JPS6274285A - モノメチルアミン酸化酵素の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、モノメチルアミン酸化酵素の安定化法に関す
る。

〔従来の技術〕

従来、アミン酸化酵素につし・では、アスペルギル７、
・ニガー、ベニ／リウム・クリソゲナム、モナスカス・
アンカ、フサリウム・プルビゲナムに属する菌株がアミ
ン酸化酵素を生産することが報告されている〔アグリカ
ルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、　Ｖｏｌ、２９　。

Ｎへ２．Ｐ、１１７〜１２３．１９６５）。

しかしながら、これら既知のアミン酸化酵素は、いずれ
もモノメチルアミンには、作用しないものであった。

そこで先に本発明者等は、種々検討した結果、バチルス
属に属する菌株を培地に培養し、該培養物よりモノメチ
ルアミンに対する基質特異性が極めて高いモノメチルア
ミン酸化酵素（以下、Ｍ、Ｍ。

Ａ、０．と略称する。）が得られることを知り、特許出
願を行なった（特公昭６０−３３４７３号公報）。

Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，は、モノメチルアミンを分解してホル
ムアルデヒド、アンモニア及び過酸化水素を生成させる
酵素であり、該酵素は、モノメチルアミンの定量分析等
に適用することができるものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，は、極めて不安定
で保存中に酵素活性が急速に失活するのが現状である。

本発明は、Ｍ、Ｍ、Ａ、０．０安定化法を提供するとい
う問題点を解決したものである。

〔問題截を解決するための手段〕

そこで、本発明者等は、上記問題点を解消すべく種々検
討し、た結果、Ｍ、Ｍ、Ａ、０．０含有液に、糖類、重
金属塩類、アルカリ金属塩類、アルカリ土類金属塩類、
アミノ酸類、何機酸塩類、グアニジノ化合物及びキレー
ト剤より選ばれた１種以上を添加することンこより、上
記化合物無添加の場合と比較して該酵素活性は、著しく
安定化すること、殊に長期間保存を行なったのちでも、
著しく安定である等の知見を得、本発明を完成した。

すなわち本発明は、モノメチルアミン酸化酵素の含首液
に、糖類、重金属塩類、アルカリ金属塩類、アルカリ土
類金属塩類、アミノ酸類、有機酸塩類、グアニジノ化合
物及びキレート剤より選ばれた１種以上を添加すること
を特徴とするモノメチルアミン酸化酵素の安定化法であ
る。

以下、本発明について詳細ンこ１説明する。

本発明において用いられるＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，は、如何な
る起源のものでもより・が、例えば、バチルス属等の微
生物により生産されるＭ、Ｍ、Ａ、０．を使用する場合
は、該Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，生産微生物を培養して得られる
Ｍ、Ｍ、Ａ、○、含有培養物、該培養物を常法により抽
出して得た粗酵素、あるいは該酵素を常法により精製し
て得られる精製酵素等が好適に用し・ら汎る。

Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，生産微生物の具体例としては、例えば
、バチルス属に属するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　
ｓｐ。

Ｎ−１０４（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５９）が挙げられる。

この菌株は、本発明者等が千葉県野田市の畑の土壌より
新たに検索して得た菌株でその菌学的性質は、以下に示
すとおりである。

ａ　　形　　態 ■　細胞も大きさ及び形：１．５〜２×３〜５μｍの短
桿菌。

■　細胞の多形性の有無：無し。

■　運動性の有無：周俊毛を有し、運動性有り。

■　胞子の有無：有り。

■　ダラム染色性：陽性。

ｂ　各培地における生育状態。

■　肉汁寒天平板培養 ３０゛Ｃ１４８時間の培養で、直径０．５〜１朋の円形
コロニー。表面は平滑で黄色を呈し光沢がある。

■　肉汁寒天斜面培養 ３０°Ｃ１４８時間の培養で、糸状で、生育は弱（・。

表面は平滑で黄色を呈し、光沢がある。

■　肉汁液体培養 ３０°Ｃ１４８時間の静置培養でわずかに濁りを生ずる
。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０°Ｃ１４２日間の静［ｎ培養でゆっくりとゼラチン
を液化。

■　リドマスミルク培養 ３０°Ｃ１１４日間の静置培養で変化なし。

Ｃ生理的性質 ■　硝酸塩の還元：弱いながら還元。

■　脱窒反応：陽性、ガスの生成なし。

■　ＭＲテスト：陰性。

■　ｖｐテスト：陰性。

■　インドールの生成：生成しなし・。

■　硫化水素の生成：生成しない。

■　デンプンの加水分解二弱いながら分解する。

■　クエン酸の利用：利用する。

■　無機窒素源：利用しない。。

■　色素の生成：生成しない。

０　ウレアーゼ：陽性。

■　オキンダーゼ：陰性。

０　カタラーゼ：陽性。

０　生育の範囲： 温度；　１５〜４４　’Ｃ。

ｐＨ；　５〜９．５゜ ■　酸素に対する態度：好気性。

＠　０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法）：陰
性。

■　炭素源の利用：フラクトースより酸の生成０ ■　メタノールの資化性を有する。

以上の生理化学的性質をパージエイズ・マニーアル・オ
ブーディターミイネイティブ帝バクテリオロジー、第８
版によって分類すれば、本漬は芽胞子を形成すること、
桿菌であること、好気性菌であること、カタラーゼ生産
能を有すること、及びダラム陽性菌であることからバチ
ルス属に属する菌であると判定した。そして、さらに本
漬を既知バチルス属に属する菌と比較すると、細胞の大
きさが非常に大きい（１，５〜２μｍ×３〜５μｍ）こ
とからバチルス・セレウス、同アンスランス、同チュー
リンジエン／ス、同メガテリウムに近似しているが、こ
れらの菌と比較すると、本漬はグルコースから酸を生成
しないこと、メタ・′−ル資化性を有することが相違す
るので、バチルス属に属する新種であると認定した。

本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条
寄第５９号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−５９）として寄託されて
いる。

次に、本漬の培養方法及び条件につり・で述べる。

Ｍ、Ｍ、Ａ、０．生産のための微生物の培養方法及び条
件には本発明の目的を特に阻害しない限りにおし・て制
約されない。すなわち、バチルス属に属するＭ、Ｍ、Ａ
、Ｏ，生産菌の生育及びＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，の生産が可能
な環境をケーえる培養方法及び培養条件が採用され得る
。

なおバチルスｓｐ、　Ｎ　−１０４の野生株を用いた場
合、Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，の生産は、固体培養よりも液体培
養法において有利に行なわれることが判明してし・る。

しかしながら本漬に菌株改良技術を施せば、固体培養に
適した菌株の造成も可能である。

液体培養法においては、本漬が資化可能な種々の炭素源
、窒素源及び微量成分の選択、配合が考えられるが、モ
ノメチルアミン塩酸塩を０．０１〜２％添加すると、Ｍ
、Ｍ、Ａ、Ｏ，の生産量が飛躍的に増大する。上記炭素
源としてはグルマース、グリセリン、マルトース、可溶
性澱粉、エタノール等が挙げられ、窒素源としては各種
アミノ酸、ペプトン、犬豆扮、各種蛋白加水分解物、コ
ーンステイープリカー、肉エキス、酵母エキス、硝酸ナ
トリウム等が挙げられ、また微量成分としては各種のナ
トリウム塩、カリウム塩、マンガン塩、マグネ／ラム塩
、カルシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、リン酸塩、硫酸塩等が
挙げられる。

培地の具体例としては、例えばグルコース１％、酵母エ
キス２％、リン酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム０．１％、硫酸第１　鉄０．０１％、塩化マンガン０
．０１％を含む培地（ｐＨ７，２）　、モノメチルアミ
ン塩酸ｍ０．１％、グルコース１％、酵母エキス１％、
リン酸１力！Ｊ　Ｏ，１％、硫酸マグネシウム０．０５
％、硫酸第１鉄０．０１％、塩化マンガン０．０１％を
含む培地、代用肉汁培地（肉エキス１％、ポリペプトン
１％、塩化左トリウム０．５％）、麦芽汁培地（麦芽汁
２％、グルコース２％、ペプトン０．１％）、サブロー
培地（マルトース４％、ペプトン１％）　、’ＹｐＳｓ
培池（可培地澱粉１．５％、酵ＩＯエキス０．４％、リ
ン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７　水塩
ｏ、ｏ　５％）が挙げられるが、これらの培地を用いた
好気的条件下における培養によりＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，を生
産することが出来る。いずれの培地を用いる場合てあっ
ても、培養は十分な酸素供給下に行なうのが好ましく、
この目的のための振盪培養法、通気撹拌培養法が採用さ
れる。

培養条件は通常温度２０〜３５°Ｃ，ｐＨ６〜８で培養
期間が１０時間〜１週間である。

固体培養法においては、市販のフスマに対重量比６０〜
８０％散水して調製したいわゆるフスマ培地、あるいは
これらに本漬が資化可能な炭素源、窒素源、微量成分を
適宜に添加した培地、これらを適宜な配合、大きさ、形
状に造粒成型した培地などを固体培地として用いる。

培養条件は、通常温度は２０〜３５°Ｃ，ｐＨ６〜８で
培養日数が１〜１０日間である。

上記のようにして、Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，生産菌の培養によ
りＭ、Ｍ、Ａ、０．を生産することが出来る。

該培養物からＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，を採取するには、直接、
液体培養濾液あるいは固体培養物の水抽出液からＭ、Ｍ
、Ａ、０．を採取してもよいが、本酵素は菌体外に分泌
されにくいので、培養物から菌体な集め、適当な緩衝液
に懸濁後、超音波処理、トリトンＸ−１００などの界面
活性剤処理、機械的磨砕あるいはリゾチームなどの溶菌
酵素によって菌体を破壊し、菌体内のＭ、Ｍ、Ａ、０．
を効率良く採取することができる。

得られた粗酵素液に、必要シこよりプロタミン、塩化マ
ンガン、エチルイミンポリマー等を添加して該粗酵素液
から核酸を沈澱除去するか、またはヌクレアーゼを添加
して該粗酵素液から核酸を分解除去したのち、公知の方
法、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、食塩
などの塩類を用いる塩析法、アセトン類、エタノール類
などを用いる有機溶媒沈澱法、トヨパールＨＷ−５５Ｓ
（東洋曹達）、セファデックスＧ２００、セファローズ
６Ｂ（スウェーデン国ファルマシア製）、バイオゲルＰ
３００　（米国バイオランド製）などを用（・るゲル濾
過クロマトグラフィー法、オメガーアミノヘキンル・ア
ガロース（マイルズ・ラボラトリ製）を用（・る親和ク
ロマトグラフィー法、ハイドロオキシアバタイド（米国
バイオラッド製）ヲ用（・る吸着クロマトグラフィー法
、ジエチル・アミノエチルセファデックス（スウェーデ
ン国ファルマンア製）、ジエチルアミノエチルセルロー
ス、トリエチルアミノセルロース（米国バイオラッド製
）などのイオン交換体を用いるカラムクロマトグラフィ
ー法、アンホライン（スウェーデン国エルケービー製）
などを用いる等電点分画法、アセテート膜、澱粉、アク
リルアマイドゲルなどを用いる電気泳動法、透析法、各
種膜による分画法その他等電点沈澱法などの個々の手段
またはこれらの適当な組合せを適宜利用することンこよ
って本酵素を精製し、電気泳動的に単一なＭ、Ｍ。

Ａ、０．の精製標品を得ることができる。

次に、Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，を含有せしめる溶液としては、
水、緩衝液等Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，を失活させない溶媒の溶
液であれば如何なるものでも使用することができる。

本発明ｔこおいては、Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，の含有液に、糖
類、重金属塩類、アルカリ金属塩類、アルカリ土類金属
塩類、アミノ酸類、有機酸類、グアニジノ化合物及びキ
レート剤より選ばれた１種以上を、夫々単独に、あるい
は組合せて添加、溶解し、均一化させるのである。

上記した糖類としては、グルコース、マルトース、イノ
ジノトール、ラクトース、サッカロース及びツルピット
ール等が挙げられ、重金属塩類としては、マンガン、鉄
、クロム、銅等の塩化物、アルカリ金属塩類としては、
リチウム、カリウム、ナトリウム等の塩化物、アルカリ
土類金属塩類としては、カルシウム、マグネシウム、バ
リウム、ストロンチウム等の塩化物、アミノ酸類として
は、アルギニン塩酸塩、グルタミン酸ナトリウム、アス
パラギン酸ナトリウム、グリシン、有機酸塩としては、
クエン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、コハク酸ナ
トリウム、α−ケトゲルタール酸ナトリウム、グアニジ
ノ化合物としては、グアニジン塩酸塩、グアニジノ酢酸
、キレート剤としでは、エチレンジアミノ４酢酸−２Ｎ
ａ　Ｓが挙げられる。

そして、上記添加物の添加量としては、糖類の場合０．
１〜１０％　（Ｗ／Ｖ）、重金属塩類の場合１〜３０ｍ
Ｍ、アルカリ金属塩類の場合］、〜３０　ｍＭ　ｚアル
カリ土類金属塩類の場合１〜３０酬、アミノ酸類の場合
０．１〜１０％　（Ｗ／Ｖ）、有機酸塩の場合０．１〜
１０％　（Ｗ／Ｖ）、グアニジノ化合物の場合０．１〜
１０％　（Ｗ／ｖ）、キレート剤の場合０．１〜１０　
ｍＭ程度添加するのが好ましい。

また、上記添加物を添加する際のＭ、Ｍ、Ａ、０．含有
液のｐＨ値は、Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，の安定なｐＨ範囲（例
えば、５．５〜９．５のｐＨ範囲）をこあれば良く、前
記溶液のｐＨ調整が必要である場合しこは適宜な手段に
より安定なｐＨ′ｇｌ囲に調整する。

上述した如く、Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ，含体液に、糖類、重金
属塩類、アルカリ金属塩類、アルカリ土類金属塩類、ア
ミノ酸類、有機酸類、グアニジノ化合物及びキレート剤
等より選ばれた１種以上のものを添加すると、安定なＭ
、Ｍ、Ａ、Ｏ，含有溶液が得られるのであるが、このよ
うにして得たＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，含有液をさらに凍結乾燥
、真空乾燥等通常の乾燥手段により乾燥すれば、安定化
されたＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，粉末が得られる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、比較的簡易な操作によりＭ−Ｍ。

Ａ、Ｏ，の失活を著しく防止することができるので、本
発明は産業上極めて有用である。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

実施例１ モノメチルアミン塩酸塩０．１％（Ｗ／Ｖ）、グルコー
ス１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）　、リン
酸２カリウム０．１％　（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム
０．０５％　（Ｗ／Ｖ）　、硫酸第１鉄０．０１％（Ｗ
／Ｖ）、塩化マンガン０．０１％（Ｗ／Ｖ）及び水から
なる培地（ｐＨ７，２）　２　ｌを撹拌式小型培養装置
（いわしや社製）の培養槽に入れて高圧滅菌したものに
、バチルスｓｐ、Ｎ−１０４（微工研条寄第５９号ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−５９）の保存スラントに滅菌された生理的
食塩水を加えて得た菌体懸濁液２０ゴを接種し、温度３
０°Ｃで４８時間通気撹拌深部培養を行なった。

このようにして得た培養液を常法により遠心分離して得
た湿潤菌体を、２％　（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ−１００を
含有する０、０１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　
４００　ｍｌに懸濁し、温度３０°Ｃで１時間放置して
溶菌した。

次いで、沈澱部を常法により遠心分＃磯により除去して
、上清（粗酵素液）を得、これに常法により硫酸アンモ
ニウムを０．５飽和量添加し、塩析して生成した沈澱区
分を採取し、これを０．０１モルのリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に溶解したものを上記と同一の緩衝液で透析脱
塩してＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，液１８０＋＋ｒ／（酵素活性１
．３８単位／　ｒｎｌ　）を得、更に、酵素蛋白質濃度
が、１．０％（Ｗ／Ｖ）となる如く常法により限外濾過
膜を用いて濃縮されたＭ、Ｍ。

Ａ、０．液を得た。

上記の如くして得られたＭ、Ｍ、Ａ、Ｏ，液５　ｍｌず
つ仝こ、夫々下表に示す添加物を、添加、溶解したもの
を、常法により凍結乾燥して酵素粉末を得た。

（本発明） 得られた酵素粉末を、夫々褐色デンケーター内で温度３
７°Ｃで３０日間保持したのちの残存酵素活性は、下記
ンこ示すとおりであった。

なお、対照は、上記本発明調整法のうち添加物は無添加
である以外は、全く同様に調整したものである。

残存酵素活性は、下記に示す如く測定したものである。

基質のモノメチルアミン塩酸塩を０．１ＭのＫＨ２ＰＯ
４Ｎａ２Ｂ　ａ　Ｏ７緩衝液（ｐＨ７，０）中に、溶解
して基質濃度を１　ｍＭに調整する。該基質溶液１．０
ｍｌに」二記緩衝液で希釈した酵素液０．１ｍｌを混和
し、温度３０°Ｃで１０分間反応させたのち、５　Ｎ　
−ＫＯＨ水溶液１　ｍｌを添加し酵素反応を停止する。

このような酵素反応によりモノメチルアミンは、酸化分
解され、該酵素反応停止液には、ホルムアルデヒド、ア
ンモニア及び過酸化水素が生成する。

次いで、酵素反応停止液に０．５％（Ｗ／Ｖ）の４−ア
ミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１・２・４−
トリアゾールの０．５　Ｎ　−ＭＣＩ水溶液を１　ｍｌ
添加し、温度３０°Ｃで１５分間反応させたのち、これ
ｔこ０．７５％（Ｗ／Ｖ）　ＫＩＯ３の０．２１’Ｊ−
ＫＯＨ水溶液を１　ｍｌ添加し、充分に撹拌して得られ
た発色液を透明セルに入れ、５５０　ｎｍでの吸収を測
定し、前記ホルムアルデヒドを定量した。

このような測定条件で、１分間にモノメチルアミン塩酸
塩し、１マイクロモル（μｍｏｌ　）のホルムアルデヒ
ドを生成する酵素量を１単位として、活性を表示した。

上表より明らかな如く、本発明は、対照ンこ比し、安定
化効果（・こお（・て、著しく優れていることかが１す
る。

実施例２ 実施例１と全く同様にして調製したＭ、Ｍ、Ａ、０．含
有液を、０．１Ｍベロナール緩衝液（ｐＨ９，０）を用
いて透析したのち、酵素蛋白濃度が、１．０％（Ｗ／Ｖ
）となる如く、常法により限外濾過膜を用いて濃縮した
。

上記酵素液５　ｍｔに、エチレンジアミン４酢酸−２Ｎ
ａを１０’−３Ｍ濃度となる如く添加、溶解し、こレヲ
温度５０°Ｃで２０分間加熱処理したのち、残存酵素活
性を測定したところ、該活性は、９６％であり、また、
６０分間処理したのちの該活性は、７０％であった。

なお、対照は、前記エチレンジアミン４酢酸−２Ｎａを
全く添加しないほかは、本発明と全く同様に調製したも
のであり、その残存酵素活性は、２０分間処理したのち
では、５０％であり、６０′／）間処理したのちでは、
２４％であった。

以上の如く、本発明は、対照に比し、Ｍ、Ｍ、Ａ、Ｏ。

の失活を防止し、安定化させる優れた効果を有すること
が判る。

実施例３ 実施例１に記載したと全く同様にして調製したＭ、Ｍ、
Ａ、０．含有液５ｍｔ＆こ、サッカロース０．５％（Ｗ
／Ｖ）を添加、溶解したのち、これを常法により凍結乾
燥して本酵素粉末を得た。

得られた酵素粉末の残存活性は、１００％であり、また
、本酵素粉末を４°Ｃで１年６ケ月間保存しても全く安
定であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）モノメチルアミン酸化酵素の含有液に、糖類、重
   金属塩類、アルカリ金属塩類、アルカリ土類金属塩類、
   アミノ酸類、有機酸塩類、グアニジノ化合物及びキレー
   ト剤より選ばれた１種以上を添加することを特徴とする
   モノメチルアミン酸化酵素の安定化法。