JPH03279860A - 検査方法及び検査試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、抗原抗体反応を利用したタンパク質、ペプ
チド、ハプテンの検査方法及びそれに用いられる検査試
薬に関する。

［従来の技術］ 従来より抗原抗体反応を利用したタンパク質、ハプテン
（不完全抗原）の検出方法として、蛍光イムノアッセイ
、発光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ等が知ら
れている。例えば蛍光イムノアッセイは図に示すように
予め抗体分子１のＦＣ部（抗原と結合しない部分）にフ
ルオレッセイン、イソチオシアネートなどの蛍光色素２
を結合させておく。この抗体と所定のタンパク質あるい
はハプテンを反応させた後、抗体と結合した抗原３を必
要に応じＢ／Ｆ分離（結合分子と遊離分子の分離）を行
い、結合分子あるいは遊離分子の蛍光測定を行うもので
ある。

一方、ラジオイムノアッセイは１２５■、８２Ｐ１８Ｈ
等の放射性同位体でラベルした抗原あるいは抗体を用い
て抗体あるいは抗原の量を測定するもので、血中ホルモ
ン量の定量など極めて微量の物質の定量に用いられる。

［発明が解決しようとする課題］ ところで、このような従来のタンパク質等の検出方法に
おいては、特定の被検物質に対してこれと特異的に反応
する特定の抗体のみを含む試薬が用いられていた。従っ
て多種類のタンパク質、ペプチドあるいはハプテンを含
有する検体中の各被検物質を検出する場合、検査項目数
に対応する数のサンプルを用意する必要があり、サンプ
ルあるいは抗原量が極めて少ない場合には検査が困難で
あった。又、検出操作も各検査項目毎に行なわなければ
ならず、非常に手間がかかった。

この発明は上記従来の検出方法の欠点を解消し、−回の
操作で多種類のタンパク質、ペプチドあるいはハプテン
等の被検物質を検出することが可能な検査方法および検
査試薬を提供せんとするものである。

［課題を解決するための手段］ このような目的を達成する本発明の検査方法は、特定の
抗原、ハプテン等の被検物質にそれぞれ特異的に反応す
る２種以上の抗体であって、各々識別可能な標識でラベ
ルされているものを、検体と接触させて検体中に含まれ
る特定の被検物質と結合させて、抗体と結合した特定の
被検物質の各々を標識で識別するものであり、特に標識
は、放射線種の異なる２種以上の放射性同位元素、極大
吸収波長の異なる色素、蛍光極大波長の異なる蛍光色素
、極大発光波長の異なる物質又はこれらの組合せである
。

ここで、本発明の検査方法の被検物質としては、ホルモ
ン類、酵素類、腫瘍マーカー類、ウィルス類、血漿タン
パク類、薬剤、その他生理活性物質を挙げることかでき
る。

ホルモン類としては、例えば甲状腺刺激ホルモン、卵胞
刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモ
ン、成長ホルモン、乳腺刺激ホルモン、サイロキシン、
トリヨードサイロニン、カルシトニン、コルチゾール、
コルチコステロン、エストラジオール、エストリオール
、プロジェステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドト
ロピン、胎盤性ラクトゲン、インスリン、グルカゴン、
セクレチン、ガストリンなとがある。酵素では例えばプ
ロテアーゼ、システインプロテアーゼ力テブンンＢ、Ｈ
，Ｌ、乳酸脱水素酵素などかある。腫瘍マーカーでは、
ＣＥＡ、ＡＦＰＳＰＯＡ　（ｐａｎ−ｃｒｅａｔｉｃ　
ｏｎｃｏｆｅｔａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ）　、Ｂ　Ｆ　Ｐ
　（ｂａｓｉｃｆｅｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　、Ｐ　Ａ
　（ｐｒｏｓｔａｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）　、ＣＡ１９
−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ３０、ＤｔＪ−
ＰＡＮ−２などがある。ウィルスなどは例えばＢ型肝炎
ウィルス、ロタウィルス、アデノウィルス、サイトメガ
ロウィルス、ヘルペスウィルス、インフルエンザウィル
ス、エンテロウィルス、シンシアルウィルス、ナイセリ
ア、パピローマ、エイズ、マイコプラズマ、トキソプラ
ズマ、クラミジア、大腸菌、赤痢アメーバ、麻疹、おた
ふくかぜ、結核菌などがある。血漿タンパクでは、プレ
アルブミン、アルブミン、α１−フェトプロティン、α
１−ミクログロブリン、α１−酸グリコプロテイン、α
ＩＴ−グリコプロティン、α１アンチトリプシン、α２
Ｂ−グリコプロティン、ビタミンＤ−結合タンパク、α
１−リポプロティン、サイロキシン−結合タンパク、Ｚ
ｎ−α２グリコプロテイン、セルロプラスミン、レチノ
ール−結合タンパク、α２Ｈ３−グリコプロティン、α
２−グリコプロティン、ハプトグロブリン、フレーβリ
ポプロティン、トランスコバラミン、ヘモベキシン、ス
テロイド−結合−βグロブリン、β２−ミクログロブリ
ン、β２−グリコプロティン、β−リポプロティン、免
疫グロブリン、免疫グロブリンＡ２免疫グロブリンＭ１
免疫グロブリンＤ１免疫グロブリンＥ１免疫グロブリン
Ｇなどがある。血液凝固系および線溶系ではプロトロン
ビン、プラスミノダン、フィブリノゲン、第Ｖ因子、第
■因子、第■因子、第■因子、第Ｘ因子、第Ｘ因子、第
Ｘ１因子、第Ｘ■因子、第Ｘ■因子、アンチスロンビン
■、Ｃ２−プラスミン阻害因子、フィブリノペプチドＡ
１フィブリノペプチドＢβ、ティシュプラスミノーゲン
活性化因子などがある。

プロテアーゼ・インヒビターではＣ２−マクログロブリ
ン、バプトグロビン、セルロブラスミンなどがある。補
体ではＣ１ｑ因子、Ｃ１ｒ因子、Ｃ１ｓ因子、Ｃ４因子
、Ｃ５因子、Ｃ６因子、Ｃ７因子、Ｃ８因子、Ｃ９因子
などがある。薬剤では抗てんかん剤例えばエトスクシミ
ド、カルバマゼミン、パルプロ酸、フェニトイン、フエ
ノバルビタール、ブリミドンなどがあり、アミノ酸配糖
体系抗生物質ではアミカシン、カナマイシン、ゲンタマ
イシン、シソマイシン、トラブトマイシン、ネチルマイ
シンなどがあり、循環器側薬ではキニジン、ジギトキシ
ン、ジゴキシン、ジンブラミド、テオフィリン、ブロカ
インアミト、Ｎ−アセチルブロカインアミド、リドカイ
ンなどがあり、抗悪性腫瘍薬ではメトトレキサートなど
があり、生理活性物質ではボツリヌス毒素Ａ１ボツリヌ
ス毒素Ｂ１ボツリヌス毒素Ｆ１コレラ毒素、インターフ
ェロン、サイモボエチン、ブラジキニン、β−エンドル
フィン、Ｍｅｔ−エンケファリン、サブスタンスＰ、２
’、５’−オリゴアデニル酸、ｅ−ＡＭＰ、ピリドキサ
ミン、１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、ジゴキ
シン、ジニトロフェノール−ロイシン、トリニトロトル
エン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロ
ンボキサン、ロイコトリエンなどがある。

そしてこれら複数種の抗体は各々識別可能な標識でラベ
ルされている。標識としては放射性同位元素、蛍光色素
、発光色素等の色素が用いられる。

例えば放射性同位元素であればＩ２５１　、Ｂ２ｐ、８
Ｈなどエネルギービークの異なるものが用いられる。

また放射線以外の標識として用いられる色素は以下に挙
げる比色法、蛍光法、発光法等の検知方法で検知される
ものが用いられる。比色法では、基質に１．２−フユニ
レンジアミン或いは３，３゜５．５゛−テトラメチルベ
ンチジンを用いるペルオキシダーゼ法、基質に２−ニト
ロフェニル・β−Ｄガラクトシドを用いるβ−Ｄガラク
トシダーゼ法、基質に４−ニトロフェニル・フォスフェ
ートを用いるアルカリフォスファターゼ法などの方法、
蛍光法では蛍光色素としてアリルナフタレンスルホン酸
類（ＡＮＳ）、フルオレセインインチオシアネ−１−（
ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
ト（ＴＬＩ）、３−カルボエトキシ−７−ヒドロキシク
マリン（ＣＥＨ）、ダンシルクロリド（ＤＮＳ−Ｃ！Ｑ
）などを用いる方法や、基質に４−ヒドロキシフェニル
酢酸あるいは３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオ
ン酸を用いるペルオキシダーゼ法、基質に４−メチルウ
ムベリフェリル・β−Ｄガラクトシドを用いるβ−Ｄガ
ラクトシダーゼ法、基質に４−メチルウムベリフェリル
・フォスフェートを用いるアルカリフォスファターゼ法
などの方法、生物発光法では、基質にグルコース−６−
リン酸脱水素酵素を用いる脱水素酵素法、基質に２−二
トロフェニル・βＤガラクトシドを用いるβ−Ｄガラク
トシダーゼ法などの方法、化学発光法では、ルミノール
Ｈ２０，系によるペルオキシダーゼ法などの公知の方法
を用いることができる。これらは吸収波長、蛍光波長、
発光波長のそれぞれ異なるものを組合せて用いる。例え
ばＦＩＴＣ，ＴＩ＝１及びＣＥＨのＩｇＧ結合物の蛍光
波長は、それぞれ４９５　ｎｍ、。

５５２ｒ＋ｍ、　４００ｎｍてあり、これらを組合せて
複数（３種類）の抗体にラベルする。

これらの標識化法にはグルタルアルデヒド法、過よう素
酸法、マレイミド法（ヒンジ法）、ピリジル・ジスルフ
ィド法、酸無水物法、カーポジイミド法、ジイミドエス
テル法、過よう素酸酸化法、ミクサシネート法、ジアル
デヒドへの酸化法、オキシム化法などの公知の方法を用
いることができる。

本発明の検査試薬は、特定の抗原、ハプテンにそれぞれ
特異的に反応する２種以−にの抗体であって、このよう
に識別可能な標識でラベルされた抗体を含有するもので
あり、これら抗体を混合して検査試薬として用いる。通
常、水、水−アルコール等の適当な溶媒の溶液として用
いる。

本発明の検査方法及び検査試薬は、沈澱法、不溶化固相
法等に適用できる。例えば沈澱法の場合、本発明の検査
試薬を被検液と混合した後、硫酸ナトリウムや硫酸アン
モニウムにより沈澱を生じさせＢ／Ｆ分離を行ない、生
成した沈澱物の放射線測定、吸光分光測定、蛍光分光測
定の測定を行なう。そして、用いられた標識に対応する
波長における放射線の量、あるいは蛍光量を計測し被検
物質を定量する。又、不溶化抗体固相法であれば、標識
でラベルされた複数種の抗体をアガロースゲル、プロテ
ィンＡ−セファロース等の不溶化担体により固相して、
被検液と接触させた後、洗浄によりＢ／Ｆ分離を行ない
、結合型（Ｂ）の放射線スペクトル、蛍光スペクトルを
測定する。以下、沈澱法と同様にして被検物質を定量す
る。

［作用コ 各々識別可能な標識でラベルされている２種以上の抗体
と被検液とを接触させると、これら２種以上の抗体は各
々被検液中の特定の被検物質と特異的に抗原抗体反応を
生じ結合する。この混合物を公知の方法でＢ／Ｆ分離し
た後、抗体と結合している被検物質の混合物を当該標識
を検出する所定の方法、例えば放射線測定、吸光分光測
定、蛍光分光測定等の方法で測定する。各抗体に予め結
合した標識はそれぞれ、放射線種、最大吸収波長あるい
は蛍光極大波長を異にし識別可能であるので一回の測定
でそれぞれの抗原を測定することができる。

［発明の効果］ 以上の説明からも明らかなように、本発明の検査方法及
び検査試薬によれば、それぞれ異なる標識物質を用いた
複数種の抗体を一つの被検体と反応させればよいので、
−度の操作で複数の検査項目を検査することができる。

従って、極めて微量の被検物質であっても効率よく検査
することができる。

【図面の簡単な説明】

図は抗原抗体反応を利用した検査方法の一例を示す図で
ある。 １・・・・・・抗体 ２・・・・・・標識 ３・・・・・・抗原

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特定の抗原、ハプテン等の被検物質にそれぞれ特異
   的に反応する２種以上の抗体であって、各々識別可能な
   標識でラベルされているものを、検体と接触させて前記
   検体中に含まれる特定の被検物質と結合させて、前記抗
   体と結合した前記特定の被検物質の各々を前記標識で識
   別することを特徴とする検査方法。 ２、前記標識が放射線の異なる２種以上の放射性同位元
   素であることを特徴とする請求項１記載の検査方法。 ３、前記標識が極大吸収波長の異なる物質、極大蛍光波
   長の異なる物質、極大発光波長の異なる物質又はその組
   合せであることを特徴とする請求項１記載の検査方法。 ４、前記標識が極大吸収波長の異なる物質、極大蛍光波
   長の異なる物質、極大発光波長の異なる物質又はその組
   合せと放射性同位元素との組合せであることを特徴とす
   る請求項１記載の検査方法。 ５、特定の抗原、ハプテンにそれぞれ特異的に反応する
   ２種以上の抗体であって、各々識別可能な標識でラベル
   されているものを含有し、前記抗体と結合した特定の被
   検物質の各々を前記標識で識別可能とすることを特徴と
   する検査試薬。