通
りである。

１）菌体の選択、培養、集菌 ＴＰ種菌は、例えばＷＨＯ病原性標準ニコルス株あるい
は各検査機関が梅毒検査用に使用しているＴＰ菌をその
まま用いればよい。なお、ＷＨＯ病原性標準ニコルス株
は例えばＣＤ　Ｃ（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒＤｉｓｅａｓ
ｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　
５ｅｒｖｉｃｅ、　Ｕ、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔａ＋ｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、　Ｅｄ
ｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ。

Ａｔ１ａｎｔａ　Ｇｅｏｒｇｉａ）から容易に入手する
ことができる。また、本発明におけるＴＰ菌の培養方法
、培養物からの集菌方法および菌体処理方法は、公知の
方法の中から任意に採用することができる。

２）ＴＰ菌体の破砕、可溶化方法 次に、集菌した菌体を緩衝液に懸濁し、冷却破砕後回溶
化することによりＴＰ菌体由来抽出物を得る。その方法
は一般に知られている方法の中から適宜選択すれば良い
。破砕方法はホモジナイザー処理、超音波処理、凍結融
解法などが用いられる。可溶化方法は界面活性剤、カオ
トロピックイオンや尿素およびアルカリによる蛋白の可
溶化処理、酵素処理、自己融解法などが用いられる。こ
れらの中では、とくに低イオン強度の緩衝液に非イオン
系または両性の界面活性剤を加えた溶液を使用する可溶
化処理めく適している。

３）前処理 本発明を効果的に実施するためには、ＴＰ菌体由来抽出
物からあらかじめ不純物を除去するという前処理を行う
ことが好ましい。熱論、そのような前処理をしなくても
本発明は実施可能である。

前処理法としては、 ■　イオン交換クロマトグラフィーによる粗精製；陽イ
オン交換体等を用いて抗原画分以外の両分をあらかじめ
除去する。

■　硫安分画、ポリエチレングリコール分画による粗精
製 等が挙げられるが、操作の繁雑さを考えると■の方が望
ましい。

以下、本発明を実施するのに当たって好ましい形態を説
明する。しかし、本発明はそれらに制限されるものでは
ない。

１）溶液の種類 本発明に用いる溶液は、例えばリン酸緩衝液、トリス緩
衝液、グリシン緩衝液など一般の生化学実験に用いられ
るところの緩衝液ならば広く使用できるが、好ましくは
リン酸緩衝液が挙げられる。

２）溶液のｐＨ ■　抗原の吸着 ｐＨの範囲は、好ましくはｐＨ５，０からｐＨ８，０ま
で、更に好ましくは５．５から７．０である。ｐＨ５，
０未満になると、抗原性が失われ易くなるため、ＴＰ抗
原の回収率が低下する。また、ｐＨ８，０を超えると、
ゲルに対する蛋白質の吸着効率の低下のため、収率が低
下する。

■　抗原の溶出 好ましくはｐＨ５，０から１１．０まで、更に好ましく
はｐＨ５，５から１０．０である。とりわけｐＨ８，０
以上の緩衝液を用いる場合は、イオン強度１０〜６０ｍ
Ｍの緩衝液で溶出が可能である。

ｐＨ５，０未満であると、抗原性が失われ易くなるため
好ましくない。また、ｐＨ１１，０を超えると、抗原と
ともに不純物も溶出され易くなるので好ましくない。

３）溶液のイオン強度 ■　抗原の吸着 ハイドロキシアパタイトゲルにＴＰ菌体由来抽出物を吸
着させるときは、好ましくは２Ｉｌ１Ｍ〜３０ｍＭのイ
オン強度で、更に好ましくは１０ｍＭ〜２０ｍＭのイオ
ン強度でハイドロキシアパタイトゲルに抗原を含む蛋白
を吸着させる。

イオン強度が２ｍＭ未満であると、不純物がハイドロキ
シアパタイトゲルに吸着され易（なる。更に、緩衝液の
緩衝能が低下するので実用的でない。

また、３０ｍＭを超えると、抗原がハイドロキシアパタ
イトゲルに吸着されにくくなり収率が低下する。

■　抗原の溶出 溶出の際のイオン強度は、好ましくは１０〜３６０ｍＭ
、更に好ましくは５０〜１２０ｍＭである。イオン強度
が１０ＩＩＭ未満であると、酸性側のｐＨでは溶出され
にくい。また、３６０ｍＭを超えると不純物も溶出され
てくるので好ましくない。

４）溶液への添加剤等 吸着および溶出に用いる溶液に加える添加剤としては、
ＴＰ菌体の可溶化に使用できる界面活性剤、カオトロピ
ックイオン、尿素などハイドロキシアパタイトゲルが耐
性を示すものなら、いずれも使用可能であるが、操作の
繁雑さを考慮すると低イオン強度の緩衝液に非イオン系
または両性の界面活性剤を添加したものがこの方法に適
している。ＥＤＴＡのようなキレート剤はハイドロキシ
アパタイトゲルへの蛋白の吸着を阻害するので使用しな
い方が良い。

５）応用範囲 本発明で得られた抗原は、被検血清中の対応する抗体を
検出する用途に使用される。検出方法は、ニワトリ赤血
球、ヒツジ赤血球等の各種動物の赤血球、ラテックス等
の合成高分子担体またはシリカなどの無機材質の担体等
に該抗原を固定したのち、抗原抗体反応に基づく凝集反
応によって測定するもののほか、プラスチックビーズ、
プラスチックプレートなどの合成高分子などに該抗原を
固定化して測定するＥＩＡ、ＦＩＡ法などに用いること
が可能である。その他抗原抗体反応に基づく検査に用い
うるちのであればいかなるものであっても本発明の方法
に適用しうる。

また、本発明で得られた抗原は、ワクチンにも使用可能
である。

６）抗原の精製度 本発明による方法では、ハイドロキシアパタイトゲルへ
の吸着が抗原蛋白と同じ挙動を示す抗原活性のない蛋白
等が抗原に混入するかもしれないが、実際は殆ど純粋な
抗原を得ることが可能である。抗原以外の蛋白が混入し
たとしてもごく微量であり、実用上の問題はない。

（作　用〕 ＴＰ菌体由来抽出物をハイドロキシアパタイトゲルに低
い塩濃度の緩衝液中で接触させると抗原がゲルに吸着し
、ある範囲内の塩濃度で抗原がゲルより溶出されて抗原
純度の高いものが得られる。

〔実施例〕

以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。但
し、本発明は、これら実施例に限定されるものではない
。

実施例１　抗原精製法 本発明によってＴＰ抗原を精製した。

１、試薬等 １）緩衝液 １−１）リン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）（以下ＰＢＳ）
ニリン酸二水素カリウムとリン酸水素二ナトリウム（１
２水和物）と塩化ナトリウムより、リン酸濃度０．０３
６Ｍ、　ＮａＣ１濃度０．１５６Ｍ、ｐＨ６，５の緩衝
液を調整し、ＮａＮ、を０．１％（ｗ／ν）となるよう
に添加して調製した。

１−２）１％ＢＳＡ／ＰＢＳ：ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ、マイルス・ラボラトリーズ社製）をＰＢＳに１％
（ｓｖ／ｖ）　　となるように溶解した。

１−３）　１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下ＫＰ’
Ｂ）（ｐＨ６，０およびｐＨ７，０）： １０ｍＭリン酸二水素カリウム溶液、１０ｍＭリン酸水
素酸水素中ム溶液を混合してｐＨ６，０およびｐＨ７，
０に調整した。

１−４）　３５０ｍＭ　Ｋ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ６，０）　
：３５０１リン酸二水素カリウム溶液、３５０ｍＭリン
酸水素二カリウム溶液を混合してｐＨ６，０に調整した
。

２）界面活性剤　オクチルグルコピラノシド（１−０−
ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド）（以下ＯＧ
と略す。）：難溶性タンパク質研究用（ナカライテスク
社製）を使用した。

３）蛋白精製用クロマトグラフィーゲル３−１）陽イオ
ン交換体 Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ファル
マシア社）を使用した。これはアガロースゲルの表面に
スルホン酸基が導入された陽イオン交換体である。

３−２）ハイドロキシアパタイトゲル バイオゲルＨＴＰ　（バイオラッド）およびＨＣＡ−２
００Ｌ　　（三井東圧化学）を使用した。

４）ＴＰ菌体　以下に述べる方法によって培養採取した
ものを用いた。

病原性標準ニコルス株トレポネーマ・パリダムの６．０
Ｘ１０’ケ／Ｉ１１の懸濁液を家兎畢丸実質１個当たり
、１ｌＩＩｌずつ接種した。１０日間培養後、家兎１０
羽より畢丸を採取し、ミンチ後、２．２％クエン酸ナト
リウム溶液５００ｄにて３７°Ｃ３０分振とうし、増殖
したＴＰ菌を抽出した。抽出液を２ＯＯＸｇで５分間遠
心し、兎組織の沈澱を除去し、上清を３０００×ｇで３
０分間遠心分離し、ＴＰ菌を沈澱させた。

得られたＴＰ菌体をＰＢＳでくり返し洗浄した後、ＰＢ
Ｓに懸濁して暗視野顕微鏡を使用して菌数計算後１×１
０９ケ／ｄに調整し、これをＴＰ菌体懸濁液とした。こ
の菌体懸濁液を暗視野顕微鏡で観察し、兎精子および兎
組織の混入が認められないことを確認した。

５）蛋白濃度測定用試薬：　Ｂ　ＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ
　Ａｓ５ａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｐ　ＩＥ　ＲＣＥ社
）を用いた。

６）マイクロタイタープレート：ヌンク社の９６穴マイ
クロプレート　（Ｕ底）を用いた。

７）ＴＰ抗原感作血球：市販ＴＰＨＡキットであるセロ
クリッ）ＴＰ（化学および血清療法研究所）に使用され
ているものを使った。

８）梅毒陽性家兎血清：トレボネーマ・パリダムを家兎
畢丸中で４５日間培養した家兎から血清を採取して使用
した。抗体価を市販ＴＰＨＡキットで測定したところ１
０２，４００であった。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈して
使用した。

２、実験方法 ２−１）ＴＰ菌体より抗原の可溶化及び抽出ＴＰ菌体懸
濁液１０１ｄに対しＰＢＳ５０ａｆを用いて洗浄を３回
行ってからＰＢ３２０ｄに懸濁した。この懸濁液を超音
波破砕機で処理し、ＴＰ菌体を破砕した。これを１２，
６００Ｘ　ｇで３０分遠心して沈澱を取った。

沈澱はｌＱｍＭＫ　Ｆ　Ｂ　ｐＨ７，０で１２，６００
Ｘ　ｇで３０分間の遠心洗浄を２回繰り返した後、ＯＧ
を１％（ｗ／ｖ）含む１０ｎ＋ＭＫ　Ｐ　Ｂ　ｐＨ７，
０を２５ｄ加え、沈澱をよく懸濁した後、軽く超音波破
砕して可溶化した。

４　”Ｃで１６時間以上放置してから５０，０ＯＯＸ　
ｇで１時間遠心分離し、得られた上清を０．２２μｍの
フィルター（ミリポア社製、商品名マイレクスＧＳ）で
濾過した。このようにして得られたＴＰ菌体由来抽出物
を、以下抽出抗原と称する。

２−２）前処理 （１）抗原の透析 抽出抗原はｐＨ７，０の緩衝液に溶解されているので、
これをｐＨ６，０の緩衝液に透析した。透析液：抽出抗
原液＝４容：ｌ容の体積比で行い、透析外液を３度以上
交換した。最終透析の後、透析外液のｐＨを測定し、ｐ
Ｈ６，０±０．１の範囲にあることを確認した。

（２）Ｓ−セファロースゲル３０ｍ！を充填したカラム
（ファルマシア社、Ｓ　Ｒ２５／４５）に（１）の抗原
を通し、素通り画分５０ＩｎＲを抗原分画として回収し
た。

（以下これを粗精製抗原と称す。） ２−３）ハイドロキシアパタイトによる抗原の精製 （１）ハイドロキシアパタイトゲルの洗浄ハイドロキシ
アパタイトゲル８ｄをカラム（ファルマシア社、ＨＲ１
０／１０）に充填した後、ｐＨ６，０の１％ＯＧを含む
ｌＱｍＭＫ　Ｐ　Ｂで平衡化した。

洗浄液の０．０．２８０を測定し、吸光度が０．０１０
に低下するまで洗浄した。

（２）粗精製抗原の添加 ハイドロキシアパタイトカラムに粗精製抗原を添加し、
添加後ｐＨ６，０の１％ＯＧを含む１０ｍＭ　ＫＦＢを
カラムに流し、０．Ｄ、２８０での吸収が０．０１０以
下になるまで、カラムを洗浄した。このときの分画を素
通り分画とした。

（３）抗原の溶出 ｐＨ６，０の１％ＯＧを含むｌＱｍＭＫ　Ｐ　Ｂに対し
て１％ＯＧを含む３５０ｍＭ　Ｋ　Ｐ　Ｂの比率を０か
ら４０％まで徐々に増加させ、リニアグラジェントで溶
出させた後、３５０ｍＭ　Ｋ　Ｐ　Ｂの比率を１００％
にあげ溶出させた。３５０ｍＭ　Ｋ　Ｐ　Ｂの緩衝液の
比率が０−８％、８−１６％、１６−２４％、２４−３
２％、３２−４０％の溶出分画をそれぞれ集めた。３５
０ｍＭ　Ｋ　Ｐ　Ｂ　１００％で溶出された分画を集め
、これを４０％以上分画とした。

（４）各フラクションのアッセイ 素通り分画、０−８％分画、８−１６％分画、１６−２
４％分画、２４−３２％分画、３２−４０％分画、４０
％以上分画の各フラクションの抗原活性、蛋白濃度を以
下の方法でもとめ、これより比活性を算出した。

２−４）抗原アッセイ法 （１）蛋白濃度 ローリ−法の改変法の一つであるｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉ
ｎｉｃａｃｉｄを用いた測定法（Ｓｍｉｔｈ、　ＰＪ、
　、　Ｋｒｏｈｎ、　Ｒ，１，ｅｔｃ。

（１９８５）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｉ、皿７６−
８５．）を原理とするＢ　ＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ
５ａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｐ　Ｉ　Ｅ　ＲＣＥ社製）
によって測定した。スタンダードは１％ＯＧを含む１０
＊ＭＫ　Ｐ　ＢにＢＳＡを溶解したものを用い、単位は
（μｇ／ｄ）で示した。

（２）抗原活性 ■　１％ＢＳＡ／ＰＢＳをマイクロタイタープレートの
各ウェルに２５μＰずつ滴下する。

■　各抗原フラクションをマイクロタイタープレートの
手前側のウェルに２５μ！すっとり、これをプレート上
で１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液により倍々希釈してゆく。

■　抗体価を５０に希釈した梅毒陽性家兎血清を、■で
倍々希釈した抗原に加えて混合する。

■　室温で３０分以上反応させる。このときプレートの
手前側の抗原濃度の高いウェルの抗体は抗原と結合して
消費されてしまうが、抗原濃度の低いウェルの抗体は消
費されずに残る。

■　次に、各ウェルにＴＰ抗原感作血球を加え、消費さ
れずに残っている抗体と凝集反応を起こしたウェル中の
家兎血清の最終希釈率（８，１６，３２，。

１．）をもって抗原活性とし、これをタイター（ｔｉｔ
ｅｒ／ｄ）と称する。

■　抗原比活性は抗原活性を蛋白濃度で割った値で示し
、単位は（ｔｉｔｅｒ／μｇ）で示した。

■　抗原活性を示した分画のうち、比活性１２ｔｉｔｅ
ｒ／μｇ以上を示した分画を集め、蛋白質濃度５０μｇ
７ｘ１以上になるまで、セロファンチューブ（和光純薬
工業）を用いて減圧下で濃縮した。これによって得られ
た分画をＨＡｐ精製抗原と称す。

３、結果 バイオゲルＨＴＰおよびＨＣＡ−２０ＯＬを用いて抗原
精製を行ったが、その操作は全（同じように行った。上
記のフラクションのほか、抽出抗原、粗精製抗原でも蛋
白濃度および抗原活性を測定し、総抗原活性、総蛋白量
、抗原比活性を算出した。その結果を第１表に示す。

４、結論 第１表の結果から明らかなように、ＴＰ菌体由来抽出物
をハイドロキシアパタイトゲルに吸着させた後、一定の
範囲の塩濃度で溶出させると、バイオゲルＨＴＰでは塩
濃度８％（３７，２ｍＭ）から４０％（１４６，抛Ｍ）
までの範囲で溶出される分画に抗原が溶出され、ＨＣＡ
−２００Ｌでは塩濃度８％（３７，２−Ｍ）から３２％
（１１８，８ｍＭ）までの範囲で溶出される分画に抗原
が溶出され、これらを集めることによって抗原比活性が
、それぞれ２６．６．３６．７（ｔｉｔｅｒ／μｇ）の
高純度のＴＰ抗原が得られた。

第１表−（１）　　バイオゲルＨＴＰによる精製（本頁
以下余白） （本頁以下余白） 第１表−（２）　　ＨＣＡ−２００Ｌによる精製参考例
Ｉ　　５ＤＳ−ＰＡＧＥによる蛋白純度の確認１、材料 １）電気泳動装置：　ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（ファル
マシア社）を使用し、操作方法はその説明書に従った。

２）分子量マーカー：　ＬＭＷ　ｋｉｔ　Ｅ（ファルマ
シア社）を使用した。

３）試料処理用緩衝液：　１０＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−１（
Ｃ１，２ｓＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）にドデシル硫酸ナ
トリウムを５％、メルカプトエタノールを１０％となる
ように添加して調製した。

４）ポリアクリルアミドゲル：　　ＰｈａｓｔＧｅｌ　
Ｇｒａ−ｄｉｅｎｔ　１Ｏ−１５（ＰｈａｓｔＳｙｓｔ
ｅ＋ｓ用）を使用した。

５）染色液：電気泳動用高感度銀染色液セット「シルベ
ストスティン」　（ナカライテスク社製）を使用し、操
作方法は説明書に従った。

２、操作方法 １）試料の調製：実施例（１）で得られた抽出抗原、粗
精製抗原またはＨＡｐ精製抗原と試料処理用緩衝液を等
量ずつ混合し、１００°Ｃで５分間インキュベートした
。

２）分子量マーカーの調製：分子量マーカーは、精製水
で２倍希釈した試料処理用緩衝液に溶解し、１００°Ｃ
で５分間インキュベートして用いた。

３）上記の調製法試料をポリアクリルアミドゲルの上に
１μｉずつのせ、電気泳動を行った。

４）泳動後、ポリアクリルアミドゲルを染色し、分子量
マーカーの位置より蛋白質の分子量を算出した。

３、結果 抽出抗原は２０本程度のハンドが観察されたが、粗精製
抗原では１０本程度、ＨＡｐ精製抗原では３本のハンド
（分子量３１，０００．４１，０００．４７，０００付
近）が観察された。

４、結論 結果から明らかなように、ハイドロキシアパタイトゲル
を用いることによって極めて純度の高いＴＰ抗原が得ら
れた。

応用例Ｉ　　ＴＰＨＡ 本発明で得られた精製抗原を用いて羊赤血球に担持させ
、ＴＰＨＡ法での本発明の効果を確認した。

１、材料 特に示さない限り、実施例１と同一名の試薬および緩衝
液は実施例１と同じように調製した。

１）緩衝液 （１）　　０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　：
　０．１５Ｍリン酸二水素ナトリウム（２水和物）およ
び０．１５　Ｍリン酸水素二ナトリウム（１２永和物）
水溶液を混合してｐＨ７，４に調整する。

（２）生理食塩水：　９．Ｏｇの塩化ナトリウムを１０
００ｇの精製水に溶解したもの （３）　　Ｍ　ｃ＠Ｉ　１　ｖａ　ｉｎｅ緩衝液、（以
下ＭｃＴと略す）：０．１０Ｍクエン酸と０．２０Ｍリ
ン酸水素２ナトリウム（１２水和物）を混合し、ｐＨ６
，５になるように調整したもの。

（４）１％ＯＧ　／　ＭｃＴ　：　ＭｃｌにＯＧを１％
（ｗ／ｖ）ン容解したもの。

（５）ＰＨＡ緩衝液 以下の溶液および試薬を混合して作成した（緩衝液ＩＱ
ＯＯｄ！あたりの量）。

■　兎正常血清　、　　　　　　　　　３０ｄ■　羊赤
血球ストローマ　　　　　　　１０Ｉｄ■　アジ化ナト
リウム　　　　　　　　　１ｇ■　０．１５Ｍ　　リン
酸ナトリウム 緩衝液ｐＨ’７．４　　　　　　　　１００ＩＩ１１■
　生理食塩水　　　　　　　　　　８６〇−２）試薬等 （１）タンニン酸　ナカライテスク■から購入した。

（２）固定羊血球　羊赤血球をグルタルアルデヒド固定
処理したものを用いた。

（３）市販ＴＰＨＡキット： セロディアＴＰ　（富士レビオ）およびセロクリットＴ
Ｐ　　（化血研）を使用した。

３）検体 （１）　　梅毒陽性検体二十分治療した後期梅毒検体で
Ｉｇ−Ｇ抗体が多（含まれる３検体（Ｇ、、Ｇｚ、Ｇｚ
）および感染後３〜５週間の初期梅毒でＩｇ−Ｇ抗体が
あまり産生されておらずＩｇ−Ｍ抗体が多く産生されて
いる３検体（Ｍｌ、Ｍ！、Ｍ３）を用いた。

（２）梅毒陰性検体：３検体（Ｎ　、、Ｎ２．　Ｎ、）
を用いた。いずれも市販のＴＰＨＡキットで非特異反応
の見られた検体で、ＰＴＡ−ＡＢＳで梅毒陰性であるこ
とが確認された検体である。

（３）抗家兎組織抗血清：正常家兎翠丸をミンチ後、１
％ＯＧで可溶化したものを山羊に免疫して得た。

（４）抗Ｒｅ１ｔｅｒ株抗血清：　Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
　ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓｂｉｏｔｙｐｅ　Ｒｅ１ｔｅｒ
の菌体成分を１％ＯＣＴ：可溶化したものを山羊に免疫
して得た。

４）ＴＰ抗原 第２表　抗原液の抗原活性、蛋白濃度 ２、方法 （１）血球調製法 ■　固定羊血球を生理食塩水で７００Ｘｇで５分間の遠
心洗浄を４回行ってから、生理食塩水で固形分６％にな
るように懸濁した。タンニン酸を生理食塩水に溶解し、
これを血球懸濁液に加え、撹拌した。

■　攪拌終了後、生理食塩水で２回、ＭｃＩで１回遠心
洗浄し、ＭｃＩに固形分６％となるように懸濁し、直ち
に抗原感作に使用した。

■　ＴＰ抗原液（抽出抗原液、粗精製抗原液、ＨＡｐ精
製抗原液）をあらかじめ１％ＯＧ／ＭｃＩで透析した。

この抗原液を第３表のように調製し、抗原感作液とした
。感作液Ａは抗原活性が１００（ｔｉｔｅｒ／ｄ）にな
るように調製したものである。感作液Ｂは蛋白濃度がＬ
Ｏｕｇ／ｌｐｄ！になるように調整したものである。上
記■の血球懸濁液と第３表の抗原感作液を等量混合し、
２５°Ｃ１時間攪拌した。

（本頁以下余白） 第３表　ＴＰＨＡでの抗原感作液の組成■　感作血球を
２回生理食塩水で洗浄後、ＰＨＡ緩衝液中に血球固形分
０．２％となるように懸濁した。常温で３時間放置後、
アッセイに用いた。

（２）ＴＰＨＡアッセイ方法 ■　ＰＨＡ￥Ｉｔ衝液をマイクロタイタープレートの手
前側のウェルに１００μｌずつ、それ以外のウェルに２
５μ２ずつ分注した。

■　各検体を手前側のウェルに２５μ！ずっ分注し、こ
れをプレート上で倍々希釈した。一方、手前側のウェル
から、希釈検体液を７５μ！取り出すことにより、手前
側のウェルに残った希釈検体液量を２５μ！になるよう
にした。

■　（１）で作成した血球液をよく振って均１な浮遊液
としたものを各ウェルに７５μ！ずつ滴下した。

■　プレートの角を軽くポルテックスミキサーに当てて
十分に混合してから、蒸発を防ぐために空のプレートで
蓋をし、振動を与えないように注意して常温に静置した
。２時間後判定した。

■　白紙の上にプレートを置き、血球凝集像を観察し、
肉眼で判定した。凝集を示した最高の希釈倍数（２０，
４０，８０，、、、）を抗体価とした。

３、結果 上記の方法によって得られた感作血球を用い、各検体の
血球凝集反応の有無および抗体価を測定し、第４表に示
すような結果を得た。

第４表より、まず抽出抗原を用いた感作血球では総て陰
性となる初期梅毒３検体について、本発明品のＨＡｐ精
製抗原を用いた感作血球はいずれも陽性をしめす。また
、市販ＴＰＨＡキットで非特異的反応の見られた梅毒陰
性３検体では、凝集反応を示していない。さらに本発明
品を用いた感作血球は、抗家兎組織抗血清、抗Ｒｅ１ｔ
ｅｒ株抗血清とも凝集反応を示さな−かった。

４、結論 結果から明らかなように、本発明によって精製した抗原
を用いれば、初期梅毒でも検出可能であり、また、非特
異反応による偽陽性もみられない。

（本頁以下余白） 第４表　ＴＰＨＡの結果 ＋：陽性（抗体価８０を越えるもの） ±：疑陽性（抗体価８０のもの） 各結果の下の数値は抗体価を表す。

（１）感作液（Ａ）　　抗原量一定感作：陰性（抗体価
８０未満） （２）感作液（Ｂ）　　蛋白量一定感作応用例２　ラテ
ックス試薬（全自動分析装置を用いた測定法） 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を定量する場合の本
発明の効果を全自動分析装置を用いてラテンクス診断試
薬の凝集を測定することにより確認した。特に示さない
限り、実施例１、応用例１と同一名の試薬および検体は
実施例１、応用例１と同様に調製した。

１、試薬および検体の調製 １）ラテックス：積木化学工業■製の０．４００μ閑の
ポリスチレンラテックス（固形分１０％）を用いた。

２）ＰＢＳ（ｐＨ７，４）ニリン酸１ナトリウム（２水
和物）、リン酸２ナトリウム（２水和物）、塩化ナトリ
ウムから、０．０２Ｍリン酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ムを調製した。０．１％ＮａＮ、を含む。

３）　　ＮａＣ１−ＰＢＳ　　（ｐＨ６，５）ニリン酸
１ナトリウム（２水和物）、リン酸２ナトリウム（２水
和物）、塩化ナトリウムから、０．０２Ｍリン酸、１．
００Ｍ塩化ナトリウムを調製した。０．１％ＮａＮ３を
含む。

４　）　１００ｍＭ　ＮａＰＢ　ニリン酸水素２ナトリ
ウム（無水）、リン酸２水素ナトリウム（１２水和物）
より１００ｍＭ　ＮａＰＢ（ｐＨ７，５０）を調製した
。０．１％ＮａＮ３を含む。

５）１％Ｂ　Ｓ　Ａ−ＮａＰＢ　：　１００ｍＭ　Ｎａ
ＰＢにＢＳＡが１％になるように調製したもの。

６）５％Ｂ　Ｓ　Ａ−ＮａＰＢ　：　１００ｍＭ　Ｎａ
ＰＢにＢＳＡが５％になるように調製したもの。

７）希釈液：５％Ｂ　Ｓ　Ａ−ＮａＰＢにポリエチレン
グリコール（平均分子量５００，０００　：和光純薬）
を０．２５％（ｗ／ｖ）　　となるようにン容解させた
もの。

８）装置：日立７０５０型　全自動分析装置を用いて測
定を行った。

２、方法 １）抗原感作液の調製 第２表に示した抗原価、蛋白濃度の各抗原液に、ＮａＣ
１−Ｐ　Ｂ　Ｓ、１％ＯＧを含む１０ｍＭＫＰＢをそれ
ぞれ第５表に示した量で混合したものを抗原感作液とし
た。感作液Ａは抗原活性を２５０（ｔｉｔｅｒ／ｄ）に
なるように調整したものであり、感作液Ｂは蛋白濃度を
約２５μｇ／ｙｘｌになるように調整したものである。

第５表　ラテックス試薬化用抗原感作液の組成感作液囚
抗原量一定感作 感作液■蛋白量一定感作 ２）梅毒抗原の固定化 固形分１０％のポリスチレンラテックス１００μｌを４
°Ｃのインキュヘーター中でマグネチックスターラーで
攪拌しながら、■）の梅毒抗原液４００μ！を素早く混
合し、４　’Ｃにて１時間撹拌した。その後１％ＢＳＡ
を５Ｆｄを添加し、４°Ｃにて１．５時間撹拌した。そ
の後、１５０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。得られ
た沈澱に、もう−度１％Ｂ　Ｓ　Ａ−ＮａＰＢ５　ｍｌ
添加し、同様に遠心して沈澱を洗浄した。この沈澱に１
％Ｂ　Ｓ　Ａ−ＮａＰＢ　５　ｄを添加し、よく分散し
て固形分０．２％のラテックス試薬とした。ラテックス
試薬は４°Ｃで保存した。

３）測定条件 測定条件を以下のように設定した。

試料容量　　　２０μ！　（検体） Ｒ１容量　　　５０μｌ　（ラテックス試薬）Ｒ２容量
　　３５０μＰ、（希釈液） 波　　　長　　　５７０ｎｍ ４）測定方法 測定開始後、８０秒後と３２０秒後の波長５７０ｎｍの
吸光度の差をとり、Ｏ，０，５７０の変化量とした。

３．結果 上記の方法によってＴＰ抗原液より調製したラテックス
試薬を用い、各検体との反応をＯ，０，５７０での濁度
の変化量として測定したところ第６表に示すような結果
が得られた。

まず、抽出抗原、粗精製抗原を用いたラテックス試薬で
は陰性となる初期梅毒検体について本発明品はいずれも
陽性と判定するのに十分な感度をしめす。また、市販の
ＴＰＨＡキットでは非特異反応の見られた梅毒陰性３検
体において、本発明品では非特異的反応は見られなかっ
た。

さらに、本発明品を用いたラテックス試薬は、抗家兎細
胞抗血清、抗Ｒｅ１ｔｅｒ株抗血清とは陽性と判定され
るような値を示さなかった。

４、結論 結果から明らかなように、本発明によって精製した抗原
を用いれば、従来の抽出抗原よりも反応性が大きい（す
なわち、感度が高い）。その結果、従来の抽出抗原では
検出できなかった初期梅毒でも検出できている。

また、市販のＴＰＨＡキットで検出できなかった初期梅
毒も検出できている。

また、従来の抽出抗原と異なり、非特異反応による偽陽
性がみられない。

（本頁以下余白） 第６表 ラテックス試薬での結果 表の単位は吸光度変化を１００００倍にしたものである
。

感作液囚　抗原量一定感作 怒作液■　蛋白量一定感作 応用例３　　ＥＬＩＳＡによる梅毒抗体アッセイ法本発
明で得られた精製抗原を用いたＥＬＩＳＡ法で本発明の
効果を確認した。

１、試薬および検体の調製 以下の試薬および検体を調製して用いた。ただし実施例
１、応用例１．２と同一名の試薬および検体は実施例１
、応用例１．２と同様に調製した。

（１）ＴＰ抗原 実施例１で得られた抽出抗原、粗精製抗原、ＨＡｐ精製
抗原を用いた。

（２）検体 応用例１で使用したものを１％ＢＳＡで１００倍に希釈
して用いた。

（３）ペルオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇ−Ｇマイルス・
ラボラトリーズ社のペルオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇ−
Ｃ，（ヒツジ由来）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１０００倍
に希釈して用いた。

（４）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇ−Ｇ及び１−Ｍ マイルス・ラボラトリーズ社のペルオキシダーゼ標識抗
ヤギＩｇ−ＧおよびＩｇ−Ｍ（ヒツジ由来）を１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳで１０００倍に希釈して用いた。

（５）　　マイクロタイタープレート：ヌンク社の９６
穴マイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡ用平底）を用
いた。

（６）ペルオキシダーゼ基質ニリン酸−クエン酸緩衝液
に０−フェニレンジアミン（２塩酸）を２■／ｄ、過酸
化水素水を０．０３％になるように溶解した。基質の調
製は使用直前に行った。

（７）ＩＮ硫酸：　濃硫酸を精製水で希釈してＩＮ硫酸
水溶液とした。

２、方法 １）ＴＰ抗原液の調製：応用例２と同様に各抗原液と１
％ＯＣを含む１０ｍＭＫ　Ｐ　ＢとＮａＣｌ／　Ｐ　Ｂ
　Ｓとを第７表に示した組成で混合したものを用いた。

（本頁以下余白） 第７表　ＥＬＩＳＡ用抗原感作液の組成感作液■抗原量
一定怒作 感作液■蛋白量一定感作 ２）ＴＰ抗原の固定化 マイクロタイタープレートに（１）のＴＰ抗原液を５０
μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベートした。

インキュベート後、ＴＰ抗原液を吸引除去し、２００μ
での１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回吸引洗浄した。吸引洗浄
後、２００μ！の１％ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、室温で１
時間インキュベートしブロッキングを行った。ブロッキ
ングが終わったプレートはすくに抗原抗体反応に使用し
た。

３）抗原抗体反応 第１抗体として、検体をそれぞれ１％ＢＳＡ／ＰＢＳで
１００倍したものを１００μ！ずつ各ウェルに分注した
。対照として、抗原の代わりに１％ＢＳＡ／ＰＢＳを添
加したウェルにも同様に検体を分注した。室温で１時間
インキュベート後、吸引除去し、２００μｌの１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳで３回吸引洗浄した。

吸引洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒ）ＩｇＧ、抗ヒ
）Ｉｇ−Ｍを初期梅毒検体、後期梅毒検体と梅毒陰性検
体を分注したウェルに、抗ヤギｒｇＧを抗Ｒｅ１ｔｅｒ
株抗血清と抗家兎組織抗血清を分注したウェルに、１ｏ
ｏｔＩｌずつ分注して室温で１時間インキュベートした
。インキュベート後、各ウェルを吸引除去し、２００μ
ｆ（７）１％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　ＢＳで３回吸引洗浄した
。洗浄後、すぐに各ウェルに結合した酵素活性を測定し
た。

４）酵素反応 各ウェルに１００μｌずつペルオキシダーゼ基質を添加
し、室温で１５分間インキュベートした。基質ブランク
として、抗原も第１抗体も第２抗体も含まないウェルに
も同様に基質を分注した。インキュベート後、ＩＮ硫酸
を１ＯＯｕＩ！、添加し、酵素反応を停止させた。各ウ
ェルの酵素反応時間は一定になるように注意して行った
。反応停止後、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍ
ＴＰ−１００，コロナ社）により、基質ブランクを対照
として４９２ｒ＋＋＋＋の吸光度を測定した。

３、結果 上記の方法によってＴＰ抗原液を用いたＥＬＩＳＡ法に
より、各検体との反応を４９２ｎｍにおける吸光度を測
定したところ第８表に示すような結果が得られた。

即ち、まず初期梅毒３検体では、本発明品を用いること
によってＴｇＭの検出感度が向上する。また梅毒陰性３
検体では抽出抗原では陽性値（ＯＤｏ、０５７以上を陽
性とする）を示すものがあるが本発明品では陽性値を示
さない。

さらに本発明品のＴＰ抗原は、抗家兎組織血清、抗Ｒｅ
１ｔｅｒ株抗血清とも陽性反応と診断されるような値を
示さなかった。

４、結論 結果から明らかなように、本発明によって精製した抗原
を用いれば、従来の抽出抗原を用いたＥＬＩＳＡ法では
、検出できなかった初期梅毒でも検出可能であり、また
非特異反応による偽陽性は見られない。

第８表　ＥＬＩＳＡの結果 ０、Ｄ、＆ｍの平均値（ｎ＝４） 感作液（Ａ）　　抗原量一定感作 感作液（Ｂ）　　蛋白量一定感作 参考例２　イムノブロッティングアッセイによる抗原蛋
白の確認 １、試薬および試料 特に示さない限り、実施例１、参考例１、応用例３と同
一名の試薬および試料は実施例１、参考例１、応用例３
と同じように調製した。

１）フロフティング用緩衝液：２５１１Ｍトリス、１９
２ｍＭグリシン、２０％メタノールを混合し、ｐＨ８，
３であることを確認した。

２）ニトロセルロースメンブレン（以下ＮＣと略す。）
：バイオランド社製のポアサイズ０６４５μ、９Ｘ１２
ＣＩ＋シートを使用した。

３）梅毒陽性血清：初期梅毒検体および後期梅毒検体は
それぞれプールしたものを使用した。

４）ペルオキシダーゼ基質：　４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−
Ｎａｐｈｔｏｌ　（ナカライテスク■社製）１０■を氷
冷したメタノール３．３４ｄに溶解してから、クエン酸
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）　１６．６６１Ｒ１と混合
し、使用直前に、３０％過酸化水素水１０μ！を加えた
。基質は用時調整した。

２、操作方法 １）参考例１の方法と同様にして、抽出抗原、粗精製抗
原およびＨＡｐ精製抗原の電気泳動を行った。泳動法ゲ
ルは同じものを５種類用意した。

２）あらかじめＮＣをブロッティング用緩衝液に浸し平
衡化してから、１）のゲルの上に密着させ、ブロッティ
ング用緩衝液中で蛋白をゲルからＮＣへ電気泳動によっ
て転写した。

３）ＰＢＳで３回洗浄後、ＮＣを３％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓ緩衝液に浸し、ブロッキングを行った。

４）初期梅毒検体、後期梅毒検体、梅毒陰性検体、抗家
兎組織血清、抗Ｒｅ１ｔｅｒ株抗血清を１％ＢＳＡ／Ｐ
ＢＳで１００倍に希釈し、各血清を上記のＮＣに転写さ
れた各抗原と反応させた。

５）１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄後、初期梅毒検体、
後期梅毒検体と梅毒陰性検体を反応させたＮＣをそれぞ
れペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇ−Ｇ、抗ヒトＩｇ−
Ｍを含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に浸漬、反応させた。同
様に抗Ｒｅ　ｉ　ｔｅｒ株抗血清と抗家兎組織抗血清を
反応させたＮＣを抗ヤギＩｇＧを含む１％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ中に浸漬、反応させた。室温で１時間インキュベート
した後、ＰＢＳで３回吸引洗浄した。洗浄後、すぐに、
各ＮＣに結合した酵素活性をみた。

６）ペルオキシダーゼ基質を添加し室温でインキュベー
トした。適当なメンブレンの発色像が得られたところで
、メンブレンを脱塩水で洗浄後、乾燥させてから、発色
の位置、程度を観察した。

３、結果 参考例１の結果にあるＨＡｐ精製抗原の３本のバンド（
分子量３１，０００．４１，０００．４７　、０００付
近）は、梅毒陽性血清とのみ特異的に反応する蛋白であ
ることが確認された。抽出抗原、粗精製抗原では抗家兎
組織血清、抗Ｒｅ１ｔｅｒ株抗血清と反応するバンドが
見られたが、ＨＡｐ精製抗原では見られなかった。

４、結論 結果から明らかなように、ハイドロキシアパタイトゲル
を用いることによって得られたＴＰ抗原は、梅毒陽性血
清とのみ特異的に反応する成分からなる純度の高い抗原
である。

〔発明の効果〕 本発明の梅毒抗原の製造法によれば、従来品に比し、極
めて純度の高い梅毒トレボネーマ抗原を得ることができ
、該抗原を用いることにより、後期梅毒と同様に初期梅
毒も検出することが可能で偽陽性のみられない梅毒検査
用試薬を提供することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、梅毒トレポネーマ菌体由来抽出物を溶液中において
   ハイドロキシアパタイトゲルに吸着させ、溶出させるこ
   とを特徴とする梅毒抗原の製造法。 ２、吸着に用いる溶液のｐＨが５．０〜８．０でイオン
   強度が２〜３０ｍＭである請求項１記載の製造法。 ３、溶出に用いる溶液のｐＨが５．０〜１１．０でイオ
   ン強度が１０〜３６０ｍＭである請求項１又は請求項２
   に記載の製造法。