JPH0327298A - 安定化された試薬混合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、少なくとも１つの酵素および錯化剤の塩を含
有する試薬混合物、該試薬混合物の製造方法および分析
測定のための試薬混合物の使用に関する。

（従来の技術） 本発明は、生化学および臨床化学の分野に関するもので
ある。これら両分野では、酵素を含有する試薬混合物が
使用される。すなわち、例えば、酵素学における酵素一
接触反応を行うためおよび研究するために、酵素溶液ま
たは懸濁液が使用される。一般に、このような溶液は貯
蔵容器中に保持されており、必要な場合に、その一部分
を貯蔵容器から取り出す。したがって、これらの溶液は
、比較的長期間安定でなければならない。

臨床化学では、特に、例えば体液の分析測定のために酵
素を含有する試薬混合物を使用する。溶液のほかに、こ
こでは乾燥試薬が広範に使用される。すなわち、測定に
必要な試薬を吸収担体４二にフィルム形態で適用したか
または塗布した試験ストリップは、該試験ストリップが
特に使用し易く、それによって迅速に結果が得られると
いう長所を有している。これらの試薬混合物は、必要な
場合に研究を素早く行うことができるように、貯蔵容器
に保持されるのが好都合である。したがって、試薬が比
較的長期間、貯蔵安定であることが必要である。

重金属イオンか制御し難いレドノクス反応を触媒するの
で、試料中に含まれる酵素の活性は、し，ばしば、該重
金属イオンによってかなり損なわれる。従って、欧州特
許第０．１３０，７０８号公開明細書には、試薬混合物
にエチＥ／ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような錯化
剤を添加することか示唆されている。この方法で、酵素
活性における重金属イオンによるダメージング作用を減
少させることができる。結果、ＥＤＴＡおよびナトリウ
ム塩が使用きれた。

（７かし、ＥＤＴＡまたはその塩の添加によって酵素が
実質的に完全に不活性化され得ることがわかった。実際
に、欧州特許第０，　Ｏ　７　５，　２　９　３号明細
書には、これらの性質を実際に使用するβガラクトシダ
ーゼの制御方法か開示されている。

さらに、既知の酵素含有試薬混合物の貯蔵安定性は、臨
床化学のために充分でないということがわかった。

（発明が解決（２ようとずる課題〉 したがって、特に、上記欠点を示さないが、重金属イオ
ンの有害な作用を防止ｌ２、確実に貯蔵安定性を増大す
る、少なくとも１つの酵素および陽イオンならびに錯化
剤を含有する試薬混合物が必要である。

本発明は、この要求を満足することを目的とするもので
ある。

（課題を解決するための手段） 本発明は、少なくとも１つの酵素と錯化剤または錯化剤
の塩とを含有してなる試薬混合物でおいて、多価の非レ
ドックス活性陽イオンを配合１−たことを特徴とする試
薬混合物を提供するものである。

本発明は、該試薬混合物の製造方法を提供するものでも
あり、分析測定のための該試薬混合物の使用に関するも
のでもある。

本発明の試薬は、個々のまたは混合物の形態の如何なる
種類の酵素をも含有することができる。

本発明の試薬混合物の組成物は、酵素が、重金属イオン
が痕跡漬存在ずるだｌｊであっても該重金属イオンによ
って抑制されるものである場合に特に優れている。本発
明の試薬は、重金属イオンの存在にもかかわらず、酵素
活性が維持されるどいう長所を有している。さらに、こ
れら酵素は、その活性が、ある多価の非レドックス活性
金属陽イオンの存在に依存するものか特に好ましいこと
かわかった。これら陽イオンが酵素に対して有効でない
場合は、該酵素活仕は最適ではない。このような酵素は
知られており、例えば、β一カラク１・／ダーゼ、アミ
ラーゼ、コレステロールエステラーゼ、ルシフェラーゼ
、プロテアーゼのようなヒドロラーゼ、およびＤＮＡ開
裂酵素、またはレドソクス活性酵素か挙げられる。これ
らの酵素の場含、本発明の試薬は、錯化剤の存在下で予
想されることとは反対に酵素活性が全く消失せずに、該
酊素活性が維持されるという長所を有する。

本発明の試薬混合物は、錯化剤または錯化剤の塩を含有
ずる。該錯化剤はｌまたはそれ以−Ｌの妨害（ｄｉｓｔ
．ｕｒｂｉｎｇ）陽イオンと安定な錯体を形或すること
ができる全一この化学化合物であると理解される。

これらの錯化剤は、重金属イオンと錯体を形成すること
ができるものか好ましい。重金属イオンは、特に酵素の
酵素活性を抑制するものであるか、または、別の方法で
、例えば、カラーグラ／ユエーターのような試薬の戊分
と、試薬の別の成分、それらと接触させる試薬の成分、
または周囲の媒質、例えば空気との望ま（７くないレド
ックス反応を触媒ナるため、試薬の測定使用を損なうも
のである。特に妨害イオンは、レドックス活性イオン、
例えばＦｅ”、Ｍｎ”およびＣｏｎである。これらのイ
オンは、試薬の個々の戊分において可溶性の不純物とし
てエントレインすることができる。多くの試薬戊分が性
質によってｊｌｌｌＰ１されるがそれにもかかわらず妨
害イオンを含有していることがわかった：これらは、例
えば、シリカゲルおよび二酸化チタンのような鉱物担体
物質を含む。

前記の錯化剤としては、例えば、多歯（＠ｕｌｔｉ一ｔ
ｏｏｔｈｅｄ）配位子、クリブタンド、クラウンエーテ
ル、ブロダネン（ｐｒｏｄａｎｅｎ）などが挙げられる
。多歯配位子が特に優れており、これらのうちニトリ口
酢酸、特に二ｌ・リロ三酢酸、およびアルキレンジアミ
ン酢酸、特にエチレンジアミン四酢酸（Ｅ１）　Ｔ　Ａ
　）が優れていることがわかった。

錯化剤の陽イオン成分と１，て錯化剤の塩を使用する場
合、妨害陽イオンほど強く錯形成されない全ての陽イオ
ンを使用することができる。陽イオンは、本発明の試薬
の多価の非１ノドソクス活性陽イオンと同じくらい強く
錯形成されるか、または該陽イオンほど強く錯形成され
ないのが好ましい。

多価の非レドノクス活性陽イオンそのものを使用するこ
ともできる。これらの陽イオンのうち、同一または異な
る２またはそれ以土を含有する錯化剤の塩を使用するこ
ともできる。

錯化剤の塩が陽イオン或分として多価の非レドックス活
性悶イオンを含有する場合が好ましい。この場合、本発
明に係る作用を達成するために試薬にこの陽イオンを付
加的に添加する必要はない。

しかし、添加は可能である。

一錯化剤の塩が陽イオン成分とレご多価の非レドックス
活性陽イオンを含有する場合、この陽イオンは、例えば
ハロゲン化物のような壇の形態で、付加的成分として試
薬に添加されなければならない。

本発明の試薬中の錯化剤およびその塩の濃度は、試薬中
の妨害イオンの濃度に依存する。すなわち、該濃度は、
少なくとも、これらのイオンを実質的に完全に錯形戊し
得る（らい高くなければならない。したがって、添加す
る錯化剤の量は、試薬中の妨害イオンの濃度から簡単な
方法で測定することができる。

多価の非レドックス活性陽イオンは、試薬中で酵素の活
性を抑制しない陽イオンである。該陽イオンは、妨害イ
オンほど錯化剤によっ゛Ｃ強く錯形戊されないのが好ま
しい。これら陽イオンのうち、酵素活性のために必要で
あり、該活仕を増大させるものが特に好ましい。二価の
アルカリ土類金属イオンが特に好ましい。特定の酵素の
活性を確実にするのに適切である多価の非レドソクス活
性陽イオンは知られている。β−ガラクト／ダーゼ、ア
ミラーゼ、ルシフェラーゼおよびコレステロールヱステ
ラーゼに関する陽イオンは、Ｍ　ｇ　ｔ　”であり、あ
まり〜般的でない酵素に関しては、（”，　ａ　Ｒ　”
またはＺｎ”を使用することもできる。

「非レドックス活性」なる用語は、レドックス法に依存
する意図されていない方法において対応する陽イオンが
副反応、例えば試薬の別の成分の酸化を触媒しないとい
うことを意味すると理解するのが好ましい。

多価の非レドソクス活性陽イオンの濃度は、妨害イオン
の濃度に依存する。陽イオンのＦｉ　ｆＪｔ　ハ、少な
くとも、妨害イオンと同量である。該ｌｇ度は、錯化剤
の濃度よりも高いかまたは該ｔＲ度ど同一であるのが好
まし《、該ａ度に等しいのが特に好ましい。

いわゆる乾燥試験の場合、例えば、ドイツ連邦共和国特
許出願第Ａ，−２９　１０　１３４号公開明細書に開示
されているように、試験ストリンプ上のフィルム中にお
ける液体試料の成分の分析のために必要な試薬の全てを
混合するのが好都会であることかわかった。

本発明の試薬ａ合物には多くの用徐がある。特に、液体
試料溶液中での分析の検出のために有利な方法で用いる
ことかできる。その場合、検出反応または一連の反応に
必要なイ・１加的物質を含有するのか好ましく、反応開
始直前に該物質を混合する。

酵素および錯化剤を含有する既知の試薬混合物と比較ｊ
７て、本発明の試薬混合物は、望ましくないイオン、例
えば重金属イオンによる妨害が排除ざれるか、それにも
かかわらず、錯化剤の添加によって酵素活性か破壊され
ないという長所を有している。このことは、例えば、困
難な方法によって試薬の戊分から重金属イオンを除去す
る必要はないという結果も有ず６。実際、あまり良く純
化されていない試薬戊分を使用することができる。

これは、鉱物および酵素の場合において、特に優れてい
る点である。

本発明の好ましい態様としてはコレステロールの検出用
試薬をフィルム形態で試験ストリノブに適用することで
ある。該試薬は反応を行うのに必要な物質、すなわち色
指示薬（ｃｏｌｏｕｒ　ｉｎｄｉｅａｔ．ｏｒ）として
テトラメチルベンンシン、酵素としてコレステロールオ
キシダーゼ、コレステロールエスデラーゼおよびベルオ
キ／ダーゼ、およびｐＨ緩衝液、ならびに添加物である
ブロピオン酸ポリビニル、ケイソウ土および没食子酸（
カラーグラデュエーションのため）を含有する。

本発明は、試薬混合物の製造方法を提供するものでちあ
る。このために、各成分、すなわち、酵素、多価の非レ
ドソクス活性陽イオンを含有する錯化剤、および所望に
より添加剤を一績に？ＬＪ合ｌ２、所望により、適切な
形態にする。陽イオンを含有する錯化剤の代わりに、錯
化剤またはその塩を多価の非１／ドックス活性１場イオ
ンの塩と一緒に使用することができる。

試薬混合物か固形担体上でフィルム形態に製造される場
合、まず、試薬／ｆｊ．６物の１茂分の全ての竪濁液ま
たは溶液を調製し、その後これを担体上で平らにならし
、次いで乾燥させることが好都合であることがわかった
。試薬マス（ｍａｓｓ）中の錯化剤または陽イオンの，
・虚度は、好ましくは試薬マス１００ｆＩ当たり５０−
５００１１！Ｉｉ＋であるか、または通常のケイソウ土
をフィルムオープナー（ｒｉｌ＋ａｏｐｅｎｅｒ）とし
て使用する場合はケイソウ土１００曾当たり２５０〜２
５００ＩＩ！９である。

本発明の試薬混合物は、非常に安定であるという長所を
＃ｒ　Ｌ．−ｒいる。例えば、コｌ／ステロールエステ
ラーゼの活性および没食子酸の如きレドックス感受性付
加物質の濃度は、コレステロール検出用オーブンフィル
ム（ｏｐｅｎ　ｆｉｌｍ）９７造のための液体試薬マス
中で特にほとんど減少しないか、既知の試薬混合物の場
含は、酵素活性が破壊されるか、もしくは段食子酸の濃
度が減少するか、または両方の結果がみられる。

混合している間、適切な形態にすることができるまで、
比較的長時間、試薬混合物を液体状態に１１６持しなけ
ればならないので、試薬混合物の安定性は非常に１Ｒ要
である。

本発明は、担体物質上にフィルムとして本発明の試薬を
含有する試験スＩ・り，ブを提供するものでもある。

本発明は、分析測定のための本発明の試薬混金物の使用
に関するものでもある。このために、付加的に必要な試
薬と混音することができる試薬混合物を分析する試料と
接触させ、生起した測定反応を観察する。例えば、コレ
ステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーセ
、Ｍｇ−ＥＤＴＡ、没食子酸、ケイソウーし、ベルオキ
／ターゼおよびテ１・ラメチルベンジジンならびに別の
ｆｆ用な添加剤を含有する試薬混合物は、＋Ｔｎ液中の
コレステロールのハ１リ定に特に浸オ１７いるこどがわ
かった。

（実施例） 裏施徊−土： 本発明の試薬混合物の調製 ドイツ連邦共和国↑礼１：出願第Ａ−２９１０１３４号
公開明細書の記載と同様の方注で以下の成分を混合した Ｐｉｅｈｌｅｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ＩＪＳＡＪ
２０９ リン酸塩緩衝液（ｐｌｌ６．　４） 蒸留水 ２０９ ｌｏｇ 以下、得られたマスをマス■として用いた。

失麺牲２−： 反応混含物の戊分の濃度の比較 ａ）マス■ Ｋ　ｔ　Ｍ　ｇ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを等価量のＮ　ａｔ　
Ｈ　ｔ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（９０＋ＬｉＩ，２．４ミリ
ミモル、メルク・アクチェン・ゲゼルシャフト、タルム
スタット、ＦＲＧ）に代えた以外は実施例１と同様に、
マスをＪ．１１１た。

ｂ）マス■ Ｋ　ｔＭｇＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを添加しなかった以外は実施
例１と同様に、マスを調製した。

マスＩ１■および■において、没食子酸およびテトラメ
チルベンジジン（ＴＭＢ）の濃度およひコレステロール
エステラーゼの活性度をモニターした。

酵素の測定は、測光試験法［ベルグメイヤー（Ｂ　ｅｒ
ｇｉｉｅｔｅｒ）、１９８３、メソノズ・オブ・エンザ
イマティック・アナリシス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅ
ｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｉｓ）、第１６８頁〜第
１７０頁および第２６７頁〜第２６８頁参照］によって
行われた。

ＴＭＢ／没食子酸の測定は、パーティシル（Ｐａｒｔｉ
ｓｉｌ）　ＯＤＳ　　３／５　　カラム［ワッ１・マン
・リミテノド（Ｗｈａｔｍａｒ＋　Ｉ．ｔｄ．　）、ス
プリングフィールド、ＵＫ］−上でＨ　ｌ）　Ｉ、Ｃに
よってクロマトグラフィー的に行われた。

個々の製剤変形物Ｉ〜■における戎分物質の濃度の経時
変化を下記第１表〜第３表および添付した第１図〜第３
図に示す。

結果： 製剤の全てにおいて、ＴＭＢはＯ〜４時間の試料採取時
間に有意な動力学を示さなかった。

第３表および第３図は、没食子酸かやかで破壊されるこ
とを示している。

特に粗製の物質であるセラトム（Ｃ　ｅｌａｔｏｍ）か
らの痕跡量の金属イオンは、それらが没食子酸と交換反
応する前に錯形戊されるので、Ｎａ２Ｈ，ＥＤＴＡの添
加によって、没食子酸の安定住の改善を達成することが
できる。

しかし、ＮａｔＨ　！Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ（７Ｍ！用は、コ
レステロールエステラーゼ（ＣＨＥ）のｌ１Ｚ性の経時
的な減少によって見ることができるマグネシウム依ａ性
Ｃ　Ｈ　Ｅの独特のダメージングを含んでいる（マス■
、第２表および第２図）。

没食子酸およびＣ　｝４　Ｅの安定性は、まず本発明に
よるＭｇ２゜イオン（Ｋ２ＭｇＥＤＴＡ，またはＮａ＝
Ｈ　，　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを有するＭ　ｇＲ−塩、例えば
塩化マグネシウム：マス■、第ｌ表および第ｌ図）の同
時添加の場含に得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例ｌの試薬混含物中のコレステロールエ
ステラーゼの濃度（◇）、テトラメチルベンジジンの濃
度（口）および没食子酸の濃度（＋）を示すグラフであ
る。 第２図は、実施例２ａの試薬混合物中のコレステロール
エステラーゼの濃度（◇）、テ１・ラメチルベンジジン
の濃度（口）および没食子酸の濃度（＋）を示すグラフ
である。 第３図は、実施例２ｂの試薬混合物中のコレステロール
エステラーゼの濃度（◇）、テ１・ラメチルベンジジン
の濃度（口）および没食子酸の濃度（＋）を示すグラフ
である。 また、該第１図〜第３図において、各グラフは、試料採
取時間（時）（横座標）に対する最川の値（ｌ００％）
に関する成分の７Ｒ度（縦座標）を示す。 ｎ　許出願人　ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシャ
フｌ・・ミノ！・・ベシュレンクテル・ハフツング 代理　人　弁理士　青　山　葆　はかｌ名第１図 第２図 訊討採本時間（時　） 試尉採氷時間（吟）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１つの酵素と錯化剤または錯化剤の塩
   とを含有してなる試薬混合物において、多価の非レドッ
   クス活性陽イオンを配合したことを特徴とする試薬混合
   物。
2. （２）結合剤、膨潤剤およびケイソウ土を含有する請求
   項（１）記載の試薬混合物。
3. （３）陽イオンがアルカリ土類金属イオンである請求項
   （１）または（２）記載の試薬混合物。
4. （４）陽イオンがＭｇ＾２＾＋またはＣａ＾２＾＋であ
   る請求項（１）〜（３）のいずれか１つに記載の試薬混
   合物。
5. （５）エチレンジアミン四酢酸およびＭｇ＾２＾＋を含
   有する請求項（１）〜（４）のいずれか１つに記載の試
   薬混合物。
6. （６）酵素と、多価の非レドックス活性陽イオンを含有
   する錯化剤の塩、または錯化剤もしくはその塩および多
   価の非レドックス活性陽イオンの塩、ならびに所望によ
   り慣用の添加剤とを混合することを特徴とする請求項（
   １）記載の試薬混合物の製造方法。
7. （７）試薬混合物が分析測定に必要な試薬の全てを含有
   しており、その少なくとも１つの試薬が酵素であり、さ
   らに、多価の非レドックス活性陽イオンを含有する錯化
   剤の塩、または錯化剤もしくはその塩および多価の非レ
   ドックス活性陽イオンの塩である、分析測定のための試
   薬混合物の使用。
8. （８）固形担体に塗布されたフィルム形態で請求項（１
   ）〜（５）のいずれか１つに記載の試薬混合物を含有す
   る試料分析測定用試験ストリップ。