JPH0486559A - 梅毒検査試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は梅毒トレポネーマ（病原性Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ
ｐａｌｌｉｄｕｍ　Ｎ１ｃｏｌｓ、以下ＴＰと略記する
。）菌の破砕菌体またはそれに由来する抗原を動物赤血
球やＥＩＡピースおよびラテックス等の担体に担持し、
得られた抗原感作担体に反応する被検血清中の抗体の存
在を検出することによって梅毒感染の診断を行うテスト
の改良に関する。更に詳しくは、特異性が高く、初期感
染を高感度に検出しうる梅毒検査用試薬に関する。

〔従来の技術〕

従来、梅毒の診断法はＴＰ菌を直接抗原として用いて被
検血清中の抗梅毒トレポネーマ抗体（以下ＴＰ抗体）と
の抗原抗体反応を利用する検査法が行われている。その
中では音訳らによって開発されたＴＰＨＡテストが鋭敏
性、特異性、操作の簡便性等の利点から現在広く用いら
れており、梅毒の代表的な臨床検査法としてその優秀性
が世界中に認められている。

上記方法において用いられているＴＰ菌由来抗原（以下
ＴＰ抗原）は、従来ＴＰ菌を家兎こう丸で培養したもの
から採取した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、直ちにホモ
ジナイザー処理、超音波処理などによってＴＰ菌体を破
砕し、あるいはこれを可溶化して担体感作抗原液として
用いていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、このような従来技術においては、以下の
（１）〜（３）に記載するような問題を有していた。

（１）初期梅毒の検出の困難性 ＴＰＨＡのような抗原抗体反応を利用した梅毒抗体検出
法においては、後期抗体（Ｉｇ−Ｇ）に比較して初期抗
体（Ｉｇ−Ｍ）に対する検出感度が低かった。それは、
担体に担持する抗原の純度か原因であった。即ち、従来
のＴＰＨＡテストにおいて動物赤血球の担持に用いられ
ていたＴＰ抗原は製法上必然的に不純物が多く、不純蛋
白の９０％以上かＴＰ菌を培養した家兎栗丸由来の不純
物や抗原性のないＴＰ菌体由来の蛋白と言われている。

このように、不純物画分が抗原画分に比べかなり高い分
量で混入しているために、従来の抗原では初期抗体（Ｉ
ｇ−Ｍ）を検出てきなかった。

（２）試薬の品質管理の困難性 従来、ＴＰ抗原は家兎こう丸から採取したＴＰ菌体を破
砕し、あるいはこれを可溶化して直接担体感作用抗原液
として用いていた。しかじ家兎を使ったＴＰ菌体の培養
は、培養温度、培養時の家兎の状態、菌体の継代中の変
異なとで菌体の抗原性にばらつきが出やすかった。しか
し、ＴＰ抗原の品質を簡便確実に認識し得る方法がなか
ったため、梅毒検査用試薬の品質管理が困難であった。

（３）試薬化方法に対する制限 従来使用されていた抗原は（１）に述べたように抗原の
純度が低かったため、試薬化方法としては高感度測定が
可能な方法を用いねばならなかった。

そのような高感度測定系としては酵素免疫測定法、蛍光
免疫測定法などがあり、またＴＰＨＡに用いられている
血球凝集反応も比較的高感度な測定が可能な方法である
。しかし、上に述べたような高感度測定法は、簡便性と
いう点で十分満足のいく方法ではなく、より簡便な方法
、例えばラテックス凝集反応のような方法が望まれてい
た。しかし、ラテックス凝集反応のような検出感度のや
や不足するような方法は従来の純度の抗原では必要な感
度が得られないという問題があった。

そこで、本発明の課題は、抗梅毒トレポネーマ抗体を検
出することにより梅毒を診断する検査試薬において、抗
原の品質のばらつきという問題点を解決するとともに、
後期梅毒と同様に初期梅毒に対しても特異性と鋭敏性か
高く、非特異反応による偽陽性のない梅毒検査用試薬を
提供することにあり、さらに適用できる試薬形態の範囲
を広げることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は鋭意研究の結果、梅毒トレポネーマ菌体由
来の抗原を含む試料をハイドロキシアパタイトゲルのカ
ラムにより抗原純度の検定を行い一定純度以上の抗原を
梅毒検査試薬に使用することにより上記課題を解決し得
ることを見い出し本発明を完成するに至ったものである
。

すなわち本発明の第一発明は、抗梅毒トレポネーマ抗体
を検出することにより、梅毒を診断する検査試薬におけ
る抗原として、梅毒トレポネーマ菌体由来の抗原含有試
料をハイドロキシアパタイトゲルカラムに吸着、溶出さ
せることにより抗原純度の検定を行ったときに、以下の
式により検定される抗原純度が２５％以上である抗原を
使用することを特徴とする梅毒検査試薬であり、そのこ
とにより上記課題が解決される。

但し、上記式における添加蛋白量は、あらかじめ１％オ
クチルグルコシドを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６，０、以下Ａ液という）でノ＼イドロキシ
アパタイトゲルカラムを十分に平衡化し、梅毒トシポネ
ーマ菌体由来の抗原含有試料の溶媒をＡ液に交換してか
らカラムに添加したときの抗原含有試料の蛋白量であり
、回収蛋白量は、該抗原含有試料を添加後、Ａ液をカラ
ム容量の３倍以上流し、未吸着の成分が十分洗浄された
後、溶出用緩衝液（以下Ｂ液という）として１％オクチ
ルグルコシドを含む３５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ６，０）を用い、Ａ液に対するＢ液の割合を０％〜
１００％まで連続的または段階的に変えながら溶出をさ
せたときに、Ｂ液の割合が８％〜４０％の間に回収され
た蛋白量であり、 又、カラム回収率は、−度回収された蛋白質を再度同一
条件で上記カラムに添加して同一部分のフラクションを
回収したときの一度目の回収蛋白量に対する二度目の回
収蛋白量の比率を示す。

本発明の第２発明は、抗梅毒トレポネーマ抗体を検出す
ることにより、梅毒を診断する検査試薬における抗原と
して、梅毒トレポネーマ菌体由来の抗原含有試料を陽イ
オン交換体カラムで処理後、ハイドロキシアパタイトゲ
ルカラムに吸着、溶出させることにより抗原純度の検定
を行ったときに、以下の式により検定される抗原純度が
２５％以上である抗原を使用することを特徴とする梅毒
検査試薬であり、このことにより前記課題が解決される
。

式 但し、上記式における添加蛋白量は、あらかじめ１％オ
クチルグルコシドを含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６，０、以下Ａ液という）で陽イオン交換体
カラムとハイドロキシアパタイトゲルカラムを十分に平
衡化し、梅毒トレポネーマ菌体由来の抗原含有試料の溶
媒をＡ液に交換してから陽イオン交換体のカラムに添加
したときの抗原含有試料の蛋白量であり、回収蛋白量は
該抗原含有試料を該陽イオン交換体カラムに添加後、Ａ
液を流して素通り分画を得た後、該素通り分画をハイド
ロキシアパタイトゲルカラムに添加し、Ａ液をカラム容
量の３倍以上流し、未吸着の成分が十分洗浄された後、
溶出用緩衝液（以下Ｂ液という）として１％オクチルグ
ルコシドを含む３５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６，０）を用い、Ａ液に対するＢ液の割合を０％〜１０
０％まで連続的または段階的に変えながら溶出をさせた
ときに、Ｂ液の割合が８％〜４０％の間に回収された蛋
白量であり、 又、カラム回収率は、−度回収された蛋白質を再度同一
条件で上記ハイドロキシアパタイトゲルカラムに添加し
て同一部分のフラクションを回収したときの一度目の回
収蛋白量に対する二度目の回収蛋白量の比率を示す。

以下に本発明をさらに詳しく説明する。

本発明においては、まず梅毒検査試薬に用いる抗原を準
備する。梅毒検査試薬に用いる抗原は種々の方法で調製
されるか、その−例は次のとおりである。公知の方法に
よりＴＰ菌体を培養する。

これをそのまま、または必要に応じて冷却破壊し、ある
いはこれを可溶化し、梅毒抗原として使用する。さらに
必要に応じて、これを適当な手法によって精製、または
非抗原性の蛋白質を除去したものを梅毒抗原として使用
する。その他、ＴＰ菌体由来の抗原としては遺伝子組み
換えにより、大腸菌、酵母などに作らせた抗原でも良い
。

本発明の梅毒抗原としては、以下に示す検定により抗原
純度が２５％以上とされた抗原が用いられ、これを動物
赤血球やプラスチックビーズ、ラテックス等の担体に担
持させて本発明の梅毒検査試薬を製造する。

ＴＰ抗原の取得、精製方法 １）菌体の選択、培養 ＴＰ種菌は、例えばＷＨＯの病原性標準ニコルス株ある
いは各検査機関か梅毒検査用に使用しているＴＰ菌をそ
のまま用いればよい。なお、ＷＨＯ病原病原性標準ニコ
ルス例えばＣＤ　Ｃ（Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　　Ｄｉｓｅ
ａｓｅ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ、　　Ｐｕｂｌｉｃ　　Ｈｅ
ａｌｔｈ　　５ｅｒｖｉｃｅ。

Ｌｌ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ
、　　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄＷｅｌｆａｒｅ、　
Ａｔ１ａｎｔａ　Ｇｅｏｒｇｉａ）から容易に入手する
ことかできる。また、本発明におけるＴＰ菌の培養方法
、培養物からの集菌方法は、公知の方法の中から任意に
採用することかできる。

２）ＴＰ菌体からのＴＰ抗原の取得法 ＴＰ菌体はそのまま、または必要に応じて、以下のよう
な処理をしてから使用される。１）のＴＰ菌体を培養後
集菌し、緩衝液に懸濁し、冷却破砕してから遠心分離法
によって分画をおこない、各分画のうち抗原の含まれる
分画を集めることによりＴＰ菌培養物由来抗原を得、必
要に応じて可溶化する。その方法は一般に知られている
方法のなかから適宜選択すれば良い。破砕方法はホモジ
ナイザー処理、超音波処理、凍結融解法などが用いられ
る。可溶化方法は界面活性剤、カオトロピックイオンや
尿素およびアルカリによる蛋白の可溶化処理、酵素処理
、自己融解法などが用いられる。

３）ＴＰ抗原の精製 ＴＰ抗原は必要に応じて精製される。ＴＰ抗原の精製方
法は公知の生化学的手法の中から任意に採用することが
できる。例えば、以下の方法かある。

■　硫安塩析法による分画法、ポリエチレングリコール
による沈澱分画法、等電点沈澱法による精製。

■　クロマトグラフィーによる精製；ゲルクロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィーアフィニティー
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相
クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト担体を用
いたクロマトグラフィーなど。また、高速液体クロマト
グラフィー装置を用いて、上記のクロマトグラフィーで
抗原を精製することも可能である。

４）その他のＴＰ抗原の取得法 その他ＴＰ抗原としては、遺伝子組み換えによって大腸
菌、酵母その他宿主に産生させたＴＰ抗原を含む試料で
もよい。

料として、梅毒検査用試薬を製造する。

１）本発明の第１発明においては、梅毒抗原を含む試料
をハイドロキシアパタイトゲルのカラムに添加する。こ
のときあらかじめ吸着用緩衝液として１％オクチルグル
コシド含有１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（１）Ｈ６，
０、Ａ液）を用い、これによりカラムを十分に平衡化し
、また梅毒抗原を含む試料はＡ液に透析、ゲル濾過など
適当な方法で溶媒交換してからカラムに添加する。この
ときカラムに添加した梅毒抗原を含む試料の蛋白量を添
加蛋白量とする。

ついでＡ液をカラム容量の３倍以上流し、未吸着の成分
が十分洗浄された後、溶出用緩衝液として１％オクチル
ゲルコルシトを含有する３５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（Ｂ液）を用い、Ａ液に対するＢ液の割合を０％〜１
００％まで連続的または段階的に変えながら溶出させる
。このとき、Ｂ液の割合が８〜４０％の間に得られた蛋
白量を回収蛋白量とする。本発明においては、以下の式
により抗原純度を求めたときに２５％以上のＴＰ抗原を
原材なお、数式におけるカラム回収率とはこの方法で一
度回収された蛋白質を再度同一条件てカラムに添加して
同一部分のフラクションを回収したときの一度目の回収
蛋白量に対する二度目の回収蛋白量の比率のことである
。

本発明において使用するハイドロキシアパタイトゲルは
その形状、Ｃａ／Ｐ比などのゲルの特性を問わないか、
回収率はゲルの特性により大きな差かある。これはハイ
ドロキシアパタイトゲルによっては、吸着した成分が１
００％は回収されないものがあるためである。即ち、本
発明を実施するにあたり、ゲルの特性を補正する必要が
ある。そこでその方法で一度回収された蛋白質を再度同
一条件でカラムに添加して同一部分のフラクションを回
収したときの一度目の蛋白回収量に対する二度目の蛋白
回収量の比率を求め、これをカラム回収率として、補正
しなければならない。

２）次に本発明の第２発明を説明する。菌体の培養、抽
出、精製条件あるいは抗原の由来なとにより、抗原を含
む試料中にハイドロキシアパタイトによる抗原純度の検
定を妨害する成分を含むことがある。このような場合に
おいては、ハイドロキシアパタイトゲルカラムへの吸着
の前に、あらかじめ該試料を陽イオン交換体に通すこと
か望ましい。

すなわち、このような成分としては、組織中、菌体中な
どの等電点６以上の物質（主としてタンパク質）が考え
られる。これらか、試料中に大量に含まれていた場合、
ハイドロキシアパタイトによる検定において、目的の分
画（Ｂ液８〜４０％）付近に、溶出され、検定を妨害す
ることがある。

目的の分画の前に溶出されるとテーリング現象により、
あるいは目的の分画の後に溶出されるとリーディング現
象により、場合によっては、目的の分画内に溶出された
りすることにより、目的分画の回収タンパク量が増加し
、見かけ上抗原純度か高くなることがあり、所望の品質
の抗原を得ることが困難となる。

したかってこれを回避するために陽イオン交換体により
、測定を妨害する成分を減らし、ハイドロキシアパタイ
トによる検定の信頼性を上げることか必要となる。

ここでこの陽イオン交換体を用いる場合の抗原の検定方
法について以下具体的に説明する。

あらかじめ前記吸着用緩衝液（Ａ液）で陽イオン交換体
を充填したカラムおよびハイドロキシアパタイトゲルの
カラムとも十分に平衡化する。また、梅毒抗原を含む試
料はＡ液に透析、ゲル濾過など適当な方法で交換する。

それから梅毒抗原を含む試料を陽イオン交換体を充填し
たカラムに通し、素通り分画を得る。これによりハイド
ロキシアパタイトゲルによる純度測定を妨害する物質を
除去する。それからこれをハイドロキシアパタイトゲル
のカラムに添加する。このとき陽イオン交換体に添加す
る前の梅毒抗原を含む試料の蛋白量を添加蛋白量とする
。以下は前記１）と同様である。

ついでＡ液をハイドロキシアパタイトカラム容量の３倍
以上流し、未吸着の成分が十分洗浄された後、前記溶出
用緩衝液（Ｂ液）を用い、Ａ液に対するＢ液の割合を０
％〜１００％まで連続的または段階的に変えながら溶出
をさせる。このとき、Ｂ液の割合が８％〜４０％の間に
得られた蛋白量を回収蛋白量とする。そして、以下の式
により抗原純度を求めたときに２５％以上のＴＰ抗原を
原材料として、梅毒検査用試薬を製造する。

なお、カラム回収率とはこの方法で一度回収された蛋白
質を再度同一条件でハイドロキシアパタイトゲルカラム
に添加して同一部分のフラクションを回収したときの一
度目の回収蛋白量に対する二度目の回収蛋白量の比率の
ことである。

使用する陽イオン交換体には種々のものがあるか、本発
明は、ゲルマトリックスとして蛋白質の非特異的吸着か
少ないセルロース、アガロースまたは架橋アガロースか
好適に用いられる。イオン交換基としてはカルボキシル
基、スルホン酸基か導入されたイオン交換体が好適に用
いられるか、適用できるｐＨの範囲が広いことなどから
、スルホン酸基の導入された強イオン交換体か特に好適
である。

３）本発明の梅毒検査試薬においては、抗原純度２５％
以上のＴＰ抗原を用いるが、さらに好ましくは３０％以
上の方かよい。ただし、抗原純度に関する規格値をそれ
以上厳しくするとこの規格に適合できるＴＰ抗原が限ら
れてくるため、ＴＰ菌体またはＴＰ抗原の精製工程を追
加しなければならず、結果的にコスト高になる。

２５％以上の純度のＴＰ抗原であれば、担体に担持した
ときに十分な特異性と感度を示し、非特異的反応による
偽陽性が見られないので、梅毒検査試薬の製造に十分使
用可能である。

なお、上記、ハイドロキシアパタイトゲルカラムからの
溶出においては、前記１）、２）にも記載しているよう
に、Ａ液に対するＢ液の割合は８〜４０％である。Ｂ液
の割合の変化のさせ方は連続的でも、段階的でも良い。

また、前記抗原純度の検定において用いる蛋白質の定量
法は、試料にオクチルグルコシドを含んでいるためにそ
の影響を受けない方法を用いる。

例えばｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ　ａｃｉｄを用いた
測定法（Ｓｍｉ　ｔｈ。

Ｐ、に、、　Ｋｒｏｈｎ、　Ｒ，１，ｅｔｃ　（１９８
５）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１５０、７６−８５．）などを用いることかできる。

本発明の梅毒検査試薬の形態 本発明の梅毒検査用試薬の形態としては、以下のものか
可能である。担体として、ニワトリ赤血球、ヒツジ赤血
球等の各種動物の赤血球、ラテックス等の合成高分子担
体およびシリカなどの無機材質担体などを用い、該抗原
を固定したのち抗原抗体反応に基づ（凝集反応によって
測定するもののほか、プラスチックビーズ、プラスチッ
クプレートなどの合成高分子などに該抗原を固相化して
測定するＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＦＩＡ（蛍光免疫
測定法）も可能である。その他抗原抗体反応に基づく検
査に用いられる方法であればいかなるものであっても本
発明の梅毒検査試薬として適用可能である。

〔実施例〕

以下の実施例において、実施例１として、／Ｓイドロキ
シアバタイトゲルを用いて精製した抗原とその純度検定
を述べ、実施例２として、アフィニティークロマトグラ
フィーにより精製した抗原とその純度検定を述へる。そ
して、実施例１および２て純度検定した抗原を使用して
、ＴｐＨＡ法による己 梅毒検査試薬を作製して本発明効果を検討したものを実
施例３として、ラテックス法による試薬を作製して本発
明の効果を検討したものを実施例４として述べる。

以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説明する。但
し、本発明はこれら実施例に限定されるものでない。

実施例１　抗原の調製と本発明による純度検定（ハイド
ロキシアパタイトゲルを用い て精製したＴＰ抗原） ｉ、抗原の調製 １）材　料 （１）緩衝液 （１−１）リン酸塩緩衝液ｐＨ６，５（以下ＰＢＳ）ニ
リン酸二水素カリウムとリン酸水素二ナトリウム（１２
水和物）と塩化ナトリウムより、リン酸濃度０．０３６
Ｍ、　ＮａＣｌ濃度０．１５６Ｍ、　ｐＨ６，５の緩衝
液を調製し、これに０．１％（Ｗ／Ｖ）となるようにＮ
ａＮ　２を添加した。

（１−２）１％ＢＳＡ／ＰＢＳ　： ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ、マイルズ社製）をＰ
ＢＳに１％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解した。

（１−３）　１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（以下ＫＰ
ＢＩ）Ｈ６，０およびｐＨ７，０）： １０ｍＭリン、酸二水素カリウム溶液、ｌｏｍＭリン酸
水素酸二素カリウム溶液してｐＨ６，０およびｐＨ７，
０に調整した。

（１−４）　３５０ｍＭ　Ｋ　Ｐ　Ｂ　（ｐＨ６，０）
：３５０ｍＭリン酸二水素カリウム溶液、３５０ｍＭリ
ン酸水素二酸二素カリウム溶液てＩ）Ｈ６，Ｏに調整し
た。

（２）界面活性剤オクチルグルコピラノシド（ｌｏ−ｎ
−才クチル−β−Ｄ−グルコピラノシト）以下ＯＧと略
す。難溶性タンパク質研究用（ナカライテスク社製）を
使用した。

（３）６１１８１１ｍクロマトグラフィーゲル（３−１
）陽イオン交換体 Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ファル
マシア社製）を使用した。これは架橋アガロースゲルの
表面にスルホン酸基が導入された陽イオン交換体である
。

（３−２）ハイドロキシアパタイトゲルバイオゲルＨＴ
Ｐ　（バイオラッド社製）およびＨＣＡ−２００Ｌ　（
三井東圧化学社製）を使用した。

（４）ＴＰ菌体：以下に述べる方法によって培養採取し
たものを用いた。

病原性標準ニコルス株トレポネーマパリダムの６．０Ｘ
１０７ケ／イの懸濁液を家兎皐丸実質１個当り、１７ｎ
ｌずつ接種した。ｌＯ日間培養後、家兎１ｏ羽より栗丸
を採取し、ミンチ後、２．２％クエン酸ナトリウム溶液
５００ｉで３７°Ｃで３０分振とうし、ＴＰ菌を抽出し
た。抽出液を２００Ｘｇで５分間遠心し、兎組織の沈澱
を除去し、上清を３０００Ｘｇで３０分間遠心分離し、
ＴＰ菌を沈澱させた。得られたＴＰ菌体をＰＢＳて繰り
返し洗浄した後、ＰＢＳに懸濁して暗視野顕微鏡を用い
て菌数計算後ｌＸｌ０”ケ／ｍｌに調整し、これをＴＰ
菌体懸濁液とした。この菌体懸濁液を暗視野顕微鏡で観
察し、兎精子および兎組織の混入が認められないことを
確認した。

（５）蛋白濃度測定用試薬：　Ｂ　ＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ａｓ５ａｙ１１％ｅａｇｅｎｔ（Ｐ　Ｉ　Ｅ　ＲＣ
Ｅ社製）を用いた。

（６）マイクロタイタープレート：ヌンク社の９６穴マ
イクロウエルプレー）　（Ｕ底）を用いた。

（７）ＴＰ抗原感作血球：市販Ｔ　Ｐ　’ＨＡキットで
あるセロクリットＴＰ　（化学および血清療法研究新製
）の構成品を使用した。

（８）梅毒陽性家兎血清：トレポネーマ・パリダムを家
兎皇丸中で４５日間培養した家兎から血清を採取して使
用した。抗体価を市販ＴＰＨＡキットで測定したところ
１０２．４００であった。１％ＢＳＡ／ＰＢＳて希釈し
て使用した。

２）方　法 （１）蛋白濃度の測定 ローリ−法の改変法の−っであるｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉ
ｎｉｃａｃｉｄを用いた測定法（Ｓｍｉｔｈ、　Ｐ、に
、、　Ｋｒｏｈｎ、　ＲｏＩ。

ｅｔｃ、（１９８５）　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　１５０．７６−８５．）を原理とするＢ　ＣＡ　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｐ　Ｉ　
Ｅ　ＲＣＥ社製）によって測定した。スタンダードは１
％ＯＧを含む１０ｍＭＫ　Ｐ　ＢにＢＳＡを溶解したも
のを用い、単位は（μｇ／ｍｊ）で示した。

（２）抗原活性の測定 血球凝集阻止試験による方法で行った。

■　１％ＢＳＡ／ＰＢＳをマイクロタイタープレートの
各ウェルに２５μβずつ滴下する。

■　各抗原フラクションをマイクロタイタープレートの
手前側のウェルに２５μｌずつとり、これをプレート上
で１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液により倍倍希釈してゆく。

■　抗体価５０に希釈した梅毒陽性家兎血清を、■で倍
々希釈した抗原に加えて混合する。

■　室温で３０分以上反応させる。このときプレートの
手前側の抗原濃度の高いウェルの抗体は抗原と結合して
消費されてしまうか、抗原濃度の薄いウェルの抗体は消
費されずに残る。

■　次に、各ウェルにＴＰ抗原感作血球を加え、消費さ
れずに残っている抗体と凝集反応を起こしたウェル中の
家兎血清の最終希釈率（８，１６，３２１、、、、）を
もって抗原活性とし、単位は（ｔｉｔｅｒ／ｒｎｌ）で
示した。

■　抗原比活性は抗原活性を蛋白濃度で割った値で示し
、単位は（ｔｉｔｅｒ／μｇ）で示した。

（３）ＴＰ菌体より抗原の可溶化及び抽出ＴＰ菌体懸濁
液５０ｍ１に対しＰ　Ｂ　Ｓ　５０ｒｎＩを用いて３０
００Ｘｇで３０分の遠心洗浄を３回行ってからＰＢＳ５
０−に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕機で処理し、
ＴＰ菌体を破砕した。これを１２．６００Ｘｇで３０分
遠心して沈澱を取った。

沈澱は１０ｍＭＫ　Ｐ　Ｂ　ｐＨ７，０を用いて１２，
０００Ｘｇの遠心洗浄を２回繰り返した後、ＯＧを１％
（Ｗ／Ｖ）含む１０ｍＭＫ　Ｐ　Ｂ　１）Ｈ７，０を５
０イ加え、沈澱をよく懸濁したのち軽く超音波破砕して
可溶化した。４°Ｃで１６時間以上放置してから５０．
０００　ｘ　ｇで１時間遠心分離し、得られた上清を０
．２２μｍのフィルター（ミルポア社製、商品名マイレ
クスＧＳ）で濾過し、５０イ（抗原活性２０４８ｔｉｔ
ｅｒ／ｍｊ、蛋白濃度３６５μｇ／ｍｊ）のＴＰ菌体由
来抽出物を得た。以下これを抽出抗原と称す。

（４）抗原の精製 ■抗原の透析 上記抽出抗原は１％ＯＧを含む１０ｍＭＫ　Ｐ　Ｂ　ｐ
）Ｉ７．０に溶解されているのて、そのうち３０７１Ｌ
ｌを１％ＯＧを含むｐＨ６，０の同緩衝液（Ａ液）に透
析した。

透析液：抽出抗原液＝４容：ｌ容の体積比で行い、透析
外液を３度以上交換した。最終透析の後、透析外液のｐ
Ｈを測定し、ｐＨ６，０±０．１の範囲にあることを確
認した。

■抗原の粗精製 Ｓ−セファローズゲル３（Ｗを充填したカラム（ファル
マシア社、Ｓ　Ｒ２５／４５）に■の抗原を通し、素通
り画分６０ｒｎｌ（抗原活性１０２４ｔ　１ｔｅｒ／ｍ
／、蛋白濃度１０１μｇ／ｍＮ）を抗原分画として回収
した。

（以下これを粗精製抗原と称す。） ■ハイドロキシアパタイトゲルによる精製ハイドロキシ
アパタイトゲル８ｉをカラム（ファルマンア社、ＨＲＩ
Ｏ／１０）に充填した後、１％ＯＧを含む１０ｍＭＫ　
Ｐ　Ｂ　ｐＨ６，０（以下Ａ液）で平衡化した。

各ハイドロキシアパタイトカラムに上記粗精製抗原を２
０イ添加してから、Ａ液をカラムに流し、０、　Ｄ、　
２８０での吸収かｏ、ｏｉｏ以下になるまてカラムを洗
浄した。このときの分画を素通り分画とした。

Ａ液に対して１％ＯＧを含む３５０ｍＭＫ　Ｐ　Ｂ　ｐ
Ｈ６，０（以下Ｂ液）の比率を０から４０％まで徐々に
増加させ、リニアグラジェントで溶出させたのち、Ｂ液
の比率を１００％にあげ溶出させた。

Ｂ液の比率か０％→８％、８→１６％、１６→２４％、
２４→３２％、３２→４０％の溶出分画をそれぞれ集め
た。

３５０ｍＭ　Ｋ　Ｐ　８１００％で溶出された分画をあ
つめ、これを４０％以上分画とした。

■各フラクンヨンのアッセイ 素通り分画、０−８％分画、８−１６％分画、１６２４
％分画、２４−３２％分画、３２−４０％分画、４０％
以上分画の各フラクションの抗原活性、蛋白濃度をそれ
ぞれ２）の（２）と２）の（１）の方法てもとめ、これ
より比活性を算出した。

■ＨＡｐ抗原の濃縮 抗原活性を示した分画のうち、比活性１２ｔｉｔｅｒ／
μｇ以上を示した分画を集め、蛋白質濃度４０μｇ／ｒ
ｎＩ以上になるまで、セロファンチューブ（和光純薬工
業）を用いて減圧下で濃縮した。各ハイドロキシアパタ
イトカラムで精製した抗原を１０ｍ１　（バイオゲル−
ＨＴＰて精製したものは抗原活性２０４８ｔｉｔｅｒ／
ｍｆ７、蛋白濃度７７μｇ／ｍＮ、ＨＣＡ−２００Ｌで
精製したものは抗原活性１５３６ｔ　ｉ　ｔｅｒ／ｍｅ
、蛋白濃度４２μｇ／ｍ（りずつ得た。以下これによっ
て得られた分画をＨＡｐ精製抗原と称す。

１１、本発明による抗原純度検定 ｌ）第１発明による検定 ■抽出抗原２ｍｌ、粗精製抗原４ｒｎｌおよびＦ（Ａｐ
精製抗原（バイオゲルＨＴＰＳＨＣＡ−２００Ｌとも）
２ｍｌをＡ液で透析した。透析外液：抗原液−４容、１
容の体積比で行い、透析外液を３度以上交換した。

■　ハイドロキシアパタイトゲルを充填したカラム（フ
ァルマシア社、ＨＲＩＯ／１０）を、Ａ液で十分に平衡
化した。

■　抽出抗原、粗精製抗原、ＨＡｐ精製抗原をカラムに
添加後にのときカラムに添加する前の蛋白量を添加蛋白
量とした。）、Ａ液をカラム容量の３倍以上流した。０
．　Ｄ、　２８０での吸収か０．０１０以下になるまで
、カラムを洗浄した。

■　Ａ液に対するＢ液の割合を０％〜４０％まで連続的
に変えながら溶出してから、Ｂ液の割合を１００％にあ
げてカラム１洗浄した。Ｂ液の割合が８％〜４０％の間
に回収された蛋白質の蛋白量（回収蛋白量）を蛋白濃度
より算出した。

■　カラム回収率は、次の方法で算出した。■で、各抗
原を各ハイドロキシアパタイトカラムに添加して回収し
た分画の一部をとりにのときの蛋白量Ｐ１＝５０μｇと
する。）、Ａ液で透析してから上記■、■の操作を繰り
返してＢ液の割合が８〜４０％の間に回収された蛋白量
を算出したにのときの蛋白量をＰ２とする。）。カラム
回収率＝Ｐ２／Ｐ１としてカラム回収率を算出した。

■　下記の式より各抗原の抗原純度を算出した。

２）第２発明による検定 ■抽出抗原２ｍｌ、粗精製抗原４ｍｌおよびＨＡｐ精製
抗原（バイオゲルＨＴＰ、ＨＣＡ−２００Ｌとも）２ｍ
ｌをＡ液で透析した。透析外液：抗原液−４容１容の体
積比で行い、透析外液を３度以上交換した。

■　Ｓ−セファロースを充填したカラム（ファルマシア
社、ＨＲＩＯ／１０）およびハイドロキシアパタイトゲ
ルを充填したカラム（ファルマシア社、ＨＲＩＯ／１０
）を、Ａ液で十分に平衡化した。

■　抽出抗原、粗精製抗原、ＨＡｐ精製抗原をＳ−セフ
ァロースカラムに添加後にのときカラムに添加する前の
蛋白量を添加蛋白量とした。）、Ａ液を流して素通り画
分を得た。

■　各抗原の素通り分画をハイドロキシアパタイトカラ
ムに添加後、Ａ液をカラム容量の３倍以上流した。Ｏ，
Ｄ、　２８０での吸収か０．０１０以下になるまで、カ
ラムを洗浄した。

■　Ａ液に対するＢ液の割合を０％〜４０％まで連続的
に変えながら溶出してから、Ｂ液の割合を１００％にあ
げてカラムを洗浄した。Ｂ液の割合か８％〜４０％の間
に回収された蛋白質の蛋白量（回収蛋白量）を蛋白濃度
より算出した。

■　カラム回収率は、次の方法で算出した。■で、各抗
原を各ハイドロキシアパタイトカラムに添加して回収し
た分画の一部をとりにのときの蛋白量Ｐ１＝５０μｇと
する。）、Ａ液で透析してから上記■、■の操作を繰り
返してＢ液の割合か８〜４０％の間に回収された蛋白量
を算出したにのときの蛋白量をＰ２とする。）。カラム
回収率−Ｐ２／Ｐ　１としてカラム回収率を算出した。

■　下記の式より各抗原の抗原純度を算出した。

ｉ　ｉ　ｉ、結　果 ハイドロキシアパタイトゲルはバイオゲルＨＴＰおよび
ＨＣＡ−２００Ｌを用い、全く同じ操作で抗原精製を行
った。ｉの２）の（４）の■て得たフラクションのほか
、抽出抗原、粗精製抗原でも蛋白濃度および抗原活性を
測定し、抗原比活性を算出した。その結果を第１表に示
す。

抽出抗原、粗精製抗原、ＨＡｐ精製抗原の一部を使用し
、カラム回収率を算出した結果を第２表に示す。カラム
回収率は測定試料による差はみられなかった。以下の計
算ではカラム回収率は第２表の平均値を用いた。

更に抽出抗原、粗精製抗原、ＨＡｐ精製抗原のそれぞれ
について本発明の第１発明および第２発明により、バイ
オゲルＨＴＰ、ＨＣＡ−２００Ｌを用イて抗原純度を算
出した結果を、第１発明によるものを第３表に、第２発
明によるものを第４表に示した。これにより、抗原純度
の高い抗原はど抗原比活性か高い傾向かみられた。

（本頁以下余白） 第１表 （１）バイオゲルＨＴＰによる精製 第１表 （２）　ＨＣＡ−２０ＯＬによる精製 実施例２　抗原の調製と本発明による純度検定（アフィ
ニティークロマトグラフィー により精製した抗原） ｉ、抗原の調製 １）材　料 特に示さない限り、実施例１のｉの１）と同一名の試薬
及び試料は実施例１のｉの１）と同じように調製した。

（１）緩衝液 （１−１）カップリング緩衝液：炭酸水素ナトリウム、
炭酸ナトリウム、塩化ナトリウムから、０．５ＭＮａＣ
ｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８，３）を調製した
。

（１−２）ブロッキング緩衝液ニゲリシンを溶解後、Ｎ
ａＯＨてｐＨを調整することによって、０．２Ｍグリシ
ン緩衝液（ｐＨ８，０）を調製した。

（１−３）酢酸緩衝液：　０．１　Ｍ酢酸と０，１Ｍ酢
酸ナトリウムを混合し、これにＮａＣｌを加え０．５　
Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）
を調製した。

（１−４）　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ−０，１５Ｍ
　Ｋ　Ｃ１（ｐＨ８，０Ｘ以下ＴＫＢと略す。） （２）アフィニティークロマトグラフィーゲルＣＮ　Ｂ
　ｒ　−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−３ａｐｈａｒｏｓｅ　４
Ｂ　（ファルマシア社製）を使用した。

（３）抗ＴＰ抗体：実施例１のｉの２）の−（４）の■
でバイオゲルＨＴＰにより精製した抗原をＦｒｅｕｎｄ
のｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔとともに家
兎に免疫して産生させた抗血清（抗体価４０．９６０）
より、１．４Ｍ硫安分画を２回行って精製したミーグロ
ブリン分画をカップリング緩衝液に透析後使用した２）
、方法 （１）抗ＴＰ抗体の固定化： ■ＣＮ　Ｂ　ｒ　−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−３ａｐｈａｒ
ｏｓｅ　４Ｂの乾燥粉末３．５ｇを１ｍＭＨＣｌ中で１
５分間膨潤後、グラスフィルター上で、そのゲルを１ｍ
ＭＨＣ］を用いて洗浄した。

■ゲルをカップリング緩衝液で洗浄してから、同緩衝液
に懸濁する。ゲル１ｒｎｌあたり抗ＴＰ抗体か７■含ま
れるように抗ＴＰ抗体溶液を添加し、４℃て１６６時間
混した。

■ゲルをブロッキング緩衝液に懸濁してから室温で２時
間混合した。

■カップリング緩衝液でゲルを洗浄後、酢酸緩衝液で洗
浄し、更にカップリング緩衝液で洗浄した。これを３回
繰り返した後、ＴＫＢによって洗浄後、ＴＫＢに懸濁し
て保存した。

（２）アフィニティークロマトグラフィーによる精製 ■抗ＴＰ抗体カラムの準備 抗ＴＰ抗体を固定化したゲルＩＯ−をカラム（ファルマ
シア社、ＨＲＩＯ／１０）に充填した。

■ＴＰ抗原の調製 実施例１て得られた抽出抗原１０−を１％ＯＧを含むＴ
ＫＢに透析後使用した。透析液：抽出抗原液＝４容：１
容の体積比で透析を行い、透析外液を３度交換した。

■抗ＴＰ抗体カラムへのＴＰ抗原の吸着抗ＴＰ抗体カラ
ムはあらかじめ１％ＯＧを含むＴＫＢで平衡化してから
ＴＰ抗原をカラムへ添加した。添加後１％ＯＧを含むＴ
ＫＢをカラムに流し、Ｏ，Ｄ、　２８０での吸収か０．
０１０以下になるまで洗浄した。

■ＴＰ抗原の溶出 ３Ｍグアニジン塩酸と１％ＯＧを含むＴＫＢをカラムに
流してＴＰ抗原を溶出した。得られたＴＰ抗原は直ちに
１％ＯＧを含むｌＯｍＭＫ　Ｐ　Ｂで平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（商品名ＰＤｌＯ、ファルマシ
ア社製）に添加し、バッファー交換することによってグ
アニジン塩酸をＴＰ抗原より除去した。

■ＴＰ抗原の濃縮 蛋白質濃度５０μｇ／−以上になるまで、セロファンチ
ューブ（和光純薬工業）を用いて減圧下で濃縮し、１０
艷の分画を得た。これによって得られた分画をＡＣ精製
抗原と称す。

（３）抗原アッセイ法等 ＡＣ精製抗原の抗原活性および蛋白濃度の測定も実施例
１と同様の方法で行った。

ｉｉ１本発明による抗原純度検定 ＡＣ精製抗原のうち２−を使用し、実施例１のｉｉ、と
同様の方法で行った。カラム回収率は第２表の平均値を
用いた。

ｉ　ｉ　ｉ、結　果 上記の方法に従い実施例１の抽出抗原を用いてアフィニ
ティークロマトグラフィーによる抗原精製を行ってから
、蛋白濃度および抗原活性を測定し、総抗原活性、総蛋
白量および抗原比活性を算出した。その結果、抗原活性
２０４８ｔｉｔｅｒ／ｍｌ、蛋白濃度８２．２　ｕ　ｇ
／ｍ１１抗原比活性２４．９ｔｉｔｅｒ／μｇのＡＣ精
製抗原が得られた。

抽出抗原、ＡＣ精製抗原のそれぞれについて本発明の第
１発明および第２発明で純度検定を行った。その結果を
第１発明によるものを第５表に、第２発明によるものを
第６表に示す。

（本頁以下余白） 実施例３　　ＴＰＨＡ 本発明により純度を確認したＴＰ抗原を用いて羊赤血球
に担持させ、ＴＰＨＡ法での本発明の効果を確認した。

１）材　料 特に示さない限り、実施例１．２と同一名の試薬及び緩
衝液は実施例１．２と同じように調製した。

（１）緩衝液 （１−１）　０．１５Ｍリン酸緩衝液（１）８７．４　
）：　０．１５Ｍリン酸二水素ナトリウム（２水和物）
およびＯ，１５Ｍリン酸水素二ナトリウム（１２水和物
）を水溶液を混合してｐＨ７，４に調整する。

（１−２）生理食塩水９．０ｇの塩化ナトリウムを１０
００ｇの精製水に溶解したもの。

（１−３）　ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（以下ＭｃＩと
略す。）＝０．１Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸酸水素ナ
ナトリウム１２水和物）を混合し、ｐＨ６，５になるよ
うに調整したもの。

（１−４）１％ＯＧ／Ｍｅ　Ｉ　：　Ｍｅ　ＩにＯＧを
１％（ｗ／ｖ）溶解したもの。

（１−５）ＰＨＡ緩衝液： 以下の溶液および試薬を混合して作製した（緩衝液１０
００ｒｎｌあたりの量）。

■　兎正常血清　　　　　　　　　　　３Ｗ■　羊赤血
球ストローマ　　　　　　　１０７ｎｌ■　アジ化ナト
リウム　　　　　　　　　１ｇ■　０，１５Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ７，４００ｒｎＩ ■　生理食塩水　　　　　　　　　　８６（Ｗ（２）試
薬等 （２−１）タンニン酸　ナカライテスク■から購入した
。

（２−１）固定羊血清　羊赤血球をグルタルアルデヒド
固定処理したものを用いた。

（２−３）市販ＴＰＨＡキット： セロディアＴＰ　（富士レビオ）およびセロクリットＴ
Ｐ　（化血研）を使用した。

（３）検　体 （３−１）梅毒陽性検体：十分治療した後期梅毒検体で
Ｉｇ−Ｇ抗体が多く含まれる３検体（Ｃｚ、Ｇ１、Ｇ、
）および感染後３〜５週間の初期梅毒でＩｇ−Ｇ抗体か
あまり産生されておらず、Ｉ　ｇ−Ｍ抗体が多く産生さ
れている３検体（Ｍ、、Ｍ２、Ｍｌ）を用いた。

（３−２）梅毒陰性検体：３検体（Ｎ、、Ｎ、、Ｎ、）
を用いた。いずれも市販のＴＰＨＡ試験で非特異反応の
見られた検体で、ＰＴＡ−ＡＢＳで梅毒陰性であること
が確認された検体である。

（３−３）抗家兎組織抗血清：正常家兎翠丸をミンチ後
、１％ＯＧで可溶化したものを山羊に免疫して得た。

（３−４）抗Ｒｅ１ｔｅｒ株抗血清：　Ｔｒｅｐｏｎｅ
ｍａ　ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓｂｉｏｔｙｐｅ　Ｒｅ１ｔ
ｅｒの菌体成分を１％ＯＧで可溶化したものを山羊に免
疫して得た。

（４）ＴＰ抗原 実施例１て得られた抽出抗原、粗精製抗原、ＨＡｐ精製
抗原および実施例２で得られたＡＣ精製抗原を用いた。

各抗原液の抗原活性、蛋白濃度は第７表に示したとおり
である。

２）方　法 （１）血球調製法 ■　固定羊血球を生理食塩水で７００Ｘｇで５分間の遠
心洗浄を４回行ってから、生理食塩水で固形分６％にな
るように懸濁した。タンニン酸を生理食塩水に溶解し、
これを上記血球懸濁液に加え、攪拌した。

■　攪拌終了後、生理食塩水で２回、Ｍｃｌで１回遠心
洗浄し、ＭｃＩに固形分６％となるように懸濁し、直ち
に抗原感作に使用した。

■　ＴＰ抗原液（抽出抗原液、粗精製抗原液、ＨＡｐ精
製抗原液）をあらかじめ１％ＯＧ／ＭｃＩで透析した。

この抗原液を第８表のように調製し、抗原感作液とした
。上記■の血球懸濁液と抗原感作液を等量混合し、２５
℃１時間攪拌した。

感作液入を抗原活性を１ｏｏｔｉｔｅｒ／ｍｊになるよ
うに調製したものである。感作液Ｂは、蛋白量を１０μ
ｇ／ｍｌになるように調製したものである。

■　感作血球を２回生理食塩水で洗浄後、ＰＨＡ緩衝液
中に血球固形分０゜２％となるように懸濁した。

常温で３時間放置後、 アッセイに用いた。

（本質以下余白） （２）ＴＰＨＡアッセイ方法 ■　ＰＨＡ緩衝液をマイクロタイタープレートの手前側
のウェルに１００μｐずつ、それ以外のウェルに２５μ
ｌずつ分注した。

■　各検体を手前側のウェルに２５μβずつ分注し、こ
れをプレート上で倍々希釈した。一方、手前側のウェル
から希釈検体液を７５μβ取り出すことにより、手前側
のウェルに残った希釈検体液か２５μｌになるようにし
た。

■（１）で作製した血球液をよく振って均等な浮遊液と
したものを各ウェルに７５μｌずつ滴下した。

■　プレートの角を軽（ポルチックミキサーに当てて十
分に混合してから、蒸発を防ぐために空のプレートで蓋
をし、振動を与えないように注意して常温に静置した。

２時間後判定した。

■　白紙の上にプレートを置き、血球凝集像を観察し、
肉眼で判定した。凝集を示した最高の希釈倍数（２０，
４０，８０，、、、）を抗体価とした。

３）結　果 上記の方法によって得られた感作血球を用い、各検体の
血球凝集反応の存無および抗体価を測定し、第９表に示
すように結果を得た。

（本質以下余白） 第９表　本発明のＴＰＨＡの結果 ＋・陽性、　−陰性、　±−疑陽性、 （１）感作ｆ１囚抗原量一定感作 各結果の下の数値は抗体価を表す。

（２）感作液■蛋白量一定感作 注）抗原純度はバイオゲルＨＴＰによる抗原純度（ＨＣ
Ａ−２０ＯＬでの抗原純度）で示した。

注）抗原純度はバイオゲルＨＴＰによる抗原純度ＣＨＣ
八−２０ＯＬでの抗原純度）で示した。

第９表より、抗原純度２５％以下の抽出抗原を担持した
感作血球では総て陰性となる初期梅毒３検体について、
抗原純度２５％以上の抗原（粗精製抗原、ＨＡｐ精製抗
原、ＡＣ精製抗原）を担持した感作血球はいずれも陽性
をしめす。また、市販のＴＰＨＡおよび抽出抗原を担持
した感作血球で非特異的反応の見られた梅毒陰性３検体
ては、純度２５％以上の抗原を担持した感作血球は非特
異反応による凝集反応を示していない。さらに、純度２
５％以上の抗原を担持した感作血球は抗家兎組織抗血清
および抗Ｒｅ１ｔｅｒ株抗血清とは凝集反応を示さなか
った。なお、上記の初期梅毒３検体および梅毒陰性３検
体に対する従来のＴＰＨＡ法、ＲＰＲ法、ガラス板法、
ＰＴＡ−ＡＢＳ法での検査結果を第１０表に示す。

（本質以下余白） ４）結　論 結果から明らかなように、本発明の純度規格を満たす抗
原を担持した血球を用いたＴＰＨＡ法は、従来のＴＰＨ
Ａ法では、検出できなかった初期梅毒が検出可能になり
、また、非特異反応による偽陽性も見られない。

実施例４　ラテックス試薬（全自動分析装置を用いた測
定法） 梅毒トレポネーマ抗原に対する抗体を定量する場合の本
発明の効果を全自動分析装置を用いてラテックス診断試
薬の凝集を測定することにより確認した。特に示さない
限り、実施例１〜３と同一名の試薬及び検体は実施例１
〜３と同様に調製した。

■）試薬および検体の調整 （、１−１）ラテックス：積水化学工業■製の０．４０
０μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％）を用
いた。

（１−２）　ＰＢＳ　ｐＨ７，４ニリン酸１ナトリウム
（２水和物）、リン酸２ナトリウム（２水和物）、塩化
ナトリウムから、０．０２λ（リン酸、０．１５Ｍ塩化
ナトリウムを調整した。０．１％ＮａＮ　ｓを含む。

（１−３）　ＮａＣ１−ＰＢＳ　ｐＨ６，５リン酸１ナ
トＩＪ　ラム（２水和物）、リン酸２ナトリウム（２水
和物）、塩化ナトリウムから、０．０２Ｍリン酸、１．
００Ｍ塩化ナトリウムを調整した。０．１％ＮａＮ　３
を含む。

（１−４）　１００ｍＭ　ＮａＰＢ　ニリン酸水素ナト
リウム（無水）、リン酸２水素ナトリウム（１２水和物
）より１００ｍＭＮａＰＢ　（ｐＨ７，５０）を調整し
た。０．１％ＮａＮｘを含む。

（１−５）１％Ｂ　Ｓ　Ａ　−ＮａＰＢ　：　１００ｍ
Ｍ　ＮａＰＢｉ：　Ｂ　Ｓ　Ａが１９６になるように調
整したもの。

（１−６）５％Ｂ　Ｓ　Ａ　−ＮａＰＢ　：　１００ｍ
Ｍ　ＮａＰＢｆ：　Ｂ　Ｓ　Ａが５％になるように調整
したもの。

（１−７）希釈液＝５％ＢＳＡ−ＮａＰＢにポリエチレ
ングリコール（平均分子量５００，０００　：和光純薬
）を０．２５％（Ｗ／Ｗ）となるように溶解させたもの
。

（１−８）装置：日立７０５０型　全自動分析装置を用
いて測定を行った。

２）方　法 （１）抗原感作液の調製 第７表に示した抗原活性および蛋白濃度の各抗原液を、
ＮａＣ１−ＰＢＳ　、　　１％○Ｇを含む１０ｍＭＫ　
Ｐ　Ｂをそれぞれ第１１表に示した量で混合したものを
抗原感作液とした。感作液囚は抗原活性を２５０ｔｉｔ
ｅｒ／　ｍｌになるように調製したものである。感作液
■は、蛋白量を２５μｇ／ｒｎ（！になるように調製し
たものである。

（本質以下余白） 第１１表　ラテックス試薬化用抗原感作液の組成感作液
（イ）抗原量一定感作 感作液■蛋白量一定感作 （２）梅毒抗原の固定化 固形分１０％のポリスチレンラテックスｌＯＯμｐを４
°Ｃのインキュベーター中でマグネチックスターラーて
攪拌しながら、（１）の梅毒抗原液４００μｌを素早く
混合し、４°Ｃにて１時間攪拌した。

その後１％ＢＳＡを５ｍｌを添加し、４°Ｃにて１．５
時間攪拌した。その後、１５０００ｒｐｍで１時間遠心
分離した。得られた沈澱に、もう−度１％ＢＳＡ−Ｎａ
ＰＢ　５ｍｌ添加し、同様に遠心して沈澱を洗浄した。

この沈澱に１％Ｂ　Ｓ　Ａ　−ＮａＰＢ　５艷添加し、
よく分散して固形分０，２％のラテックス試薬とした。

ラテックス試薬は４°Ｃで保存した。

（３）測定条件 測定条件を以下のように設定した。

試料容量　　２０μｌ　（検体） Ｒ１容量　　５０μｌ　（ラテックス試薬）Ｒ２容量　
３５０μｌ　（希釈液） 波　　長　　５７０　ｎｍ 測定温度　　３７°Ｃ （４）測定方法 測定開始後、８０秒後と３２０秒後との波長５７０ｎｍ
の差をとり、０．　Ｄ、　５７０の変化量とした。

３）結　果 上記の方法によってＴＰ抗原液より調製したラテックス
試薬を用い、各検体との反応をＯ，Ｄ、　５７０での濁
度の変化量として測定したところ、第１２表に示すよう
に結果を得た。

（本質以下余白） 第１２表より、まず初期梅毒３検体は、抗原純度２５％
以下の抽出抗原を用いて調製したラテックス試薬では陽
性と判定するほどの感度を示さないか、抗原純度２５％
以上である粗精製抗原、ＨＡｐ精製抗原、ＡＣ精製抗原
を用いて調製したラテックス試薬はいずれも陽性と判定
するのに十分な感度を示す。特に純度の高いＨＡｐ精製
抗原、ＡＣ精製抗原は感度か大幅に向上している。また
、後期梅毒３検体でも同様な感度の向上か見られる。

梅毒陰性３検体では、本発明の規格を満たす精製抗原を
用いて調製したラテックス試薬は非特異反応による凝集
反応はいずれも見られなかった。

さらに本発明の規格を満たす精製抗原を用いて調整した
ラテックス試薬は抗家兎組織抗血清および抗Ｒｅ１ｔｅ
ｒ株抗血清とは陽性と判定されるような値を示さなかっ
た。

４）結　論 結果から明らかなように、本発明の規格を満たす抗原を
用いることにより、ラテックス凝集反応による検査試薬
の製造が可能である。また、本発明の規格を満たす抗原
を用いたラテックス試薬は初期梅毒の検出が可能であり
、非特異反応による偽陽性が見られない。

〔発明の効果〕

本発明の梅毒検査試薬は、抗原純度が高い抗原を使用し
ているため、後期梅毒と同様に初期梅毒に対しても特異
性が高く、また非特異反応による偽陽性がなく、さらに
試薬の規格も一定のものに管理しやすく、品質のばらつ
きを抑えることができ、梅毒検査試薬として極めて有用
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗梅毒トレポネーマ抗体を検出することにより、梅
   毒を診断する検査試薬における抗原として、梅毒トレポ
   ネーマ菌体由来の抗原含有試料をハイドロキシアパタイ
   トゲルカラムに吸着、溶出させることにより抗原純度の
   検定を行ったときに、以下の式により検定される抗原純
   度が２５％以上である抗原を使用することを特徴とする
   梅毒検査試薬。 式 ｛回収蛋白量／（添加蛋白量×カラム回収率）｝×１０
   ０（％）但し、上記式における添加蛋白量は、あらかじ
   め１％オクチルグルコシドを含有する１０ｍＭリン酸カ
   リウム緩衝液（ｐＨ６．０、以下Ａ液という）でハイド
   ロキシアパタイトゲルカラムを十分に平衡化し、梅毒ト
   レポネーマ菌体由来の抗原含有試料の溶媒をＡ液に交換
   してからカラムに添加したときの抗原含有試料の蛋白量
   であり、回収蛋白量は、該抗原含有試料を添加後、Ａ液
   をカラム容量の３倍以上流し、未吸着の成分が十分洗浄
   された後、溶出用緩衝液（以下Ｂ液という）として１％
   オクチルグルコシドを含む３５０ｍＭリン酸カリウム緩
   衝液（ｐＨ６．０）を用い、Ａ液に対するＢ液の割合を
   ０％〜１００％まで連続的または段階的に変えながら溶
   出をさせたときに、Ｂ液の割合が８％〜４０％の間に回
   収された蛋白量であり、 又、カラム回収率は、一度回収された蛋白質を再度同一
   条件で上記カラムに添加して同一部分のフラクションを
   回収したときの一度目の回収蛋白量に対する二度目の回
   収蛋白量の比率を示す。 ２、抗梅毒トレポネーマ抗体を検出することにより、梅
   毒を診断する検査試薬における抗原として、梅毒トレポ
   ネーマ菌体由来の抗原含有試料を陽イオン交換体カラム
   で処理後、ハイドロキシアパタイトゲルカラムに吸着、
   溶出させることにより抗原純度の検定を行ったときに、
   以下の式により検定される抗原純度が２５％以上である
   抗原を使用することを特徴とする梅毒検査試薬。 式 ｛回収蛋白量／（添加蛋白量×カラム回収率）｝×１０
   ０（％）但し、上記式における添加蛋白量は、あらかじ
   め１％オクチルグルコシドを含有する１０ｍＭリン酸カ
   リウム緩衝液（ｐＨ６．０、以下Ａ液という）で陽イオ
   ン交換体カラムとハイドロキシアパタイトゲルカラムを
   十分に平衡化し、梅毒トレポネーマ菌体由来の抗原含有
   試料の溶媒をＡ液に交換してから陽イオン交換体のカラ
   ムに添加したときの抗原含有試料の蛋白量であり、回収
   蛋白量は該抗原含有試料を該陽イオン交換体カラムに添
   加後、Ａ液を流して素通り分画を得た後、該素通り分画
   をハイドロキシアパタイトゲルカラムに添加し、Ａ液を
   カラム容量の３倍以上流し、未吸着の成分が十分洗浄さ
   れた後、溶出用緩衝液（以下Ｂ液という）として１％オ
   クチルグルコシドを含む３５０ｍＭリン酸カリウム緩衝
   液（ｐＨ６．０）を用い、Ａ液に対するＢ液の割合を０
   ％〜１００％まで連続的または段階的に変えながら溶出
   をさせたときに、Ｂ液の割合が８％〜４０％の間に回収
   された蛋白量であり、又、カラム回収率は、一度回収さ
   れた蛋白質を再度同一条件で上記ハイドロキシアパタイ
   トゲルカラムに添加して同一部分のフラクションを回収
   したときの一度目の回収蛋白量に対する二度目の回収蛋
   白量の比率を示す。