JPH03280876A - リパーゼ遺伝子およびその使用方法 - Google Patents
リパーゼ遺伝子およびその使用方法Info
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- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はダラム陰性ホストにおけるリパーゼの調製およ
び該ホストとリパーゼの使用に関する。
び該ホストとリパーゼの使用に関する。
従来技術
微生物は商業的に興味のある色々な産物を製り出す。自
然の産物製法は、低収率、生成物の単離のむつかしさ、
高い製造費等のため、多くの場合、役に立たない。中に
は、特定のホストが形質転換、効率的生産、または商業
的に有用な生産レベルまでのスケールアップに耐えられ
ない場合もある。
然の産物製法は、低収率、生成物の単離のむつかしさ、
高い製造費等のため、多くの場合、役に立たない。中に
は、特定のホストが形質転換、効率的生産、または商業
的に有用な生産レベルまでのスケールアップに耐えられ
ない場合もある。
他に、収量が一時的であったり、変動的であったりする
場合もある；特に、興味のあるタンパク質を表現する遺
伝子がプラスミドに基づいている場合、プラスミドが不
安定であることがある。それ故、有機体を変性すること
ができることに興味があり、興味のある生成物を自然に
生じる効率のよい生産を考える。
場合もある；特に、興味のあるタンパク質を表現する遺
伝子がプラスミドに基づいている場合、プラスミドが不
安定であることがある。それ故、有機体を変性すること
ができることに興味があり、興味のある生成物を自然に
生じる効率のよい生産を考える。
組み換えＤＮＡ技術は、細胞を変性する機会を提供する
。そのような技術としては、ペプチド生成物を暗号化す
る連鎖を利用すること、１つの遺伝子と関係している複
写開始領域を自然のペプチド以外を表現するオープンリ
ープイーディングフレイム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）に結びつけることにより混合染色体遺伝
子を作り出すこと、特定の遺伝子をざらに後生する準備
をすること、改良された表現型を準備するホストを選択
すること等を挙げることができる。これらの工程が、労
働集約型であり連鎖を単離し、同定すること、構造を適
当なものに変性すること、ホスト中へ形質転換すること
、そして生成物形成を実証することに広範囲な実験を必
要とする。これらの手段のそれぞれが、広範囲な操作、
所望の操作がされ、突然変位がおこっていないことの証
明を含む。各構成体は、ホスト細胞上での新規なりＮＡ
連鎖の効果に関して、そしてどの程度まで、ホスト細胞
は、新規な連鎖に適応し、表現の準備をするかについて
不確かである。最後に、リパーゼの性質、その特性、そ
してそれに商業的用途があるかどうかということがある
。
。そのような技術としては、ペプチド生成物を暗号化す
る連鎖を利用すること、１つの遺伝子と関係している複
写開始領域を自然のペプチド以外を表現するオープンリ
ープイーディングフレイム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ）に結びつけることにより混合染色体遺伝
子を作り出すこと、特定の遺伝子をざらに後生する準備
をすること、改良された表現型を準備するホストを選択
すること等を挙げることができる。これらの工程が、労
働集約型であり連鎖を単離し、同定すること、構造を適
当なものに変性すること、ホスト中へ形質転換すること
、そして生成物形成を実証することに広範囲な実験を必
要とする。これらの手段のそれぞれが、広範囲な操作、
所望の操作がされ、突然変位がおこっていないことの証
明を含む。各構成体は、ホスト細胞上での新規なりＮＡ
連鎖の効果に関して、そしてどの程度まで、ホスト細胞
は、新規な連鎖に適応し、表現の準備をするかについて
不確かである。最後に、リパーゼの性質、その特性、そ
してそれに商業的用途があるかどうかということがある
。
関連文献
微生物のリパーゼのクローニングと同定に関する多くの
文献がある。例えば日本特許出願環５９−４３８９９、
公告第６Ｏ−１８８０７２（１９８５年９月２５日公告
）；オーデラ（Ｏｄｅｒａ）ら、Ｊ。
文献がある。例えば日本特許出願環５９−４３８９９、
公告第６Ｏ−１８８０７２（１９８５年９月２５日公告
）；オーデラ（Ｏｄｅｒａ）ら、Ｊ。
Ｆ ｅｒｍｅｎｔ−Ｔｅｃｈｎｏｌ、（１９８６）、６
４．３６３−３７１；クジミャ（Ｋｕｊｉｍｉｙａ）ら
、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂ １ｏｐ１８９；ハース（Ｈ
ａａｓ）、Ｊ 、Ａ、Ｏ，Ｃ，Ｓ（１９８７）、ｌ上、
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ、 ｌ ４２ ；ゴツツ（Ｇｏ
ｔｚ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、（１９
８５）、上３． ５８９５−５９０６およびＷＯ３６１
０６７４３を参照せよ。
４．３６３−３７１；クジミャ（Ｋｕｊｉｍｉｙａ）ら
、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂ １ｏｐ１８９；ハース（Ｈ
ａａｓ）、Ｊ 、Ａ、Ｏ，Ｃ，Ｓ（１９８７）、ｌ上、
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ、 ｌ ４２ ；ゴツツ（Ｇｏ
ｔｚ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、（１９
８５）、上３． ５８９５−５９０６およびＷＯ３６１
０６７４３を参照せよ。
多くの文献が色々な微生物からのリパーゼの特徴を研究
している。例えば、リー（Ｌ ｅｅ）およびイアンドロ
（Ｉ ａｎｄｏｌｏ）、Ｊ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ（１９８５）、上ｌ上、２８８−２９３；（１９
８６）、上１５３８５−３９１；サイツ（Ｓｅｉｔｚ）
、Ｊ、Ａ、Ｏ，Ｃ。
している。例えば、リー（Ｌ ｅｅ）およびイアンドロ
（Ｉ ａｎｄｏｌｏ）、Ｊ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ（１９８５）、上ｌ上、２８８−２９３；（１９
８６）、上１５３８５−３９１；サイツ（Ｓｅｉｔｚ）
、Ｊ、Ａ、Ｏ，Ｃ。
ｓ、（１９７４）、ｌ上、ｌ ２−１６；コスギ（Ｋｏ
ｓｕｇｉ）およびカミバヤシ（Ｋａｍｉｂａｙａｓｈｉ
）、Ｊ 、 Ｆ ｅｒｍｅｎｔ。
ｓｕｇｉ）およびカミバヤシ（Ｋａｍｉｂａｙａｓｈｉ
）、Ｊ 、 Ｆ ｅｒｍｅｎｔ。
Ｔｅｃｈｎｏｌ、（１９７１）、土９，９６８−９８０
；ルー（Ｌｕ）およびリス力（Ｌｉｓｋａ）、Ａｐｐｌ
、Ｍｉｃｒｏ。
；ルー（Ｌｕ）およびリス力（Ｌｉｓｋａ）、Ａｐｐｌ
、Ｍｉｃｒｏ。
（１９６９）、ユ、１０８−１１３；ニシン（Ｎｉｓｈ
ｉｎｏ）ら、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃ：ｈｅｍ、（１
９８７）、ｌ上、１８１−１８３；アマ−（Ａ ｍｍａ
ｒ）およびマクダニエル（ＭｃＤａｎｉｅｌ）、Ｍｉｋ
ｒｏｂｉｏｌ、（１９８４）、上３９．６１−６８、お
よびコクシｘ −（Ｋ ｏｋｕｓｈｏ）１５９−１１６
４；（１９８２）４６、７４３ １７５０を参照せよ。
ｉｎｏ）ら、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃ：ｈｅｍ、（１
９８７）、ｌ上、１８１−１８３；アマ−（Ａ ｍｍａ
ｒ）およびマクダニエル（ＭｃＤａｎｉｅｌ）、Ｍｉｋ
ｒｏｂｉｏｌ、（１９８４）、上３９．６１−６８、お
よびコクシｘ −（Ｋ ｏｋｕｓｈｏ）１５９−１１６
４；（１９８２）４６、７４３ １７５０を参照せよ。
広いホスト範囲プラスミドに関連した文献とし３５１；
イト−（Ｉ ｔｏｈ）ら、 Ｐ ｌａｓｍｉｄ（１９８４）、 １１．２０６−２２０；イト−（Ｉ ｔｏｈ）およびバ
ー２９９−３０８；バクダサリアン（Ｂ ａｇｄａｓａ
ｒ １ａｎ）ら、Ｇｅｎｅ（１９８１）、１６．２３７
−２４７；およびフリートマン（Ｆ ｒ ｉｅｄｍａｎ
）ら、Ｇｅｎｅ（１９８２）、上８，２８９−２９６を
挙げることができる。
イト−（Ｉ ｔｏｈ）ら、 Ｐ ｌａｓｍｉｄ（１９８４）、 １１．２０６−２２０；イト−（Ｉ ｔｏｈ）およびバ
ー２９９−３０８；バクダサリアン（Ｂ ａｇｄａｓａ
ｒ １ａｎ）ら、Ｇｅｎｅ（１９８１）、１６．２３７
−２４７；およびフリートマン（Ｆ ｒ ｉｅｄｍａｎ
）ら、Ｇｅｎｅ（１９８２）、上８，２８９−２９６を
挙げることができる。
リパーゼに関連した興味ある特許として、ＪＰ（日本特
許）８６１５４５０８（ＪＰ６２２／Ｉ ０９８１）；
ＪＰ８６１５４５０９（ＪＰ６２２／１０９８６）；Ｊ
Ｐ８６１５４５１０（ＪＰ６２２／１０９８７）；ＥＰ
（ヨーロッパ特許）８６／７２３０７（ＪＰ６２２／２
８２７９）；ＥＰＯ２３８０２３；ＥＰＯ２４３３３８
を挙げることができる。
許）８６１５４５０８（ＪＰ６２２／Ｉ ０９８１）；
ＪＰ８６１５４５０９（ＪＰ６２２／１０９８６）；Ｊ
Ｐ８６１５４５１０（ＪＰ６２２／１０９８７）；ＥＰ
（ヨーロッパ特許）８６／７２３０７（ＪＰ６２２／２
８２７９）；ＥＰＯ２３８０２３；ＥＰＯ２４３３３８
を挙げることができる。
発明の要約
表現構成物、ベクター、形質転換されたホスト、そのホ
ストの使用方法は、所望の特性を有する特定のプセウド
モナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ酵素の効
率的製造のために供給される。有機体および生成物は、
洗剤および脂質汚れ除却のたるの洗浄製品の成分として
、エステルの加水分解および製造、すなわちモノグリセ
リド、エステル立体異性体の分解、ヒドロキシ置換ジカ
ルボン酸の環化によるラクトンの形成における一成分と
して使用できる。それらは芳香分子の合成および過酸の
製造のための先駆物質である。
ストの使用方法は、所望の特性を有する特定のプセウド
モナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ酵素の効
率的製造のために供給される。有機体および生成物は、
洗剤および脂質汚れ除却のたるの洗浄製品の成分として
、エステルの加水分解および製造、すなわちモノグリセ
リド、エステル立体異性体の分解、ヒドロキシ置換ジカ
ルボン酸の環化によるラクトンの形成における一成分と
して使用できる。それらは芳香分子の合成および過酸の
製造のための先駆物質である。
発明の詳細な説明
プセウドモナスリパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ構成物
（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を提供する。該構成物は、特
に安定なエピソームの要素として、リパーゼの表現のた
めに、適当なホストに形質転換される。
（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を提供する。該構成物は、特
に安定なエピソームの要素として、リパーゼの表現のた
めに、適当なホストに形質転換される。
リパーゼは単離され、色々、商業的に応用される。
使用されるリパーゼ遺伝子は分泌可能で、プセウドモナ
ズエスピー、 （ｓｐ、）ＡＴＣＣ２１８０８に存在す
るプセウドモナスリパーゼである。該遺伝子およびその
コンシナ−は指示された菌株からの７ラグメント（ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ）を含むベクターでＬｉｐ−ホスト（リパ
ーゼ活性の欠くホスト）を形質転換することにより得て
もよい。種々のプセウドモナスＬｉｐ−菌株、例えばプ
セウドモナス・オレオポランス（Ｐ、Ｏｌ５ｏｖｏｒａ
ｎｓ）Ａ Ｔ ＣＣ８０６２Ｒｉｆ’の菌株が存在する
。Ｌｉｐ＋形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）（
リパーゼ活性のあるホスト）の存在は、ひまし油のよう
な脂質エステルを加水分解する能力によって検出されう
る。
ズエスピー、 （ｓｐ、）ＡＴＣＣ２１８０８に存在す
るプセウドモナスリパーゼである。該遺伝子およびその
コンシナ−は指示された菌株からの７ラグメント（ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ）を含むベクターでＬｉｐ−ホスト（リパ
ーゼ活性の欠くホスト）を形質転換することにより得て
もよい。種々のプセウドモナスＬｉｐ−菌株、例えばプ
セウドモナス・オレオポランス（Ｐ、Ｏｌ５ｏｖｏｒａ
ｎｓ）Ａ Ｔ ＣＣ８０６２Ｒｉｆ’の菌株が存在する
。Ｌｉｐ＋形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）（
リパーゼ活性のあるホスト）の存在は、ひまし油のよう
な脂質エステルを加水分解する能力によって検出されう
る。
一旦、遺伝子を含む７ラグメントが同定されると、その
フラグメントは色々な方法で扱いうる。
フラグメントは色々な方法で扱いうる。
特に、最初のライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）または遺
伝子銀行が１０ｋｂｐ以上のフラグメントを含む場合、
フラグメントは、異なった内ヌクレアーゼを使用し、約
２ないし１ｏｋｂｐの範囲にフラグメントを準備し、さ
らなる制限に付してもよい。小さい７ラグメントはと、
利用できる制限部位の数の減少、簡単な操作、有害な連
鎖の回避等多くの有利な点をもつ。
伝子銀行が１０ｋｂｐ以上のフラグメントを含む場合、
フラグメントは、異なった内ヌクレアーゼを使用し、約
２ないし１ｏｋｂｐの範囲にフラグメントを準備し、さ
らなる制限に付してもよい。小さい７ラグメントはと、
利用できる制限部位の数の減少、簡単な操作、有害な連
鎖の回避等多くの有利な点をもつ。
さらに、オープンリーディングフレイム（ｏｐｅｎｒｅ
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）および転写および翻訳の開
始調節領域として役に立つ５″−未翻訳領域を同定を希
望する人もいるかもしれない。調節領域は色々な方法で
、例えば転写開始領域を異なった領域でおきかえたり、
または温度を変化させたり代謝物質を存在させたりさせ
なかったり等することにより、誘導調節を準備する領域
を結合させたりして変性してもよい。所望により、さら
に２以上の翻訳開始領域を縦列に有するようにプロモー
ター領域を添加したり置換してもよい。
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）および転写および翻訳の開
始調節領域として役に立つ５″−未翻訳領域を同定を希
望する人もいるかもしれない。調節領域は色々な方法で
、例えば転写開始領域を異なった領域でおきかえたり、
または温度を変化させたり代謝物質を存在させたりさせ
なかったり等することにより、誘導調節を準備する領域
を結合させたりして変性してもよい。所望により、さら
に２以上の翻訳開始領域を縦列に有するようにプロモー
ター領域を添加したり置換してもよい。
プセウドモナスにおいて使用してもよい翻訳開始領域は
、β−ガラクトシターゼ、ａ−アミラーゼ、グリセロー
ル−６−７オスフエート、デヒドロゲナーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、プロテアーゼ、トルエン分解、す」
プロモーター、９驕プロモーター等のための領域である
。その領域はプセウドモナス種ホストに対しては内因性
であるかもじれないし、イー、コーリー、バチルス（Ｅ
。
、β−ガラクトシターゼ、ａ−アミラーゼ、グリセロー
ル−６−７オスフエート、デヒドロゲナーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、プロテアーゼ、トルエン分解、す」
プロモーター、９驕プロモーター等のための領域である
。その領域はプセウドモナス種ホストに対しては内因性
であるかもじれないし、イー、コーリー、バチルス（Ｅ
。
ｃｏｌｉ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からのプセウドモナス
において機能性のある領域等のプセウドモナスに対して
は外因性であるかもしれない。
において機能性のある領域等のプセウドモナスに対して
は外因性であるかもしれない。
制限フラグメントは、完全遺伝子を含むように選択して
もよく、表現に必要な調節領域を含む。
もよく、表現に必要な調節領域を含む。
一般に、自然のフラグメントは、約０ 、５ ｋｂｐ以
上で、より普通には３ ｋｂｐ以上であり、約１０ｋｂ
ｐより多くなく、より普通には８ ｋｂｐより多くない
。
上で、より普通には３ ｋｂｐ以上であり、約１０ｋｂ
ｐより多くなく、より普通には８ ｋｂｐより多くない
。
ある場合には、５°−未翻訳領域を異なった調節領域で
おきかえることにより連鎖を操作することが望ましい。
おきかえることにより連鎖を操作することが望ましい。
５′−未翻訳領域は、制限、切除、ブライマー修復、イ
ン・ビトロ変化誘発等により除去してもよい。リパーゼ
を暗号化する構造遺伝子のすべてまたは一部を合成して
もよい。特に、構造遺伝子の塩基対を変性、挿入または
削去したりしてリパーゼ中に１以上の突然変位を導入す
る場合などである。
ン・ビトロ変化誘発等により除去してもよい。リパーゼ
を暗号化する構造遺伝子のすべてまたは一部を合成して
もよい。特に、構造遺伝子の塩基対を変性、挿入または
削去したりしてリパーゼ中に１以上の突然変位を導入す
る場合などである。
クローニングベクターは、表現ベクターとして働いても
よく、このような場合、そのクローニングベクターは、
ホスト中で機能性を有する複製系を有する。特に、フラ
グメントが陰性のバックグラウンドにおいてリパーゼの
表現により同定される場合、そのベクターは、単離し、
そして所望のリパーゼの製造のため表現ホスト中に形質
転換してもよい。所望により、遺伝子を単離し、操作し
、そしてリパーゼ遺伝子の形質転換および表現のため異
なったベクターに挿入してもよい。
よく、このような場合、そのクローニングベクターは、
ホスト中で機能性を有する複製系を有する。特に、フラ
グメントが陰性のバックグラウンドにおいてリパーゼの
表現により同定される場合、そのベクターは、単離し、
そして所望のリパーゼの製造のため表現ホスト中に形質
転換してもよい。所望により、遺伝子を単離し、操作し
、そしてリパーゼ遺伝子の形質転換および表現のため異
なったベクターに挿入してもよい。
ベクターは１以上の複製系を有することにより特徴付け
られる。たとえば、複製系がクローニングホスト、Ｉ；
とえばイー、コーリーや表現ホスト、にとえばプセウド
モナス・エスピービー（ｓｐｐ）のために存在する場合
、シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターを使用してもよ
い。さらに、通常、ベクターで形質転換されたホストセ
ルの選択マーカーが１以上ある。マーカーは、耐生物殺
傷、例えば耐抗生、栄養要求性ホストへのプロトトロピ
ー付与等であるものであってもよい。他に存在してもよ
い機能としては、移動力（ｍｏｂｉｌｚａｂｉｌｉｔｙ
Ｘ伝達（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉ １ｉｔｙ）ではな
い）、高イコピー数、トメトもない複写系１１．特に温
度に感じる、ポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）等
である。
られる。たとえば、複製系がクローニングホスト、Ｉ；
とえばイー、コーリーや表現ホスト、にとえばプセウド
モナス・エスピービー（ｓｐｐ）のために存在する場合
、シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターを使用してもよ
い。さらに、通常、ベクターで形質転換されたホストセ
ルの選択マーカーが１以上ある。マーカーは、耐生物殺
傷、例えば耐抗生、栄養要求性ホストへのプロトトロピ
ー付与等であるものであってもよい。他に存在してもよ
い機能としては、移動力（ｍｏｂｉｌｚａｂｉｌｉｔｙ
Ｘ伝達（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉ １ｉｔｙ）ではな
い）、高イコピー数、トメトもない複写系１１．特に温
度に感じる、ポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）等
である。
ベクターは、従来の方法、例えば、トランスフェクショ
ン、接合、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）、注射、融合、形質導入等によりホス
ト中に導入してもよく、それらの方法はすべて、ＤＮＡ
の細胞ホスト中への導入およびそのようなりＮＡの複製
の準備をする。
ン、接合、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）、注射、融合、形質導入等によりホス
ト中に導入してもよく、それらの方法はすべて、ＤＮＡ
の細胞ホスト中への導入およびそのようなりＮＡの複製
の準備をする。
ある場合は、リパーゼ遺伝子のコピー数を促進するため
に、同じホストに多くのマルチコピープラスミドを存在
させることが望ましい。これは、複写系が異なった不適
合性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉ １ｉｔｙ）グループ、
たとえば異なったピー、不適合性グループ（Ｐ、 ｉｍ
ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ）からの場合
に適当である。
に、同じホストに多くのマルチコピープラスミドを存在
させることが望ましい。これは、複写系が異なった不適
合性（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉ １ｉｔｙ）グループ、
たとえば異なったピー、不適合性グループ（Ｐ、 ｉｍ
ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ）からの場合
に適当である。
リパーゼの表現は、従来のいかなるホスト、特に、原核
生物のホスト中で行なってもよいが、支配を受けるホス
トはプセウドモナスホスト、特に遺伝子を単離できるプ
セウドモナスホスト中に形質転換できることが望ましい
。プセウドモナスホストを選択することにより、それは
、すでに相対的に高いリバーゼプロデュサ−（高製産の
ために選択された陽性バックグラウンド）であるが、改
良された結果が得られうる。
生物のホスト中で行なってもよいが、支配を受けるホス
トはプセウドモナスホスト、特に遺伝子を単離できるプ
セウドモナスホスト中に形質転換できることが望ましい
。プセウドモナスホストを選択することにより、それは
、すでに相対的に高いリバーゼプロデュサ−（高製産の
ために選択された陽性バックグラウンド）であるが、改
良された結果が得られうる。
組み換え体表現ベクターは、５以上、通常１０以上、好
ましくは約１５以上のコピーを提供するマルチコピーで
あるべきで、そして１００以上、または通常約２０より
多くなくてもよい。形質転換されたホストは形質転換さ
れていないホストによって自然に製造されるリパーゼの
量の１０倍以上、好ましくは約１５倍以上、そしてより
好ましくは約２０倍以上である。形質転換されていない
ホストは、約２４〜９６時間の間、実験部分に記載され
ている条件下で５ ２０Ｕ／ｍｆｆの濃度が一般的であ
る。
ましくは約１５以上のコピーを提供するマルチコピーで
あるべきで、そして１００以上、または通常約２０より
多くなくてもよい。形質転換されたホストは形質転換さ
れていないホストによって自然に製造されるリパーゼの
量の１０倍以上、好ましくは約１５倍以上、そしてより
好ましくは約２０倍以上である。形質転換されていない
ホストは、約２４〜９６時間の間、実験部分に記載され
ている条件下で５ ２０Ｕ／ｍｆｆの濃度が一般的であ
る。
興味あるリパーゼは、温度安定性があり、広範囲のｐＨ
範囲で活性であり、アルカリ性側で最適値を有すること
によって特徴付けられる。さらに、リパーゼは一般に分
泌される。
範囲で活性であり、アルカリ性側で最適値を有すること
によって特徴付けられる。さらに、リパーゼは一般に分
泌される。
特定の複写系はＰ−１またはＰ−４不適合性グループプ
ラスミド、たとえばｐＫＴ２３１（パドサリアン（Ｂ
ａｄｓａｒ １ａｎ）ら、Ｇｅｎｅ（１９８１）、１６
．２３７−２４７）、ＲＰ４、ＲＫ２、ｐＶｓｌ（イト
−（Ｉ ｔｏｈ）およびハース（Ｈａｓｓ）、Ｇｅｎｅ
（１９８５）、３６，２７−３６）、ｐＲＫ２９０等か
ら誘導されるプラスミドを包含する。興味ある特定のホ
ストは、プセウドモナス・オレオボランス（ｏｌｅｏｖ
ｏｒａｎｓ）、プセウドモナス−１スビー、ＡＴＣＣ２
１８０８、プセウドモナス・プチダ（ｐｕｔｉｄａ）、
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｕｓ）（枯草菌）、
およびバチルス優りへニホルミス（Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）を包含する。
ラスミド、たとえばｐＫＴ２３１（パドサリアン（Ｂ
ａｄｓａｒ １ａｎ）ら、Ｇｅｎｅ（１９８１）、１６
．２３７−２４７）、ＲＰ４、ＲＫ２、ｐＶｓｌ（イト
−（Ｉ ｔｏｈ）およびハース（Ｈａｓｓ）、Ｇｅｎｅ
（１９８５）、３６，２７−３６）、ｐＲＫ２９０等か
ら誘導されるプラスミドを包含する。興味ある特定のホ
ストは、プセウドモナス・オレオボランス（ｏｌｅｏｖ
ｏｒａｎｓ）、プセウドモナス−１スビー、ＡＴＣＣ２
１８０８、プセウドモナス・プチダ（ｐｕｔｉｄａ）、
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｕｓ）（枯草菌）、
およびバチルス優りへニホルミス（Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）を包含する。
形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）は、生存能力
を維持し、リパーゼの安定した構造を高めるような条件
下で成長する。セル（細胞）濃度は、一般に約１０’〜
１０１１セル／ｍＱの範囲である。、温度は一般に２８
°Ｃ〜３９℃の範囲である。使用できる栄養媒体はＰＹ
ＥＯ（以下に記載の実施例５をみよ）を含む。
を維持し、リパーゼの安定した構造を高めるような条件
下で成長する。セル（細胞）濃度は、一般に約１０’〜
１０１１セル／ｍＱの範囲である。、温度は一般に２８
°Ｃ〜３９℃の範囲である。使用できる栄養媒体はＰＹ
ＥＯ（以下に記載の実施例５をみよ）を含む。
他の使用条件としては、通常ロータリー振動（２５０ｒ
ｐｍ）およびバッフル（ｂａｆ ｆ Ｉｅ）を含有する
エルレンマイヤーフラスコである。
ｐｍ）およびバッフル（ｂａｆ ｆ Ｉｅ）を含有する
エルレンマイヤーフラスコである。
リパーゼは、セルの分離、表面浮遊物またはろ過の濃縮
、エタノールでの沈殿、適当であれば再分散および再沈
殿により、従来の方法で単離しうる。酵素は、さらに逆
相クロマトグラフィーおよび、予備的等電集束（ｐｒｅ
ｐａｒａｔｉｖｅ ｉｓｏｅｌｅｃｔｕｉｃｆｏｃｕｓ
ｉｎｇ）を使用することにより精製してもよい。
、エタノールでの沈殿、適当であれば再分散および再沈
殿により、従来の方法で単離しうる。酵素は、さらに逆
相クロマトグラフィーおよび、予備的等電集束（ｐｒｅ
ｐａｒａｔｉｖｅ ｉｓｏｅｌｅｃｔｕｉｃｆｏｃｕｓ
ｉｎｇ）を使用することにより精製してもよい。
特に興味あるものは、実質的にＮ−末端に次のアミノ酸
およびＤＮＡ連鎖を有するアミン末端を有する十分成熟
して分泌されたリパーゼ酵素である： Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ ５’ ＧＣＣ
ＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＧ ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＧＴ
ＴＡＴ ＣＣＧＴＣ 推定されている活性位アミノ酸および暗号化するＤＮＡ
連鎖は次のようなものである１Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ５’ＣＴ
ＣＧＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＧＧＧ ここで、下線のアミノ酸は、多くの源がらのリパーゼ中
に保存されているようなものである。
およびＤＮＡ連鎖を有するアミン末端を有する十分成熟
して分泌されたリパーゼ酵素である： Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｔ
ｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｉｌｅ ５’ ＧＣＣ
ＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＧ ＧＣＧ ＡＣＧ ＣＧＴ
ＴＡＴ ＣＣＧＴＣ 推定されている活性位アミノ酸および暗号化するＤＮＡ
連鎖は次のようなものである１Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ５’ＣＴ
ＣＧＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＧＧＧ ここで、下線のアミノ酸は、多くの源がらのリパーゼ中
に保存されているようなものである。
支配的な組成物は、エステルの加水分解、特に脂肪を加
水分解して脂肪酸およびモノグリセリドを製造する用途
に適用できる。所望により方法を逆にしてもよく、リパ
ーゼを使用してグリセロールまたは砂糖等のポリオール
をエステル化してもよい。さらに、エステルの鏡像異性
選択的（ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）加水分解
のために使用し、鏡像異性に富んだだシントン（ｓｙｎ
ｔｈｏｎ）を準備してもよい。
水分解して脂肪酸およびモノグリセリドを製造する用途
に適用できる。所望により方法を逆にしてもよく、リパ
ーゼを使用してグリセロールまたは砂糖等のポリオール
をエステル化してもよい。さらに、エステルの鏡像異性
選択的（ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）加水分解
のために使用し、鏡像異性に富んだだシントン（ｓｙｎ
ｔｈｏｎ）を準備してもよい。
それ故、立体異性の脂肪酸および／またはエステルを含
有するエステルを使用して、特定のエナンチオマーに富
む生成物を得てもよい。
有するエステルを使用して、特定のエナンチオマーに富
む生成物を得てもよい。
本発明のリパーゼは液体および粒状洗剤への脂肪分解性
の添加剤として有用に使用できる。洗剤組成物は、一般
に、欠くことのできない成分である界面活性剤、洗剤ビ
ルダー、漂白剤、蛍光白化剤および補助剤を含有する。
の添加剤として有用に使用できる。洗剤組成物は、一般
に、欠くことのできない成分である界面活性剤、洗剤ビ
ルダー、漂白剤、蛍光白化剤および補助剤を含有する。
補助剤は、蛋白質加水分解酵素および脂肪分解酵素等の
酵素であってよい。リパーゼは普通に使用される洗剤プ
ロテアーゼの存在下洗剤溶液中で安定であるべきである
。
酵素であってよい。リパーゼは普通に使用される洗剤プ
ロテアーゼの存在下洗剤溶液中で安定であるべきである
。
さらに、ここで述べられているリパーゼは、特に酵素感
応性汚れ（脂肪等）について、改良された洗浄力および
よりよい安定性を提供する。さらに、このリパーゼは、
漂白用過酸のイン・スツ（ｉｎｓｉｔｕ）発生のための
活性化系に使用してもよい。
応性汚れ（脂肪等）について、改良された洗浄力および
よりよい安定性を提供する。さらに、このリパーゼは、
漂白用過酸のイン・スツ（ｉｎｓｉｔｕ）発生のための
活性化系に使用してもよい。
リパーゼを使用した洗剤組成物は、文献中に例示されて
いる。たとえばＥＰＡ２５８００８（この文献を明細書
の一部としてここに引用する、特に第４頁、第２２行〜
ｇ５頁、第２４行）。
いる。たとえばＥＰＡ２５８００８（この文献を明細書
の一部としてここに引用する、特に第４頁、第２２行〜
ｇ５頁、第２４行）。
以下に本発明を実施例を用いて説明するが、何ら本発明
を制限するものではない。
を制限するものではない。
実験
実施例Ｉ
パートｌ：ビー、エスピー、（Ｐ 、ｓｐ、）Ａ Ｔ
ＣＣ２１８０８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅＣｏ１１ｅｃｉｉｏｎ）、ロックビレ（Ｒｏｃｋ
ｖｉｌ］ｅ）、エムデイ−（ＭＤ））からゲノムＤＮＡ
の単離ゲノムＤＮＡをプセウドモナス・エスピー、ＡＴ
ＣＣ２１８０８から単離した。それはリパーゼ酵素を分
泌し、アマノ製薬（Ａｍａｎｏ Ｐｈｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ）株式会社（名古屋、日本）の科学者により土か
ら最初に単離されたものである。その微生物的特徴、す
なわちモルフォロジー、培養特性、および他の微生物学
的特徴は、「脂質代謝改良および抗−アテローム剤」と
題されている合衆国特許第３８７５００７第７〜９欄に
記載されている。
ＣＣ２１８０８（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅＣｏ１１ｅｃｉｉｏｎ）、ロックビレ（Ｒｏｃｋ
ｖｉｌ］ｅ）、エムデイ−（ＭＤ））からゲノムＤＮＡ
の単離ゲノムＤＮＡをプセウドモナス・エスピー、ＡＴ
ＣＣ２１８０８から単離した。それはリパーゼ酵素を分
泌し、アマノ製薬（Ａｍａｎｏ Ｐｈｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ）株式会社（名古屋、日本）の科学者により土か
ら最初に単離されたものである。その微生物的特徴、す
なわちモルフォロジー、培養特性、および他の微生物学
的特徴は、「脂質代謝改良および抗−アテローム剤」と
題されている合衆国特許第３８７５００７第７〜９欄に
記載されている。
ビー、エスピー、 （Ｐ、ｓｐ、）ＡＴＣＣ２１８０８
バクテリアは極性のある鞭毛好気性桿菌を形成するダラ
ム陰性非胞子である。
バクテリアは極性のある鞭毛好気性桿菌を形成するダラ
ム陰性非胞子である。
そのビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８セルを栄養素
液体培養基（それは、１リツトルあたりビーフ抽出物３
ｇ（デイ７コ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ １ａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト、エム・アイ（Ｍｌ）
）および５ｇのペグトン（デイフコ・ラボラトリーズ、
デトロイト、エムアイ）からなる）中３０°Ｃで一晩成
長させた。
液体培養基（それは、１リツトルあたりビーフ抽出物３
ｇ（デイ７コ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ １ａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト、エム・アイ（Ｍｌ）
）および５ｇのペグトン（デイフコ・ラボラトリーズ、
デトロイト、エムアイ）からなる）中３０°Ｃで一晩成
長させた。
バクテリアを４０℃で２０分間２９５０ Ｘｇで遠心分
離してとり入れ、０．０５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）（シグ
マ・ケミカル（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）株式
会社、セント、ルイス（Ｓ Ｌ、 Ｌ ｏｕｉｓ）、エ
ムオー（Ｍ Ｏ））および０．０５Ｍエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡＸシグマ・ケミカル株式会社、セント
、ルイス、エムオー）中にｐＨ８で再懸濁した。次にセ
ルを溶解する前に、４℃で４５分間リゾチーム（Ｉ ｍ
ｙ／ｍ１２）（シグマ・ケミカル株式会社、セント、ル
イス、エムオー）で処理した。セルを０．５％（ｗ／Ｖ
）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（ビエールセ・ケ
ミカル（Ｐ １ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）株式会社
、ロックフィールド（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、アイエル（
ＩＬ））、０．０５ＭトリスｐＨ７，５、および０．４
Ｍ ＥＤＴＡを含有する洗剤溶液の１／４容積で溶解し
た。セル溶解は１時間５０℃で破壊セルを培養すること
により完結した。さらｔこ、セル溶解物中のタンパク質
を上記加熱工程の間にプロテアーゼＫ（シグマ。
離してとり入れ、０．０５Ｍトリス（Ｔｒｉｓ）（シグ
マ・ケミカル（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）株式
会社、セント、ルイス（Ｓ Ｌ、 Ｌ ｏｕｉｓ）、エ
ムオー（Ｍ Ｏ））および０．０５Ｍエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡＸシグマ・ケミカル株式会社、セント
、ルイス、エムオー）中にｐＨ８で再懸濁した。次にセ
ルを溶解する前に、４℃で４５分間リゾチーム（Ｉ ｍ
ｙ／ｍ１２）（シグマ・ケミカル株式会社、セント、ル
イス、エムオー）で処理した。セルを０．５％（ｗ／Ｖ
）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（ビエールセ・ケ
ミカル（Ｐ １ｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）株式会社
、ロックフィールド（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、アイエル（
ＩＬ））、０．０５ＭトリスｐＨ７，５、および０．４
Ｍ ＥＤＴＡを含有する洗剤溶液の１／４容積で溶解し
た。セル溶解は１時間５０℃で破壊セルを培養すること
により完結した。さらｔこ、セル溶解物中のタンパク質
を上記加熱工程の間にプロテアーゼＫ（シグマ。
ケミカル株式会社、セント、ルイス、エムオーＸ ｌｌ
１ｇ／ａｎ）で加水分解した。
１ｇ／ａｎ）で加水分解した。
核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を非緩衝液フェノール／ク
ロロホルム（１：ｌ、ｖ／ｖＸインターナショナル−バ
イオチク／Ｃ７ジーズ（Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ）株式会社、ニューバー
ペン、シーティー（ＣＴ））で２度、そしてクロロホル
ム／イソアミルアルコール（シグマ・ケミカル株式会社
、セント、ルイス、エムオーＸ２４：ｌ、ｖ／Ｖ）で−
度抽出することにより他の細胞成分から分離した。核酸
を７．５Ｍアンモニウムアセテート（インターナショナ
ル・バイオチクノロシーズ株式会社、ニューバーペン、
シーティー）ｌ／２容積、および冷１００％エタノール
（インターナショナル・バイオチクノロシーズ株式会社
、ニューバーペン、シーティー）の２容積を添加して沈
殿させた。核酸を無菌のガラスパスツールピペット上へ
まきとった。その核酸を０．０５ＭトリスｐＨ７。
ロロホルム（１：ｌ、ｖ／ｖＸインターナショナル−バ
イオチク／Ｃ７ジーズ（Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ）株式会社、ニューバー
ペン、シーティー（ＣＴ））で２度、そしてクロロホル
ム／イソアミルアルコール（シグマ・ケミカル株式会社
、セント、ルイス、エムオーＸ２４：ｌ、ｖ／Ｖ）で−
度抽出することにより他の細胞成分から分離した。核酸
を７．５Ｍアンモニウムアセテート（インターナショナ
ル・バイオチクノロシーズ株式会社、ニューバーペン、
シーティー）ｌ／２容積、および冷１００％エタノール
（インターナショナル・バイオチクノロシーズ株式会社
、ニューバーペン、シーティー）の２容積を添加して沈
殿させた。核酸を無菌のガラスパスツールピペット上へ
まきとった。その核酸を０．０５ＭトリスｐＨ７。
５．１ｍＭＥＤＴＡ、および２００ ｐ ｇ／ｍ１２ア
ールナーゼ（ＲＮａｓｅ）Ａ（シグマ・ケミカル株式会
社、セント、ルイス、エムオー）を含む溶液中に再溶解
した。アールナーゼＡは汚染物ＲＮＡを加水分解した。
ールナーゼ（ＲＮａｓｅ）Ａ（シグマ・ケミカル株式会
社、セント、ルイス、エムオー）を含む溶液中に再溶解
した。アールナーゼＡは汚染物ＲＮＡを加水分解した。
ＤＮＡをクロロホルム／イソアミルアルコールで再抽出
し、上記したように再沈殿させ、まきとりそして、０．
０５ＭトリスｐＨ７，５および１ｍＭＥＤＴＡ中に再溶
解した。約５００μｇのＤＮＡをビー、エスピー、ＡＴ
ＣＣ２１８０８セル５０ｍ１２培養液から単離した。
し、上記したように再沈殿させ、まきとりそして、０．
０５ＭトリスｐＨ７，５および１ｍＭＥＤＴＡ中に再溶
解した。約５００μｇのＤＮＡをビー、エスピー、ＡＴ
ＣＣ２１８０８セル５０ｍ１２培養液から単離した。
パート２ニブラスミドベクターｐｃＰ１３ＤＮＡの単離
プラスミＦｐＣＰ１３（エフ・アウスベル（Ｆ、Ａｕ５
ｕｂｅｌ’）、デパートメント・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ）、マサーチューセッツ・ジェネラル・
ホスピタル（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒ
ａｌ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）、ボストン、エムニー（Ｍ
Ａ ））は、プラスミドｐＬＡＦＲ１から誘導される広
いホスト範囲のコスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクターであ
り、フリートマン（Ｆ ｒ ｉｅｄｍａｎ）ら、Ｇｅｎ
ｅ（１９８，，２）、上８，２８９〜２９６に記載され
ている。ベクターｐｃＰ１３は大きさ２３キロベース（
ｋｉｌｏｂａｓｅｓＸ Ｋ ｂ）で、テトラサイタリン
（Ｔｃ）およびカナマイシン（Ｋｍ）抵抗を暗号化し、
多くの独特の内ヌクレアーゼ制限部位を含有し、可動性
（ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ）（Ｍｏｂ” ）であるが、
自己−伝達可能でない（Ｔｒａ−）。
ｕｂｅｌ’）、デパートメント・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ）、マサーチューセッツ・ジェネラル・
ホスピタル（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒ
ａｌ Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）、ボストン、エムニー（Ｍ
Ａ ））は、プラスミドｐＬＡＦＲ１から誘導される広
いホスト範囲のコスミド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクターであ
り、フリートマン（Ｆ ｒ ｉｅｄｍａｎ）ら、Ｇｅｎ
ｅ（１９８，，２）、上８，２８９〜２９６に記載され
ている。ベクターｐｃＰ１３は大きさ２３キロベース（
ｋｉｌｏｂａｓｅｓＸ Ｋ ｂ）で、テトラサイタリン
（Ｔｃ）およびカナマイシン（Ｋｍ）抵抗を暗号化し、
多くの独特の内ヌクレアーゼ制限部位を含有し、可動性
（ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ）（Ｍｏｂ” ）であるが、
自己−伝達可能でない（Ｔｒａ−）。
プラスミドｐｃＰ１３は、イト−（Ｉ ｔｏｈ）ら、Ｐ
Ｉａｓｍｉｄ（１９８４）、１上、２０６〜２２０の方
法ヲ少し変形して、エシェリキア・コーリー菌株ＨＢ１
０１のセルから単離される。イー、コーリー（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ−）ＨＢ １０１ （ｐＣＰ １３ ）セルを、
ルリア（Ｌｕｒｉａ）液体培養基培地中、ロータリー振
動器（１７５ｒｐｍ）３２℃、通気状態で一晩成長させ
た。
Ｉａｓｍｉｄ（１９８４）、１上、２０６〜２２０の方
法ヲ少し変形して、エシェリキア・コーリー菌株ＨＢ１
０１のセルから単離される。イー、コーリー（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ−）ＨＢ １０１ （ｐＣＰ １３ ）セルを、
ルリア（Ｌｕｒｉａ）液体培養基培地中、ロータリー振
動器（１７５ｒｐｍ）３２℃、通気状態で一晩成長させ
た。
ルリア液体培養基培地は１０ｇ（グラム／リットル）の
トリプトン（デイフコ・ラボラトリーズ、デトロイト
エムアイ）、５ｇのイースト抽出物（デイ７コ・ラボラ
トリーズ、デトロイト・エムアイ）、および１０ｇの塩
化ナトリウム（ＮａＣＱ）（シグマ・ケミカル株式会社
、セント、ルイス、エムオー）からなる。この媒地は２
３μｇ／ｍＱテトラサイクリン（Ｔｃ）（カルビオケム
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、う・ジョラ（Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ）、シーニー（ＣＡ））を補足した。
トリプトン（デイフコ・ラボラトリーズ、デトロイト
エムアイ）、５ｇのイースト抽出物（デイ７コ・ラボラ
トリーズ、デトロイト・エムアイ）、および１０ｇの塩
化ナトリウム（ＮａＣＱ）（シグマ・ケミカル株式会社
、セント、ルイス、エムオー）からなる。この媒地は２
３μｇ／ｍＱテトラサイクリン（Ｔｃ）（カルビオケム
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、う・ジョラ（Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ）、シーニー（ＣＡ））を補足した。
イー・コーリーセルを４℃で１０分間５０００Ｘｇで遠
心分離することにより取り入れた。そのセルは、２０セ
チルエーテル（ブリジー５８（Ｂｒｉｊ−５８Ｘシグマ
・ケミカル株式会社、セント、ルイス、エムオー）およ
びデオキシコール酸ナトリウム（シグマ・ケミカル株式
会社、セント、ルイス、エムオー）を含有する洗剤溶液
で溶解した。
心分離することにより取り入れた。そのセルは、２０セ
チルエーテル（ブリジー５８（Ｂｒｉｊ−５８Ｘシグマ
・ケミカル株式会社、セント、ルイス、エムオー）およ
びデオキシコール酸ナトリウム（シグマ・ケミカル株式
会社、セント、ルイス、エムオー）を含有する洗剤溶液
で溶解した。
溶解した後（１０〜２０分）、透明になった溶解物を９
０分間、４０°Ｃ！、３９０００Ｘｇで遠心分離するこ
とにより得た。上澄み層をデカントした後、ＰＥＧ６０
００（ポリエチレングリコール）（シグマ・ケミカル株
式会社、セント、ルイス、エムオー）の１１５容積およ
び３％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムを添加した。溶解物を
４０℃で一晩培養し、プラスミドＤＮＡの沈殿を完結さ
せた。
０分間、４０°Ｃ！、３９０００Ｘｇで遠心分離するこ
とにより得た。上澄み層をデカントした後、ＰＥＧ６０
００（ポリエチレングリコール）（シグマ・ケミカル株
式会社、セント、ルイス、エムオー）の１１５容積およ
び３％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムを添加した。溶解物を
４０℃で一晩培養し、プラスミドＤＮＡの沈殿を完結さ
せた。
沈殿したプラスミドＤＮＡを４℃で１０分間、１４００
０Ｘｇで遠心分離することにより集めた。
０Ｘｇで遠心分離することにより集めた。
ＤＮＡペレットを０．０５Ｍ）リス、ｐＨ８，５ｍＭ
ＥＤＴＡ、および０．０５Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、
そして次に９ｇの塩化セシウム（インターナショナル・
バイオチクノロシーズ株式会社、ニューバーペン、シー
ティー）および０．７５ｍ＜１１０１／顧エチジウムブ
ロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅＸシグ
マ・ケミカル株式会社、セント、ルイス、エムオー）を
使用して塩化セシウム勾配中で精製した。
ＥＤＴＡ、および０．０５Ｍ塩化ナトリウムに溶解し、
そして次に９ｇの塩化セシウム（インターナショナル・
バイオチクノロシーズ株式会社、ニューバーペン、シー
ティー）および０．７５ｍ＜１１０１／顧エチジウムブ
ロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅＸシグ
マ・ケミカル株式会社、セント、ルイス、エムオー）を
使用して塩化セシウム勾配中で精製した。
ＤＮＡ溶液を４℃で６０分間培養した後、線状の固まり
になったポリエチレングリコール沈殿物を、４℃、４５
分間、１２０００ｘｇで遠心分離することにより溶解し
た。プラスミドＤＮＡから分離した。プラスミドＤＮＡ
をベックマン（Ｂ ｅｃｋｍａｎ）Ｔｉ７０．１０−タ
ー中で４５００ Ｏｒｐｍ、 １８℃、４５時間遠心
分離にかけ、染色体のＤＮＡから分離した。プラスミド
ｐｃＰ１３ＤＮＡからなるより低い集まり（ｂａｎｄ）
をシリンジで集めた。エチジウムブロマイドを塩化セシ
ウム飽和水溶液に対して平衡されたｎ−ブタノール（シ
グマ・ケミカル株式会社、セント、ルイス、エムオー）
で３回抽出することにより除去した。塩化セシウムを０
．０１Ｍトリス、１ｍＭ ＥＤＴ Ａ ｐＨ８，０（Ｔ
Ｅ）緩衝液を３回変えて透析した。約４００μｇのｐＣ
Ｐ１３ＤＮＡを１リツトルの培養液から単離した。
になったポリエチレングリコール沈殿物を、４℃、４５
分間、１２０００ｘｇで遠心分離することにより溶解し
た。プラスミドＤＮＡから分離した。プラスミドＤＮＡ
をベックマン（Ｂ ｅｃｋｍａｎ）Ｔｉ７０．１０−タ
ー中で４５００ Ｏｒｐｍ、 １８℃、４５時間遠心
分離にかけ、染色体のＤＮＡから分離した。プラスミド
ｐｃＰ１３ＤＮＡからなるより低い集まり（ｂａｎｄ）
をシリンジで集めた。エチジウムブロマイドを塩化セシ
ウム飽和水溶液に対して平衡されたｎ−ブタノール（シ
グマ・ケミカル株式会社、セント、ルイス、エムオー）
で３回抽出することにより除去した。塩化セシウムを０
．０１Ｍトリス、１ｍＭ ＥＤＴ Ａ ｐＨ８，０（Ｔ
Ｅ）緩衝液を３回変えて透析した。約４００μｇのｐＣ
Ｐ１３ＤＮＡを１リツトルの培養液から単離した。
パート３：ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡ
の１５〜３ＯＫｂサイズの７ラグメントの分離 ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８からの総ＤＮＡ（
５５０μｇ）および制限酵素五ｈｏＩにュー・イングラ
ンド・バイオラポズ（Ｎｅｗ Ｉｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ、 ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、エムニー
（ＭＡ）３１．２５−Ｌ＝ニットＵｎｉｔＸＵ）を共に
７．５ｍ（２溶液ｐＨ７，８の０．０２５Ｍ２５Ｍトリ
スル（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）、０．０５Ｍ ＮａＣ（２，
０，０１Ｍ塩化マグネシウム（ＭｇＣ１ｚ）、１００
μｇ／ｍＲボビン血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅ
ｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（Ｂ Ｓ Ａ）、を含有）に
混合し、上記溶液を１時間３７℃で培養シた。１ユニツ
トの制限酵素は０ 、０５ ｍＯ，（７）ｆ。
の１５〜３ＯＫｂサイズの７ラグメントの分離 ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８からの総ＤＮＡ（
５５０μｇ）および制限酵素五ｈｏＩにュー・イングラ
ンド・バイオラポズ（Ｎｅｗ Ｉｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ、 ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、エムニー
（ＭＡ）３１．２５−Ｌ＝ニットＵｎｉｔＸＵ）を共に
７．５ｍ（２溶液ｐＨ７，８の０．０２５Ｍ２５Ｍトリ
スル（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）、０．０５Ｍ ＮａＣ（２，
０，０１Ｍ塩化マグネシウム（ＭｇＣ１ｚ）、１００
μｇ／ｍＲボビン血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅ
ｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（Ｂ Ｓ Ａ）、を含有）に
混合し、上記溶液を１時間３７℃で培養シた。１ユニツ
トの制限酵素は０ 、０５ ｍＯ，（７）ｆ。
容積中３７°０１６０分でラムダＤＮＡのｌｐｇを完全
に消化、亥るのに要求される酵素の量として規定される
。次に、制限酵素を非緩衝フェノール／クロロホルム（
１：Ｌｖ／のて２回、クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２４： ｌ 、 ｖ／ｖ）で−回抽出することに
よりその消化混合物から除去した。消化されたＤＮＡを
、０．５容積の７．５Ｍアンモニウムアセテートおよび
２容積の冷１００％エタノールを添加することにより再
沈殿させた。
に消化、亥るのに要求される酵素の量として規定される
。次に、制限酵素を非緩衝フェノール／クロロホルム（
１：Ｌｖ／のて２回、クロロホルム／イソアミルアルコ
ール（２４： ｌ 、 ｖ／ｖ）で−回抽出することに
よりその消化混合物から除去した。消化されたＤＮＡを
、０．５容積の７．５Ｍアンモニウムアセテートおよび
２容積の冷１００％エタノールを添加することにより再
沈殿させた。
−７０℃で３０分間培養した後、沈殿したＤＮＡを、エ
ッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離器（５４
１５；７’リンクマン・インストルメンツ（Ｂｒｉｎｋ
ｍａｎ Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）株式会社、ウェス
トベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、エヌワイ（ＮＹ））中
、４℃で３０分間１３０００Ｘｇで遠心分離することに
より取り入れた。ＤＮＡペレットを７０％冷エタノール
で一度洗浄したあと、ＤＮＡをＴＥ緩衝液ｐＨ８の１ｍ
Ｑ中に再溶解した。部分的に消化されたＤＮＡの少量の
アリコートを、アガロースゲル電気泳動により分析した
。この分析によると、ＤＮＡの大部分は１ＯＫｂより長
かった。
ッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離器（５４
１５；７’リンクマン・インストルメンツ（Ｂｒｉｎｋ
ｍａｎ Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）株式会社、ウェス
トベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、エヌワイ（ＮＹ））中
、４℃で３０分間１３０００Ｘｇで遠心分離することに
より取り入れた。ＤＮＡペレットを７０％冷エタノール
で一度洗浄したあと、ＤＮＡをＴＥ緩衝液ｐＨ８の１ｍ
Ｑ中に再溶解した。部分的に消化されたＤＮＡの少量の
アリコートを、アガロースゲル電気泳動により分析した
。この分析によると、ＤＮＡの大部分は１ＯＫｂより長
かった。
１５〜３０Ｋｂサイズのフラグメントをサッカーロース
密度遠心分離により分離した。ポリアロマ−（ｐｏｌｙ
ａｌ Ｉｏｍｅｒ）超遠心分離チューブ（ベックマン・
インストルメンツ株式会社、パロ・アルド（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ）、シーニー（ＣＡ））を１１．４ｍ（ｌの２
５％（Ｗ／Ｖ）サッカロース（インターナショナル・バ
イオテクノロジー株式会社、ニューバーペン、シーティ
ー）溶液（０，０２Ｍ１−リスｐＨ８，５ｍＭＥＤＴＡ
、および１ＭＮａＣ１中に調製されている）で満たし、
−２０℃でサッカロースを凍結させることにより連続（
１０〜４０％；ｗ／ｖ）サッカロース勾配を組み立てた
。４℃で４時間かけてサッカロース溶液を徐々に溶かし
た後、部分的に消化したＤＮＡ溶液をＩＭ ＮａＣＱ、
０．０２Ｍ トリス、ｐＨ８、および５ｍＭＥＤＴＡに
再調整し、連続サッカロース勾配のトップに適用した。
密度遠心分離により分離した。ポリアロマ−（ｐｏｌｙ
ａｌ Ｉｏｍｅｒ）超遠心分離チューブ（ベックマン・
インストルメンツ株式会社、パロ・アルド（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ）、シーニー（ＣＡ））を１１．４ｍ（ｌの２
５％（Ｗ／Ｖ）サッカロース（インターナショナル・バ
イオテクノロジー株式会社、ニューバーペン、シーティ
ー）溶液（０，０２Ｍ１−リスｐＨ８，５ｍＭＥＤＴＡ
、および１ＭＮａＣ１中に調製されている）で満たし、
−２０℃でサッカロースを凍結させることにより連続（
１０〜４０％；ｗ／ｖ）サッカロース勾配を組み立てた
。４℃で４時間かけてサッカロース溶液を徐々に溶かし
た後、部分的に消化したＤＮＡ溶液をＩＭ ＮａＣＱ、
０．０２Ｍ トリス、ｐＨ８、および５ｍＭＥＤＴＡに
再調整し、連続サッカロース勾配のトップに適用した。
超遠心分離をベックマン５Ｗ４０Ｔｉローター中で２６
０Ｑｒｐｍ、１８°Ｃで２４時間行なった。フラクショ
ン（ｆ ｒａｃ ｔ １ｏｎ）を集めて、ＤＮＡ含量を
アガロースゲル電気泳動で分析した。１５〜３０Ｋｂサ
イズのＤＮＡを含有するフラクションを一緒にした。
０Ｑｒｐｍ、１８°Ｃで２４時間行なった。フラクショ
ン（ｆ ｒａｃ ｔ １ｏｎ）を集めて、ＤＮＡ含量を
アガロースゲル電気泳動で分析した。１５〜３０Ｋｂサ
イズのＤＮＡを含有するフラクションを一緒にした。
次に、ＤＮＡ溶液中のサッカロースを除去し、その溶液
をセントリフン−３０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−’３０
）マイマロ濃縮装置（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）株式会
社、ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ）、エムニー（Ｍ Ａ
））で濃縮した。
をセントリフン−３０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−’３０
）マイマロ濃縮装置（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）株式会
社、ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ）、エムニー（Ｍ Ａ
））で濃縮した。
パート４：ピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡの
プラスミドクローニングベクターｐｃＰ１３での組み換
え ６０マイクログラムのプラスミドｐｃＰ１３ＤＮＡおよ
び１８０Ｕの制限酵素ＸｈｏＩを前のセクションに記載
したのと同じ消化緩衝溶液２５０μＱに併合し、３７℃
で１８時間培養した。アガロースゲル電気泳動によるＤ
ＮＡの分析によると、消化は完結していた。非緩衝フェ
ノール／クロロホルム（１：１．Ｖ／Ｖ）で２回そして
クロロホルム／イソアミ−ルア（２４：１、ｖ／ｖ）で
−度抽出することにより、消化混合物からタンパクおよ
び他の汚染物質を除去した。プラスミドＤＮＡをＯ１５
容積の７．５Ｍアンモニウムアセテートおよび２容積の
冷１００％エタノールで沈殿させた。
プラスミドクローニングベクターｐｃＰ１３での組み換
え ６０マイクログラムのプラスミドｐｃＰ１３ＤＮＡおよ
び１８０Ｕの制限酵素ＸｈｏＩを前のセクションに記載
したのと同じ消化緩衝溶液２５０μＱに併合し、３７℃
で１８時間培養した。アガロースゲル電気泳動によるＤ
ＮＡの分析によると、消化は完結していた。非緩衝フェ
ノール／クロロホルム（１：１．Ｖ／Ｖ）で２回そして
クロロホルム／イソアミ−ルア（２４：１、ｖ／ｖ）で
−度抽出することにより、消化混合物からタンパクおよ
び他の汚染物質を除去した。プラスミドＤＮＡをＯ１５
容積の７．５Ｍアンモニウムアセテートおよび２容積の
冷１００％エタノールで沈殿させた。
７０℃で２０分間培養した後、沈殿ＤＮＡをエッペンド
ルフ（Ｅ ｐｐｅｎｄｏｒｆ ）遠心分離器中で４℃２
０分間１３０００ Ｘｇで遠心分離することにより取り
入れた。プラスミドＤＮＡペレットを７０％冷エタノー
ルで３回洗浄後、ＤＮＡを１２０μＱのＴＥ緩衝液に再
溶解した。
ルフ（Ｅ ｐｐｅｎｄｏｒｆ ）遠心分離器中で４℃２
０分間１３０００ Ｘｇで遠心分離することにより取り
入れた。プラスミドＤＮＡペレットを７０％冷エタノー
ルで３回洗浄後、ＤＮＡを１２０μＱのＴＥ緩衝液に再
溶解した。
ＸｈｏＩ消化ｐｃＰ１３ＤＮＡを脱リン酸反応し、あと
の結紮反応においてプラスミドが回送する（ｒｅｃｉｒ
ｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のを防いだ。これは、次の
ようのにしてなしとげられた。消化ｐｃＰ１３ＤＮＡお
よび２２Ｕの子牛の腸のアルカリ性７オス７アターセ（
ホエーリンガ−・マンハイム・パイオケミカルズ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）、インデイアナポリス（Ｉ ｎｄｉａｎ
ａｐｏｌ ｉｓ）、アイエヌ（ＩＮ））の１０μｇアリ
コート２つを、０．０５Ｍ１−リスｐＨ９，５＄；よび
２５μｇ／ｍＱスペルミン（シグマ・ケミカル株式会社
、セント、ルイス、エムオー）を含有する２００μＱ溶
液中に併合し、３７℃で６０分間培養した。アルカリホ
スファターゼの１ユニツトは、１Ｍジェタノールアミン
、０．０１Ｍ４−ニトロフェニルホスフェート、０．０
２５Ｍ ＭｇＣＱ、、ｐＨ９，８からなる緩衝溶液中３
７°Ｃで１分、４−ニトロフェニルホスフェートの１μ
ｍｏｌｅを加水分解する酵素の量として規定した。
の結紮反応においてプラスミドが回送する（ｒｅｃｉｒ
ｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のを防いだ。これは、次の
ようのにしてなしとげられた。消化ｐｃＰ１３ＤＮＡお
よび２２Ｕの子牛の腸のアルカリ性７オス７アターセ（
ホエーリンガ−・マンハイム・パイオケミカルズ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）、インデイアナポリス（Ｉ ｎｄｉａｎ
ａｐｏｌ ｉｓ）、アイエヌ（ＩＮ））の１０μｇアリ
コート２つを、０．０５Ｍ１−リスｐＨ９，５＄；よび
２５μｇ／ｍＱスペルミン（シグマ・ケミカル株式会社
、セント、ルイス、エムオー）を含有する２００μＱ溶
液中に併合し、３７℃で６０分間培養した。アルカリホ
スファターゼの１ユニツトは、１Ｍジェタノールアミン
、０．０１Ｍ４−ニトロフェニルホスフェート、０．０
２５Ｍ ＭｇＣＱ、、ｐＨ９，８からなる緩衝溶液中３
７°Ｃで１分、４−ニトロフェニルホスフェートの１μ
ｍｏｌｅを加水分解する酵素の量として規定した。
６８℃で１０分間培養することによりホスファターゼを
不活性化し、前パフグラフに記載したように７エノール
／クロロホルムとクロロホルム／イソアミルアルコール
抽出と同じようにして、汚染タンパクを除去した。さら
に、脱リン酸されたｐＣＰ １３ＤＮＡを沈殿させて、
−２０°Ｃで一晩培養し、そして前述したように７０％
エタノールで洗浄した。スピードバック濃縮器（Ｓｐｅ
ｅｄ−ＶａｃＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（サバートー
インストルメンツ（Ｓ ａｖａｎｔ Ｉ ｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ）株式会社、ファルミングダレ（Ｆ ａｒｍｉ
ｎｇｄａｌｅ）、エヌワイ（ＮＹ））中で１０分間プラ
スミドＤＮＡベレットを乾燥した後、プラスミドＤＮＡ
をＴＥ緩衝溶液中で再溶解した。
不活性化し、前パフグラフに記載したように７エノール
／クロロホルムとクロロホルム／イソアミルアルコール
抽出と同じようにして、汚染タンパクを除去した。さら
に、脱リン酸されたｐＣＰ １３ＤＮＡを沈殿させて、
−２０°Ｃで一晩培養し、そして前述したように７０％
エタノールで洗浄した。スピードバック濃縮器（Ｓｐｅ
ｅｄ−ＶａｃＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（サバートー
インストルメンツ（Ｓ ａｖａｎｔ Ｉ ｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ）株式会社、ファルミングダレ（Ｆ ａｒｍｉ
ｎｇｄａｌｅ）、エヌワイ（ＮＹ））中で１０分間プラ
スミドＤＮＡベレットを乾燥した後、プラスミドＤＮＡ
をＴＥ緩衝溶液中で再溶解した。
次に、０．５μｇの消化され、サイズ選択されたビー、
エスピーＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡ、４゜５ｇの消化ｐ
ＣＰ１３ＤＮＡおよび２０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにニ
ー・イングランド・バイオラボス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）
、エムニー（Ｍ Ａ ））を、０．０２５Ｍトリス−Ｈ
（１２（ｐＨ７，８）、Ｏ−ＩＭ ＭｇＣ（ｈ、０．０
４Ｍβ−メルカプトエタノール、および４ｍＭのアデノ
シン５′−トリホスフェート（ＡＴＰ）を含有する溶液
２０μα中に混合し、４℃で１６時間培養した。
エスピーＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡ、４゜５ｇの消化ｐ
ＣＰ１３ＤＮＡおよび２０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼにニ
ー・イングランド・バイオラボス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）
、エムニー（Ｍ Ａ ））を、０．０２５Ｍトリス−Ｈ
（１２（ｐＨ７，８）、Ｏ−ＩＭ ＭｇＣ（ｈ、０．０
４Ｍβ−メルカプトエタノール、および４ｍＭのアデノ
シン５′−トリホスフェート（ＡＴＰ）を含有する溶液
２０μα中に混合し、４℃で１６時間培養した。
リガーゼの１ユニツトは、２０μＱの溶液（０，０５Ｍ
１−リス−ＨＣＱ ｐＨ７，８，０，０１Ｍ ＭｇＣＱ
２．０．０２Ｍジチオスレイトーノ喧ｄｉＬｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ）、１ｍＭ ＡＴＰ、５０μｇ／ｍＱＢＳ
Ａからなる）中１６℃で３０分間、ラムダＤＮＡのＨｉ
ｎｄＩ［［フラグメントの５０％結紮および０．１２μ
Ｍ（３００μｇ／ｍ（２）の５’ＤＮＡ末端濃度を与る
のに必要とされる量として規定される。ｌ Ｏ： ｌ
（ｗ／ｗ）の比を挿入するベクターを使用して、長１１
１ＤＮＡ鎖状体の形成を促進し、ＤＮＡ分子をラムダビ
ールス粒子にイン・ビトロでパッケージングするのに好
ましい基質で１．ある。
１−リス−ＨＣＱ ｐＨ７，８，０，０１Ｍ ＭｇＣＱ
２．０．０２Ｍジチオスレイトーノ喧ｄｉＬｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ）、１ｍＭ ＡＴＰ、５０μｇ／ｍＱＢＳ
Ａからなる）中１６℃で３０分間、ラムダＤＮＡのＨｉ
ｎｄＩ［［フラグメントの５０％結紮および０．１２μ
Ｍ（３００μｇ／ｍ（２）の５’ＤＮＡ末端濃度を与る
のに必要とされる量として規定される。ｌ Ｏ： ｌ
（ｗ／ｗ）の比を挿入するベクターを使用して、長１１
１ＤＮＡ鎖状体の形成を促進し、ＤＮＡ分子をラムダビ
ールス粒子にイン・ビトロでパッケージングするのに好
ましい基質で１．ある。
パート５ニブラスミド含有ビー・エスピー、ＡＴＣＣ２
１８０８ＤＮＡのラムダ粒子へのイン・ビトロパッケー
ジング イン・ビトロパッケージングは、組換え体コスミド（ｃ
ｏｓｍｉｄｓ）をホストセル中へ導入する効果的手段で
ある。パッカジエン（Ｐ ａｃｋａｇｅｎｅ）抽出物（
プロメガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ
ｃ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ダブリューアイ（
Ｗ Ｉ ））を氷上で溶かし、ビー・エスピー、ＡＴＣ
Ｃ２１８０８ＤＮＡ／ｐｃＰ１３結紮混合物の半分を加
え、その混合物を２２℃で２時間培養した。次にパッケ
ージング混合物をＱ、５ｍ１２の０．１Ｍ ＮａＣｆｆ
、０゜０１ＭトリスｐＨ７，９、および０．０１Ｍ硫酸
マグネシウム（ＭｇＳ０４Ｘシグマ・ケミカル株式会社
、セント・ルイス、エムオー）で希釈した。このラムダ
粒子（組み換え体ｐｃＰ１３／ピー・エスピー、ＡＴＣ
Ｃ２１８０８ＤＮＡ分子を含有する）ヲクロロホルム上
４℃で貯蔵した。
１８０８ＤＮＡのラムダ粒子へのイン・ビトロパッケー
ジング イン・ビトロパッケージングは、組換え体コスミド（ｃ
ｏｓｍｉｄｓ）をホストセル中へ導入する効果的手段で
ある。パッカジエン（Ｐ ａｃｋａｇｅｎｅ）抽出物（
プロメガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ
ｃ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ダブリューアイ（
Ｗ Ｉ ））を氷上で溶かし、ビー・エスピー、ＡＴＣ
Ｃ２１８０８ＤＮＡ／ｐｃＰ１３結紮混合物の半分を加
え、その混合物を２２℃で２時間培養した。次にパッケ
ージング混合物をＱ、５ｍ１２の０．１Ｍ ＮａＣｆｆ
、０゜０１ＭトリスｐＨ７，９、および０．０１Ｍ硫酸
マグネシウム（ＭｇＳ０４Ｘシグマ・ケミカル株式会社
、セント・ルイス、エムオー）で希釈した。このラムダ
粒子（組み換え体ｐｃＰ１３／ピー・エスピー、ＡＴＣ
Ｃ２１８０８ＤＮＡ分子を含有する）ヲクロロホルム上
４℃で貯蔵した。
パート６：ビー・エスピー。ＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡ
および抗生抵抗のあるマーカーを含有するプラスミドの
イー、コーリー中への形質導入イー、コーリー菌株ＨＢ
ＩＯＩをトリプトン（Ｔ ｒｙｐｔｏｎｅ）液体培養基
（ＴＢ）培地（その培地はトリプトン１０ｇ（グラム／
リットル）、ＮａＣＱ５ｇ、マルトーゼ２ｇ（シグマ・
ケミカル株式会社、セント・ルイス、エムオー）および
２．４６ｇのＭｇ５Ｏ６からなる）中１７５ ｒｐｍで
ロータリー振動器中３０℃で一晩フラスコ中で生長させ
た。１００μａの再懸濁ＨＢ １０１バクテリア（０，
０１Ｍ ＭｇＳＯ４中）および５０μＱのパッケージン
グ混合物（ラムダ粒子を含む）をチューブ中に一緒に混
合し、３７℃２０分培養した。次に、１ｍ１２の前加熱
されたルリア（Ｌｕｒｉａ）液体培養基培地を加え、チ
ューブをロータリー振動器中１５０ ｒｐｍで６０分３
７℃で培養した。形質導入されたＨＢＩＯＩセルをエッ
ペンドルフ遠心分離器中、１３０００Ｘｇ。
および抗生抵抗のあるマーカーを含有するプラスミドの
イー、コーリー中への形質導入イー、コーリー菌株ＨＢ
ＩＯＩをトリプトン（Ｔ ｒｙｐｔｏｎｅ）液体培養基
（ＴＢ）培地（その培地はトリプトン１０ｇ（グラム／
リットル）、ＮａＣＱ５ｇ、マルトーゼ２ｇ（シグマ・
ケミカル株式会社、セント・ルイス、エムオー）および
２．４６ｇのＭｇ５Ｏ６からなる）中１７５ ｒｐｍで
ロータリー振動器中３０℃で一晩フラスコ中で生長させ
た。１００μａの再懸濁ＨＢ １０１バクテリア（０，
０１Ｍ ＭｇＳＯ４中）および５０μＱのパッケージン
グ混合物（ラムダ粒子を含む）をチューブ中に一緒に混
合し、３７℃２０分培養した。次に、１ｍ１２の前加熱
されたルリア（Ｌｕｒｉａ）液体培養基培地を加え、チ
ューブをロータリー振動器中１５０ ｒｐｍで６０分３
７℃で培養した。形質導入されたＨＢＩＯＩセルをエッ
ペンドルフ遠心分離器中、１３０００Ｘｇ。
室温で５分間遠心分離し、取り入れ、続いてルリア液体
培養基培地の小容積中へ再懸濁させた。ＨＢＩＯＩセル
を１５μｇ／ｍＱＴｃを含有するルリア寒天培養基プレ
ート上で成長させた。
培養基培地の小容積中へ再懸濁させた。ＨＢＩＯＩセル
を１５μｇ／ｍＱＴｃを含有するルリア寒天培養基プレ
ート上で成長させた。
この選択的培地により、プラスミドｐｃＰ１３（テトラ
サイクリン抵抗遺伝子を有する）を含有するイー、コー
リーＨＢＩＯＩセルのみの成長が可能となる。組み換え
体ＤＮＡを含有するセルの数を決定するため、Ｔｃ抵抗
性セルをＫｍ（シグマ・ケミカル株式会社、セント・ル
イス、エムオー）に対する抵抗のために遮断（ｓｃｒｅ
ｅｎ） Ｌ／た。ＤＮＡの７ラグメントの独自のｐｃＰ
１３のＸｈｏ１１１＠部位中への挿入は、Ｋｍ抵抗を暗
号化しているプラスミド遺伝子を不活性化するので、Ｋ
ｍ感度の頻度は、セル総数中における組み換え体ｐｃＰ
１３プラスミドを含有するイー９コーリーセルの数を与
える。Ｋｍ感度もある各Ｔｃ抵抗セルは、それがビー・
エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡを含有するｐｃＰ
１３プラスミドを有していることを示していた。千二百
のＨ８１０１組み換え体菌株が、個々に単離された。
サイクリン抵抗遺伝子を有する）を含有するイー、コー
リーＨＢＩＯＩセルのみの成長が可能となる。組み換え
体ＤＮＡを含有するセルの数を決定するため、Ｔｃ抵抗
性セルをＫｍ（シグマ・ケミカル株式会社、セント・ル
イス、エムオー）に対する抵抗のために遮断（ｓｃｒｅ
ｅｎ） Ｌ／た。ＤＮＡの７ラグメントの独自のｐｃＰ
１３のＸｈｏ１１１＠部位中への挿入は、Ｋｍ抵抗を暗
号化しているプラスミド遺伝子を不活性化するので、Ｋ
ｍ感度の頻度は、セル総数中における組み換え体ｐｃＰ
１３プラスミドを含有するイー９コーリーセルの数を与
える。Ｋｍ感度もある各Ｔｃ抵抗セルは、それがビー・
エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡを含有するｐｃＰ
１３プラスミドを有していることを示していた。千二百
のＨ８１０１組み換え体菌株が、個々に単離された。
実施例２
パート１：イー、コーリーＨＢＩＯＩ組み換え体菌株の
プールの製造 千二百の個々に単離されたＴｃ’Ｋｍ’ＨＢ Ｉ Ｏｌ
菌株、それは、組換え体（ビー・エスピー、ＡＴＣＣ２
１８０８／ｐＣＰ ｌ ３）ＤＮＡプラスミドを有する
が、１５μｇ ／ ｍｆｆ Ｔ ｃを補足されたルリア
寒天プレート（ｌプレート当り５０クローン）の表面に
点在させた。３７℃で１０時間寒天プレートを培養した
後、１５μｇ／ｍＱＴｃを含有するルリア液体培養基を
３−各プレートに添加し、各プレート上のバクテリアを
一緒にばらばらにした。２つのプレート（１００ＨＢＩ
ＯＩクローン）からの再懸濁セルを一緒にし、それによ
りＨＢＩＯＩクローンの１２のプールを形成した。
プールの製造 千二百の個々に単離されたＴｃ’Ｋｍ’ＨＢ Ｉ Ｏｌ
菌株、それは、組換え体（ビー・エスピー、ＡＴＣＣ２
１８０８／ｐＣＰ ｌ ３）ＤＮＡプラスミドを有する
が、１５μｇ ／ ｍｆｆ Ｔ ｃを補足されたルリア
寒天プレート（ｌプレート当り５０クローン）の表面に
点在させた。３７℃で１０時間寒天プレートを培養した
後、１５μｇ／ｍＱＴｃを含有するルリア液体培養基を
３−各プレートに添加し、各プレート上のバクテリアを
一緒にばらばらにした。２つのプレート（１００ＨＢＩ
ＯＩクローン）からの再懸濁セルを一緒にし、それによ
りＨＢＩＯＩクローンの１２のプールを形成した。
パート２：ビー・エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８ＤＮＡ
を含有する組み換え体プラスミドの接合によるイー、コ
ーリーからビー・オレオポランスへの転移 ドナーおよびレシピエンドセルを、ホム（Ｈｏｍ）ら、
Ｊ 、ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４）、
１５９．３３５〜３４０の方法を少し変え、接合用に調
製した。
を含有する組み換え体プラスミドの接合によるイー、コ
ーリーからビー・オレオポランスへの転移 ドナーおよびレシピエンドセルを、ホム（Ｈｏｍ）ら、
Ｊ 、ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４）、
１５９．３３５〜３４０の方法を少し変え、接合用に調
製した。
ルリア液体培養基培地の３−を含有するチューブをルリ
ア寒天（＋１５μｇ／ｍ＋２Ｔｃ）ストックプレートか
らのイー、コーリ（ドナー）プールで接種し、ローラー
ドラム（二ニー・ブルンスウィック・サイエンテ（７（
−／り（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ５ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ）株式会社、ニュー・ブルンスウィック、エヌ・
ジェー（Ｎ Ｊ ））中で３０℃１晩培養した。これら
の−晩培養菌を使用し、０．１５のＡ４ｍ。（４２０ｎ
市の波長での光学散乱）に対して同じ培地のｌｏｍＱを
接種した。これらの培養菌を３７℃で３時間２００ｒｐ
ｍでロータリー振動器上で培養した。
ア寒天（＋１５μｇ／ｍ＋２Ｔｃ）ストックプレートか
らのイー、コーリ（ドナー）プールで接種し、ローラー
ドラム（二ニー・ブルンスウィック・サイエンテ（７（
−／り（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ５ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ）株式会社、ニュー・ブルンスウィック、エヌ・
ジェー（Ｎ Ｊ ））中で３０℃１晩培養した。これら
の−晩培養菌を使用し、０．１５のＡ４ｍ。（４２０ｎ
市の波長での光学散乱）に対して同じ培地のｌｏｍＱを
接種した。これらの培養菌を３７℃で３時間２００ｒｐ
ｍでロータリー振動器上で培養した。
１５μｇ／ｍＱＫｍを含有するルリア液体培養基３ｒｎ
Ｑを含有するチューブに、ストックプレートからのプラ
スミドｐＲＫ２１０３を含んでいるイーコーリーＨＢＩ
ＯＩで接種１、上述したようにローラードラム中で培養
した。−晩培養菌を使用し、０．１のＡ４２゜に対して
同じ培地の６２０＋＋＋Ｑを接種した。この培養菌も３
７℃で３時間２０ Ｏｒｐｍで培養した。プラスミドｐ
ＲＫ２０１３はＣｏ１Ｅｌレプリコン上ヘクローンされ
たＲＫ２転移遺伝子からなるカナマイシン−抵抗ヘルパ
ー（ｈｅｌｐｅｒ）プラスミドである。（ジー、ジッタ
（Ｑ、ｐｉｔｔａ）、デプト、オブ・バイオロジー（Ｄ
ｅｐｔ、ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ）、カリホルニア大学
、サンジエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ラジョラ（Ｌａ
Ｊｏｌｌａ）、シーｘ−（ＣＡ））。それは、ｐｃＰ１
３組み換え体プラスミドの効率的可動化（転移）に必要
なタンパクを供給し、ジッタ（Ｄｉｔｔａ）ら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ Ｓ Ａ（１９８
０）、７７．７３４３〜７３５１に詳細に記載されてい
る。
Ｑを含有するチューブに、ストックプレートからのプラ
スミドｐＲＫ２１０３を含んでいるイーコーリーＨＢＩ
ＯＩで接種１、上述したようにローラードラム中で培養
した。−晩培養菌を使用し、０．１のＡ４２゜に対して
同じ培地の６２０＋＋＋Ｑを接種した。この培養菌も３
７℃で３時間２０ Ｏｒｐｍで培養した。プラスミドｐ
ＲＫ２０１３はＣｏ１Ｅｌレプリコン上ヘクローンされ
たＲＫ２転移遺伝子からなるカナマイシン−抵抗ヘルパ
ー（ｈｅｌｐｅｒ）プラスミドである。（ジー、ジッタ
（Ｑ、ｐｉｔｔａ）、デプト、オブ・バイオロジー（Ｄ
ｅｐｔ、ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ）、カリホルニア大学
、サンジエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ラジョラ（Ｌａ
Ｊｏｌｌａ）、シーｘ−（ＣＡ））。それは、ｐｃＰ１
３組み換え体プラスミドの効率的可動化（転移）に必要
なタンパクを供給し、ジッタ（Ｄｉｔｔａ）ら、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ Ｓ Ａ（１９８
０）、７７．７３４３〜７３５１に詳細に記載されてい
る。
ｌＯμｇ／ｍＱのり７アムプシン（シグマ・ケミカル株
式会社、セント・ルイス、エムオー）を含有する栄養素
液体培養基の１０ｍ（＋を含有フラスコを同じ媒体を含
有するストックプレートからのビー・オレオポランスＡ
ＴＣＣ８０６２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、ロックビレ、エムデイ−）Ｒｉｆ’レシピ
エンドセルを接種し、ロータリー振動器上３０℃２０
Ｏｒｐｍで一晩培養した。−晩培養菌を使用し、０．３
のＡＨｏに対して同じ媒体の６０１を接種した。その培
養菌も上記と同様に培養した。ビー、オレオポランスＡ
ＴＣｃ８０６２はＪ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
（１９４１）、４１３７３〜３８６に詳細に記述されて
いる。
式会社、セント・ルイス、エムオー）を含有する栄養素
液体培養基の１０ｍ（＋を含有フラスコを同じ媒体を含
有するストックプレートからのビー・オレオポランスＡ
ＴＣＣ８０６２（アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、ロックビレ、エムデイ−）Ｒｉｆ’レシピ
エンドセルを接種し、ロータリー振動器上３０℃２０
Ｏｒｐｍで一晩培養した。−晩培養菌を使用し、０．３
のＡＨｏに対して同じ媒体の６０１を接種した。その培
養菌も上記と同様に培養した。ビー、オレオポランスＡ
ＴＣｃ８０６２はＪ 、 Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
（１９４１）、４１３７３〜３８６に詳細に記述されて
いる。
ドナーおよびレシピエンドセルを４℃で１０分間４４０
０Ｘｇで遠心分離して取り入れた。ドナーおよびレシピ
エンドセルをルリア液体培養基および栄養素液体培養基
でそれぞれ一回洗浄し、抗生物質を除去した。最後に、
バクテリアを栄養素液体培養基をもつ培養容積０．２５
中に再懸濁した。
０Ｘｇで遠心分離して取り入れた。ドナーおよびレシピ
エンドセルをルリア液体培養基および栄養素液体培養基
でそれぞれ一回洗浄し、抗生物質を除去した。最後に、
バクテリアを栄養素液体培養基をもつ培養容積０．２５
中に再懸濁した。
ＨＢ １０１クローンプール、ＨＢＩＯＩ（ｐＲＫ２０
１３）ヘルパーセル、およびビー、オレオポランスレシ
ピエントをレシピエンドセル当り５ドナーおよび５ヘル
パープラスミドセルの比で混合し、マトリセル（Ｍａｔ
ｒｉｃｅｌ）メンブランフィルタ−（直径２５ｍｍ、０
．４５μｍの大きさの細孔、ゲルマン・インストルメン
ト（Ｇｅ１２ｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）株式会社
、アン・アーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、エムアイ（
Ｍ Ｉ ））上へ補集し、３０°０２日間栄養素寒天媒
体上で培養した。次に、そのセルを栄養素液体培養基の
５−中に再懸濁し、続いて希釈し、そして、５０μｇア
リコートを、５０μＱ／ｍＱリファムプシン、２５ ｉ
ｔ ｇ／ｍｆｆＴ ｃおよび０．０５％（ｖ／ｖ）カス
ドール（ｃａｓｔｏｒ）オイル（シグマ・ケミカル株式
会社、セント・ルイス、エムオー）を補足した栄養素寒
天プレート上へ展開した。これらのプレートを３０℃１
０日間培養した。ひまし油を調製物中へ乳状にし、半透
明の寒天媒体を形成した。
１３）ヘルパーセル、およびビー、オレオポランスレシ
ピエントをレシピエンドセル当り５ドナーおよび５ヘル
パープラスミドセルの比で混合し、マトリセル（Ｍａｔ
ｒｉｃｅｌ）メンブランフィルタ−（直径２５ｍｍ、０
．４５μｍの大きさの細孔、ゲルマン・インストルメン
ト（Ｇｅ１２ｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）株式会社
、アン・アーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、エムアイ（
Ｍ Ｉ ））上へ補集し、３０°０２日間栄養素寒天媒
体上で培養した。次に、そのセルを栄養素液体培養基の
５−中に再懸濁し、続いて希釈し、そして、５０μｇア
リコートを、５０μＱ／ｍＱリファムプシン、２５ ｉ
ｔ ｇ／ｍｆｆＴ ｃおよび０．０５％（ｖ／ｖ）カス
ドール（ｃａｓｔｏｒ）オイル（シグマ・ケミカル株式
会社、セント・ルイス、エムオー）を補足した栄養素寒
天プレート上へ展開した。これらのプレートを３０℃１
０日間培養した。ひまし油を調製物中へ乳状にし、半透
明の寒天媒体を形成した。
この寒天媒体は、組み換え体プラスミド上に表現できる
リパーゼ遺伝子を受けとったビー・オレオポランスを検
出するのに使用される。これらのリパーゼ陽性コロニー
は、ひまし油トリグリセリドを加水分解し、それにより
コロニーの周囲に透明なゾーンを形成する。選択培地上
へのブレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）時のレシピエン
ドの数は、５０μｇ／ｍＱリファムプシンを補足した栄
養素寒天プレート上へ１００μｇの連続希釈物のアリコ
ートをブレーティングすることによって決定される。
リパーゼ遺伝子を受けとったビー・オレオポランスを検
出するのに使用される。これらのリパーゼ陽性コロニー
は、ひまし油トリグリセリドを加水分解し、それにより
コロニーの周囲に透明なゾーンを形成する。選択培地上
へのブレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）時のレシピエン
ドの数は、５０μｇ／ｍＱリファムプシンを補足した栄
養素寒天プレート上へ１００μｇの連続希釈物のアリコ
ートをブレーティングすることによって決定される。
転移接合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ） コｏ
ニー、組み換え体ｐＣＰ１３プラスミドを受けたレシピ
エンドセルは、ルシピエント当り２Ｘ１０−’〜２Ｘ１
０４の頻度で現われる。イー、コーリークローンプール
のそれぞれからの組み換え体プラスミドを含有する約３
２５００の転移接合体、または実験当り約２５００の転
移接合体が、選択プレート上で成長する。
ニー、組み換え体ｐＣＰ１３プラスミドを受けたレシピ
エンドセルは、ルシピエント当り２Ｘ１０−’〜２Ｘ１
０４の頻度で現われる。イー、コーリークローンプール
のそれぞれからの組み換え体プラスミドを含有する約３
２５００の転移接合体、または実験当り約２５００の転
移接合体が、選択プレート上で成長する。
交接利用したプール番号１３からの２３７５の転移接合
体のうち、４つのコロニーがリパーゼ活性の存在を示す
透明なゾーンを製造した。同様に、交接使用したプール
番号２３からの２８５０の転移接合体のうち３５が透明
ゾーンを製造した。リパーゼ活性を示す転移接合体をひ
まし油を含有する同じ寒天プレート上へ直線培養を行な
ったところ、再び透明ゾーン（リパーゼ）が各菌株にお
いて形成された。
体のうち、４つのコロニーがリパーゼ活性の存在を示す
透明なゾーンを製造した。同様に、交接使用したプール
番号２３からの２８５０の転移接合体のうち３５が透明
ゾーンを製造した。リパーゼ活性を示す転移接合体をひ
まし油を含有する同じ寒天プレート上へ直線培養を行な
ったところ、再び透明ゾーン（リパーゼ）が各菌株にお
いて形成された。
パート１：ビー、オレオポランスからリパーゼ遺伝子を
含有するプラスミドの単離 リパーゼクローンを含有する３つの違ったピーオレオポ
ランス菌株を、ｌＯμｇ／ｍＱＲｉｆおよび５μｇ／ｍ
ＱＴｃで補足された栄養素液体培養基５−を含有するチ
ューブ中で成長させた。そのチューブをローラードラム
中３０℃で一晩培養した。１３０００Ｘｇ、室温１分間
１．５ｍｆｆ容量のマイクロ遠心分離チューブ中で遠心
分離することにより、セルの１．５ｍ１２アリコート２
つを取り入れた。そのセルを、０．０５Ｍグルコース（
シグマ・ケミカル株式会社、セント・ルイス、エムオー
）、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、０．０２５ＭトリスｐＨ
８、および４ｍｇ／ｒａＱリゾチームを含有する冷溶液
２００μｇ中に無菌のドースビックＱｏｏｔｈｐｉｃｋ
）を用いて再懸濁し、室温で５分間培養した。新しく作
った０゜２Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨＸングマ・ケ
ミカル株式会社、セント・ルイス、エムオー）４００μ
ＱおよＵ１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳを添加してセル溶解を完
結させ、５分間４℃で培養した。冷３Ｍ酢酸ナトリウム
（シグマ・ケミカル株式会社、セント・ルイス、エムオ
ー）ｐＨ４，８の３００μｇ添加、４℃５分間の培養、
およびｌ ３０００ Ｘｇで４℃１０分間の遠心分離に
より、タンパクおよび他の細胞破片を沈殿させた。上澄
み液の７００μＱを新しい１．５ｍ１２容量のマイクロ
遠心分離チューブに移し、同容量の非緩衝（１：Ｌｖ／
ｖ）フェノール／クロロホルムで抽出し、残っている汚
染タンパクを除去した。
含有するプラスミドの単離 リパーゼクローンを含有する３つの違ったピーオレオポ
ランス菌株を、ｌＯμｇ／ｍＱＲｉｆおよび５μｇ／ｍ
ＱＴｃで補足された栄養素液体培養基５−を含有するチ
ューブ中で成長させた。そのチューブをローラードラム
中３０℃で一晩培養した。１３０００Ｘｇ、室温１分間
１．５ｍｆｆ容量のマイクロ遠心分離チューブ中で遠心
分離することにより、セルの１．５ｍ１２アリコート２
つを取り入れた。そのセルを、０．０５Ｍグルコース（
シグマ・ケミカル株式会社、セント・ルイス、エムオー
）、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、０．０２５ＭトリスｐＨ
８、および４ｍｇ／ｒａＱリゾチームを含有する冷溶液
２００μｇ中に無菌のドースビックＱｏｏｔｈｐｉｃｋ
）を用いて再懸濁し、室温で５分間培養した。新しく作
った０゜２Ｎ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨＸングマ・ケ
ミカル株式会社、セント・ルイス、エムオー）４００μ
ＱおよＵ１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳを添加してセル溶解を完
結させ、５分間４℃で培養した。冷３Ｍ酢酸ナトリウム
（シグマ・ケミカル株式会社、セント・ルイス、エムオ
ー）ｐＨ４，８の３００μｇ添加、４℃５分間の培養、
およびｌ ３０００ Ｘｇで４℃１０分間の遠心分離に
より、タンパクおよび他の細胞破片を沈殿させた。上澄
み液の７００μＱを新しい１．５ｍ１２容量のマイクロ
遠心分離チューブに移し、同容量の非緩衝（１：Ｌｖ／
ｖ）フェノール／クロロホルムで抽出し、残っている汚
染タンパクを除去した。
抽出された水性層の５００μａ中の核酸を２容積の冷１
００％エタノールを添付して沈殿させた。
００％エタノールを添付して沈殿させた。
＝７０℃で２５分間培養後、沈殿したＤＮＡを１３００
０Ｘｇ、４°０２０分間遠心分離し取り入れた。核酸ペ
レットを７０％エタノールで３回洗浄し、残っている塩
およびフェノール／クロロホルムを除去した。次に、ペ
レットをスピード−バック濃縮器（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ
Ｃａｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）で７分間乾燥した。核酸
をＴＥｐＨ８緩衝液５０μα中で再懸濁した。
０Ｘｇ、４°０２０分間遠心分離し取り入れた。核酸ペ
レットを７０％エタノールで３回洗浄し、残っている塩
およびフェノール／クロロホルムを除去した。次に、ペ
レットをスピード−バック濃縮器（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ
Ｃａｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）で７分間乾燥した。核酸
をＴＥｐＨ８緩衝液５０μα中で再懸濁した。
パート２：形式転換用反応性イー、コーリー成分の調製
ルリア液体培養基の５ｍＱを含有するチューブをイー、
コーリ〜ＨＢＩＯＩバクテリアで接種し、ローラドラム
中３０℃で一晩成長させた。次に、ルリア液体培養基の
４００ｍ１２を含有するフラスコを０．０２のＡ、。。
コーリ〜ＨＢＩＯＩバクテリアで接種し、ローラドラム
中３０℃で一晩成長させた。次に、ルリア液体培養基の
４００ｍ１２を含有するフラスコを０．０２のＡ、。。
に対してＨＢＩＯＩで接種し、ロータリー振動器上２０
Ｏｒｐｍｌ、 ２５分間培養した６４℃で２０分間セ
ルを培養した後、２０００×ｇ１４℃で１５分間遠心分
離することＩこより取り入れた。取り入れたイー、コー
リーセルを形質変換用に、シルバービー（Ｓｉｌｈａｖ
いら、遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ）、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、エヌワイ（
ＮＹ）、（１９８４）、１６９頁の塩化カルシウム法に
より、調製した。
Ｏｒｐｍｌ、 ２５分間培養した６４℃で２０分間セ
ルを培養した後、２０００×ｇ１４℃で１５分間遠心分
離することＩこより取り入れた。取り入れたイー、コー
リーセルを形質変換用に、シルバービー（Ｓｉｌｈａｖ
いら、遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉ
ｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ）、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、エヌワイ（
ＮＹ）、（１９８４）、１６９頁の塩化カルシウム法に
より、調製した。
パート３ニブラスミドのイー、コーリー中への形質転換
パート１で部分的に精製されたＤＮＡの１０マイクロリ
ツトルを、シルバービーら、遺伝子融合実験、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、エヌワイ（１
９８４）、１７０頁の方法により、イー、コーリーセル
中へ形質転換した。そのセルを３７℃で一晩、１５μｇ
／ｍＱＴｃを含有するシリア寒天プレート上で成長させ
た。この媒体を選択することにより、リパーゼ遺伝子お
よびＴＣ抵抗マーカーを有する組み換え体ｐｃＰ１３プ
ラスミドを含有するセルのみの成長が可能となる。
ツトルを、シルバービーら、遺伝子融合実験、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、エヌワイ（１
９８４）、１７０頁の方法により、イー、コーリーセル
中へ形質転換した。そのセルを３７℃で一晩、１５μｇ
／ｍＱＴｃを含有するシリア寒天プレート上で成長させ
た。この媒体を選択することにより、リパーゼ遺伝子お
よびＴＣ抵抗マーカーを有する組み換え体ｐｃＰ１３プ
ラスミドを含有するセルのみの成長が可能となる。
実施例４
ピー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８リパーゼドの物理
的分析 組み換え体ｐｃｐ１３プラスミドを、実施例３、バート
ｌに記載したように３つの異なるＬｉｐ＋ビ、オレオポ
ランス菌株の培養菌から、部分的に精製した。半分（２
５μａ）の部分的に精製されたプラスミドＤＮＡを、５
０μＱ溶液（０，０２５Ｍトリス−ＨＣＱｐＨ７，８，
０，０５Ｍ ＮａＣｌ２，０゜０１Ｍ ＭｇＣＱ、、１
００ μｓ／ｍＱＢ Ｓ Ａ、 ２ｍＭβ−メルカプ
トエタノール、および２００μｇ／ｍΩリボヌクレアー
ゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）からなる）中に、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉの７．５Ｕと共に混合し、３７℃で一晩培養した。
的分析 組み換え体ｐｃｐ１３プラスミドを、実施例３、バート
ｌに記載したように３つの異なるＬｉｐ＋ビ、オレオポ
ランス菌株の培養菌から、部分的に精製した。半分（２
５μａ）の部分的に精製されたプラスミドＤＮＡを、５
０μＱ溶液（０，０２５Ｍトリス−ＨＣＱｐＨ７，８，
０，０５Ｍ ＮａＣｌ２，０゜０１Ｍ ＭｇＣＱ、、１
００ μｓ／ｍＱＢ Ｓ Ａ、 ２ｍＭβ−メルカプ
トエタノール、および２００μｇ／ｍΩリボヌクレアー
ゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）からなる）中に、制限酵素Ｘｈｏ
Ｉの７．５Ｕと共に混合し、３７℃で一晩培養した。
消化したプラスミドＤＮＡを０．７％アガロースゲル電
気泳動で分析した。ゲルと保有緩衝液（ｒｅｓｅｒｖｏ
ｉｒ ｂｕｆｆｅｒ）は、０．０８９Ｍ トリス−ボレ
ートおよび０．０８９ホウ酸（マリンクロット（Ｍａｌ
ｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）株式会社、パリス（Ｐａｒｉｓ）
、ケーワイ（ＫＹう）であった。ゲル（ＤＮＡ）を０．
５μｇ／ｍ＋２エチジウムブロマイドで２５分間室温で
染色し、ｌ ｍＭ ＭｇＳ Ｏ、で３０分間室温で洗浄
し、非ＤＮＡ結合エチジウムブロマイドを除去した。
気泳動で分析した。ゲルと保有緩衝液（ｒｅｓｅｒｖｏ
ｉｒ ｂｕｆｆｅｒ）は、０．０８９Ｍ トリス−ボレ
ートおよび０．０８９ホウ酸（マリンクロット（Ｍａｌ
ｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）株式会社、パリス（Ｐａｒｉｓ）
、ケーワイ（ＫＹう）であった。ゲル（ＤＮＡ）を０．
５μｇ／ｍ＋２エチジウムブロマイドで２５分間室温で
染色し、ｌ ｍＭ ＭｇＳ Ｏ、で３０分間室温で洗浄
し、非ＤＮＡ結合エチジウムブロマイドを除去した。
ＤＮＡフラグメントパターンおよびサイズを表１に示し
た。
た。
表１
リパーゼ陽性組み換え体プラスミドのサイズ分析
フラグメントＮｏ ｐＨＳＨ１ｐＨＳＨ２ｐＨＳＨ７
１９，４ ２７，４ ５４，９ ６３，１３，１ ７１，２ 合計Ｋｂ ２３．７ ２１．２ ２３．８ ３種の組み換え体プラスミドのそれぞれは、プセウドモ
ナスＤＮＡの２０Ｋｂを少し越えて有していた。３つの
通常の７ラグメント、それはリパー遺伝子総計１３．２
Ｋｂを含有するが、上記表１中に示したように下線を引
いた。
１９，４ ２７，４ ５４，９ ６３，１３，１ ７１，２ 合計Ｋｂ ２３．７ ２１．２ ２３．８ ３種の組み換え体プラスミドのそれぞれは、プセウドモ
ナスＤＮＡの２０Ｋｂを少し越えて有していた。３つの
通常の７ラグメント、それはリパー遺伝子総計１３．２
Ｋｂを含有するが、上記表１中に示したように下線を引
いた。
実施例５
活性
ペプトン／イースト抽出（ＰＹＥ）培地（ｐＨ７゜５）
（ペプトン８ｇ（グラム／リットル）、イースト抽出２
ｇ、およびＮａＣｌ２５ｇを含有する）を５μｇ／ｍＱ
す７アムプシンおよび１５μｇ／ｍＱＴｃで補足し、リ
パーゼクローンを含有するピー、オレオポラン−るーＡ
ＴＣＣ８０６２Ｒｉｆ’菌株で接種した。また、組み換
え体クローンを含有しないビー６オレオポランスＡＴＣ
Ｃ８０６２およびピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒ
ｉｆ’はコントロールとして働き（陽性、陰性それぞれ
）、上記培地中で成長させた、ただしＴｃはなし。チュ
ーブをローラードラム中で３０℃で一晩培養した。続い
て、０．５％（Ｗ／Ｖ）オリーブオイル（シグマ・ケミ
カル株式会社、セント、ルイス、エムオー）で補足され
た上記培地５０ｍｆｆを含有する５００ＩＩＩＱ容量の
“流れ防止すれた（ｂａｆｆｌｅｄ）”エルレンマイヤ
ーフラスコ（フラスコの底には３つのくぼみがある）を
０．０８の Ａ、１゜に対して接種し、ロータリー振動器中３０℃で
３日間培養した。
（ペプトン８ｇ（グラム／リットル）、イースト抽出２
ｇ、およびＮａＣｌ２５ｇを含有する）を５μｇ／ｍＱ
す７アムプシンおよび１５μｇ／ｍＱＴｃで補足し、リ
パーゼクローンを含有するピー、オレオポラン−るーＡ
ＴＣＣ８０６２Ｒｉｆ’菌株で接種した。また、組み換
え体クローンを含有しないビー６オレオポランスＡＴＣ
Ｃ８０６２およびピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒ
ｉｆ’はコントロールとして働き（陽性、陰性それぞれ
）、上記培地中で成長させた、ただしＴｃはなし。チュ
ーブをローラードラム中で３０℃で一晩培養した。続い
て、０．５％（Ｗ／Ｖ）オリーブオイル（シグマ・ケミ
カル株式会社、セント、ルイス、エムオー）で補足され
た上記培地５０ｍｆｆを含有する５００ＩＩＩＱ容量の
“流れ防止すれた（ｂａｆｆｌｅｄ）”エルレンマイヤ
ーフラスコ（フラスコの底には３つのくぼみがある）を
０．０８の Ａ、１゜に対して接種し、ロータリー振動器中３０℃で
３日間培養した。
培養菌アリコート（ＩＩＩＩＱ）をエッペンドルフ遠心
分離で１３０００Ｘｇ、１分間遠心分離した。培養菌上
澄み液のリパーゼ活性を人工培養基としてｐ−ニトロフ
ェニルパルミテート（ＰＮＰＰ）を使用しスペクトル光
度計分析で測定した。反応容積は１ｍｇで、反応混合物
は、０．ＩＭＦリスｐＨ７。
分離で１３０００Ｘｇ、１分間遠心分離した。培養菌上
澄み液のリパーゼ活性を人工培養基としてｐ−ニトロフ
ェニルパルミテート（ＰＮＰＰ）を使用しスペクトル光
度計分析で測定した。反応容積は１ｍｇで、反応混合物
は、０．ＩＭＦリスｐＨ７。
５．０．５％（ｖ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ
−１００（シグマ・ケミカル・セント、ルイス、エムオ
ー）および０ 、２ ｗａ９／ｒｎＱ ｐ−ニトロフェ
ニルパルミテート（シグマ・ケミカル株式会社、セント
、ルイス、エムオー）を含有していた。リパーゼ分析は
、培養菌上澄み液のアリコートを反応混合物中に加える
ことによって開始し、１分間で４００ｎｍでの吸収を増
加させた。リパーゼは黄色を製造するｐニトロフェニル
部分を放出するＰＮＰＰの加水分解を媒介した。リパー
ゼ活性を表２に示した。
−１００（シグマ・ケミカル・セント、ルイス、エムオ
ー）および０ 、２ ｗａ９／ｒｎＱ ｐ−ニトロフェ
ニルパルミテート（シグマ・ケミカル株式会社、セント
、ルイス、エムオー）を含有していた。リパーゼ分析は
、培養菌上澄み液のアリコートを反応混合物中に加える
ことによって開始し、１分間で４００ｎｍでの吸収を増
加させた。リパーゼは黄色を製造するｐニトロフェニル
部分を放出するＰＮＰＰの加水分解を媒介した。リパー
ゼ活性を表２に示した。
表２
ヒ−，７ｉし７）−ポ５ ンＸＡＴＣＣ８０６２Ｒｉｆ
’：（プラスミドなし＞ ０．０
０（リパーゼクローン１） ０．０１７（
リパーゼクローン２） ０−０１７（リパ
ーゼクローン３） ０．０１０ヒ−、ｘＺ
ヒ−、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆｒ１８．５コントロー
ルピー、オレオポランス菌株は、リパーゼ活性を全く示
さなかった。一方、ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０
８は高いリパーゼ活性を有していた。リパーゼ活性の１
ユニツトは、上記した分析条件で３０℃で１分間ＰＮＰ
Ｐ １μｍｏｌｅを加水分解するのに要求されるリパ
ーゼ酵素の量として定義される。リパーゼ遺伝子を有す
る組み換え体プラスミドを含有するビー、オレオボラン
ス菌株は、ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８に比べ
て約０．１％のレベルのリパーゼ活性を有していた。こ
の低いが重要なリパーゼ活性は、たぶんビー、オレボバ
ランスの転写および／または翻訳の機構の無能さにあり
、ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８の調節（開始）
連鎖を認める。
’：（プラスミドなし＞ ０．０
０（リパーゼクローン１） ０．０１７（
リパーゼクローン２） ０−０１７（リパ
ーゼクローン３） ０．０１０ヒ−、ｘＺ
ヒ−、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆｒ１８．５コントロー
ルピー、オレオポランス菌株は、リパーゼ活性を全く示
さなかった。一方、ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０
８は高いリパーゼ活性を有していた。リパーゼ活性の１
ユニツトは、上記した分析条件で３０℃で１分間ＰＮＰ
Ｐ １μｍｏｌｅを加水分解するのに要求されるリパ
ーゼ酵素の量として定義される。リパーゼ遺伝子を有す
る組み換え体プラスミドを含有するビー、オレオボラン
ス菌株は、ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８に比べ
て約０．１％のレベルのリパーゼ活性を有していた。こ
の低いが重要なリパーゼ活性は、たぶんビー、オレボバ
ランスの転写および／または翻訳の機構の無能さにあり
、ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８の調節（開始）
連鎖を認める。
実施例６
パート１：リパーゼ遺伝子を含有するより小さい普通の
ＤＮＡフラグメントの検出 実施例４で記述したように、３つの種類のリパーゼ遺伝
子を含有するビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８ＤＮ
Ａ挿入物は、普通のＤＮＡの１３．２Ｋｂを有する。３
つの種類のＬｉｐ＋プラスミドＤＮＡを実施例１、パー
ト２に記述したように単離した。３つの種類の組み換え
体プラスミドそれぞれの０．５μｙ、制限酵素Ｈ４ｎｄ
ｌｎのＩＯＵを実施例４中の消化緩衝液と同じ成分を含
有する２０μＱ溶液中に混合した物を３７°Ｃで１時間
培養した。消化したプラスミドＤＮＡをアガローゼゲル
電気泳動で分析した。３つの独特なりＮＡフラグメント
パターンは、多分完全なリパーゼ遺伝子を有する単一の
８．ＯＫｂの普通のＤＮＡフラグメントを示した。
ＤＮＡフラグメントの検出 実施例４で記述したように、３つの種類のリパーゼ遺伝
子を含有するビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８ＤＮ
Ａ挿入物は、普通のＤＮＡの１３．２Ｋｂを有する。３
つの種類のＬｉｐ＋プラスミドＤＮＡを実施例１、パー
ト２に記述したように単離した。３つの種類の組み換え
体プラスミドそれぞれの０．５μｙ、制限酵素Ｈ４ｎｄ
ｌｎのＩＯＵを実施例４中の消化緩衝液と同じ成分を含
有する２０μＱ溶液中に混合した物を３７°Ｃで１時間
培養した。消化したプラスミドＤＮＡをアガローゼゲル
電気泳動で分析した。３つの独特なりＮＡフラグメント
パターンは、多分完全なリパーゼ遺伝子を有する単一の
８．ＯＫｂの普通のＤＮＡフラグメントを示した。
パート２： ８．ＯＫｂの普通の７ラグメントを生成し
たＨｉｎｄｎ［の単離 実施例４における消化緩衝液と同じ成分を含有する溶液
２００μΩ中にプラスミドｐＨＳＨＩ ＤＮＡ１００
μｙおよびＨｉｎｄｌ［Ｉの３００Ｕ混合した溶液を３
７℃１時間で培養した。次に、ＤＮＡ消化フラグメント
を垂直アガローゼゲル電気泳動により分離した。−アガ
ローゼゲル濃度は０．９％であった。ゲルおよび保有緩
衝液は、０．０４Ｍトリス−アセテートおよび２ｍＭＥ
ＤＴＡであった。
たＨｉｎｄｎ［の単離 実施例４における消化緩衝液と同じ成分を含有する溶液
２００μΩ中にプラスミドｐＨＳＨＩ ＤＮＡ１００
μｙおよびＨｉｎｄｌ［Ｉの３００Ｕ混合した溶液を３
７℃１時間で培養した。次に、ＤＮＡ消化フラグメント
を垂直アガローゼゲル電気泳動により分離した。−アガ
ローゼゲル濃度は０．９％であった。ゲルおよび保有緩
衝液は、０．０４Ｍトリス−アセテートおよび２ｍＭＥ
ＤＴＡであった。
ゲルは実施例４に記載のように染色および脱色した。８
．ＯＫｂ ＤＮＡ帯を含有するゲルをかみそり刃で切除
し、１８番ゲージの針に通し、蒸留水Ｈ，Ｏの１５＋ｍ
１２を含有するチューブ中へ押し出した。チューブを４
°Ｃで一晩、前後に振動させた。
．ＯＫｂ ＤＮＡ帯を含有するゲルをかみそり刃で切除
し、１８番ゲージの針に通し、蒸留水Ｈ，Ｏの１５＋ｍ
１２を含有するチューブ中へ押し出した。チューブを４
°Ｃで一晩、前後に振動させた。
８．０Ｋｂ７ラグメント含有ＤＮＡ溶液を何回も遠心分
離して濃縮しアガローゼを取り除き、そして何回もｎ−
ブタノールで抽出することによりＨ，０を取り除いた。
離して濃縮しアガローゼを取り除き、そして何回もｎ−
ブタノールで抽出することによりＨ，０を取り除いた。
最後に、ＤＮＡを沈澱させて実施例１に記載したように
ＴＥ ｐＨｇ中に再懸濁しブこ。
ＴＥ ｐＨｇ中に再懸濁しブこ。
パート３：クローニング用プラスミドｐｃＰ１３の調製
実施例４に記載したように消化緩衝液と同じ成分を含有
する２５０μＣ溶液中にプラスミドｐＣＰ１３６０μり
および制限酵素几胆ｄＩ［［１８０Ｕを混合した液を３
７℃で一晩培養した。制限酵素および他の汚染タンパク
を実施例１パート３に記載したように有機溶媒抽出で除
去した。また線状になったｐｃＰ１３ ＤＮＡをエタ
ノール沈澱により取り入れ、７０％エタノールで３回洗
浄し、実施例１１パート３に記載したように再懸濁させ
た。アガローゼゲル電気泳動によるプラスミドＤＮＡの
分析によると消化は完全であった。
する２５０μＣ溶液中にプラスミドｐＣＰ１３６０μり
および制限酵素几胆ｄＩ［［１８０Ｕを混合した液を３
７℃で一晩培養した。制限酵素および他の汚染タンパク
を実施例１パート３に記載したように有機溶媒抽出で除
去した。また線状になったｐｃＰ１３ ＤＮＡをエタ
ノール沈澱により取り入れ、７０％エタノールで３回洗
浄し、実施例１１パート３に記載したように再懸濁させ
た。アガローゼゲル電気泳動によるプラスミドＤＮＡの
分析によると消化は完全であった。
ＨｉｎｄＩ［［消化ｐｃＰ１３ ＤＮＡは、実施例１
１パート４に記載したように脱リン酸反応し、次の結紮
反応でプラスミドが回送するのを防止した。
１パート４に記載したように脱リン酸反応し、次の結紮
反応でプラスミドが回送するのを防止した。
さらに、実施例１、パート３に記載したように汚染タン
パクを除去し、脱リン酸反応したＤＮＡを沈澱、取り入
れ、そして洗浄およびＴＥ ｐＨＢ中に再懸濁させた
。
パクを除去し、脱リン酸反応したＤＮＡを沈澱、取り入
れ、そして洗浄およびＴＥ ｐＨＢ中に再懸濁させた
。
パート４：Ｆ２フラグメントのプラスミドｐＣＰ１３で
の組み換え 等量（０，５μｇ）のＦ２およびｐｃＰ１３ ＤＮＡ
および２０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを２０μｇ溶液（実
施例↓、パート４で記載したのと同じ結紮緩衝液を含む
）中に一緒にし、１４℃で一晩培養した。アガローゼゲ
ル電気泳動によるＤＮＡ結紮混合物を分析したところ、
結紮は完全であった。
の組み換え 等量（０，５μｇ）のＦ２およびｐｃＰ１３ ＤＮＡ
および２０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを２０μｇ溶液（実
施例↓、パート４で記載したのと同じ結紮緩衝液を含む
）中に一緒にし、１４℃で一晩培養した。アガローゼゲ
ル電気泳動によるＤＮＡ結紮混合物を分析したところ、
結紮は完全であった。
パート５ ：Ｆ ２／ｐＣＰ １３組み換え体プラスミ
ドを含有するイー、コーリーセルの単離反応能のあるイ
ー、コーリー ＨＢＩＯＩセルを実施例３、パート２に
記載したように調製した。
ドを含有するイー、コーリーセルの単離反応能のあるイ
ー、コーリー ＨＢＩＯＩセルを実施例３、パート２に
記載したように調製した。
前のパートで調製された結紮ＤＮＡの１／２をＨＢＩＯ
Ｉのセルに形質転換し、形式転換体を実施例３パート３
に記載したように選択した。
Ｉのセルに形質転換し、形式転換体を実施例３パート３
に記載したように選択した。
２２Ｔｃ’ＨＢ ｌ ０１形質転換体のプラスミド含量
は、実施例４に記載したように分析した。この場合、部
分的に精製したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄｌ
ｌＩで消化した。アガローゼゲル電気泳動″Ｃ０８９％
アガローゼ濃度）による分析によると、すべての２２形
質転換体は、８．０ＫｂＦ２７ラグメントを有する組み
換え体ｐｃＰ１３プラスミドを含有していた。
は、実施例４に記載したように分析した。この場合、部
分的に精製したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄｌ
ｌＩで消化した。アガローゼゲル電気泳動″Ｃ０８９％
アガローゼ濃度）による分析によると、すべての２２形
質転換体は、８．０ＫｂＦ２７ラグメントを有する組み
換え体ｐｃＰ１３プラスミドを含有していた。
パート６：Ｆ２フラグメントが完全なリパーゼ遺伝子を
含有することの決定 Ｆ２／ｐｃＰ１３組み換え体プラスミド（ｐＨＳＨ１７
と呼ばれる）を実施例２パート２に記載したようにイー
、コーリーＨＢＩＯＩからピー、オレオポランスＡＴＣ
Ｃ８０６２Ｒｉｆ’へ接合により転移した。すべてのピ
ー、オレオポランスＴｃ’転移接合体コロニーは、半透
ひまし油エマルジョンを含有する寒天プレート上に透明
ゾーンを形成した。４つのピー、オレオポランスＴｃ’
転移接合体のプラスミド含量を前のパートで記述したよ
うに分析した。アガローゼゲル電気泳動分析によると、
すべての４つの転移接合体は、８．０ＫｂＦ２７ラグメ
ントを有する組み換え体ｐｃＰ１３プラスミドを含有し
ていた。この結果は、Ｆ２フラグメントは完全なピー、
エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８リパーゼ遺伝子を含有し
ていることを示している。
含有することの決定 Ｆ２／ｐｃＰ１３組み換え体プラスミド（ｐＨＳＨ１７
と呼ばれる）を実施例２パート２に記載したようにイー
、コーリーＨＢＩＯＩからピー、オレオポランスＡＴＣ
Ｃ８０６２Ｒｉｆ’へ接合により転移した。すべてのピ
ー、オレオポランスＴｃ’転移接合体コロニーは、半透
ひまし油エマルジョンを含有する寒天プレート上に透明
ゾーンを形成した。４つのピー、オレオポランスＴｃ’
転移接合体のプラスミド含量を前のパートで記述したよ
うに分析した。アガローゼゲル電気泳動分析によると、
すべての４つの転移接合体は、８．０ＫｂＦ２７ラグメ
ントを有する組み換え体ｐｃＰ１３プラスミドを含有し
ていた。この結果は、Ｆ２フラグメントは完全なピー、
エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８リパーゼ遺伝子を含有し
ていることを示している。
実施例７
リパーゼ遺伝子および抗生抵抗マーカーを含有するプラ
スミドのプセウドモナス・アエルギノーザおよびプセウ
ドモナス・フルオレッセンス中への接合 実施例６に記述されたように組み立てられた組み換え体
プラスミドｐＨＳＨ１７をリパーゼ遺伝子を含有するＤ
ＮＡ７ラグメント（Ｆ２）の源として使用した。プラス
ミドｐＨＳＨ１７を、実施例２パート２に記述している
ように、接合により、±二、コーリーＨＢ ｌ ０１か
ら、止、アユルギｌ二文ＰＡＯ２００３（ピー、ホロウ
ェー（Ｅ。
スミドのプセウドモナス・アエルギノーザおよびプセウ
ドモナス・フルオレッセンス中への接合 実施例６に記述されたように組み立てられた組み換え体
プラスミドｐＨＳＨ１７をリパーゼ遺伝子を含有するＤ
ＮＡ７ラグメント（Ｆ２）の源として使用した。プラス
ミドｐＨＳＨ１７を、実施例２パート２に記述している
ように、接合により、±二、コーリーＨＢ ｌ ０１か
ら、止、アユルギｌ二文ＰＡＯ２００３（ピー、ホロウ
ェー（Ｅ。
Ｈｏｆ ｌｏｗａｙ）、デプト・オプ・ジェネティック
ス（Ｄｅｐｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、モナシュ
ーユニバーシティー（Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ）、クレイトン（Ｃ１ａｙｔｏｎ））、ビクトリ
ア（Ｖ １ｃｔｏｒｉａ）、オーストラリア）Ｒｉｆ’
およびピー、フルオレッセンスＡＴＣＣ９４８Ｒｉｆ’
へ転移させた。ピー、アエルギノーザＰＡ ０２００
３Ｒｉｆ“は低い固有のリパーゼ活性を有しているので
、転移接合体は、ひまし油寒天プレート上にわずかに広
い透明ゾーンを形成した（実施例２バート２を見よ）。
ス（Ｄｅｐｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、モナシュ
ーユニバーシティー（Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ）、クレイトン（Ｃ１ａｙｔｏｎ））、ビクトリ
ア（Ｖ １ｃｔｏｒｉａ）、オーストラリア）Ｒｉｆ’
およびピー、フルオレッセンスＡＴＣＣ９４８Ｒｉｆ’
へ転移させた。ピー、アエルギノーザＰＡ ０２００
３Ｒｉｆ“は低い固有のリパーゼ活性を有しているので
、転移接合体は、ひまし油寒天プレート上にわずかに広
い透明ゾーンを形成した（実施例２バート２を見よ）。
さらに、ピー、フルオレッセンス転移接合体は、透明ゾ
ーンを形成した。いくつかのピー、アエルギノーザおよ
びピー、フルオレッセンスＴｃ’転移接合体のプラスミ
ド含量を実施例６パート５に記載したように分析した。
ーンを形成した。いくつかのピー、アエルギノーザおよ
びピー、フルオレッセンスＴｃ’転移接合体のプラスミ
ド含量を実施例６パート５に記載したように分析した。
アガローゼゲル電気泳動分析によると、両種のすべての
転移接合体は、プラスミドｐＨＳＨ１７を含有していた
。
転移接合体は、プラスミドｐＨＳＨ１７を含有していた
。
ヒー、アエルギノーサ、ピー、フルオレッセンス、およ
びｐＨＳＨ１７を含有するピー、オレオポランス菌株の
リパーゼ活性を実施例５に記述しであるように決定した
。実施例５におけるように、ｐＨＳＨＩ７を含有してい
な菌株はコントロールとして役に立ち、記述したように
成長させた。リパーゼ活性を表３に示した。コントロー
ルピー、オレオポランスおよびピー、フルオレッセンス
菌株はリパーゼ活性を全く有さなかったが、ピー、アエ
ルギノーザは低いリパーゼ活性を有していた。ピー、フ
ルオレッセンス（ｐＨＳＨ１７）組み換え体菌株は、低
いリパーゼ活性を有しており、その活性はピー、オレオ
ポランス（ｐＨＳＨ１７）のリパーゼ活性よりもわずか
に高かった。他方、ピー、アエルギノーザ（ｐＨＳＨＩ
７）は、ピー、フルオレッセ＞７．菌株の活性の約５倍
のリパーゼ活性を有していた（背景分を差し引いた後）
。
びｐＨＳＨ１７を含有するピー、オレオポランス菌株の
リパーゼ活性を実施例５に記述しであるように決定した
。実施例５におけるように、ｐＨＳＨＩ７を含有してい
な菌株はコントロールとして役に立ち、記述したように
成長させた。リパーゼ活性を表３に示した。コントロー
ルピー、オレオポランスおよびピー、フルオレッセンス
菌株はリパーゼ活性を全く有さなかったが、ピー、アエ
ルギノーザは低いリパーゼ活性を有していた。ピー、フ
ルオレッセンス（ｐＨＳＨ１７）組み換え体菌株は、低
いリパーゼ活性を有しており、その活性はピー、オレオ
ポランス（ｐＨＳＨ１７）のリパーゼ活性よりもわずか
に高かった。他方、ピー、アエルギノーザ（ｐＨＳＨＩ
７）は、ピー、フルオレッセ＞７．菌株の活性の約５倍
のリパーゼ活性を有していた（背景分を差し引いた後）
。
表３
異なったプセウドモナス菌株のリパーゼ活性（プラスミ
ドなし） （ｐｆ（ＳｎＩ２） ヒ−、７ｘルキ／ −ｆＰＡ ０２００３ Ｒｉｆｒ（
プラスミドなし） （＋）Ｈ５Ｈ１７） ヒー、フルオレッセンスＡＴＣＣ９４８Ｒ１ｆｒ（プラ
スミドなし） ／−ｕｃＬ１１７’＋ ０．００ ０．０３ ０．１９ ０．４０ ０．００ 実施例８ プラスミドｐＭＥ ２９０ （Ｃｂ Ｋｍ Ｍｏｂ−；
デイハース（Ｄ、 ）（ａａｓ）、ミクロバイオロジ
ッシェス・インスティテニート（Ｍ ｉｋｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｓｃｈｅｓＩ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、エイドケネ
ッシッシェ・テクニッシエホツクシニーレ（Ｅ ｉｄｇ
ｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅ ＴｅｃｈｎｉｓｃｈｅＨｏｃ
ｋｓｃｈｕ ｌｅ）、チューリッヒ、スイス）、それは
、ピー、アエルギノーザプラスミドｐＶ Ｓ １ （Ｈ
ｇＳｕＭｏｂ ＩｎｃＰ（未分類）イト−（ｌ ｔｏ
ｈ）ら、Ｐ ｌａｓｍｉｄ（１９８４）、１１，２０６
−２２０）から誘導されたのであるが、サイズ６．８Ｋ
ｂ、カルベニシリン（Ｃｂ）を暗号化する遺伝子および
Ｋｍ抵抗を携帯し、挿入不活性（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａ
ｌ １ｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を経て性質の異なる
ＤＮＡをクローニングするためのいくつかの部位を有す
る（イト−およびハース、Ｇｅｎｅ（１９８５）、旦、
２７〜３６）、さらに、非可動性プラスミドｐＭＥ２９
０を形質転換により導入し、セル当り７〜１０コピーの
間の程度でプセウドモナスの種々の種に保持することが
できる。
ドなし） （ｐｆ（ＳｎＩ２） ヒ−、７ｘルキ／ −ｆＰＡ ０２００３ Ｒｉｆｒ（
プラスミドなし） （＋）Ｈ５Ｈ１７） ヒー、フルオレッセンスＡＴＣＣ９４８Ｒ１ｆｒ（プラ
スミドなし） ／−ｕｃＬ１１７’＋ ０．００ ０．０３ ０．１９ ０．４０ ０．００ 実施例８ プラスミドｐＭＥ ２９０ （Ｃｂ Ｋｍ Ｍｏｂ−；
デイハース（Ｄ、 ）（ａａｓ）、ミクロバイオロジ
ッシェス・インスティテニート（Ｍ ｉｋｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｉｓｃｈｅｓＩ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、エイドケネ
ッシッシェ・テクニッシエホツクシニーレ（Ｅ ｉｄｇ
ｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅ ＴｅｃｈｎｉｓｃｈｅＨｏｃ
ｋｓｃｈｕ ｌｅ）、チューリッヒ、スイス）、それは
、ピー、アエルギノーザプラスミドｐＶ Ｓ １ （Ｈ
ｇＳｕＭｏｂ ＩｎｃＰ（未分類）イト−（ｌ ｔｏ
ｈ）ら、Ｐ ｌａｓｍｉｄ（１９８４）、１１，２０６
−２２０）から誘導されたのであるが、サイズ６．８Ｋ
ｂ、カルベニシリン（Ｃｂ）を暗号化する遺伝子および
Ｋｍ抵抗を携帯し、挿入不活性（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａ
ｌ １ｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を経て性質の異なる
ＤＮＡをクローニングするためのいくつかの部位を有す
る（イト−およびハース、Ｇｅｎｅ（１９８５）、旦、
２７〜３６）、さらに、非可動性プラスミドｐＭＥ２９
０を形質転換により導入し、セル当り７〜１０コピーの
間の程度でプセウドモナスの種々の種に保持することが
できる。
ＨｉｎｄＩ［＋はリパーゼ遺伝子を含有する８、０Ｋｂ
Ｆ２ ＤＮＡフラッグメント（実施例６パート２に記述
されているように単離される）を生成した。
Ｆ２ ＤＮＡフラッグメント（実施例６パート２に記述
されているように単離される）を生成した。
プラスミドｐＭＥ２９０を実施例１１パート２に記載し
た方法によりピー、アエルギノーザＰＡ０２００３ Ｒ
ｉｆ’（ｐＭＥ ２９０）のセルから精製した。バクテ
リアを５ｇ／Ｑのイースト抽出物および１００μｇ／ｗ
ｒＱのカルベニシリン（シグマ・ケミカル株式会社、セ
ント、ルイス、エムオー）で補足した栄養素液体培養基
中で成長させた。
た方法によりピー、アエルギノーザＰＡ０２００３ Ｒ
ｉｆ’（ｐＭＥ ２９０）のセルから精製した。バクテ
リアを５ｇ／Ｑのイースト抽出物および１００μｇ／ｗ
ｒＱのカルベニシリン（シグマ・ケミカル株式会社、セ
ント、ルイス、エムオー）で補足した栄養素液体培養基
中で成長させた。
１７．５μ９のプラスミドｐＭＥ２９０ＤＮＡおよび５
２．５Ｕの制限酵素ＨｉｎｄＤＩを実施例４で使用した
消化緩衝液と同じ成分を含有する２５０μＱ溶液中に一
緒にし、３７℃で一晩培養した。制限酵素および他の汚
染タンパクを除去し、培養プラスミドＤＮＡを実施例１
パート３に記述されているように取り入れ、再懸濁させ
た。次に、消化ｐＭＥ２９０ＤＮＡを実施例１パート４
に記述されているように脱リン酸反応した。さらに、実
施例１パート３に記述したように汚染プロティンを除去
し、そして脱リン酸反応したＤＮＡを沈澱させ、取り入
れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨ８緩衝液中で再懸濁させた
。
２．５Ｕの制限酵素ＨｉｎｄＤＩを実施例４で使用した
消化緩衝液と同じ成分を含有する２５０μＱ溶液中に一
緒にし、３７℃で一晩培養した。制限酵素および他の汚
染タンパクを除去し、培養プラスミドＤＮＡを実施例１
パート３に記述されているように取り入れ、再懸濁させ
た。次に、消化ｐＭＥ２９０ＤＮＡを実施例１パート４
に記述されているように脱リン酸反応した。さらに、実
施例１パート３に記述したように汚染プロティンを除去
し、そして脱リン酸反応したＤＮＡを沈澱させ、取り入
れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨ８緩衝液中で再懸濁させた
。
等量（０，５μｇ）のＤＮＡフラグメントＦ２およびｐ
ＭＥ２９０ＤＮＡを実施例６バート４に記述したように
共に結紮した。ＤＮＡ結紮混合物をアガローゼゲル電気
泳動で分析したところ結紮は完全であった。
ＭＥ２９０ＤＮＡを実施例６バート４に記述したように
共に結紮した。ＤＮＡ結紮混合物をアガローゼゲル電気
泳動で分析したところ結紮は完全であった。
効果的な形質転換用のピー、アエルギノーザＰＡ０２０
０３Ｒｉｆ’セルを、ＭｇＣＱ１処理前に１７５ｒｐｍ
３−時間ロータリー振動器上３７℃でルリア液体培養基
中で成長させた以外、レデルベルグ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒ
ｇ）およびコーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｊ 、 Ｂａｃｔ
ｅｒ角包■（１９７４）、１上９．ＩＱ７２〜１０７４
の方法により調製した。
０３Ｒｉｆ’セルを、ＭｇＣＱ１処理前に１７５ｒｐｍ
３−時間ロータリー振動器上３７℃でルリア液体培養基
中で成長させた以外、レデルベルグ（Ｌｅｄｅｒｂｅｒ
ｇ）およびコーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｊ 、 Ｂａｃｔ
ｅｒ角包■（１９７４）、１上９．ＩＱ７２〜１０７４
の方法により調製した。
プラスミドのピー、アエルギノーザ中へ形質転換するた
めに、上記で調製したＤＮＡ結紮混合物の半分をレデル
ベルグおよびコーヘン、Ｊ。
めに、上記で調製したＤＮＡ結紮混合物の半分をレデル
ベルグおよびコーヘン、Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７４）、１上９，１０
７２〜１０７４の方法によりピー、アエルギノーザＰＡ
０２００３Ｒｉｆ’の成分セル中へ形質転換した。
７２〜１０７４の方法によりピー、アエルギノーザＰＡ
０２００３Ｒｉｆ’の成分セル中へ形質転換した。
そのセルを５００μｇ／ｍＱのカルベニシリン含有栄養
素寒天培養基プレート上で３７°Ｃ−晩培養した。この
選択培養基により、ｃｂ抵抗マーカーを有するｐＭＥ２
９０プレートを含有するセルのみの成長が可能となる。
素寒天培養基プレート上で３７°Ｃ−晩培養した。この
選択培養基により、ｃｂ抵抗マーカーを有するｐＭＥ２
９０プレートを含有するセルのみの成長が可能となる。
組み換え体ＤＮＡを含有するセルの数を決定するため、
ｃｂ’セルをカナマイシンに対する感度のために遮断し
た。ＤＮＡの７ラグメントをｐＭＥ２９０の唯一のＨｉ
ｎｄＩ［［制限部位へ挿入することにより、Ｋｍ抵抗を
暗号化するプラスミドを不活性化するので、Ｋｍ感度の
頻度により、Ｃｂ′形質転換体の固体群中に組み換え体
ｐＭＥ２９０プラスミドを含有するピー、アエルギノー
ザセルの数がわかる。Ｃｂ′抵抗セルの２゜３０％が、
Ｋｍ’でもあり、フラグメントＦ２を含有するｐＭＥ２
９０プラスミドを示している（ｐＨＥＳ３と呼ぶ）。
ｃｂ’セルをカナマイシンに対する感度のために遮断し
た。ＤＮＡの７ラグメントをｐＭＥ２９０の唯一のＨｉ
ｎｄＩ［［制限部位へ挿入することにより、Ｋｍ抵抗を
暗号化するプラスミドを不活性化するので、Ｋｍ感度の
頻度により、Ｃｂ′形質転換体の固体群中に組み換え体
ｐＭＥ２９０プラスミドを含有するピー、アエルギノー
ザセルの数がわかる。Ｃｂ′抵抗セルの２゜３０％が、
Ｋｍ’でもあり、フラグメントＦ２を含有するｐＭＥ２
９０プラスミドを示している（ｐＨＥＳ３と呼ぶ）。
ピー、アエルギノーザ（ｐＨＥＳ３）菌株のリパーゼ活
性は、実施例５に記載したように決定した。
性は、実施例５に記載したように決定した。
プラスミドｐＭＥ２９０およびピー、エスピーＡＴＣＣ
２１８０８Ｒｉｆ’を含有するピー、アエルギノーザ菌
株は、陰性および陽性コントロールとして（それぞれ）
役に立ち、実施例５に記載したように成長させた。リパ
ーゼ活性を表４に示す。コントロールピー、アエルギノ
ーザ（ｐＭＥ２９０）は低い固有のリパーゼ活性を有し
ていた。ピーアエルギノーザ（ｐＨＥＳ３）組み換え体
菌株は、ピー、アエルギノーザ（ｐＭＥ ２９０）の活
性の２倍のリパーゼ活性を有していた（背景分を差し引
いた後）。さらに、ピー、アエルギノーザ（ｐＨＥＳ３
）のリパーゼ活性は、ピー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８
０８Ｒｉｆ’の活性の約５％でありＩこ。
２１８０８Ｒｉｆ’を含有するピー、アエルギノーザ菌
株は、陰性および陽性コントロールとして（それぞれ）
役に立ち、実施例５に記載したように成長させた。リパ
ーゼ活性を表４に示す。コントロールピー、アエルギノ
ーザ（ｐＭＥ２９０）は低い固有のリパーゼ活性を有し
ていた。ピーアエルギノーザ（ｐＨＥＳ３）組み換え体
菌株は、ピー、アエルギノーザ（ｐＭＥ ２９０）の活
性の２倍のリパーゼ活性を有していた（背景分を差し引
いた後）。さらに、ピー、アエルギノーザ（ｐＨＥＳ３
）のリパーゼ活性は、ピー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８
０８Ｒｉｆ’の活性の約５％でありＩこ。
（以下、余白）
表
４
ＰＡＯ２００３Ｒｉｆｒ
（ｐＭＥ２９０）
（ｐＨＥＳ３）
ビー、エスピー、ＡＴＣＣ
０，１９３
０，６６１
Ｈｉｎｄｎｌはリパーゼ遺伝子を含有する８ 、 Ｏｋ
ｂＦ２ＤＮＡフラグメント（実施例６パート６に記述さ
れているように単離される）を生成しｔ；。
ｂＦ２ＤＮＡフラグメント（実施例６パート６に記述さ
れているように単離される）を生成しｔ；。
ｐＭＥ ２８５（ＨｇＫｍＭｏｂ” ；デイ−１）＼
−ス、ミクロバイオロジツシエス・インステイテニート
、エイドゲネッシエ・テクニツシエ・ホックシューレ、
チューリッヒ、スイス）をクローニングベクターとして
選択した。なぜなら、それはｐＭＥ２９０と同じビー、
アエルギノーザプラスミド（ｐＶＳｌ）から誘導されて
おり、選択可能な水銀抵抗（Ｈｇ）遺伝子をもっている
。
−ス、ミクロバイオロジツシエス・インステイテニート
、エイドゲネッシエ・テクニツシエ・ホックシューレ、
チューリッヒ、スイス）をクローニングベクターとして
選択した。なぜなら、それはｐＭＥ２９０と同じビー、
アエルギノーザプラスミド（ｐＶＳｌ）から誘導されて
おり、選択可能な水銀抵抗（Ｈｇ）遺伝子をもっている
。
プラスミドｐＭＥ２８５（イト−および／Ｘ−ス、Ｇｅ
ｎｅ（１９８５）、３６．２７−３６）を実施例８に記
述したように、旦二、アエルギノーザＰＡＯ２００３Ｒ
ｉｆ’（ｐＭＥ ２８５）の細胞から精製した。
ｎｅ（１９８５）、３６．２７−３６）を実施例８に記
述したように、旦二、アエルギノーザＰＡＯ２００３Ｒ
ｉｆ’（ｐＭＥ ２８５）の細胞から精製した。
ただし、バクテリアの成長培地は、２．５μｇ／ｍｆｆ
の塩化水銀（Ｈｇ ＣＬＸシグマ・ケミカル株式会社、
セントルイス、エムオー）および１００μｇ／ｍ１２Ｋ
ｍで補足されている。プラスミドｐＭＥ２８５ＤＮＡの
ｌｏμｇおよび制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉの３０Ｕを、実
施例４に使用した消化緩衝液と同じ成分を含有する１２
５μＱ溶液中に一緒にした。
の塩化水銀（Ｈｇ ＣＬＸシグマ・ケミカル株式会社、
セントルイス、エムオー）および１００μｇ／ｍ１２Ｋ
ｍで補足されている。プラスミドｐＭＥ２８５ＤＮＡの
ｌｏμｇおよび制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉの３０Ｕを、実
施例４に使用した消化緩衝液と同じ成分を含有する１２
５μＱ溶液中に一緒にした。
３７℃で一晩反応を培養した後、消化されたｐＭＥ２８
５プラスミドを実施例１パート４に記載したように脱リ
ン酸反応した。ただし、最終容積は２１６μｇであった
。さらに実施例１パート３に記述しているように汚染タ
ンパクを除去し、そして、脱リン酸反応されたＤＮＡを
沈殿させ、取り入れ、洗浄し、ＴＥｐＨ８中に再懸濁し
た。
５プラスミドを実施例１パート４に記載したように脱リ
ン酸反応した。ただし、最終容積は２１６μｇであった
。さらに実施例１パート３に記述しているように汚染タ
ンパクを除去し、そして、脱リン酸反応されたＤＮＡを
沈殿させ、取り入れ、洗浄し、ＴＥｐＨ８中に再懸濁し
た。
フラグメントＦ２を実施例８に記述されているようにプ
ラスミドｐＭＥ２８５に結紮した。ＤＮＡ結紮混合物の
１／２を実施例８に記述したようにピー、アエルギノー
ザＰＡＥ ２００３ Ｒｉｆ’の反応性セル中へ形質転
換した。この場合、形質転換したセルを、５０ ｐｇ／
ｍＱＲｉｆおよび３０μｇ／ｍＱ ＨｇＣ（ｋを含有す
る栄養素寒天プレート上で３０℃２日間培養した。この
選択培養基により、Ｈｇ抵抗遺伝子を含有するｐＭＥ２
８５プラスミドを含有するセルのみの成長が可能となる
。組み換え体ＤＮＡを含有する細胞の数を決定するため
に、Ｈｇ’セルをＫｍに対する感度のために遮断した。
ラスミドｐＭＥ２８５に結紮した。ＤＮＡ結紮混合物の
１／２を実施例８に記述したようにピー、アエルギノー
ザＰＡＥ ２００３ Ｒｉｆ’の反応性セル中へ形質転
換した。この場合、形質転換したセルを、５０ ｐｇ／
ｍＱＲｉｆおよび３０μｇ／ｍＱ ＨｇＣ（ｋを含有す
る栄養素寒天プレート上で３０℃２日間培養した。この
選択培養基により、Ｈｇ抵抗遺伝子を含有するｐＭＥ２
８５プラスミドを含有するセルのみの成長が可能となる
。組み換え体ＤＮＡを含有する細胞の数を決定するため
に、Ｈｇ’セルをＫｍに対する感度のために遮断した。
ＤＮＡの７ラグメントをｐＭＥ２８５の唯一のＨｉｎｄ
Ｉ［［制＠部位へ挿入することは、Ｋ＋ｎ’を暗号化す
るプラスミド遺伝子を不活性化するので、Ｋｍ感度は、
組み換え体プラスミドを含有するピー、アエルギノーザ
セルを示す。すべてのＨｇ’組み換え体はＫｍ’であり
、それらはＦ２（ｐＨＳＨ４３）を含有するｐＭＥ２８
５プラスミドを有することを示している。
Ｉ［［制＠部位へ挿入することは、Ｋ＋ｎ’を暗号化す
るプラスミド遺伝子を不活性化するので、Ｋｍ感度は、
組み換え体プラスミドを含有するピー、アエルギノーザ
セルを示す。すべてのＨｇ’組み換え体はＫｍ’であり
、それらはＦ２（ｐＨＳＨ４３）を含有するｐＭＥ２８
５プラスミドを有することを示している。
ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’は本来水
銀に対して非常に感度があるので、組み換え体プラスミ
ドｐＨＳＨ４３（Ｆ２／ｐＭＥ２８５）は、形質転換の
ためリパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡの源として選択さ
れる。プラスミドｐＨＳＨ４３は、実施例３バート１に
記述されているようにピー、アエルギノーザＰＡＯ２０
０３Ｒｉｆ’（ｐＨＳＨ４３）のセルから部分的に精製
した。
銀に対して非常に感度があるので、組み換え体プラスミ
ドｐＨＳＨ４３（Ｆ２／ｐＭＥ２８５）は、形質転換の
ためリパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡの源として選択さ
れる。プラスミドｐＨＳＨ４３は、実施例３バート１に
記述されているようにピー、アエルギノーザＰＡＯ２０
０３Ｒｉｆ’（ｐＨＳＨ４３）のセルから部分的に精製
した。
バクテリア成長培地は５μｇ／ｍｌ２Ｒｉｆおよび２゜
５μｇ／ｍ＋２Ｈｇｃ（２，で補足された栄養素液体培
養基であった。再懸濁部分精製ｐＨＳＨ４３プラスミド
ＤＮＡの７５μｇを実施例８に記述したようにピー、エ
スピー、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’の反応性セル中へ
形質転換させた。ただし、セルは、ＭｇＣＱ、処理の前
、５７ｚｇ／ｍｆｆＲｉｆで補足された栄養素液体培養
基中、ロータリー振動器上２０ Ｏｒｐｍ、３時間、３
０℃で成長させた。ｐＨＳＨ４３プラスミドを含有する
ピー、エスピー＋ ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’組み換
え体を選択し実施例９に記述したように確かめた。
５μｇ／ｍ＋２Ｈｇｃ（２，で補足された栄養素液体培
養基であった。再懸濁部分精製ｐＨＳＨ４３プラスミド
ＤＮＡの７５μｇを実施例８に記述したようにピー、エ
スピー、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’の反応性セル中へ
形質転換させた。ただし、セルは、ＭｇＣＱ、処理の前
、５７ｚｇ／ｍｆｆＲｉｆで補足された栄養素液体培養
基中、ロータリー振動器上２０ Ｏｒｐｍ、３時間、３
０℃で成長させた。ｐＨＳＨ４３プラスミドを含有する
ピー、エスピー＋ ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’組み換
え体を選択し実施例９に記述したように確かめた。
実施例１１
ピー、エスピー ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’（ｐＨＳ
Ｈ４３）を、成長培地を５μｇ／ｍＱＨｇｃＱｘで補足
した以外、実施例５に記載したように成長させた。また
、プラスミドを含有しないピー、エスピー、 ＡＴＣＣ
２１８０８Ｒｉｆ’菌株およびプラスミドｐＭＥ２８５
を含有する菌株は、陰性コントロールとして役に立った
。プラスミドを含有しない菌株およびｐＭＥ２８５含有
菌株を５μｇ／ｍａＲｉｆのみ、および５ ｐ ｇ／
ｍ（ＩＲｉｆ＋ ２．５ ｐ ｇ／ｍ（ｌＨｇｃ（ｌｘ
＋ １００ ／’ｇ／ｒｎＱ Ｋｍをそレソレ有する
培地中で成長させた。
Ｈ４３）を、成長培地を５μｇ／ｍＱＨｇｃＱｘで補足
した以外、実施例５に記載したように成長させた。また
、プラスミドを含有しないピー、エスピー、 ＡＴＣＣ
２１８０８Ｒｉｆ’菌株およびプラスミドｐＭＥ２８５
を含有する菌株は、陰性コントロールとして役に立った
。プラスミドを含有しない菌株およびｐＭＥ２８５含有
菌株を５μｇ／ｍａＲｉｆのみ、および５ ｐ ｇ／
ｍ（ＩＲｉｆ＋ ２．５ ｐ ｇ／ｍ（ｌＨｇｃ（ｌｘ
＋ １００ ／’ｇ／ｒｎＱ Ｋｍをそレソレ有する
培地中で成長させた。
量的リパーゼ活性の決定は、実施例５に記載したように
行なった。リパーゼ活性を表５に示した。
行なった。リパーゼ活性を表５に示した。
ピー、エスピー、 ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’（ｐＨ
ＳＨ４３）はプラスミドを含有する菌株およびｐＭＥ２
８５−含有菌株の１７〜１９倍高い最高のリパーゼ活性
を有していた。
ＳＨ４３）はプラスミドを含有する菌株およびｐＭＥ２
８５−含有菌株の１７〜１９倍高い最高のリパーゼ活性
を有していた。
表５
ピー、エスピー、２１８０８Ｒｉｆ’菌株のリパーゼ活
性 （Ｕ／ｍ（２上澄み液） ２４時間 ４８時間 ７２時間 ２１８０８ ６．１１ ７．８８ ６．６４２
１８０８（ｐＭＥ２８５） ４．８６ ８．７８ ８．
９４２１８０８（ｐＨＳＨ４３）１２９ １５２ １４
１実施例１２ パート１：ｐＨＳＨ４３ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１
８０８中で維持できる組み換え体プラスミドの構成 ２つの適合性プラスミド（それぞれはリパーゼ遺伝子を
含有する）を有するピー。エスピー、ＡＴＣＣ２１８０
８Ｒｉｆ’を組みたて、リパーゼ生産を増加させた。
性 （Ｕ／ｍ（２上澄み液） ２４時間 ４８時間 ７２時間 ２１８０８ ６．１１ ７．８８ ６．６４２
１８０８（ｐＭＥ２８５） ４．８６ ８．７８ ８．
９４２１８０８（ｐＨＳＨ４３）１２９ １５２ １４
１実施例１２ パート１：ｐＨＳＨ４３ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１
８０８中で維持できる組み換え体プラスミドの構成 ２つの適合性プラスミド（それぞれはリパーゼ遺伝子を
含有する）を有するピー。エスピー、ＡＴＣＣ２１８０
８Ｒｉｆ’を組みたて、リパーゼ生産を増加させた。
リパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ挿入物はＦ２の６．５
Ｋｂサブフラグメントであった。Ｆ２ＤＮＡ（４，２５
μｇ）および１２．７５Ｕの制限酵素ＢａｍＨＩ（二ニ
ー・イングランド・バイオラポズ、ビ）（リー、エムニ
ー）を５０μａ溶液中に一緒に混合しくその溶液は、実
施例１パート３に記述したように同じ消化緩衝液を含有
していた（ただし０゜１ＭＮａｃＩ２を使用した））、
３７°Ｃで一晩で培養した。次に実施例１パート３に記
述したようにタンパクを除去し、消化ＤＮＡを取り入れ
、洗浄し、ＴＥｐＨ８に再懸濁した。
Ｋｂサブフラグメントであった。Ｆ２ＤＮＡ（４，２５
μｇ）および１２．７５Ｕの制限酵素ＢａｍＨＩ（二ニ
ー・イングランド・バイオラポズ、ビ）（リー、エムニ
ー）を５０μａ溶液中に一緒に混合しくその溶液は、実
施例１パート３に記述したように同じ消化緩衝液を含有
していた（ただし０゜１ＭＮａｃＩ２を使用した））、
３７°Ｃで一晩で培養した。次に実施例１パート３に記
述したようにタンパクを除去し、消化ＤＮＡを取り入れ
、洗浄し、ＴＥｐＨ８に再懸濁した。
プラスミドｐｃＰ１３をクローニングベクターとして選
択した。なぜならそれは、ｐＭＥ２８５の不適合性基以
外の異なった不適合性基を有するプラスミドから誘導さ
れるからである。プラスミドｐｃＰ１３ ＤＮＡ（２
０μｇ）および制限酵素ＨｉｎｄＩ［［の６０Ｕを１２
５／７１２溶液（実施例１パート３に記述した同じ消化
緩衝液を含有する）に共に混合し、３７°Ｃで１時間培
養した。その溶液を０．１ＭＮａＣｌ２に調整した後、
制限酵素ＢａｍＨＩの６０Ｕを添加し、消化を３７℃−
晩培養した。
択した。なぜならそれは、ｐＭＥ２８５の不適合性基以
外の異なった不適合性基を有するプラスミドから誘導さ
れるからである。プラスミドｐｃＰ１３ ＤＮＡ（２
０μｇ）および制限酵素ＨｉｎｄＩ［［の６０Ｕを１２
５／７１２溶液（実施例１パート３に記述した同じ消化
緩衝液を含有する）に共に混合し、３７°Ｃで１時間培
養した。その溶液を０．１ＭＮａＣｌ２に調整した後、
制限酵素ＢａｍＨＩの６０Ｕを添加し、消化を３７℃−
晩培養した。
次に実施例９に記載されているように消化ｐｃＰ１３Ｄ
ＮＡを脱リン酸反応し、汚染タンパクを除去し、そして
プラスミドＤＮＡを沈殿させ、取り入れ、洗浄し、そし
てＴＥｐＨ８中に再懸濁させｌこ。
ＮＡを脱リン酸反応し、汚染タンパクを除去し、そして
プラスミドＤＮＡを沈殿させ、取り入れ、洗浄し、そし
てＴＥｐＨ８中に再懸濁させｌこ。
Ｆ２のサブフラグメントを実施例８に記述したようにプ
ラスミドｐｃＰ１３に結紮しＩ；。ＤＮＡ結紮混合物を
実施例３パート２および３に記述したようにイー、コー
リー、ＨＢｌｏｌの反応性セル中へ形質転換した。形質
転換したセルを１５μｇ／ｍ１２Ｔｃを含有するシリア
寒天プレート上で培養し、３７℃で一晩培養した。選択
培地により、Ｔｃ抵抗遺伝子を含有するｐｃＰ１３プラ
スミドを含有するセルのみの成長が可能となる。組み換
え体ＤＮＡを含有するセルの数を決定するために、Ｔｃ
’セルをＫｍに対する感度のために遮断した。
ラスミドｐｃＰ１３に結紮しＩ；。ＤＮＡ結紮混合物を
実施例３パート２および３に記述したようにイー、コー
リー、ＨＢｌｏｌの反応性セル中へ形質転換した。形質
転換したセルを１５μｇ／ｍ１２Ｔｃを含有するシリア
寒天プレート上で培養し、３７℃で一晩培養した。選択
培地により、Ｔｃ抵抗遺伝子を含有するｐｃＰ１３プラ
スミドを含有するセルのみの成長が可能となる。組み換
え体ＤＮＡを含有するセルの数を決定するために、Ｔｃ
’セルをＫｍに対する感度のために遮断した。
ＤＮＡフラグメントをｐｃＰ１３の非対称ＨｉｎｄｌＩ
［／ＢａｍＨ１部位へ挿入することはカナマイシン抵抗
遺伝子の不足するプラスミドを形成するので、Ｋｍ“は
組み換え体プラスミドを含有するイー、コリー、セルを
示している。すべてのＴｃ’組換え体はＫｍ’であった
。
［／ＢａｍＨ１部位へ挿入することはカナマイシン抵抗
遺伝子の不足するプラスミドを形成するので、Ｋｍ“は
組み換え体プラスミドを含有するイー、コリー、セルを
示している。すべてのＴｃ’組換え体はＫｍ’であった
。
１２Ｔｃ’Ｋｍ’形式転換体のプラスミド含量を実施例
４に記載したようにアガロースゲル電気泳動により分析
した。この場合、部分的に精製したプラスミドＤＮＡを
、上記したように２−ステップ１つの形質転換体は、６
．５Ｋｂフラグメントを有する組換え体ｐｃＰ１３プラ
スミドを含有していた（ｐＨＳＨ３１と呼ばれる）。プ
ラスミドｐＨＳ Ｈ３１を実施例３パート２に記述して
いるようにに一、オレオポランスに移転した。ビー、オ
レオポランス（ｐＨＳＨ３１）は、選択プレート上に透
明ゾーンを製造した。
４に記載したようにアガロースゲル電気泳動により分析
した。この場合、部分的に精製したプラスミドＤＮＡを
、上記したように２−ステップ１つの形質転換体は、６
．５Ｋｂフラグメントを有する組換え体ｐｃＰ１３プラ
スミドを含有していた（ｐＨＳＨ３１と呼ばれる）。プ
ラスミドｐＨＳ Ｈ３１を実施例３パート２に記述して
いるようにに一、オレオポランスに移転した。ビー、オ
レオポランス（ｐＨＳＨ３１）は、選択プレート上に透
明ゾーンを製造した。
ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８は本来高いＴｃ抵
抗であるので、選択可能な抗生抵抗マーカーを、ルプク
ン（Ｒｕｖｋｕｎ）およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ
）、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）、２８９，８５〜８８の
方法に少し改良を加えてトランスポゾンＴｎ５（それは
Ｋｍ’を暗号化する）の挿入を経てｐＨＳＨ３１中へ導
入した。Ｔｎ５を含有する欠損ラムダビールスはアール
、マイアー（Ｒ，Ｍａｉｅｒ）、デプト・オブ・パオロ
ジー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ）、ザ・ジョ
ーンズ・ホプキンス・ユニブ（Ｔｈｅ ＪｏｈｎｓＨｏ
ｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖ、）、バルチモア（Ｂ ａ Ｉ
ｔ ｉｍｏｒｅ）、エムデイ−（ＭＤ）からの贈り物で
あった。プラスミドｐＨＳＨ３１を含有するイー、コー
リー、ＨＢｌｏｌを実施例１バート６に記述したように
トリプトン液体培養基中で成長させた。感染の多重度（
ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ １ｎｆｅｃｔｉｏｎ
）は０．５であった。
抗であるので、選択可能な抗生抵抗マーカーを、ルプク
ン（Ｒｕｖｋｕｎ）およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ
）、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）、２８９，８５〜８８の
方法に少し改良を加えてトランスポゾンＴｎ５（それは
Ｋｍ’を暗号化する）の挿入を経てｐＨＳＨ３１中へ導
入した。Ｔｎ５を含有する欠損ラムダビールスはアール
、マイアー（Ｒ，Ｍａｉｅｒ）、デプト・オブ・パオロ
ジー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ）、ザ・ジョ
ーンズ・ホプキンス・ユニブ（Ｔｈｅ ＪｏｈｎｓＨｏ
ｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖ、）、バルチモア（Ｂ ａ Ｉ
ｔ ｉｍｏｒｅ）、エムデイ−（ＭＤ）からの贈り物で
あった。プラスミドｐＨＳＨ３１を含有するイー、コー
リー、ＨＢｌｏｌを実施例１バート６に記述したように
トリプトン液体培養基中で成長させた。感染の多重度（
ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ １ｎｆｅｃｔｉｏｎ
）は０．５であった。
ゲノム中へのＴｎ５転移は１５μｇ／ｍＱＴＣおよび４
０μｇ／ｍ（２Ｋｍを含有するシリア寒天プレート上で
のバクテリア培養により選択される。プラスミドｐＨＳ
Ｈ３１中へのＴｎ５転移は、数千のＴｃ’Ｋｍ’コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを単離することにより同定され
る（実施例１パート２に記載されているように）。次に
プラスミドＤＮＡを実施例３パート２および３に記述さ
れているようにＨＢｌｏｌ中へ形質転換した。形質転換
されたセルを、ｌ ５ｐｇ／ｙｎＱＴｃおよび４０ ｐ
ｇ／ｍｎ Ｋｍを含有するシリア寒天プレート上で培養
し、３７°Ｃで一晩培養した。この選択培地により、Ｔ
ｎ５挿入物を有するｐＨＳＨ３１プラスミド（ｐＨＳＨ
３１：：Ｔｎ５）を有するセルのみの成長が可能となる
。
０μｇ／ｍ（２Ｋｍを含有するシリア寒天プレート上で
のバクテリア培養により選択される。プラスミドｐＨＳ
Ｈ３１中へのＴｎ５転移は、数千のＴｃ’Ｋｍ’コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを単離することにより同定され
る（実施例１パート２に記載されているように）。次に
プラスミドＤＮＡを実施例３パート２および３に記述さ
れているようにＨＢｌｏｌ中へ形質転換した。形質転換
されたセルを、ｌ ５ｐｇ／ｙｎＱＴｃおよび４０ ｐ
ｇ／ｍｎ Ｋｍを含有するシリア寒天プレート上で培養
し、３７°Ｃで一晩培養した。この選択培地により、Ｔ
ｎ５挿入物を有するｐＨＳＨ３１プラスミド（ｐＨＳＨ
３１：：Ｔｎ５）を有するセルのみの成長が可能となる
。
Ｔｎ５は５．７Ｋｂであり、ＥｃｏＲＩ位を含有しない
ので、ｐＨＳＨ３１のｐｃＰ１３部分中へのＴｎ５挿入
物は、５．７ｋｂ広い線状のｐｃＰ１３プラスミドバン
ドが現われることにより、（実施例４に記載したように
）アガロースゲル電気泳動により同定した。２３ Ｔｃ
’Ｋｍ’のうち１８がｐｃＰ１３中へ挿入されたＴｎ５
を有するｐＨＳＨ３１を含有していた。１つの形質転換
体を本研究のために選択した（ｐＨＳＨ３１：：Ｔｎ５
−６と呼ぶ）。
ので、ｐＨＳＨ３１のｐｃＰ１３部分中へのＴｎ５挿入
物は、５．７ｋｂ広い線状のｐｃＰ１３プラスミドバン
ドが現われることにより、（実施例４に記載したように
）アガロースゲル電気泳動により同定した。２３ Ｔｃ
’Ｋｍ’のうち１８がｐｃＰ１３中へ挿入されたＴｎ５
を有するｐＨＳＨ３１を含有していた。１つの形質転換
体を本研究のために選択した（ｐＨＳＨ３１：：Ｔｎ５
−６と呼ぶ）。
パート２：ｐＨＳＨ３１：：Ｔｎ５−６のビー、エスピ
ー、ＡＴＣＣ２１８０８（ｐＨＳＨ４３）中への接合 プラスミドｐＨＳＨ３１：：Ｔｎ５−６を、実施例２パ
ート２に記述しであるように接合により、エコーリー−
ＨＢＩＯ１からビー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉ
ｆ’（ｐＨＳＨ４３）へ転移させた。ドナーセルを、１
５μｇ／ｍ１２Ｔｃおよび４０μｇ／ｍＱ Ｋｍを含有
するルリア液体培養基中で培養した。ビー、エスピー、
ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’Ｈｇ’転移接合体を、５０
μｇ／ｍａＲｉｒ、 ３０ ｐｇ／ｍｆｆＨｇｃＱ２
、および５００ ｐｇ／ｒｎＤ−Ｋｍで補足された栄養
素寒天プレート上で選択した。アガロ−ゼゲル電気泳動
によりプラスミド分析は、両プラスミドの存在が確かめ
られた。この菌株構成は、ビー、エスピー、２１８０８
が成長し、リパーゼ遺伝子を含有する２つの異なったキ
メラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）プラスミドを同時に保持でき
ることを示している。
ー、ＡＴＣＣ２１８０８（ｐＨＳＨ４３）中への接合 プラスミドｐＨＳＨ３１：：Ｔｎ５−６を、実施例２パ
ート２に記述しであるように接合により、エコーリー−
ＨＢＩＯ１からビー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉ
ｆ’（ｐＨＳＨ４３）へ転移させた。ドナーセルを、１
５μｇ／ｍ１２Ｔｃおよび４０μｇ／ｍＱ Ｋｍを含有
するルリア液体培養基中で培養した。ビー、エスピー、
ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’Ｈｇ’転移接合体を、５０
μｇ／ｍａＲｉｒ、 ３０ ｐｇ／ｍｆｆＨｇｃＱ２
、および５００ ｐｇ／ｒｎＤ−Ｋｍで補足された栄養
素寒天プレート上で選択した。アガロ−ゼゲル電気泳動
によりプラスミド分析は、両プラスミドの存在が確かめ
られた。この菌株構成は、ビー、エスピー、２１８０８
が成長し、リパーゼ遺伝子を含有する２つの異なったキ
メラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）プラスミドを同時に保持でき
ることを示している。
パート３ニオリーブオイル濃度のリパーゼ活性への効果
さらに、オリーブオイル濃度が高い程、より高いリパー
ゼ活性の表現を促進する。フラスコ振動により上述した
ように培養菌を成長させた。ただし、オリーブオイル２
５０ Ｃ２（０，０５％ｖ／ｖ）を培養２４時間後各培
養菌に添加した。以下の記述および表２に示すように、
菌株２１８０８（ｐＨＳＨ４３）は前の実験とほぼ同じ
量を基準として、より高い最大リパーゼ活性を有してい
るが（２１８０８ｐＭＥ２８５の１９倍、そして２１８
０８の１６倍）、菌株２１８０８（ｐＨＳＨ４３）は前
の実験におけるよりも２４倍高い（１６８時間で３５９
Ｕ／ｍＱ）最大リパーゼ活性を有していた。
ゼ活性の表現を促進する。フラスコ振動により上述した
ように培養菌を成長させた。ただし、オリーブオイル２
５０ Ｃ２（０，０５％ｖ／ｖ）を培養２４時間後各培
養菌に添加した。以下の記述および表２に示すように、
菌株２１８０８（ｐＨＳＨ４３）は前の実験とほぼ同じ
量を基準として、より高い最大リパーゼ活性を有してい
るが（２１８０８ｐＭＥ２８５の１９倍、そして２１８
０８の１６倍）、菌株２１８０８（ｐＨＳＨ４３）は前
の実験におけるよりも２４倍高い（１６８時間で３５９
Ｕ／ｍＱ）最大リパーゼ活性を有していた。
表６
オリーブオイルを補足したピー、エスピーＡＴＣＣ２１
８０８菌株のリパーゼ活性 ２１８０８ ２．２７ ２．９２ １３．０
２１．２２１８０８（ｐＭＥ２８５） １．９９
８．８９ ８．１５１７．０２１８０８（ｐＨＳＨ４
３） ６１．７ ４６．３ ７２−７ ２９４２２．
３ １８．５ ５９ このより高いリパーゼ活性は増加セル数によるものでな
い。というのは、育ちうるセル濃度は両実験で同じであ
るからである。
８０８菌株のリパーゼ活性 ２１８０８ ２．２７ ２．９２ １３．０
２１．２２１８０８（ｐＭＥ２８５） １．９９
８．８９ ８．１５１７．０２１８０８（ｐＨＳＨ４
３） ６１．７ ４６．３ ７２−７ ２９４２２．
３ １８．５ ５９ このより高いリパーゼ活性は増加セル数によるものでな
い。というのは、育ちうるセル濃度は両実験で同じであ
るからである。
実施例１３
リパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ挿入物は、Ｆ２の２．
５にサブフラグメントであった。Ｆ２ＤＮＡ（４−２５
μｇ）およびＩＯＵの制限酵素ＢｇＱＩ［にニー・イ７
ングランド・バイオラポズ、ビバリ、エムニー）を３７
．５μＱ溶液（実施例１パート３に記述したのと同じ消
化緩衝液を含有する）に共に混合し、３７℃で一晩培養
した。その溶液を０．１ＭＮａ（ｊ２に調整した後、制
限酵素ＥｃｏＲＩの１０Ｕを添加して３７℃で１時間培
養した。実施例１パート３に記述しているようにタンパ
クを除去し、そして消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄し、そ
してＴＥｐＨ８中に再懸濁させた。
５にサブフラグメントであった。Ｆ２ＤＮＡ（４−２５
μｇ）およびＩＯＵの制限酵素ＢｇＱＩ［にニー・イ７
ングランド・バイオラポズ、ビバリ、エムニー）を３７
．５μＱ溶液（実施例１パート３に記述したのと同じ消
化緩衝液を含有する）に共に混合し、３７℃で一晩培養
した。その溶液を０．１ＭＮａ（ｊ２に調整した後、制
限酵素ＥｃｏＲＩの１０Ｕを添加して３７℃で１時間培
養した。実施例１パート３に記述しているようにタンパ
クを除去し、そして消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄し、そ
してＴＥｐＨ８中に再懸濁させた。
プラスミドｐＫＴ２３１（ケー・ティミス（Ｋ、Ｔｉｍ
ｍ１ｓ）、デパートメントψオブ・メディカル、バイオ
ケミストリー（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉ
ｃａｌＢ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ユニバージティ
ー・オブ・ゲネバ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅｖａ）、ゲネバ（Ｇ ｅｎｅｖａ）、スイス）をク
ローニングベクターとして選択した。
ｍ１ｓ）、デパートメントψオブ・メディカル、バイオ
ケミストリー（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉ
ｃａｌＢ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ユニバージティ
ー・オブ・ゲネバ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅｖａ）、ゲネバ（Ｇ ｅｎｅｖａ）、スイス）をク
ローニングベクターとして選択した。
というのは、それは、ホスト範囲の広い色々なダラム陰
性バクテリア、イー、コーＩＪ−中１５〜２０のコピー
数、選択可能なカナマイシン抵抗（Ｋｉｎ）遺伝子を有
し、可動性陽性であったからである〔バガサリアン（Ｂ
ａｇｄｅｌａｓａｒｉａｎ）ら、Ｇｅｎｅ、 １６
．２３７〜２４７（１９８１））。
性バクテリア、イー、コーＩＪ−中１５〜２０のコピー
数、選択可能なカナマイシン抵抗（Ｋｉｎ）遺伝子を有
し、可動性陽性であったからである〔バガサリアン（Ｂ
ａｇｄｅｌａｓａｒｉａｎ）ら、Ｇｅｎｅ、 １６
．２３７〜２４７（１９８１））。
プラスミドｐＫＴ２３１を実施例バート２に記載したよ
うにｐＫＴ２３１を含有するエニ、コーリーのセルから
精製した。ただし、バクテリア成長媒地は、２５μｇ／
ｍｆｆＫｍおよび２５ ｐｇ／ｍＱストレプトマイシン
（ＳｍＸシグマ・ケミカル株式会社、セント、ルイス、
エムオー）で補足した。プラスミドｐＫＴ２３１ Ｄ
ＮＡ３μｇおよび制限酵素ＢｇｌＩ［ｌＯＵを実施例４
に記述したように消化緩衝液５０μα中に一緒にした。
うにｐＫＴ２３１を含有するエニ、コーリーのセルから
精製した。ただし、バクテリア成長媒地は、２５μｇ／
ｍｆｆＫｍおよび２５ ｐｇ／ｍＱストレプトマイシン
（ＳｍＸシグマ・ケミカル株式会社、セント、ルイス、
エムオー）で補足した。プラスミドｐＫＴ２３１ Ｄ
ＮＡ３μｇおよび制限酵素ＢｇｌＩ［ｌＯＵを実施例４
に記述したように消化緩衝液５０μα中に一緒にした。
反応を３７℃晩培養した後、その溶液をＯ，１ＭＮａＣ
ｌ２に調整し、制限酵素ＥｃｏＲＩのＩＯＵを添加し、
そして消化反応をさらに一時間３７°Ｃで培養した。次
に２重消化ｐＫＴ２３１ ＤＮＡを実施例９に記述し
たように脱リン酸反応させて、汚染タンパクを除去し、
そしてプラスミドＤＮＡを沈殿させ、取り入れ、洗浄し
、そして、ＴＥｐＨｇ中に再懸濁させｔこ。
ｌ２に調整し、制限酵素ＥｃｏＲＩのＩＯＵを添加し、
そして消化反応をさらに一時間３７°Ｃで培養した。次
に２重消化ｐＫＴ２３１ ＤＮＡを実施例９に記述し
たように脱リン酸反応させて、汚染タンパクを除去し、
そしてプラスミドＤＮＡを沈殿させ、取り入れ、洗浄し
、そして、ＴＥｐＨｇ中に再懸濁させｔこ。
Ｆ２ＤＮＡのサブフラグメントを実施例８に記述したよ
うにプラスミドｐＫＴ２３１に結紮した。ＤＮＡ結紮混
合物を実施例３パート２および３に記述したようにイー
、コーリーＨＢＩＯＩの成分セル中へ形質転換した。そ
の形質転換セルを、５０μｇ／ＩＩＩＱＫＩ１１および
５０ ｐｇ／ｒｎＱ Ｓｍを含有するシリア寒天プレー
ト上で培養し、３７℃で一晩培養した。この選択培地に
より、Ｋｍおよび５Ｉ１１抵抗遺伝子の両方を含有する
ｐＫＴ２３１プラスミドを含有するセルのみの成長が可
能となる。所望の２．５ＫｂＤＮＡ挿入物を含有する菌
株を同定する ために、Ｋｔｎ’Ｓｍ’形質転換体のプラスミド含量を
実施例４に記述したようにアガローゼゲル電気泳動によ
り分析した。この場合、部分的に精製されたプラスミド
ＤＮＡを上述したように２−ステップ消化反応において
制限酵素旦ｇ１２１ｒおよび１竺ＲＩで消化した。２１
の形式転換体の１０が２．５Ｋｂフラグメントを有する
組み換え体ｐＫＴ２３１プラスミドを含有していた（ｐ
ＨＥＳ８［ブダペスト条約に基づ＜ＡＴＣＣへの寄託番
号（以下、これを「国際寄託番号」と言う）６８１６０
］と呼ぶ）。
うにプラスミドｐＫＴ２３１に結紮した。ＤＮＡ結紮混
合物を実施例３パート２および３に記述したようにイー
、コーリーＨＢＩＯＩの成分セル中へ形質転換した。そ
の形質転換セルを、５０μｇ／ＩＩＩＱＫＩ１１および
５０ ｐｇ／ｒｎＱ Ｓｍを含有するシリア寒天プレー
ト上で培養し、３７℃で一晩培養した。この選択培地に
より、Ｋｍおよび５Ｉ１１抵抗遺伝子の両方を含有する
ｐＫＴ２３１プラスミドを含有するセルのみの成長が可
能となる。所望の２．５ＫｂＤＮＡ挿入物を含有する菌
株を同定する ために、Ｋｔｎ’Ｓｍ’形質転換体のプラスミド含量を
実施例４に記述したようにアガローゼゲル電気泳動によ
り分析した。この場合、部分的に精製されたプラスミド
ＤＮＡを上述したように２−ステップ消化反応において
制限酵素旦ｇ１２１ｒおよび１竺ＲＩで消化した。２１
の形式転換体の１０が２．５Ｋｂフラグメントを有する
組み換え体ｐＫＴ２３１プラスミドを含有していた（ｐ
ＨＥＳ８［ブダペスト条約に基づ＜ＡＴＣＣへの寄託番
号（以下、これを「国際寄託番号」と言う）６８１６０
］と呼ぶ）。
プラスミドｐＨＥＳ８（国際寄託番号６８１６０）を実
施例１Ｏに記述したように形質転換することによりビー
、エスピーＡＴＣＣ２１８０８へ移転した。プラスミド
ｐＨＥＳ８（国際寄託番号６８１６０）を実施例３パー
ト１に記述したようにイーコーリーＨＢ ｔｏ １［ｐ
ＨＥＳ８（国際寄託番号６８１６０）］のセルから部分
的に精製した。イーコーリーＨＢ １０１ ［ｐＨＥＳ
８（国際寄託番号６８１６０）］セルを培養するに使用
した媒地は５０μｇ／ｍ１２Ｋｍおよび５０ ｐｇ／ｍ
Ｑ Ｓｍを補足したルリア液体培養基であった。部分的
に精製されたｐＨＥＳ８（国際寄託番号６８１６０）プ
ラスミドＤＮＡの１９２μｇを実施例１０に記述したよ
うにビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’の反
応性セル中へ形質転換した。形質転換した。形質転換さ
れたセルを５００μｇ／ｍｆｆＫｍおよび５０μｇ／ｍ
ｆｆ５ｍを含有する栄養素寒天プレート上で培養した。
施例１Ｏに記述したように形質転換することによりビー
、エスピーＡＴＣＣ２１８０８へ移転した。プラスミド
ｐＨＥＳ８（国際寄託番号６８１６０）を実施例３パー
ト１に記述したようにイーコーリーＨＢ ｔｏ １［ｐ
ＨＥＳ８（国際寄託番号６８１６０）］のセルから部分
的に精製した。イーコーリーＨＢ １０１ ［ｐＨＥＳ
８（国際寄託番号６８１６０）］セルを培養するに使用
した媒地は５０μｇ／ｍ１２Ｋｍおよび５０ ｐｇ／ｍ
Ｑ Ｓｍを補足したルリア液体培養基であった。部分的
に精製されたｐＨＥＳ８（国際寄託番号６８１６０）プ
ラスミドＤＮＡの１９２μｇを実施例１０に記述したよ
うにビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’の反
応性セル中へ形質転換した。形質転換した。形質転換さ
れたセルを５００μｇ／ｍｆｆＫｍおよび５０μｇ／ｍ
ｆｆ５ｍを含有する栄養素寒天プレート上で培養した。
この選択培地によりｐＨＥ５８ 組み換え体プラスミド
を含有するセルのみの成長が可能となる。ｐＨＥＳ８（
国際寄託番号６８１６０）プラスミドを含有する止、エ
スピー、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’Ｋｍ’Ｓｍ’形質
転換体を選択し、上述したように確かめた。
を含有するセルのみの成長が可能となる。ｐＨＥＳ８（
国際寄託番号６８１６０）プラスミドを含有する止、エ
スピー、ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’Ｋｍ’Ｓｍ’形質
転換体を選択し、上述したように確かめた。
ｅ二、エスピー−２１８０８Ｒｉｆ’ＣｐＨＥ Ｓ ８
（国際寄託番号６８１６０）］のリパーゼ活性を実施例
５に記載したように決定した。ただし、成長培地は５０
μｇ／ｍｆｆｉＫｍで補足した。さらに、プラスミドを
含有しない旦二、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’
菌株およびプラスミドｐＫＴ２３１を含有する菌株は陰
性コントロールとして役に立った。
（国際寄託番号６８１６０）］のリパーゼ活性を実施例
５に記載したように決定した。ただし、成長培地は５０
μｇ／ｍｆｆｉＫｍで補足した。さらに、プラスミドを
含有しない旦二、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’
菌株およびプラスミドｐＫＴ２３１を含有する菌株は陰
性コントロールとして役に立った。
プラスミドを含有しない菌株およびｐＫＴ２３１を含有
する菌株を、５μｇ／ｍＱＲｉｆのみ、および５ μｇ
／ｍ（２Ｒｉｆ＋５０ ／ｊｇ／ｍｆｆ Ｋｍを有する
培地中でそれぞれ成長させた。
する菌株を、５μｇ／ｍＱＲｉｆのみ、および５ μｇ
／ｍ（２Ｒｉｆ＋５０ ／ｊｇ／ｍｆｆ Ｋｍを有する
培地中でそれぞれ成長させた。
量的リパーゼ活性を実施例５に記載したように決定した
。リパーゼ活性を表７に示す。ビー、エスピーＡＴＣＣ
２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨＥ Ｓ ８（国際寄託番号６
８１６０）］は、ププラストを含有しない菌株およびｐ
ＫＴ２３１−含有菌株の４２倍および６２倍高いリパー
ゼ活性を有していた。
。リパーゼ活性を表７に示す。ビー、エスピーＡＴＣＣ
２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨＥ Ｓ ８（国際寄託番号６
８１６０）］は、ププラストを含有しない菌株およびｐ
ＫＴ２３１−含有菌株の４２倍および６２倍高いリパー
ゼ活性を有していた。
表
ビー。
エスピー。
２１８０８ＲＩＦ′菌株のり
菌株
リパーゼ活性
（培養菌のＵ／＋＋＋Ｑ）
本発明を使用することにより高い濃度のリパーゼ製造が
達成されることが上記結果より明らかである。それ故、
商業的に所望する濃度のリパーゼを上澄み液中へ分泌し
、そして連続的に製造しモして単離できる。濃度は、さ
らにプラスミド、特に高いコピー数のプラスミドを組み
合わせることにより、高めることができる。その場合、
２つのプラスミドが強力なプロモーター、遺伝子の組み
込み、拡大等を使用し、同じホスト中に適合して保持さ
れてもよい。特に興味深いのは、１または複数のプラス
ミドを有するプセウドモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ
）ホストを使用することであり、リパーゼ遺伝子が表現
され、分泌される。
達成されることが上記結果より明らかである。それ故、
商業的に所望する濃度のリパーゼを上澄み液中へ分泌し
、そして連続的に製造しモして単離できる。濃度は、さ
らにプラスミド、特に高いコピー数のプラスミドを組み
合わせることにより、高めることができる。その場合、
２つのプラスミドが強力なプロモーター、遺伝子の組み
込み、拡大等を使用し、同じホスト中に適合して保持さ
れてもよい。特に興味深いのは、１または複数のプラス
ミドを有するプセウドモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ
）ホストを使用することであり、リパーゼ遺伝子が表現
され、分泌される。
本明細書に述べられているすべての刊行物および特許出
願は、本発明が直接関係する分野の当業者のレベルを示
す。各それぞれの刊行物または特許出願は参考文献とし
て引用するため特別に、そして個々に示されているかの
ようであるが、すべての刊行物および特許出願を同じ程
度に参考文献としてここに引用する。
願は、本発明が直接関係する分野の当業者のレベルを示
す。各それぞれの刊行物または特許出願は参考文献とし
て引用するため特別に、そして個々に示されているかの
ようであるが、すべての刊行物および特許出願を同じ程
度に参考文献としてここに引用する。
先の発明は、理解をはつきりさせるために説明および例
をあげていくらか詳しく記述したが、いくらかの変換お
よび修飾を特許請求の範囲範囲内で実施してもよいこと
は明らかであろう。
をあげていくらか詳しく記述したが、いくらかの変換お
よび修飾を特許請求の範囲範囲内で実施してもよいこと
は明らかであろう。
実施例１４
ム
バートｌ：完全なリパーゼ遺伝子を含有する組み換え体
プラスミドの構成 リパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ挿入物は、Ｆ２の５
、５ ｋｂサブフラグメントであった。Ｆ２含有プラス
ミドｐＨＳＨｌ ７ＤＮＡ（２０μｇ）および制限酵素
ＨｉｎｄＩ［Ｉの２０Ｕを２０μａ溶液（実施例１バー
ト３に記載と同じ消化緩衝液を含有する）中に一緒に混
合し、３７℃１時間培養した。その溶液を０．１ＭＮａ
Ｃｌ２に調整し、制限酵素旦ｃｏＲＩの４０Ｕを添加し
、３７℃で１時間培養した。
プラスミドの構成 リパーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ挿入物は、Ｆ２の５
、５ ｋｂサブフラグメントであった。Ｆ２含有プラス
ミドｐＨＳＨｌ ７ＤＮＡ（２０μｇ）および制限酵素
ＨｉｎｄＩ［Ｉの２０Ｕを２０μａ溶液（実施例１バー
ト３に記載と同じ消化緩衝液を含有する）中に一緒に混
合し、３７℃１時間培養した。その溶液を０．１ＭＮａ
Ｃｌ２に調整し、制限酵素旦ｃｏＲＩの４０Ｕを添加し
、３７℃で１時間培養した。
実施例１バート３に記述されているようにタンパクを除
去し、消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨ
ａ中に再懸濁した。
去し、消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨ
ａ中に再懸濁した。
クローニングベクター、プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
（２０μｇ）を上述したように２−ステップ消化反応に
おいて制限酵素ＨｉｎｄＩ［［およびＥｃ。
（２０μｇ）を上述したように２−ステップ消化反応に
おいて制限酵素ＨｉｎｄＩ［［およびＥｃ。
Ｒ１で消化した。実施例１バート３に記載しているよう
にタンパクを除去し、そして消化されたＤＮＡを取り入
れ、洗浄し、そして再懸濁させた。
にタンパクを除去し、そして消化されたＤＮＡを取り入
れ、洗浄し、そして再懸濁させた。
プラスミドｐＨＳＨ１７の消化から生じたＦ２ＤＮＡの
サブフラグメントを実施例６バート４に記述したように
プラスミドｐＢＲ３２２に結紮させた。ＤＮＡ結紮混合
物を実施例３パート２８よび３に記載したようにイー、
コーリーＨＢＩＯＩの反応性のあるセル中へ形質転換し
た。形質転換したセルを５０μｇ／ｒｎＱアムビシリン
を含有するルリア寒天プレート上で培養し、３７°Ｃで
一晩培養した。この選択培地により、アムビシリン抵抗
遺伝子を含有するｐＢＲ３２２プラスミド含有セルのみ
の成長が可能となる。所望の５．５ｋｂＤＮＡ挿入物を
含有する菌株を同定するために、Ｔｃ’形質転換体のプ
ラスミド含量を実施例４に記載しているようにアガロー
ゼゲル電気泳動により分析した。この場合、部分的に精
製されたプラスミドＤＮＡを上述したように２−ステッ
プ消化反応において制限酵素ＨｉｎｄＩ［［およびＥｃ
ｏＲＩで消化した。１８の形質転換体の１つが５．５Ｋ
ｂフラグメントを有する組み換え体ｐＢＲ３２２プラス
ミドを含有していた（ｐＨＲＡ １と呼ぶ）。
サブフラグメントを実施例６バート４に記述したように
プラスミドｐＢＲ３２２に結紮させた。ＤＮＡ結紮混合
物を実施例３パート２８よび３に記載したようにイー、
コーリーＨＢＩＯＩの反応性のあるセル中へ形質転換し
た。形質転換したセルを５０μｇ／ｒｎＱアムビシリン
を含有するルリア寒天プレート上で培養し、３７°Ｃで
一晩培養した。この選択培地により、アムビシリン抵抗
遺伝子を含有するｐＢＲ３２２プラスミド含有セルのみ
の成長が可能となる。所望の５．５ｋｂＤＮＡ挿入物を
含有する菌株を同定するために、Ｔｃ’形質転換体のプ
ラスミド含量を実施例４に記載しているようにアガロー
ゼゲル電気泳動により分析した。この場合、部分的に精
製されたプラスミドＤＮＡを上述したように２−ステッ
プ消化反応において制限酵素ＨｉｎｄＩ［［およびＥｃ
ｏＲＩで消化した。１８の形質転換体の１つが５．５Ｋ
ｂフラグメントを有する組み換え体ｐＢＲ３２２プラス
ミドを含有していた（ｐＨＲＡ １と呼ぶ）。
パート２：リパーゼ遺伝子プロモーターの欠失唯一の旦
ｇＱｎ制限部位を有するプラスミドｐＨＲＡＩはリパー
ゼ遺伝子プロモーター領域の近くに位置していた。リパ
ーゼプロモーター領域の欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）の組
み合わせは、唯一の旦赳■制限部位からの外ヌクレアー
ゼＢａ１２３１（インターナショナル・バイオチクノロ
シーズ株式会社、二ニー・バーベン、シーティ（ＣＴ）
）によるプラスミドｐＨＲＡ１の消化の進行により組み
立てられた。
ｇＱｎ制限部位を有するプラスミドｐＨＲＡＩはリパー
ゼ遺伝子プロモーター領域の近くに位置していた。リパ
ーゼプロモーター領域の欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）の組
み合わせは、唯一の旦赳■制限部位からの外ヌクレアー
ゼＢａ１２３１（インターナショナル・バイオチクノロ
シーズ株式会社、二ニー・バーベン、シーティ（ＣＴ）
）によるプラスミドｐＨＲＡ１の消化の進行により組み
立てられた。
Ｂａ（＋３１は直線状ＤＮＡフラグメントの３′および
５′両末端からヌクレオチドを欠失する外ヌクレアーゼ
である。プラスミドｐＨＲＡＩ ＤＮＡ（８０μｇ）お
よび制限酵素１旺■の１２８Ｕを４８μα溶液（実施例
１に記載した同じ消化緩衝液を含有）中に一緒に混合し
、３７°Ｃで一晩培養した。実施例１バート３に記述し
ているように、タンパクを除去し、そして消化ＤＮＡを
取り入れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨＢ中に再懸濁させた
。
５′両末端からヌクレオチドを欠失する外ヌクレアーゼ
である。プラスミドｐＨＲＡＩ ＤＮＡ（８０μｇ）お
よび制限酵素１旺■の１２８Ｕを４８μα溶液（実施例
１に記載した同じ消化緩衝液を含有）中に一緒に混合し
、３７°Ｃで一晩培養した。実施例１バート３に記述し
ているように、タンパクを除去し、そして消化ＤＮＡを
取り入れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨＢ中に再懸濁させた
。
旦赳■消化ｐＨＲＡＩＤＮＡの１０μｇおよび乱ａｆｆ
３１ Ｆａｓｔの１００Ｕを含有する８つのアリコート
を１００μＱ溶液（６００ｍＭ ＮａＣＬ １２゜５
ｍＭ Ｃａ（ｊ＋２．１２ 、５ ｍＭ Ｍｇ（１２２
，２０ｍＭトリス−ＭＣＩ２ｐｈ３および１ｍＭＥＤＴ
Ａを含有）中に共に混合し、４５分３０分培養した。実
施例１パート３に記述したように、タンパクを除去し、
消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨａ中に
再懸濁した。
３１ Ｆａｓｔの１００Ｕを含有する８つのアリコート
を１００μＱ溶液（６００ｍＭ ＮａＣＬ １２゜５
ｍＭ Ｃａ（ｊ＋２．１２ 、５ ｍＭ Ｍｇ（１２２
，２０ｍＭトリス−ＭＣＩ２ｐｈ３および１ｍＭＥＤＴ
Ａを含有）中に共に混合し、４５分３０分培養した。実
施例１パート３に記述したように、タンパクを除去し、
消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨａ中に
再懸濁した。
パート３：ｔａｃプロモーターに対する融合のためのり
パーゼ遺伝子プロモーターの欠失を含有するＤＮＡフラ
グメントの調製 Ｂａ１２３１処理ｐＨＲＡＩ ＤＮＡを２６０μＱ溶
液（２５ｍＭ）リス−ＨＣＱｐＨ７，８，５０＋ｏＭＮ
ａＣＱ、１０ｍＭ ＭｇＣＱｚ、１００ ｐｇ／ｍＱ牛
血清アルブミン、０．１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰ。
パーゼ遺伝子プロモーターの欠失を含有するＤＮＡフラ
グメントの調製 Ｂａ１２３１処理ｐＨＲＡＩ ＤＮＡを２６０μＱ溶
液（２５ｍＭ）リス−ＨＣＱｐＨ７，８，５０＋ｏＭＮ
ａＣＱ、１０ｍＭ ＭｇＣＱｚ、１００ ｐｇ／ｍＱ牛
血清アルブミン、０．１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰ。
およびｄＧＴＰ、および１ｍＭジチオスレイトール（ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含有）中に、イー、コ
ーリーＤＮＡポリメラーゼ（クレノー７ラグメント（Ｋ
ｌｅｎｏｗＦ ｒａｇｍｅｎｔ）；ニュー・イングラン
ド・バイオラポズ、ビバリー、エムニー）の５Ｕを添加
することにより純末端（ｂｌｕｎｔ −ｅｎｄｅｄ）と
し、３７℃で１゜５時間培養した。実施例１パート３に
記述したようにタンパクを除去し、消化ＤＮＡを取り入
れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨＢ中に再懸濁した。
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含有）中に、イー、コ
ーリーＤＮＡポリメラーゼ（クレノー７ラグメント（Ｋ
ｌｅｎｏｗＦ ｒａｇｍｅｎｔ）；ニュー・イングラン
ド・バイオラポズ、ビバリー、エムニー）の５Ｕを添加
することにより純末端（ｂｌｕｎｔ −ｅｎｄｅｄ）と
し、３７℃で１゜５時間培養した。実施例１パート３に
記述したようにタンパクを除去し、消化ＤＮＡを取り入
れ、洗浄し、そしてＴＥｐＨＢ中に再懸濁した。
多重ＥｃｏＲＩリンカ−（ｌｉｎｋｅｒ）Ｇ Ｇ Ａ
Ａ Ｔ Ｔ ＣＣ；層遺伝子（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ
）、う・ジョラ（Ｌａ Ｊ。
Ａ Ｔ Ｔ ＣＣ；層遺伝子（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ
）、う・ジョラ（Ｌａ Ｊ。
１１ａ、シーニー（ＣＡ））をＴ、ＤＮＡリガーゼの２
０００Ｕを２００Ｃ２溶液（２５ｍＭｌ−リス−Ｈ（１
ｐＨ７，８，１０ｍＭ ＭｇＣ（１，，４ｍＭβ−メル
カプトエタノール、０．４ｍＭＡＴＰおよび５ ｎｇ／
ｍＱＥｃｏＲＩリンカ−を含有）に添加することにより
純末端ｐＨＲＡＩＤＮＡの末端に添加し、室温で一晩培
養した。
０００Ｕを２００Ｃ２溶液（２５ｍＭｌ−リス−Ｈ（１
ｐＨ７，８，１０ｍＭ ＭｇＣ（１，，４ｍＭβ−メル
カプトエタノール、０．４ｍＭＡＴＰおよび５ ｎｇ／
ｍＱＥｃｏＲＩリンカ−を含有）に添加することにより
純末端ｐＨＲＡＩＤＮＡの末端に添加し、室温で一晩培
養した。
ＥｃｏＲＩのリンカ−された（ｌｉｎｋｅｒｅｄ）プラ
スミドｐＨＲＡＩ ＤＮＡおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ
の１００Ｕを３００μｇ溶液（実施例１３に記述したの
と同じ消化緩衝液を含有）に共に混合し、３７℃で６時
間培養した。実施例１パート３に記述しであるように、
タンパクを除去し、そして消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄
し、そしてＴＥｐｈＳ中に再懸濁した。プロモーター領
域に可能な欠失を有するリパーゼ遺伝子を含有するＤＮ
Ａフラグメントを、実施例６バート２に記述したように
垂直ゲル電気泳動によりｐＢＲ３２２プラスミ ドフラグメ ントから分離した。
スミドｐＨＲＡＩ ＤＮＡおよび制限酵素ＥｃｏＲＩ
の１００Ｕを３００μｇ溶液（実施例１３に記述したの
と同じ消化緩衝液を含有）に共に混合し、３７℃で６時
間培養した。実施例１パート３に記述しであるように、
タンパクを除去し、そして消化ＤＮＡを取り入れ、洗浄
し、そしてＴＥｐｈＳ中に再懸濁した。プロモーター領
域に可能な欠失を有するリパーゼ遺伝子を含有するＤＮ
Ａフラグメントを、実施例６バート２に記述したように
垂直ゲル電気泳動によりｐＢＲ３２２プラスミ ドフラグメ ントから分離した。
パート４：リパーゼ遺伝子に融合されたｔａＣプロモー
タを含有する組換え体プラスミドの構成プラスミドｐＭ
ＭＢ２２（エム・バダサリアン（Ｍ、 Ｂａｇｄａｓａ
ｒｉａｎ）、ミシガン・バイオテクノロジー・インステ
ィテニート（Ｍ ｉｃｈｉｇａｎ Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙＩ ｎ５ｔｉｔｕｔａ）、ランラング（Ｌａ
ｎｓｉｎｇ）、 エムアイ（Ｍｌ）をクローニングベク
ターとして選択した。
タを含有する組換え体プラスミドの構成プラスミドｐＭ
ＭＢ２２（エム・バダサリアン（Ｍ、 Ｂａｇｄａｓａ
ｒｉａｎ）、ミシガン・バイオテクノロジー・インステ
ィテニート（Ｍ ｉｃｈｉｇａｎ Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙＩ ｎ５ｔｉｔｕｔａ）、ランラング（Ｌａ
ｎｓｉｎｇ）、 エムアイ（Ｍｌ）をクローニングベク
ターとして選択した。
というのは、それはｔａｃプロモータ、ダラム陰性バク
テリアの色々なホスト範囲、選択可能なアムビシリン抵
抗（Ａｐ）遺伝子、および可動遺伝子を有するからであ
る［バダサリアンら、Ｇｅｎｅ、２６．２７３〜２８２
（１９８３）］。さらに、このプラスミドはビー・アユ
ルギノーザ中ビー、アエルギノーザ・ホスホマンノース
（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ） Φイソメラーゼ遺
伝子を過表現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）するのにうま
く使用される。
テリアの色々なホスト範囲、選択可能なアムビシリン抵
抗（Ａｐ）遺伝子、および可動遺伝子を有するからであ
る［バダサリアンら、Ｇｅｎｅ、２６．２７３〜２８２
（１９８３）］。さらに、このプラスミドはビー・アユ
ルギノーザ中ビー、アエルギノーザ・ホスホマンノース
（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ） Φイソメラーゼ遺
伝子を過表現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）するのにうま
く使用される。
プラスミドｐＭＭＢ２２を実施例１パート２に記述した
ようにｐＭＭＢ２２を含有するイー、コーリーのセルか
ら精製した。ただし、バクテリア成長培地は２５μｇ／
ｍ（ｌＡｐ（シグマ・ケミカル株式会社、セント・ルイ
ス、エムオー）で補足されている。プラスミドｐＭＭＢ
２２ ＤＮＡの４４μ９および制限酵素ＥｃｏＲＩの
４０Ｕを実施例１３に記載したように消化緩衝溶液の１
２５μＱ溶液中に一緒にして、３７°Ｃ−晩培養した。
ようにｐＭＭＢ２２を含有するイー、コーリーのセルか
ら精製した。ただし、バクテリア成長培地は２５μｇ／
ｍ（ｌＡｐ（シグマ・ケミカル株式会社、セント・ルイ
ス、エムオー）で補足されている。プラスミドｐＭＭＢ
２２ ＤＮＡの４４μ９および制限酵素ＥｃｏＲＩの
４０Ｕを実施例１３に記載したように消化緩衝溶液の１
２５μＱ溶液中に一緒にして、３７°Ｃ−晩培養した。
ＥｃｏＲＩ消化ｐＭＭＢ２２ ＤＮＡを実施例１パー
ト４に記述したように脱リン酸反応し、あとの結紮反応
におけるプラスミド回送を防止した。実施例１パート３
に記述されているように、汚染タンパクを除去し、そし
て脱リン酸反応されたＤＮＡを沈澱し、取り入れ、洗浄
し、そしてＴＥｐＨＢ中に再懸濁した。プロモータ領域
に起こりうる欠失を有するリパーゼ遺伝子を含有する精
製ＤＮＡフラグメント（上記パート３に記載）したよう
にプラスミドｐＭＭＢ２２に結紮した。
ト４に記述したように脱リン酸反応し、あとの結紮反応
におけるプラスミド回送を防止した。実施例１パート３
に記述されているように、汚染タンパクを除去し、そし
て脱リン酸反応されたＤＮＡを沈澱し、取り入れ、洗浄
し、そしてＴＥｐＨＢ中に再懸濁した。プロモータ領域
に起こりうる欠失を有するリパーゼ遺伝子を含有する精
製ＤＮＡフラグメント（上記パート３に記載）したよう
にプラスミドｐＭＭＢ２２に結紮した。
バート５：′プラスミドのイー、コーリー中への形質転
換 ＤＮＡ結紮混合物を実施例３パート２および３に記述し
たようにイー、コーリーＤＨ５の反応性のある細胞に形
質転換した。形質転換されたセルを５０μｇ／ｒｎＱＡ
ｐを含有するシリア寒天プレート上で培養し、３７℃で
一晩培養した。この選択培地の選択により、Ａｐ抵抗遺
伝子を含有するｐＭＭＢ２２プラスミドを含有するセル
のみの成長を可能とする。ｔａｃプロモータに融合され
たプロモータのないリパーゼ遺伝子を有する所望のＤＨ
５挿入物を含有する菌株を同定するため、Ａｐ’形質転
換体を、５０ ｐｇ／ｒｎＱＡｐ、 ０．０５％ひまし
油および１ｍＭイソプロピル−チオガラクトジッド（■
ＰＴＧ、インターナショナル・バイオチクノロシーズ株
式会社、ニューバーペン、シーティー）（含有させない
ものもある）で補足されたルリア寒天プレート上遮断し
た。１つのＤＨ５Ａり・形質転換体は、ｌ ＰＴＧが存
在するときのみ、広い透明ゾーンを製造した。ｔａｃプ
ロモータにより制御されＩ；遺伝子は、代謝可能でない
ｌ ＰＴＧ分子により十分に誘導される。このＤＨ菌株
は、リパーゼ遺伝子に融合したｔａｃプロモータを有す
る組換え体９ＭＭＢ２２プラスミドを含有していた［ｐ
ＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）と呼ばれる］。
換 ＤＮＡ結紮混合物を実施例３パート２および３に記述し
たようにイー、コーリーＤＨ５の反応性のある細胞に形
質転換した。形質転換されたセルを５０μｇ／ｒｎＱＡ
ｐを含有するシリア寒天プレート上で培養し、３７℃で
一晩培養した。この選択培地の選択により、Ａｐ抵抗遺
伝子を含有するｐＭＭＢ２２プラスミドを含有するセル
のみの成長を可能とする。ｔａｃプロモータに融合され
たプロモータのないリパーゼ遺伝子を有する所望のＤＨ
５挿入物を含有する菌株を同定するため、Ａｐ’形質転
換体を、５０ ｐｇ／ｒｎＱＡｐ、 ０．０５％ひまし
油および１ｍＭイソプロピル−チオガラクトジッド（■
ＰＴＧ、インターナショナル・バイオチクノロシーズ株
式会社、ニューバーペン、シーティー）（含有させない
ものもある）で補足されたルリア寒天プレート上遮断し
た。１つのＤＨ５Ａり・形質転換体は、ｌ ＰＴＧが存
在するときのみ、広い透明ゾーンを製造した。ｔａｃプ
ロモータにより制御されＩ；遺伝子は、代謝可能でない
ｌ ＰＴＧ分子により十分に誘導される。このＤＨ菌株
は、リパーゼ遺伝子に融合したｔａｃプロモータを有す
る組換え体９ＭＭＢ２２プラスミドを含有していた［ｐ
ＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）と呼ばれる］。
バート６：プラスミドｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８
１６１）のビー、エスピー ＡＴＣＣ２１８０８中への
導入 プラスミドｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）を
実施例２バート２に記載したように接合によりビー、エ
スピーＡＴＣＣ２１８０ｇへ転移した。ピー、エスピー
ＡＴＣＣ２１８０８転移接合体を５０１１９／ｒｎＱ
Ｒｉｆおよび１０００μｐ／ｍＱＡｐを有する栄養
寒天プレート上で選択した。
１６１）のビー、エスピー ＡＴＣＣ２１８０８中への
導入 プラスミドｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）を
実施例２バート２に記載したように接合によりビー、エ
スピーＡＴＣＣ２１８０ｇへ転移した。ピー、エスピー
ＡＴＣＣ２１８０８転移接合体を５０１１９／ｒｎＱ
Ｒｉｆおよび１０００μｐ／ｍＱＡｐを有する栄養
寒天プレート上で選択した。
バート７： ビー、エスピー、ＡＴＣＣ２１８０８［ｐ
ＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）］菌株のリパー
ゼ活性 ビー、工７スピー ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨ
ＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）］のリパーゼ活性
を実施例５に記述したように決定した。
ＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）］菌株のリパー
ゼ活性 ビー、工７スピー ＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨ
ＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）］のリパーゼ活性
を実施例５に記述したように決定した。
ただし、成長培地は、５０μｇ／ｒｎＱ Ａｐを有す
るが１ｍＭ ＩＰＴＧは有しない成長培地である。
るが１ｍＭ ＩＰＴＧは有しない成長培地である。
プラスミドを含有しないピー、エスピーＡＴＣＣ２１８
０８Ｒｉｆｒ菌株およびプラスミドｐＭＭＢ２２を含有
する菌株は陰性コントロールとして役に立った。プラス
ミドを含有しない菌株およびｐＭＭＢ２２含有菌株を５
ｔｔ９／ｍＱ Ｒｉｆを有し、１ｍＭＩＰＴＧを有す
るもの、有さないもの、および５ ｐｇ／ｍＱ Ｒｉ
ｆ＋５０１１９／ｍＯＡｐそしてｌ ＰＴＧを有するも
の、有さないもの、それぞれの培地中で成長させた。
量的リパーゼ活性を実施例５に記述したように行い決定
した。リパーゼ活性を下記表に示した。
０８Ｒｉｆｒ菌株およびプラスミドｐＭＭＢ２２を含有
する菌株は陰性コントロールとして役に立った。プラス
ミドを含有しない菌株およびｐＭＭＢ２２含有菌株を５
ｔｔ９／ｍＱ Ｒｉｆを有し、１ｍＭＩＰＴＧを有す
るもの、有さないもの、および５ ｐｇ／ｍＱ Ｒｉ
ｆ＋５０１１９／ｍＯＡｐそしてｌ ＰＴＧを有するも
の、有さないもの、それぞれの培地中で成長させた。
量的リパーゼ活性を実施例５に記述したように行い決定
した。リパーゼ活性を下記表に示した。
（以下、余白）
ビー。
エスピー
１８０８
Ｒ１ｆｒ菌株のリパ
ーゼ活性
菌株／培養菌のＵ／ｒｎＱ
１ｍＭ ＩＰＴＧ
リパーゼ活性
１８０８
２１８０８
＋２１８０８ （ｐＭＭＢ２２） ２１８０８（ｐＭＭＢ２２） 十 ２１８０８ ［ｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８］６１
）］２１８０８ ［ｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１
６１）］ ＋１２．６ １２．６ １１．７ １３．４ ２６．４ ０７０ １ ＰＴＧなくして成長させたピー、エスピーＡＴＣＣ
２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨＥ Ｓ １２（国際寄託番号
６８１６１）］は、ププラストを含有しない菌株または
親のプラスミドを含有する菌株の２倍のリパーゼ活性を
有していた。他方、ＩＰＴＧ（７）存在下成長させると
、ピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨＥ
Ｓ １２（国際寄託番号６８１６１）］ｌｅｔ両コン
トロール菌株の８５倍のりパーゼ活性を有していた。
＋２１８０８ （ｐＭＭＢ２２） ２１８０８（ｐＭＭＢ２２） 十 ２１８０８ ［ｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８］６１
）］２１８０８ ［ｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１
６１）］ ＋１２．６ １２．６ １１．７ １３．４ ２６．４ ０７０ １ ＰＴＧなくして成長させたピー、エスピーＡＴＣＣ
２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨＥ Ｓ １２（国際寄託番号
６８１６１）］は、ププラストを含有しない菌株または
親のプラスミドを含有する菌株の２倍のリパーゼ活性を
有していた。他方、ＩＰＴＧ（７）存在下成長させると
、ピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ’［ｐＨＥ
Ｓ １２（国際寄託番号６８１６１）］ｌｅｔ両コン
トロール菌株の８５倍のりパーゼ活性を有していた。
実施例１５
プラスミドｐＮＭ１８５（ケー・ティミス（Ｋ。
Ｔ １ｍｍ１ｓ、デパートメント・オプ・メディカル・
バイオケミストリー、ユニバシティー・オブ・ゲネバ、
ゲネバ、スイス）をクローニングベクターとして選択し
た。というのは、それはｘｙｌプロモータ、ダラム陰性
バクテリアの色々なホスト範囲、選択可能なカナマイシ
ン抵抗（Ｋｍ）遺伝子および可動遺伝子を有するからで
ある［メルモド（Ｍｅｒｍ□ｌ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＢａｃｔｅｒｉｏＬ １６７．４４７〜４５４
（１９８６）］。このプラスミドは色々なグラム陰性バ
クテリア中ｘｙｌ Ｅ遺伝子を過表現するのにうまく使
用される。
バイオケミストリー、ユニバシティー・オブ・ゲネバ、
ゲネバ、スイス）をクローニングベクターとして選択し
た。というのは、それはｘｙｌプロモータ、ダラム陰性
バクテリアの色々なホスト範囲、選択可能なカナマイシ
ン抵抗（Ｋｍ）遺伝子および可動遺伝子を有するからで
ある［メルモド（Ｍｅｒｍ□ｌ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＢａｃｔｅｒｉｏＬ １６７．４４７〜４５４
（１９８６）］。このプラスミドは色々なグラム陰性バ
クテリア中ｘｙｌ Ｅ遺伝子を過表現するのにうまく使
用される。
プラスミドｐＮＭ１８５およびｐＨＥＳ１２を、実施例
１バート２に記述したようにｐＮＭ１８５およびｐＨＥ
Ｓ１２を含有するイー・コーリーのセルから精製した。
１バート２に記述したようにｐＮＭ１８５およびｐＨＥ
Ｓ１２を含有するイー・コーリーのセルから精製した。
ただし、バクテリア成長培地は、５０μｇ／ｖｘＱ
Ｋｍで補足されている。プラスミドｐＮＭ１８５を消化
し、脱リン酸反応し、そしてプラスミドｐＨＥＳ１２を
実施例Ａパート４に記述したように消化した。プロモー
タのないリパーゼ遺伝子を含有するｐＨＥＳ１２からの
ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＮＭ１８５（実施例
８に記述したように、ｘｙｌプロモータを含有する）に
結紮した。
Ｋｍで補足されている。プラスミドｐＮＭ１８５を消化
し、脱リン酸反応し、そしてプラスミドｐＨＥＳ１２を
実施例Ａパート４に記述したように消化した。プロモー
タのないリパーゼ遺伝子を含有するｐＨＥＳ１２からの
ＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＮＭ１８５（実施例
８に記述したように、ｘｙｌプロモータを含有する）に
結紮した。
バート２：組換え体プラスミドのイー・コーリー中への
形質転換 ＤＮＡ接合混合体を実施例３バート２および３に記載の
ようにイー・コーリーＤＨ５の反応性のあるセル中へ形
質転換した。形質転換体を実施例Ａバート５に記述した
ように選択した。ただし、５０μ９／ｌ１１２に！Ｉｔ
を使用した。沿１プロモータに対してＤＮＡ挿入物の所
望の配向を有する菌株を同定するため、Ｋ１形質転換体
を、５０ ｐｇ／ｍＱ Ｋｍ。
形質転換 ＤＮＡ接合混合体を実施例３バート２および３に記載の
ようにイー・コーリーＤＨ５の反応性のあるセル中へ形
質転換した。形質転換体を実施例Ａバート５に記述した
ように選択した。ただし、５０μ９／ｌ１１２に！Ｉｔ
を使用した。沿１プロモータに対してＤＮＡ挿入物の所
望の配向を有する菌株を同定するため、Ｋ１形質転換体
を、５０ ｐｇ／ｍＱ Ｋｍ。
０．０５％ひまし油および５ｍＭｍ−トルエン酸（ｍト
ール；イーストマン・コダック、ロビエスタ、エスワイ
）（含有させないものもある）で補足されたルリア寒天
プレート上で遮断した。ｍ−トルが存在したときのみ、
いくつかのＫｍ’形質転換体が大きな透明ゾーンを製造
した。これらのｐＨ５菌株は、プロモータのないリパー
ゼ遺伝子に融合したゎ１プロモータを有する組換え体ｐ
ＮＭ１８５プラスミドを含有していた［ｐＨＥＳ１２Ｘ
（国際寄託番号６８１８１）と呼ぶ］。
ール；イーストマン・コダック、ロビエスタ、エスワイ
）（含有させないものもある）で補足されたルリア寒天
プレート上で遮断した。ｍ−トルが存在したときのみ、
いくつかのＫｍ’形質転換体が大きな透明ゾーンを製造
した。これらのｐＨ５菌株は、プロモータのないリパー
ゼ遺伝子に融合したゎ１プロモータを有する組換え体ｐ
ＮＭ１８５プラスミドを含有していた［ｐＨＥＳ１２Ｘ
（国際寄託番号６８１８１）と呼ぶ］。
バート３：ｐＨＥＳ１２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）
のビー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８中への導入 プラスミドｐＨＥＳ１２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）
を実施例Ａに記述したように接合によりピ、ニスビーＡ
ＴＣＣ２１８０８に転移した。
のビー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８中への導入 プラスミドｐＨＥＳ１２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）
を実施例Ａに記述したように接合によりピ、ニスビーＡ
ＴＣＣ２１８０８に転移した。
ただし、５００μｇ／１ｎＱＫｒｎを使用した。
バート４： ピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８［ｐＨ
Ｅ Ｓ １２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）］菌株のリ
パーゼ活性 ピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ・［ｐＨＥＳ
ｌ ２Ｘ（国際寄託番号６８１８１））のリパーゼ活
性を実施例Ａバート７に記述したように決定した。ただ
し、５０μｇ／ｍＱＫｒｎｌおよび０．１ｍＭｍ−トー
ルを使用した。量的リパーゼ活性を実施例５に記述した
ように行い決定した。２１８０８［ｐＨＥＳ１２Ｘ（国
際寄託番号６８１８１）］のリパーゼ活性は、７５０
Ｕ／ｍＱであり、プラスミドを有さない菌株または親・
プラスミドを有する菌株の約６０倍であった。
Ｅ Ｓ １２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）］菌株のリ
パーゼ活性 ピー、エスピーＡＴＣＣ２１８０８Ｒｉｆ・［ｐＨＥＳ
ｌ ２Ｘ（国際寄託番号６８１８１））のリパーゼ活
性を実施例Ａバート７に記述したように決定した。ただ
し、５０μｇ／ｍＱＫｒｎｌおよび０．１ｍＭｍ−トー
ルを使用した。量的リパーゼ活性を実施例５に記述した
ように行い決定した。２１８０８［ｐＨＥＳ１２Ｘ（国
際寄託番号６８１８１）］のリパーゼ活性は、７５０
Ｕ／ｍＱであり、プラスミドを有さない菌株または親・
プラスミドを有する菌株の約６０倍であった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、染色体のリパーゼ遺伝子と、￥プセウドモナス￥セ
ル中でリパーゼを表現できるリパーゼ遺伝子を含む少な
くとも１つのマルチコピーベクターとを含み、このリパ
ーゼが菌株ＡＴＣＣ２１８０８から誘導されることを特
徴とする￥プセウドモナス￥セル。 ２、ベクターがｐＨＥＳ３、ｐＨＳＨ４３、ｐＨＳＨ３
１、ｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）またはｐ
ＨＥＳ１２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）である請求項
１記載の￥プセウドモナス￥セル。 ３、Ｐ−不和合性複製系、菌株ＡＴＣＣ２１８０８から
誘導されることを特徴とする￥プセウドモナス￥リパー
ゼ遺伝子、および選択マーカーからなるプラスミド。 ４、プラスミドがｐＨＥＳ３、ｐＨＳＨ４３、ｐＨＳＨ
３１、ｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）または
ｐＨＥＳ１２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）である請求
項３記載のプラスミド。 ５、リパーゼが菌株ＡＴＣＣ２１８０８から誘導される
ことを特徴とし、ゲノムのリパーゼ遺伝子およびリパー
ゼを暗号化する￥プセウドモナス￥リパーゼ遺伝子の多
数のコピーからなるプセウドモナス菌株のセルをリパー
ゼが表現されるに十分な時間および条件下、成長させ、
そして細胞を取り除きリパーゼを取り入れることからな
るリパーゼの製造方法。 ６、多数のコピーが少なくとも１つのベクターの成分で
ある請求項５記載の方法。 ７、ベクターがｐＨＥＳ３、ｐＨＳＨ４３、ｐＨＳＨ３
１、ｐＨＥＳ１２（国際寄託番号６８１６１）またはｐ
ＨＥＳ１２Ｘ（国際寄託番号６８１８１）である請求項
５記載の方法。 ８、セルが、マルチコピーリパーゼ遺伝子がないときに
比べ、少なくとも５倍のリパーゼを製造する請求項５記
載の方法。 ９、セルが２つのマルチコピーベクターからなり、各ベ
クターがリパーゼを暗号化する￥プセウドモナス￥リパ
ーゼ遺伝子からなる請求項５記載の方法。 １０、リパーゼが表現されるに十分な時間および条件下
、プラスミドｐＨＳＨ４３およびｐＨＳＨ３１からなる
プセウドモナス菌株ＡＴＣＣ２１８０８のセルを成長さ
せ、そして該セルを除いてリパーゼを取り入れることか
らなるリパーゼの製造方法。 １１、￥プセウドモナス￥・エスピー．ＡＴＣＣ２１８
０８からリパーゼ遺伝子により暗号化されたリパーゼか
らなる組成物。 １２、水性培地中で￥プセウドモナス￥・エスピー．Ａ
ＴＣＣ２１８０８からリパーゼ遺伝子によって暗号化さ
れたリパーゼとカルボン酸エステルを組み合わせて、該
有機カルボン酸エステルを加水分解する方法。 １３、水性培地中で￥プセウドモナス￥・エスピー．Ａ
ＴＣＣ２１８０８からリパーゼ遺伝子によって暗号化さ
れたリパーゼとヒドロキシカルボン酸を組み合わせて、
該ヒドロキシカルボン酸からラクトンを調製する方法。 １４、￥プセウドモナス￥・エスピー．ＡＴＣＣ２１８
０８からリパーゼ遺伝子によって暗号化されたリパーゼ
の脂質除去量からなる洗剤配合物で洗浄することにより
布から脂質汚れを除去する方法。 １５、洗剤活性組成物およびリパーゼからなり、該リパ
ーゼが、リパーゼを暗号化する遺伝子からなる組み換え
体ベクターからなる￥プセウドモナス￥微生物によって
製造され、該￥プセウドモナス￥中で表現されることを
特徴とする洗剤組成物。 １６、洗剤組成物が粒状であり、少なくとも１つのビル
ダー、漂白剤または白化剤を含む請求項１５記載の洗剤
組成物。 １７、洗剤組成物が液体であり、少なくとも１つの漂白
剤または白化剤を含有する請求項１５記載の洗剤組成物
。 １８、リパーゼがポートレートアミノ酸連鎖：Ｌ−Ｖ−
Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｑ−Ｇ−Ｇ を有することを特徴とする請求項１５記載の洗剤組成物
。 １９、リパーゼを暗号化する遺伝子の表現によって製造
されるリパーゼからなり、該遺伝子は組み換え体ベクタ
ーの一部からなることを特徴とする液体洗剤組成物。 ２０、リパーゼを暗号化する遺伝子の表現によって製造
されリパーゼを含み、該遺伝子は組み換え体ベクターの
一部からなることを特徴とする粒状洗剤組成物。 ２１、￥プセウドモナス￥・エスピーからリパーゼ遺伝
子により暗号化されたリパーゼを含む洗剤組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2075337A JPH03280876A (ja) | 1990-03-23 | 1990-03-23 | リパーゼ遺伝子およびその使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2075337A JPH03280876A (ja) | 1990-03-23 | 1990-03-23 | リパーゼ遺伝子およびその使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03280876A true JPH03280876A (ja) | 1991-12-11 |
Family
ID=13573344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2075337A Pending JPH03280876A (ja) | 1990-03-23 | 1990-03-23 | リパーゼ遺伝子およびその使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03280876A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013122219A1 (ja) * | 2012-02-15 | 2013-08-22 | 公益財団法人北九州産業学術推進機構 | カルボン酸系界面活性剤組成物及びそれを含有した洗浄剤並びに消火剤 |
-
1990
- 1990-03-23 JP JP2075337A patent/JPH03280876A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013122219A1 (ja) * | 2012-02-15 | 2013-08-22 | 公益財団法人北九州産業学術推進機構 | カルボン酸系界面活性剤組成物及びそれを含有した洗浄剤並びに消火剤 |
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