JPH03285677A - 形質転換された微生物の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、トリプトファナーゼオペロン中のプロモータ
ーによって発現可能な、動物、植物又は微生物由来の目
的構造遺伝子を含有する組換えプラスミド形質転換され
た微生物を培養して、該目的構造遺伝子の発現産物を大
量に効率よく産生せしめる方法、並びに該方法において
使用しうる新規な組換えプラスミド及び該プラスミドで
形質転換された微生物に関する。

近年、動物、植物又は微生物由来の有用物質の遺伝情報
を担う遺伝子画分を組み込んだ複合プラスミドを保有す
る宿主微生物を用いて、該微生物に上記有用物質を大量
に産生させる遺伝子組換え技術の新作はめざましく、既
に宿主微生物として大腸菌を用いてインシュリンやイン
ターフェロン等の生産が行われつつある。

しかしながら、上記の如く遺伝子組換え技術は進歩した
ものの目的構造遺伝子を保有する遺伝子組換え菌を用い
て目的生産物を大量に製造する方法はいまだ確立されて
おらず、遺伝子組換え菌の効率的な培養方法の開発が急
がれている。

一方、トリプトファナーゼオペロンの遺伝子発現機構は
「カタボライト・リプレッション」と呼ばれる発現調節
機構で制御されており（Ｂ　ｏＬｓｆｏｒｄ　　Ｊ　、
　Ｌ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｄ、　ＤｅＭｏｓｓ；　Ｊ　、　
Ｂａｃ。

１９７１．１０５゜３０３〜３１２参照）、グルコース
を主炭素源として含む培地においては、該遺伝子の発現
は極めて強く抑制されることが知られている。

そのため、トリプトファナーゼオペロン中のプロモータ
ーは、協力な目的構造遺伝子の発現能力を有しているが
、該プロモーター及び該ブロモターで発現される目的構
造遺伝子を含有するプラスミドを保有する微生物を培養
して該微生物に該目的構造遺伝子を高発現させようとす
る場合には、主炭素源としてグルコースを含有する培地
を使用することができず、コハク酸、その他の高価な炭
素源を含む培地の使用が余儀なくされていた。

このように、トリプトファナーゼオペロン中のプロモー
ターの強力な遺伝子発現能力を利用した有用構造遺伝子
の発現のために、かかる遺伝子を保有する微生物を培養
する際に、主炭素源として安価で工業的にも広く利用さ
れているグルコースを使用することができないというこ
とは、該プロモーターの工業的利用を図る上で大きな障
害となっている。

本発明者らは、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）
中のプロモーターの強力な遺伝子発現機構に着目し、そ
の有効利用について鋭意研究を行った。その結果、今回
、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）中のプロモー
ター及び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔ
ｎａＣを含むＤＮＡ断片（ａ）の下流側に、目的構造遺
伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ）を結合すると、該プロモー
ターによりトリプトファナーゼ構造遺伝子のみならず、
外来の目的構造遺伝子もまた、強力に発現されうろこと
が見い出された。

しかも、上記ＤＮＡ断片（ａ）及び（ｂ）を少なくとも
含有する組換えプラスミドで形質転換された微生物は、
前述したとおりカタボライト・リプレッション（グルコ
ースによる遺伝子発現の抑制）を受けているにも拘らず
、Ｌ−又はＤＬ−トリプトファンを含有する培養液、中
において、グルコースをその濃度が特定の限られた低い
範囲内に維持されるように連続的又は間欠的に添加して
培養する場合には、驚くべきことに、カタボライト・リ
プレッションを受けず、目的構造遺伝子が高度に発現し
、該遺伝子の発現産物を高収量で取得することができる
ことを見い出した。

なお、培地中にグルコースを成る低濃度で連続的又は断
続的に添加して微生物媒体を培養する方法として、特公
昭６１−４２５５５号公報には、培地中のグルコース濃
度が１％以下に保たれるようにグルコースを連続的又は
断続的に添加することから成るトリプトファン・シンタ
ーゼ生産菌Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの培養
方法が既に開示されている。

しかし、トリプトファン・シンターゼ構造遺伝子の発現
は、ｌ・リプトファンオペロン中のブロモターにより制
御を受けており、この遺伝子発現機構はカタボライ）・
リプレッションを受けないことが知られている。

事実、Ａｇｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３８　（
７）、１３３５〜１３４２．１９７４にはトリプトファ
ン・シンターゼ生産菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の培養に際して、培地中のグ
ルコース濃度を０．５％および１．８％で培養した菌体
のトリプトファン・シンターゼ活性は、それぞれ２．４
および７．３Ｕ／ｍ＋２でありグルコース濃度の増加に
伴い酵素活性が上昇すること、また特開昭６１２６８１
７５号公報には、トリプトファン・シンターゼ生産菌エ
シェリヒア・コリの培養に際して、培地中のグルコース
濃度を０．５〜５％に維持して培養した場合、トリプト
ファンシンターゼ活性が最も高いことが開示されている
。

前記した特公昭６１−４２５５５号公報には、実施例に
おいて培地中のグルコース濃度をそれぞれ１％および０
．０５％に維持して培養した場合、培養開始時に５％の
グルコースを含む培地にて培養した場合と比較して、グ
ルコース濃度１％では菌体収量で２．６９倍および酵素
活性で１．８０倍増加並びにグルコース濃度０．０５％
−ｃ　ハ菌体収量で３．１倍および酵素活性で２．１５
倍増加することか開示されている。この結果から、グル
コ７かより低濃度の方か菌体収量および酵素活性どもに
増加する傾向か認められるがその差はわずかである。ま
た、該培養方法において用いているトリプトファン ーゼオペロン てトリプＩ・ファン・シンターゼ構造遺伝子の発現が可
能な換えＤ　Ｎ　Ａ菌株であるという報告はない。

さらにカタボライト・リプレッションによって遺伝子発
現が抑制されている場合、菌体の増殖とは無関係に、遺
伝子の発現のみ抑制されるが、上記したとおり、特公昭
６１−４２５５５号公報で使用のエシェリヒア・コリで
は、菌体収量および酵素活性ともにグルコースで抑制を
受けている。

これらのことから、特公昭６１−４２５５５号公報で開
示されている現象は、カタボライト・リプレッションと
はその機構が全く異る、該方法において用いたｌ・リプ
トファン・シンターゼ生産菌エシェリヒア・コリのみが
有する極めて特異的な現象であると考えられる。

このように、トリプトファン・シンターゼ生産菌エシェ
リヒア・コリの培養方法については、培地中のグルコー
スを諸種の濃度に維持して行う方法が開示されている。

しかしながら、本発明のトリプトファナーゼオペロン ターによる遺伝子発現機構を利用した形質転換されたエ
シェリヒア・コリ菌株の工業的培養方法に関する報告は
、本発明者らが知る限りみあたらない。かくして、本発
明によれば、トリプトファナゼオベロン（　ｔｎａ）中
のプロモーター及び該プロモーターの下流に位置する調
節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片（ａ）と、該プロモ
ーターによって発現可能な目的構造遺伝子を含むＤＮＡ
断片（ｂ）とを少なくとも含有する組換えプラスミドで
形質転換された微生物を、Ｌ−又はＤ　Ｌ　−　トＩＪ
ブトファンを含有する培地中において、炭素源としてグ
ルコースをその濃度が０．０１〜０．３％（ｗｔ／ｖｏ
Ｑ）の範囲内に維持されるように連続的又は間欠的に該
培地に添加しつつ培養し、それによって該微生物に上記
目的構造遺伝子を発現さぜることを特徴とする上記形質
転換された微生物の培養方法が提供される。

以下、本発明に従う培養法についてさらに詳細に説明す
る。

■２形質転換された微生物 本発明の方法に従い培養される微生物は、（ａ）トリプ
トファナーゼオペロン（　Ｌｎａ）中のプロモーター及
び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子１．ｎａ
ｃを含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ｐ断片」と略称す
ることがある）と、 （ｂ）該プロモーターによって発現可能な目的構造遺伝
子を含むＤＮＡ断片（以下、これを「Ｔ断片」と略称す
ることがある） とを少なくとも含有する組換えプラスミドで形質転換さ
れた微生物である。以下、この形質転換された微生物に
ついて述べる。

［−１．組換えプラスミド 」二記形質転換された微生物を調製するに際して宿主微
生物に導入される組換えプラスミドは、上記のＤＮＡ断
片（ａ）、すなわちＰ断片とＤＮＡ断片（ｂ）、すなわ
ちＴ断片とを最小限含有し、宿主微生物中に安定に保持
され且つ複製されるものであれば、特に制限されるもの
ではなく、適宜能のＤＮＡ断片を含むことができる。

上記Ｐ断片は、当該プラスミドに組み込むことによって
発現させることを希望する目的構造遺伝子を発現させる
機能を担うものであり、その供給源としては、実用的に
はエシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡが好適である。具
体的には、例えば、エシェリヒア・コリ　ＡＴＣＣ　　
２７３２５エシエリヒア・コリ　ＡＴＣＣ　　２３２８
２エシエリヒア・コリ　ＡＴＣＣ　　２３４３７エシエ
リヒア・コリ　ＡＴＣＣ　　２３４６１等の菌株の染色
体ＤＮＡを有利に用いることができる。

これら供給源微生物からＰ断片を調製するための具体的
方法は、後記実施例１、（１）及び実施例２、（２）に
記載されているが、その基本的操作法を簡単に述べれば
次のとおりである二上記供０ 給源微生物であるエシェリヒア・コリの培養物からトリ
プト７アナーゼオベロンを含有する染色体ＤＮＡを常法
［５ａｉｔｏ　Ｈ，ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、　Ｋ、　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａ　Ｂ　１ｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔ
ａ　７２　６１９−６２９（１９６３）参照］で抽出し
、その染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、トリプ
ト７アナーオベロン（ｔｎａ）中のプロモーター及び調
節遺伝子ｔｎａ　Ｃを含むＤＮＡ断片をクローニングす
る。しかして、例えは、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎ
ｄｌＩＩを用いて切り出せば、長さが約３．２ｋｂのト
リプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）ＤＮＡ断片を得る
ことができ、それをさらに制限酵素ＡｌｕＩ及びＲｓａ
Ｉを用いて切り出せば、長さが約６３０ｂｐのｔｎａプ
ロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片を
調製することができ、このＤＮＡ断片はＰ断片として使
用することができる。

また、Ｔ断片中の目的構造遺伝子がトリプトファナーゼ
構造遺伝子（ｔｎａＡ）である場合には、上記の長さが
約３．２ｋｂのトリプトファナーゼ（ｔｎａ）ＤＮＡ断
片又はこのＤＮＡ断片のＢａｍＨ１部位から約９００ｂ
ｐをオキソヌクレアーゼ■で削除した長さが約２．３ｋ
ｂのＤＮＡ断片を、Ｐ断片とＴ断片とが連結したＤＮＡ
断片として使用することができる。

方、Ｔ断片に含まれる「目的構造遺伝子」とは、Ｐ断片
により発現可能な、タンパク質およびペプチド等に対応
した遺伝情報を担う微生物、動物又は植物由来の構造遺
伝子を示す。

そのような目的構造遺伝子が遺伝情報どして担う有用物
質の代表例を示せば次のとおりである。

Ｉ・リプトファナーゼ（Ｅ、Ｃ，４，１，９９，１）、
トリプトファン・シンターゼ（Ｅ、Ｃ，４，２，Ｉ、２
０）、クロラムフェニコール・アセデルトランスフェラ
ーゼ（ＥＸＣ，２，３，１，２８）、 アスパルターゼ（Ｅ、Ｃ１４，３，１１１）、スレオニ
ン・シンターゼ（Ｅ、Ｃ，４，２，９９，２）、ホモセ
リン・キナーゼ（Ｅ、Ｃ，２，７，１，３９）、各種の
成長ホルモン、 インシュリン、 ソマトスフチン、 １ ２ インターフェロン、 インターロイキン等。

これらの有用物質の遺伝情報を担う目的構造遺伝子を含
むＤＮＡ断片（Ｔ断片）は、該有用物質の産生能をもつ
動物、植物又は微生物の細胞から、通常用いられている
それ自体既知の手法で取得することができる。本発明で
は特にエシェリヒア・コリ由来のものが好適に使用され
る。

Ｔ断片の好ましい具体例としては、トリプトファナーゼ
構造遺伝子（ｔｎａＡ　）を含むＤＮＡ断片トリプトフ
ァン・シンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ　１ｔｒｐＢ）
Ｑ含むＤＮＡ断片等が挙げられる。また、これらＤＮＡ
断片の供給源となる微生物としては、具体的には、Ｅ　
５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＫ　−１２系株、例え
ば エシェリヒア・コリ　ＡＴＣＣ２７３２５、エシェリヒ
ア・コリ　ＡＴＣＣ２３２８２、エシェリヒア・コリ　
ＡＴＣＣ２３４３７、エシェリヒア・コリ　ＡＴＣＣ２
３４６１等が使用できる。

上記トリプトファナーゼ構造遺伝子（ｔｎａＡ　）を含
むＤＮＡ断片としては、上記エシェリヒア・コリの染色
体ＤＮＡから制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩｆｆを
もいて切り出される長さが約３．２ｋｂのトリプトファ
ナーゼオペロン（ｔｎａ）　ＤＮＡ断片及びそのＤＮＡ
断片のＢａｍＨ１部位から約９００ｂｐを削除した長さ
が約２．３ｋｂのＤＮＡ断片が挙げられる。これらは前
述したとおり、Ｐ断片の下流にトリプトファナーゼ構造
遺伝子（ｔｎａＡ　）が連結したものであり、Ｐ断片と
Ｔ断片を同時に含有するＤＮＡ断片として利用すること
ができる。

また、トリプトファン・シンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐ
Ａ　、　ｔｒｐＢ　）を含むＤＮＡ断片としては、例え
ば、上記のＥ、ｃｏｌｉの染色体ＤＮＡ中にファージ〆
８０を感染させた後誘発し、ファージＤＮＡ中にトリプ
トファンオペロンを取り込んだファージを大量に調製し
、次に７アージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩを
用いて長さが約２０ｋｂのトリプトファンオペロンＤＮ
Ａ断片を切り出し、このＤＮＡ断片をさらに制限酵素Ｈ
４ｎｃＩ［で部分針３ ４ 解を行なうことにより得られる長さが約２．６ｋｂの１
−リブトファン・シンターゼ構造遺伝子（［ｒｐＡ　、
　ｔｒｐＢ　）含有ＤＮＡ断片を挙げることができる。

さらに、本発明に従う組換えプラスミドが含みうる他の
ＤＮＡ断片としては、Ｃ０１Ｅ１系プラスミド自律増殖
能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片、Ｆ因子プラスミド由
来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片、抗
生物質（例えばアンピシリン、カナマイシン、タロラム
フェニコール等）耐性を担う遺伝子を含むＤＮＡ断片等
を例示することができる。

しかして、本発明において好適な組換えプラスミドの１
つの具体例としては、本発明者らが造成した下記の４つ
のＤＮＡ断片 （ａ）ｔ・リプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）中のプ
ロモーター及び該プロモーターの下流に位置する調節遺
伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片（Ｐ断片）と； （ｂ）上記プロモーターにより発現させうる目的構造遺
伝子を含むＤＮＡ断片（Ｔ断片）と：（ｃ）　Ｃｏｌ　
Ｅ　ｌ系プラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片と： （ｄ）Ｆ因子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺
伝子を含むＤＮＡ断片を保有するプラスミドを挙げるこ
とができる。

このプラスミドを構築するに際して、Ｐ断片及びＴ断片
と組合わせて使用される上記（ｃ）のＤＮＡ断片、すな
わち、「Ｃｏ１Ｅｌ系プラスミド由来の自律増殖を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下、「Ｓ断片」と略称す
ることがある）には、コピー数が１細胞染色体当り２０
〜３０個であるＣｏ１Ｅｌ系プラスミドの自律増殖を司
る遺伝子を含むＤＮＡ断片が包含される。そのようなＳ
断片の代表例としては、例えば、約４．３ｋｂの長さを
有するプラスミドｐＢＲ３２２由来のＳ断片又は長さが
約５．１ｋｂのプラスミドｐＫＫ２３２８中来のＳ断片
が挙げられ、その他にプラスミドｐＢＲ３２５等の由来
のＳ断片を例示することかできる。

５ ６ Ｐ断片、Ｔ断片及びＳ断片は、さらに、Ｆ因子プラスミ
ド由来のプラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含
むＤＮＡ断片（ｄ）と組合わせられる。Ｆ因子プラスミ
ドは、例えば、「蛋白質、核酸　酵素」第２７巻第１号
（１９８２）の９８頁の図１の遺伝子地図及びＥｃｏＲ
Ｉによる物理的地図に示される如き構造をもつ、分子量
が９４゜５ｋｂ（ｆ３２ＸｌＯ’ダルトン）の既知のプ
ラスミドであり、大腸菌などの腸内細菌中に通常細胞染
色体当り１〜２個のコピー数で存在し、このプラスミド
は細胞分裂後にそれぞれの娘細胞中に正確に伝達される
ような機構を備えている（このように、コピー数を低い
レベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖とペースを合わせ
て増やす仕組みをｓｔｒｉｎｇｅｎＬな増殖の制御と呼
んでいる）。Ｆ因子プラスミドにおけるこのようなｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御機能が、ｍ１ｎｉ−Ｆと呼
ばれる長さが９．２ｋｔの自律増殖できる断片に担われ
ていることも既に究明されており［”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ”　Ｉ　９
６．１８５−１９３　（１９８４）参照］、このｍ１ｎ
ｉ−ＦがＦ因子プラスミドより制限酵素ＥｃｏＲＩによ
り切り出し可能であることも知られている。

本発明に従うプラスミドはこのｍ１ｎｉ　−Ｆに担われ
ている増殖制御分配系を利用するものであり、しかして
「Ｆ因子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子
を含むＤＮＡ断片」　（以下、「Ｆ断片」と略称するこ
とがある）は、上述したようなＦ因子プラスミドを娘細
胞に正確に伝達する機構を担う遺伝子画分を意味し、そ
のようなＦ断片の代表例としては、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ
　　］　２５ｔｒａｉｎから得ることができるＦ因子プ
ラスミドから制限酵素ＥｃｏＲ，Ｉにより切り出される
長さが約９．２ｋｂのｍ１ｎｉ−Ｆ断片を挙げることが
できる。

本発明で使用しうる前記プラスミドは、以上に述べたＰ
断片、Ｔ断片、Ｓ断片及びＦ断片の４つの必須のＤＮＡ
断片を有する限り、他の遺伝情報を担うＤＮＡ断片、例
えば抗生物質耐性マーカであるアンピシリン耐性遺伝子
を含むＤＮＡ断片、カナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片等をさ７ ８ らに含有しうる。

かかるＤＮＡ断片からの組換えプラスミドの構築は、遺
伝子操作技術に関する標準的テキストに記載されている
如きそれ自体既知の方法で行なうことができる［例えば
、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　Ｅ、　Ｆ。

Ｆ　ｒｉｓｃｈ　ａｎｄ　Ｊ　、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　
”Ｍｏ１ｅｃｕｌｅａｒ　Ｃｌ。

ｎｉｎｇ”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）等の文献参照］。

本発明において使用しうる組換えプラスミドの典型的な
具体例には、Ｐ断片、Ｔ断片、Ｓ断片及びＦ断片の４つ
のＤＮＡ断片から実質的になるものであって、 （１）Ｔ断片がトリプトファナーゼ構造遺伝子（Ｌｎａ
Ａ）を含むＤＮＡ断片である分子量が約１０．２メガダ
ルトン（約１５．５ｋｂ）のプラスミドで、本発明者ら
が「プラスミドｐＭＴＰ４Ｊと命名したもの（後記実施
例４参照） （２）Ｔ断片がトリプトファナーゼ構造遺伝子（［ｎａ
Ａ）を含むＤＮＡ断片である分子量が約１０．７メガダ
ルｉ・ン（約１６．４ｋｂ）のプラスミドｐＭＴＰｌ及
びｐＭＴＰＩＲ（これらのプラスミド及びその調製法は
特開昭６３−２８３９３号公報に開示されているので、
ここではその引用をもって詳細な開示に代える）： （３）Ｔ断片がトリプトファンシンターゼ構造遺伝子（
ｔｒｐＢ　、　ｔｒｐＡ　）を含むＤＮＡ断片である分
子量が約９．９メガダルトン（約１６゜６　ｋｂ）のプ
ラスミドで、本発明者らが「プラスミドｐＭＴＹ２０ｊ
　と命名したもの（後記実施例２参照） を挙げることができ、中でもプラスミドｐＭＴＰ４及び
プラスミドｐＭＴＹ２０が好適である。また、上記プラ
スミドｐＭＴＰ４及びプラスミドｐＭＴＹ２０は従来の
文献に未載の新規なプラスミドであり、本発明の一部を
構成する。

プラスミドｐＭＴＰ４は下記衣１に記載する如き制限酵
素の認識部位数及び該制限酵素による分解断片の長さ（
ｋｂ）を示す。

０ 表１　プラスミドｐＭＴＰ４ 認識部位　　分解断片の長さ 制限酵素　　の数　　　　（ｋ　ｂ） ＥｃｏＲＩ　　　　　２　　　　９．２、　　６．３Ｂ
ａｍＨＴ　　　　　３　　　　　　　　　２．４１０．
７．２．４ ＨｉｎｄｌＩ［２１４，７，０，８ 以上に述べた如き特性をもつプラスミドｐＭＴＰ４は、
例えば次のようにして製造することができる。

まず、トリプトファナーゼプロモーター及びこのプロモ
ーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａＣキｉ・リブ
トファナーゼ構造遺伝子１１ａＡとが結合したＤＮＡ断
片（（Ｐ　ｔ　Ｔ）断片）の調製は、例えば染色体遺伝
子中にトリプトファナーゼオペロンをもつ大腸菌、例え
ば、エシェリヒア・コリに一１２系株（ＡＴＣＣ２３２
８２、ＡＴＣＣ２３４３７、ＡＴＣＣ２７３２５、ＡＴ
ＣＣ２３４６１）などから染色体ＤＮＡを抽出し、それ
から常法［Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１Ｌｓｃｈ、　Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ、　　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ　　
　（］　　９８２）　　ｐ、１６４−１６５、Ｃｏｌｄ
　Ａ　ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ参照］に従って、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ
Ｉ［［を用いてトリプトファナーゼオペロンＤＮＡ断片
を切り出すと、約３．２ｋｂのＤＮＡ断片が得られる。

次に該断片のＢａｍＨ１部位から９００ｂｐを削除しト
リゾ］・ファナーゼプロモーター及びこのプロモーター
の下流に位置する調節遺伝子ｔｎａ　Ｃ並びにトリプト
ファナーゼ構造遺伝子ｔｎａＡを含む約２．３ｋｂの（
ＰｔＴ）断片が得られる。

方、ｍ１ｎｉ　−Ｆ断片の調節は、例えば、Ｆ因子プラ
スミドを保有する微生物、例えばＥ、ｃｏｌｉＫ−１２
系株（ＡＴＣＣ１５１５３、ＡＴＣＣ２３２８２、ＡＴ
ＣＣｅ２３５９０）等がらそれ自体公知の方法で、例え
ばＰ、　Ｇｕｅｒｒｙ　　Ｄ。

Ｌ、　Ｌａ　Ｂｌａｎｃ、　Ｓ、　Ｆａｌｋｏｗ；　Ｊ
　、　Ｂａｃｔ、、　　１−シ」−１１０６４（１９７
３）等の文献に記載の方法でＦ因子プラスミドを取り出
し、それがら制限酵素ＥｃｏＲｆｆを用いて分子量が約
９．２ｋｂのｍ１ｎｉＦ断片を切り出すことにより調製
することがで１ ２ きる。

他方、Ｃｏ１Ｅｌプラスミドの自律増殖を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片の供給源としては、Ｃｏ１Ｅｌプラスミ
ドとして代表的なプラスミドｐＢＲ３２２を使用するの
が便利である。

」１記の如くして調製された（Ｐ　ｔ　Ｔ）断片を制限
酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩ［で処理したプラスミ
ドｐＢＲ３２２と一緒にし、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼを
作用させて、プラスミドｐＢＲ３２２に上記（ＰｔＴ）
断片が組み込まれたプラスミドを作成する、次いで、こ
のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで開裂させ、上記の
ようにして調製されたｍ１ｎｉＦ断片と一緒にし、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを作用させることにより、目的とするプ
ラスミドｐ　Ｍ　ＴＰ４を得ることができる。

なお、プラスミドｐＭＴＰ４の具体的調製法については
後記実施例１でさらに詳細に説明する。

他方、プラスミドｐＭＴＹ２０は下記に表２記載する如
き制限酵素の認識部位数及び該制限酵素による分解断片
の長さ（ｋｂ）を示す。

表２　プラスミドｐＭＴＹ２Ｑ ＥｃｏＲＩ　　　　　　　２　　　　　　９．２．７．
４ＨｉｎｄｌＩ［３９，３，５，０，２，３Ｓａｌ　Ｉ
　　　　　　４　　　　１２．８．２．４．０．８．０
．６ＢａｍＨＩ　　　　　　５　　　　　　６．８．４
．０．２．７．２．４．０．７ 以上に述べた如き特性をもつプラスミドｐ　Ｍ　ＴＭ０
１は、例えば次のようにして製造することができる。

まず、トリプトファナーゼプロモーター及び該プラスミ
ドの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａ　Ｃを含むＤＮＡ
断片（Ｐ断片）の調製は、例えば、染色体遺伝子中にト
リプトファナーゼオペロンをもつ大腸菌、例えば、エシ
ェリヒア・コリに一１２系株ＡＴＣＣ２３２８２、ＡＴ
ＣＣ２３４３７、ＡＴＣＣ２７３２５、ＡＴＣＣ２３４
６１などから染色体ＤＮＡを抽出し、それから常法［Ｅ
、Ｆ。

Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ、　　Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ、　　“Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）ｐ、１
６４−１６５、Ｃｏｌｄ　Ｓ　ｐｒｉｎ３ ４ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ参照］に従
って、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉを用いて
トリプト７アナゼオベロンＤＮＡ断片を切り出し、さら
に制限酵素Ｒｓａ　Ｉ、ＡｌｕＩにより約６３０ｂｐの
トリプトファナーゼプロモーター及びこのプロモーター
の下流に位置する調節遺伝子ＬｎａＣを含むＤＮＡ断片
が得られる。さらに、ＢａｍＨＩリンカ−を付与するこ
とによりＰ断片が得られる。

また、トリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（Ｔ断片）の調製は、例えば染色体遺伝子中にト
リプトファンオペロンをもつ大腸菌、例えば、エシェリ
ヒア・コリに一１２系株（ＡＴＣＣ２７３２５、ＡＴＣ
Ｃ２３２８２、ＡＴＣＣ２３４３７、ＡＴＣＣ２３４６
１）などに、７アージ、例えばファージ〆８０　（ＡＴ
ＣＣ１１４５５ａ−Ｂｌ）なとを感染させ、溶原化及び
誘発現象を利用して、ファージＤＮＡ中にトリゾｌ−７
アンオペロンを取り込んだ７アージを大量に調製し［Ｒ
、Ｍ、　Ｄｅｎｎｅｙ、　Ｃ、Ｙａｎｏｆｓｋｙ；　Ｊ
　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　ｌ　］　８．５０５
　（１９７４）参照１、それから常法［Ｅ　、　Ｆ　、
　Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　　　（］　　
９８２）　　ｐ、　　Ｉ　　６４−１６５、Ｃｏｌｄ　
Ｓ　ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｉ−ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ参照］に従ってファージＤを抽出し、制限酵素、例え
ばＢａｍＨＩ　５ＥｃｏＲＩ等を用いてトリプトファン
オペロンＤＮＡ断片を切り出し、このＤＮＡ断片をさら
に制限酵素ＨｉｎｃＩＩで部分切断を行い、ｔｒｐＡ及
びｔｒｐＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。

次に得られるＤＮＡ断片と５ａｆ２　　Ｉリンカ−を混
合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させるとｔｒｐＡ及び
ＬｒｐＢ断片の両末端に５ａ１２　　Ｉ部位をもつＴ断
片が得られる。

一方、ｍ１ｎｉ　−Ｆ断片（Ｆ断片）の調製は、例えば
、Ｆ因子プラスミドを保有する微生物、例えば、エシェ
リヒア・コリに、−１２系株（ＡＴＣＣｌ　５１５３、
ＡＴＣＣｅ２３５８９、ＡＴＣＣｃ２３５９０）等から
それ自体既知の方法で、例えばＰ。

Ｇｕｅｒｒｙ、　Ｄ　Ｌ　、　ＬｅＢ　１ａｎｃ、　Ｓ
　、　Ｆａｌｋｏｗ；　Ｊ　。

Ｂａｃｋ、、　　ｌ　１６．１０６４（１９７３）等の
文献５ ６ に記載の方法でＦ因子プラスミドを取り出し、それから
制限酵素ＥｃｏＲＨを用いて分子量が約９゜２ｋｂのｍ
１ｎｉ　−Ｆ断片を切り出すことにより調製することが
できる。

他方、Ｃｏ１Ｅｌプラスミドの自律増殖を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片（Ｓ断片）の供給源としては、Ｃｏ１Ｅ
Ｉプラスミドとして代表的なプラスミドＰＢＦ３２２を
使用するのが便利である。

上記の如くして調製されたＰ断片及びＴ断片をそれぞれ
プラスミドｐＵｃＩ］９（宝酒造製）のＢａｍＨＩ部位
及び５ａｌＩ部位に挿入後、再びＥｃ。

ＲＴとＨｉｎｄｌｌｌで部分切断を行うことによりトリ
プトファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ及
びトリブトファンンンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ　、
　ｔｒｐＢ　）を含有する画分が得られる。得られるＤ
ＮＡ断片を、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｓ断片）のＥｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄ１１１部位に挿入し、更にＥｃｏＲ
Ｉ部位にＦ断面を挿入することにより、目的とするプラ
スミドｐＭＴＹ２０を得ることができる。

なお、プラスミドＩ）ＭＴＹ２０の具体的調製法につい
ては、後記実施例２でさらに詳細に説明する。

１−２、宿主微生物 前項Ｉ−１に述べた組換えプラスミドで形質転換するこ
とができるｈｏｓ　を微生物としては、ＥＳｃｌｌｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに属する微生物が好適であるが、
該プラスミドの種類によっては、例えば、シコードモナ
ス串プチダ（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕＬｉｄａ
）　、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂ　ｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆ　１ａＶｕｍ）　、バチルス・ズ
ブチリス（Ｂ　ａｃｉｌｂｕｓ　５ｕｂｔｉ１ｉｓ）等
の微生物もまた宿主として使用しうる可能性がある。

エシェリヒア・コリに属する微生物としては、例えば、
エシェリヒア・コリに一１２系株（ＡＴＣＣ２７３２５
、ＡＴＣＣ２３２８２、ＡＴＣＣ２３４３７、ＡＴＣＣ
２３４６１等）が使用できる。

Ｉ−３、形質転換 前項ｉ−１に述べた組換えプラスミドの、前項７ ８ １−２に述べた如きｈｏｓ　を微生物への導入は、それ
自体既知の方法、例えば、Ｍ　、　Ｍａｎｄｅｌ、　Ａ
　。

Ｈｉｇａ　；　Ｊ　、　Ｍｏ１．　　Ｂ　ｉｏｌ、、　
　５３．１５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行
うことができる。

このようにして形質転換された微生物の具体例としては
次のものを挙げることができる。

（１）前記プラスミドｐＭＴＰ４を保有するエシェリヒ
ア・コリＹＫ３００７　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８０３
） （２）前記プラスミドｐＭＴＰｌを保有するエシェリヒ
ア・コリに一１２ＹＫ３００２　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１７３３）、及び プラスミドｐＭＴＰＩＲを保有するエシェリヒア・コリ
に一１２ＹＫ３００３　（ＦＥＲＭＢＰ−１７３４） （３）前記プラスミドｐＭＴＹ２０を保有するエシェリ
ヒア・コリＹＫ２０１７　（ＦＥＲＭＢＰ−２８０４） 上記（１）〜（３）に記載の形質転換されたエシェリヒ
ア・コリ系株は、茨城系つくば南東１丁目１番３号、通
商産業省微生物工業技術研究所に、前記カッコ内の受託
番号で寄託されている。

■、培養 本発明に従う形質転換微生物の培養は、Ｌ−又はＤＬ−
トリプトファンを含有する培地中において、炭素源とし
てグルコースをその濃度が０．Ｏ１〜０．３％（ｗｔ／
ｖｏｌ）の範囲内に維持されるように連続的又は間欠的
に該培地に添加しつつ行なう。これによって、該形質転
換微生物は、カタボライト・リプレッションを受けず、
トリジ１−フアナーゼオペレン（ｔｎａ）中のプロモー
ターの遺伝子発現機構が強力に働き、目的構造遺伝子が
発現して有用物質を高収率で産生ぜしめることかできる
。

培地中のグルコース濃度は、培養期間中０．０１〜０．
３％（ｗｔ／ｖｏｌ）　、好ましくは０．０２−０．２
５％（ｗＬ／ｖｏｌ）　、さらに好ましくは０．０３〜
０．２％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内に維持することがで
き、それによって工業的に高価な他の炭素源の使用を省
略することができる。しかし場合によつ９ ０ ては、他の炭素源、例えば、グリセロール、コハク酸、
酢酸、フマル酸、リンゴ酸等を使用してもよい。

また、本発明において使用する培地にはＬ−又はＤ　Ｌ
　−トリプトファンが添加される。

これによって該形質転換微生物は、トリプトファナーゼ
オペロン（ｔｎａ）中のプロモーターの遺伝子発現機構
を強力に働かせることができる。

培地中のし−又はＤＬ−１−リプトファンの濃度は、厳
密に制限されるものではないが、好ましくは０．１−２
％（ｗｔ／ｖｏｌ）さらに好ましくは０゜０５〜０．５
％（ｗＬ／ｖｏｌ）の範囲内である。Ｌ又はＤＬ−トリ
プトファンの添加時期は培養初期でも培養中期でもよい
が、好ましくは対数増殖後期以前に添加する。

また、本発明で用いる培地には、培養すべき微生物の種
類等に応じて、さらに窒素源、無機塩、成長促進物質等
の栄養分が適宜配合される。培地に含ませうる窒素源と
しては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウム等のアンモニウ
ム塩；硝酸カリ、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等
の硝酸塩；グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸
、アスパラギン等の有機窒素；アンモニアなどが挙げら
れ、これらは単独もしくは混合して用いることができる
。また無機塩としては、例えば、リン酸水素カリウ私、
リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫
酸マンガンなどが単独もしくは混合して用いることがで
きる。さらに、成長促進物質としては、特に限定される
ものではないが、例えばサイアミン、ビオチン等のビタ
ミン類；メチオニン、システィン等のアミノ酸；あるい
はこれらを全部若しくは部分的に含有する酵母エキス、
ポリペプトン、肉エキス、コーンステイープリカー、カ
ザミノ酸等が挙げられる。

これらの培地に含ませうる栄養分の含有量は特に制限さ
れるものではなく、通常の培養に用いられる含有量とす
ることができるが、特に天然物由来の栄養分は、経済性
および菌体増殖への影響により、通常１〜０．１％好ま
しくは０．５〜０゜Ｉ ２ ２％の範囲内の含有量とするのが適当である。

以上に述べた如き組成の培地での微生物の培養は、通常
用いられていると同様の培養装量を用いて、好気的条件
下に実施することができる。特に、空気その他の酵素含
有ガスを培地に通気し及び／又は撹拌することによって
、培地中の溶存酸素濃度を一般に１〜８　ｐｐｍ、好ま
しくは２〜’７　ｐｐｍの範囲内に維持することによっ
て、培養をより効率的に行なうことができる。

また、培養液中へのグルコースの添加は連続的に行なっ
てもよく、或いは一定の間隔で又はグルコース濃度をモ
ニターしながら間欠的に行なってもよい。

ここで、培養中の「溶存酵素濃度」の測定は、例えば溶
存酵素電極を用いて、「グルコース濃度」の測定は、例
えばグルコースＣテストフコ−（和光純薬製）あるいは
グルコースアナライザーＧＬＵ−１（東亜電波製）を用
いて行うことができる。

培養条件は用いる形質転換微生物の種類等に応じ該微生
物に合った条件を選択することができるが、−射的に言
えば、培養温度は約ｌＯ〜約４５０Ｃ１好ましくは約２
５〜約４０°Ｃの範囲内とすることができ、また、培地
のｐＨは約３〜約１０゜好ましくは約５〜約９の範囲内
とすることかできる。培養中培地のｐＨが変化する場合
には、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸ソーダ
、重炭酸ソーダ等のアルカリ、或いは硫酸、塩酸等の酸
を適宜添加してｐＨ調整を行なうことが望ましい。培養
時間は通常約５〜約４８時間程度とすることができる。

以上述べた如くして培養を行うことにより、目的構造遺
伝子に担われた有用物質を微生物菌体内又は培養液中に
著量蓄積せしめることができる。

微生物菌体又は培養液からの該有用物質の回収は、それ
自体既知の方法、例えば、遠心分離、限外濾過等の方法
で行なうことができる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。し
かしながら、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定３ ４ されるものではない。

また、実施例において（１）制限酵素による認識部位数
及び切断断片の大きさ、（２）トリプトファナーゼ活性
、（３）ｌ−リプトファン・シンタゼ活性、（４）タロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ
）活性、（５）供試酵素液中のタンパク質量及びグルコ
ース量、（６）菌体回収量等の測定は、次の方法で実施
した。

（１）制限酵素による認識部位数及び切断断片の大きさ 制限酵素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラ
スミドを、過剰の制限酵素の存在下で完全分解し、それ
らの分解物をそれ自体既知の方法に従い１％アガロース
ゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル電気泳動に
供し、分離可能な断片の数から決定することができる。

また、「切断断片の大きさ」及びプラスミドの大きさは
、アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリ
ヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇｅ）のＤＮＡ
を制限酵素Ｈｉｎｄ１ｍで切断して得られる分子量既知
のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描
かれる標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファ
イ・エックス１７４フアージ（Ｉ　ｘ　１．７４　ｐｈ
ａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅｌｌ［で切断して得
られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルアミ
ドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切断
ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを算
出する。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの大
きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片の大きさの
決定において、ｌｋｂ以上の断片の大きさについては、
１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果を採
用し、約０．ｌｋｂがら］、ｋｂ未満の断片の大きさに
ついては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
得られる結果を採用した。

（２）トリプトファナーゼ活性 培養液２０ｍ１２から遠心分離（４０００ＲＰＭ。

１５分間、４℃）した菌体を１００ミリｍｏｌリン５ ６− 酸緩衝液（ｐＨ８，０）２０＋ｎＱに懸濁後再び遠心分
離（４０００ＲＰＭ、１５分間、４°Ｏ）　して菌体を
集める。該集菌体を上記緩衝液２ｍαに懸濁後、超音波
破砕処理（ブランソン製ソニファイヤー２００）を行い
、該処理物を遠心分離（１２０００ＲＰＭ１４０分間、
４°Ｃ）しだ上清液を供試酵素液とした。

反応は、上記酵素液を１００ミリｍｏｌリン酸緩衝液（
ｐＨ８，０）にて適当量希釈後、該希釈液０．１ｍ１２
と反応液［Ｌ−トリプトファン１０ミリｍｏｌ、ピリド
キサールリン酸０．０４ミリｍｏ＋を含有する１００ミ
リｍｏｌリン酸緩衝液（ｐＨ８゜０）１０．９ｍａを含
む試験管に添加して３７°Ｃにて恒温水槽中で２０分間
振盪反応を行う。反応は１０重量％トリクロル酢酸１ｍ
（２を添加して停止後、遠心分離（４０００ＰＰＭ、１
５分間、４０Ｃ）にて得た上清液中の生成インドール量
をガスクロマトグラフィー（島津製、ＧＣ−３ＢＦ）に
より定量した。

トリプトファナーゼの活性は、単位タンパク質量当り１
時間に生成するインドール量として算出し、比較例の活
性を１とした相対値で表示した。

（３）トリプトファン・シンターゼ 培養液２０ｍ１２から遠心分離（４０００ＲＰＭ。

１５分間、４°Ｃ）した菌体をｌ　ＯＯｍＭ　ｌ・リス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）２０ｍ（２に懸濁後再び遠心
分離（４０００ＲＰＭ、１５分間、４°Ｏ）して菌体を
集める。該集菌体を上記緩衝液２ｍ＋２に懸濁後、超音
波破砕処理（ブランソン製ソニファイヤー２００）を行
い、該処理物を遠心分離（１２００ＯＲＰＭ、４０分間
、４°Ｏ）した上清液を供試酵素液とした。

酵素活性の測定は、上記酵素液を常法通りＹａｎｏｆｓ
ｋｙらの方法［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、　ｖｏｌ、５．７９４　（１９６２）参照１に
従い行った。

トリプトファン・シンターゼ活性は、単位タンパク質量
当り１時間に消費したインドール量きして算出し、比較
例の活性を１とした相対値で表示しＩこ。

（４）クロラムフェニコールアセチルトランス７フェラ
ーゼ（ＣＡ　Ｔ）活性 培養液を遠心分離することにより菌体を集菌し、１０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７８）５０ｍＱにて洗浄し、再び
遠心分離を行い集菌後、湿菌体を２００ｍｇ採取しｌｎ
＋ＱのｌＯｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，８）に懸濁し超
音波処理を行なった。酵素活性の測定は、処理後の菌体
破砕物を適当に１０ｍ　Ｍ　ｌ・リス緩衝で希釈して、
常法通りＷ、Ｖ。

Ｓ　ｈａｗらの方法［Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７５）　、ｖｏｌ４３、ｐ　７３
７］に従い行った。クロラムフェニコールアセデルトラ
ンスフェラーゼ活性は、単位タンパク質量当り１分間に
アセチル化されたクロラムフェニコール量として算出し
、比較例の活性を１とした相対値で表示した。

（５）供試酵素液中のタンパク質量及びグルコース量測
定は、Ｌ　ａｗｒｙ等の方法（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂ　ｉ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｌ　　ｌ
　９３、ｐ、２６５．１９５１年）に従い、また培地中
のグルコース濃度の測定は、グルコースＣテスト和光［
和光純薬工業（株）製］を用いて行った。

（６）菌体回収量 培養液５０ｍ（２から遠心分離（８０００ｒｐｍ、　２
０分間４°Ｃ）後に回収された湿菌体量として測定し　
Ｉこ　。

の形質転換 （１）トリゾ］・ファナーゼオペロン（ｔｎａ）中の、
プロモーター及び該プロモーターの下流に位置する調節
遺伝子ｔｎａ　Ｃ並びにトリプトファナーゼ構造遺伝子
（ｔｎａＡ　）を含むＤＮＡ断片の調製り培地（トリプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコース１ｇ、ＮａＣ
１５ｇ、蒸留水ｌＱ：ｐＨ７，２）１００ｍｆｆを容量
５００ｍ４の三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで１５
分間滅菌処理しｊこ。

この培地にエシェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃ１１ｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２ＡＴＣＣ２７３２５を植菌し
、３７°Ｃで１５時間培養を行った後、この培養液２９ ０ ｍ（ｌを採り、新たに上記培地１００ｍＱに接種し、再
度３７°Ｃで４時間培養を行なった。

培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８０００×９
．１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体を５０　ｍ　Ｍ
　ｈリス緩衝液（ｐＨ８，０）−１０ｍＭＥＤＴＡ・２
Ｎａ溶液５０ｍ（２に懸濁した。次にリゾチウムを最終
濃度が２ｍ１ｉ／ｍ４になるように添加し、５分間静置
後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を６ｍ４添加し
、６５°Ｃで３０分間保温した。この溶菌液に、５Ｍ　
　　ＮａＣ１溶液１５ｍＱを添加し、０°Ｃで１時間冷
却し、全量を遠心分離（１２０００Ｘｚ、６０分間、４
°Ｏ）　Ｌ、上溝画分を分取し、２倍量のエタノールを
加え、混合後、遠心分離（５０００Ｘｙ、１０分間、４
°Ｃ）した。得られた沈澱物をｌｏｍｒｖＩト！Ｊス緩
衝液（ｐＨ７，５）　　ＩｍＭ　　ＥＤＴＡ　・２Ｎａ
溶液で溶解させ、フェノール処理（除タンパク処理）お
よびＲＮＡ分解酵素による処理を行ない、最終的にＤＮ
Ａ１．５ｍｇを得た。

上記の如く調製した染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限酵素
ＨｉｎｄＩ［ｌ及びＢａｍＨＩ（各々５　ｕｎｉｔｓ）
を用いて３０°Ｃ１１時間反応で切断し、染色体ＤＮＡ
のＨ１ｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩ分解物溶液を調製した
。この分解物溶液に、プラスミドｐＢＲ３２２１μ９を
制限酵素Ｈｉｎｄｌ１１及びＢａｍＨＩ（各］　ｕｎｉ
ｔｓ）を用い、３０°Ｏ，１時間反応で切断して得た分
解物溶液を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７゜６
）、ｌ０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、ｌ　
ＯｍＭ　ＭｇＣＩ　２及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔの各
成分を添加しく各成分の濃度は最終限度である）、１６
°Ｃで１５時間反応させ、結合させｌこ。

この溶液を用い、常法［Ｍ、　Ｍａｎｄｅｌ、Ａ。

Ｈｉｇａ　；　Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、、　５
３．１５９（１９７０）参照］に従ってエシェリヒア・
コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１
２系株（トリプトファナーゼ欠損変異およびトリプトフ
ァン要求性変異株）を形質転換し、選択培地（Ｋ２ＨＰ
０．７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ、（ＮＨＩ）ｚｓＯａｌｇ
、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，１ｇ、カザミノ酸５ｇ、イ
旧 １２ ンドヘル１０ｍｇ、アデニン５０ｍｇ、コバ１Ｉｅ２９
、寒天２０ｇ、純水ＩＱ）に塗抹した。この培地」二の
生育株をＬ培地に、アンシビリンを最終濃度で５０！Ｉ
ｇ／ｍａ含む培地に植菌し、３７°Ｃで７時間培養した
後、菌体を遠心分離（８０００Ｘ９．１０分間、４°Ｃ
）により集めた。この菌体を用いてトリプトファナーゼ
活性を調べた。

トリプトファナーゼ Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８．０、ｌＯｍｌＶＩトリプトファ
ン、Ｏ．１％トリトンＸ−１００）Ｊｉｆｆに湿菌体５
０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた。

生成スるインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒドを
用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株か得られた
。この株より、アルカリ＝ＳＤＳ法［Ｔ．　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ．　Ｅ　、　Ｆ　、　Ｆｒｉｃｓｃｈ　ａｎｄ　
Ｊ　。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ；　　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　　（　１　９　８　２）ｐ９０〜９１参照］
によりプラスミドを抽出し、プラスミドをＢａｍＨＩ及
びＨｉｎｄＩ［［で切断し分子量をアガロースゲルを用
いて調べたところ、ｐＢＲ３２２の制限酵素Ｈｉｎｄｌ
Ｉ［及びＢａｍＨＴ部位に約３．２ｋｂのＤＮＡの挿入
がみられた（以下このプラスミドをｐ　Ｂ　Ｒ　３　２
　２　ｔｎａと称する）。

上記で得られた形質転換株を常法に従い液体培養し、培
養液よりプラスミドｐ　Ｂ　Ｒ　３　２　２　ｔｎａｎ
ミラ精製した。該プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＨ　ｉｎｄＩＩＩを用い、３７℃で１時間反応さ
せ、完全に分解した後、該分解物を０．８％アガロース
ゲル電気泳動にて分離させ、約３，２ｋｂのトリプトフ
ァナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片画分をゲルから切
り出し、ＤＮＡを抽出、精製しＤＮＡ断片を得た。次に
このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１１９へ導入し、ｐ
ＵＣ１１９ｔｎａを下記のとおり作製した。

プラスミドｐＵＣ　ｌ　ｌ　９は、エシェリヒア・コリ
内で複製可能でアンシピリン耐性を発現する約３、１ｋ
ｂのプラスミドであり、市販品として宝酒造より購入が
可能である。

上記プラスミドｐＵｃ１１９　　０．５μ９を制限酵素
ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩ［ｌを用いて３７°Ｃで１時
間反応させ、完全に分解した。該分解物と上記３ ４ のトリプトファナーゼ構造遺伝子を含むＢａｍＨＩ、Ｈ
ｉｎｄｌＴＩのＤＮＡ断片画分を混合し、制限酵素を不
活化するために６５°Ｃで１０分間加熱旭処理た後、該
失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ）リス
緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣＩ２、ＩＯｍＭジチ
オスレイトール、ＩｍＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼｌｕｎ
ｉｔになるように各成分を添加し、１６°Ｃで１５時間
保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１
０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は５０μｇ／ｍＱ（最終濃度）のアンシビリ
ン１００ｐｇ／ｍ（２（最終濃度）ＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、ｌ　０　０
ｐｑ　／ｍｆ２　　（最終濃度）Ｘ−ｇａｌ（５ブロモ
−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄガラクトピラノシ
ド）を含むし培地（トリプトンｌｏｇ、酵母エキス５ｇ
ＮａＣ　ｌ　５１？　、純水Ｉｆｆ。

ｐＨ７．２）で３７℃にて２４時間培養し、生育株とし
て得られた。これら生育株のうち、白いコロニーで生育
してきたものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−Ｓ
ＤＳ法［Ｔ　、ＭａｎｉａｔｌＳｓ　Ｅ　。

Ｆ　、　　Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ，　　Ｊ　、　　Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，　　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ　
　（１９８２）ｐ９０−９１参照］により抽出した（以
下このプラスミドをｐＵｃｌＩ９ｔｎａと称する）。

得られたプラスミドｐＵＣ　ｌ　ｌ　９ｔｎａ　ＤＮＡ
を制限酵素ＢａｍＨ　Ｉ　、　Ｂｂｅｌを用い、３７°
ｃ，　　１時間反応し完全に分解した。この切断断片の
、ＢａｍＨＩ部位から約９００ｂｐの不要部分をエキソ
又はフレアーゼ■（宝酒造製）を用いて削除し、Ｂｂｅ
■部位を５１スクレアーゼ（宝酒造製）処理により平滑
末端とした。次に、ＢａｍＨＩリンカ−（宝酒造製）を
混合し、５０ｍＭ）！Ｊス緩衝液（ｐＨ７、６）、１０
ｍＭＭｇＣ１．及びＴ４ＤＮＡリガーゼｌｕｎｉｔの各
成分を添加しく各成分の濃度は最終濃度である）、１６
°Ｃで１５時間反応により結合させ、プラスミドを再構
築した。

このプラスミド溶液を用い、常法［Ｍ．　Ｍａｎｄｅｌ
、Ａ．　Ｈｉｇａ；　Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ．、
　５　３、１５９（］９７０）参照］に従ってエシェリ
ヒア・コリ５ ６ （Ｅ　５ｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃａｄｉ）　Ｋ−１２系
株（トリプトファナーゼ欠損変異およびトリプトファン
要求性変異株）を形質転換し、選択培地（Ｋ２ＨＰＯ４
７ｇ　、ＫＨ２ＰＯ（２ｇ、（Ｎ　Ｈｈ　）　２　Ｓ　
Ｏ４ｉ　ｇ、Ｍｇ５ｏｔ・７Ｈ２００，Ｉｇ、カザミノ
酸５ｇ、インドール１０ｍｇ、アデニン５０ｍｇ、グル
コス２ｇ、寒天２０ｇ、純水１１２）に塗抹した。

この培地上の生育株を常法に従い、液体培養し、培養液
よりプラスミドＤＮＡを抽出し、各々制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＨｉｎｄｍを用い、３７°Ｃで１時間反応させ、
完全分解した後、０８％アガロースゲル電気泳動にて分
離させ、約２．９ｋｂ（ｐＵＣ１１９部分）と約２．３
ｋｂ（ｔｎａ部分）を示すものを選択した。さらにこの
２．３ｋｂＤＮＡ断片をゲルより切り出し、ＤＮＡを抽
出し、精製し、トリプトファナーゼプロモーターと調節
遺伝子Ｌｎａ　Ｃとトリプトファナーゼ構造遺伝子（ｔ
ｎａＡ、）を含む約２．３ｋｂの断片を調製した。

次にプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＨｉｎｄｌｌｌを用い、３７℃、１時間反応し完
全に分解した後、先に調製した約２．３ｋｂの断片と混
合し、制限酵素を不活化するために６５°０，１０分間
加熱処理した後、５０　ｍ　Ｍ　トリス緩衝液（ｐＨ７
，６）、１０ｍＭジチオスレイ１−−ル、１ｍＭ　ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ　ＭｇＣＩ　２及びＴ４　　ＤＮＡリガー
ゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加しく各成分の濃度は最終濃
度である）、１６°Ｃで１５時間反応により結合させ、
この溶液を用いてエシェリヒア・コリＨＢ　Ｉ　Ｏ１コ
ンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。得られた
形質転換株を常法により液体培養し、培養液よりプラス
ミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｈ１ｎｄＩ
１１を用いて調べたところ、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ
、ＨｉｎｄｌＩ［部位に約２．３ｋｂのＤＮＡ挿入がみ
もれた（以下このプラスミドをｐＢＲ３２２ｔｎａｌと
称する）。

（２）　ｍ１ｎｉ−Ｆ断片の調製 エシェリヒア・コリに一１２系株（ＡＴＣＣ１５１５３
）をＩＱのし培地（Ｂ　ａｃｔｏ　トリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、ＮａＣ１５ｇ、グルコ−７ ス１ｇ、水ｌα；ｐ＋−ｒ７．２）に接種し、約３７０
０で約４時間振盪培養した後、菌体を集め、リゾチウム
処理を行ない且つドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を
添加して溶菌させた。この溶菌液を３２、ＯＯＯＸｚで
４０分間遠心分離処理し、上清を分画し、次いで塩化セ
シウム−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離処
理を行なった後、透析処理により、Ｆ因子プラスミドを
含む溶液を分取した、この溶液にエタノール沈殿を行な
し＼、最終的に約２０μ９のＦ因子プラスミドを採取し
ｔこ。

次に、ｍｉｎｉ−Ｆ断片の調製に際して、上記のＦ因子
プラスミドを５μ９とり、制限酵素であるＥｃｏＲＩを
３νＯ，　　１時間作用させて該Ｆ因子プラスミドＤＮ
Ａ鎖を切断し、約９．２ｋｂのｍｉｎｉＦ断片を含むＤ
ＮＡ溶液を調製した。

（３）目的プラスミドの造成 前記（１）項で得たプラスミドｐＢＲ３２２ｔｎａ　ｌ
　　Ｄ　Ｎ　Ａを制限酵素ＥｃｏＲＴを用い、３７°Ｃ
で１時間反応し完全に分解した後、上記（２）項で得た
ｍｉｎｉ−Ｆ断片と混合し、制限酵素を不活化するため
に６５°Ｃで１０分間加熱処理した後、該失活溶液１中
の成分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ
７．６、ｌ　Ｏ　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ　Ｉ　２、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、１．ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガー
ゼ］　ｕｎｉｔになるように各成分を添加し、１６℃で
１５時間保温し結合した（以下このプラスミドをｐ　Ｂ
　Ｒ　３　２　２　Ｆ　ｔｎａと仮称することがある）
。

上記（３）項で調製したプラスミドＤＮＡを用いてエシ
ェリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２５）を常
法に従い形質転換させ、形質転換株を得た。この菌株を
常法に従い液体培養し、培養液よりプラスミドＩ）　Ｂ
　Ｒ　３　２　２　Ｆ　ｔｎａを分離精製した。このプ
ラスミドをｐＭＴＰ４と命名した。

このプラスミドｐＭＴＰ４を各種の制限酵素で分解し、
認識部位の数および分解断片の大きさを測定した。その
結果を表３に示した。

９ ０ 表　　３ ＥｃｏＲＩ　　　　　　２　　　　　　６．１（９，２
）、４．２（６，３）Ｈ１ｎｄｌＩＩ　　　　　　２　
　　　　　９．８（１４，７）、０．５（０，８）（）
内はｋｂを示す。

上記したプラスミドｐＭＴＰ４の制限酵素切断点地図を
第１図に示した。

このプラスミドｐＭＴＰ、１１を保持する形質転換株エ
シェリヒア・コリＹＫ３００７は、茨城系つくば南東１
丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、受
託番号：微工研条寄第２８０３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２
８０３）として寄託されている。

（５）形質転換株エシェリヒア・コリＹＫ３００７の安
定性 炭素源としてグルコース２ｇ／Ｑを含む前記り培地１０
０ｍＱを５００ｍ＋２容三角フラスコに分注し、１２０
°Ｃで１５分間滅菌処理したものに、実施例１で得た形
質転換株を植菌し、３７°Ｃにて２４時間振盪培養を行
なった後、同様にして調製した培地１００−を５００ｍ
１２容三角フラスコに分注し１２０°Ｃで１５分間滅菌
したものに１ｍＱ当たり５０ｃａｌｌｓの割合になるよ
うに植継ぎし、同じく３７℃にて２４時間振盪培養を行
なった。

次に遠心分離を用いて集菌し、菌体を洗浄後、アンピシ
リンを５０μｇ／ｍＱの割合で添加したし培地及び無添
加のし培地として調製した平板培地に一定量塗抹し、３
７°Ｃにて１日培養後生育コロニーをカウントする。

この結果、アンピシリン添加及び無添加培地に生育した
コロニーは同数であること、さらにＬ培地生育コロニー
は全てトリプトファンを含まない最少培地（インドール
１０ｍｇ／Ｑを含む）に生育すること、すなわち該プラ
スミドの高度の安定性を確認した。

株の形質転換 １ ２ （１）トリプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ
　、　ｔｒｐＢ　）を含むＤＮＡ断片の調製（Ａ）ファ
ージ−８０ｐｔの調製 エシェリヒア・コリに−１２系株（ＡＴＣＣ２７３２５
）をｌｏｏｍｆｆのし培地（組成は前記と同じ）に接種
し、３７℃で約４時間振盪した培養物０．２ｍ１２と、
ファージｄ８０　（ＡＴＣＣＩ　１４５６ａ−Ｂｌ）水
溶液（１０５ケ／ｍ（１）の０゜ｌｍｆｆとを、Ｌ培地
軟寒天（Ｌ培地十寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒
天プレート上に重層する。該プレートを３７°Ｃにて約
５時間培養するとプラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２
〜３日間３７°Ｃにて培養を継続すると、プラーク中に
７フージメ８０溶原菌の生育コロニーを生ずる。該溶原
菌をＬ培地にて３７°Ｃで４時間培養後、上記と同じＬ
培地寒天プレート上に塗抹したのち、紫外線照射（４０
０−８００ｅｒｇｓ／ｍｍ２．１０−２０秒）による溶
原ファージの誘発によりファージ＋（８０ｐｔ（ｔ−リ
プトファンオベロンを含むファージＤＮＡ）を調製する
。

（Ｂ）トリプトファンオペロン画分の調製エシェリヒア
・コリに一１２系株（ＡＴＣＣ２７３２５）を１１２の
培地（組成は前記と同じ）に接種し、約３７℃で約３時
間振盪培養し、対数増殖期に２５％（ｗ　／　ｖ　）グ
ルコース溶液１０ｍ（２と上記で調製したファージｌ８
０ｐＬ溶液を１０１１ケ／ｍＱの濃度で添加しくｍｏｉ
２０）　、５時間振盪を継続後常法通りクロロホルムの
添加により、７アージー８０ｐｔを大量に調製した［Ｔ
　、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　Ｅ　。

Ｆ　、　Ｆ　ｒｉｔｓｃｈｓ　Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ　；
　“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　　（１９８
２）　ｐ、７６−８０　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ参照］。

次に取得したファージｌ８０ｐＬ溶液を１−リス緩衝液
（ｐＨ７，８）にて透析後、フェノール法により、ＤＮ
Ａ抽出法［上記”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ
ｐ、８５参照］によってファージＤＮＡを抽出精製し、
これに制限酵素ＢａｍＨＩを与え３０°Ｃで３０分間反
応させ、長さ約２０ｋｂのトリプトファンオペロン遺伝
子画分を得た。

（Ｃ）プラスミドｐＢＲ３２２の調製 ３ ４ 上記（Ｂ）項で得たトリプトファンオペロン画分に制限
酵素５ａｌＩ及びＸ　ｈｏ　Ｉを３７°Ｃにて１時間反
応させ長さ約７．４ｋｂのＤＮＡ画分を切り出し、次い
で反応液を６５°Ｃで５分間熱処理して制限酵素を失活
させた後、同様に制限酵素５ａｌｌで処理したプラスミ
ドｐＢＲ３２２を添加混合した。

ついで該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０　
ｍ　Ｍ　Ｌリス緩衝液（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭ　ｇ
　ＣＩ　２．１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　Ａ
ＴＰ及びＴ、ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになるように各
成分を強化し、１６°Ｃで１５時間保温することによっ
てＤＮＡを結合させた。

再結合後のＤＮＡを用いてエンエリヒア・コリに一１２
系株（トリプトファン要求変異株、ＡＴｃｃ２３７１８
）を常法に従い形質変換させ、形質変換株［Ｔｒｐ要求
性の消失、すなわちブ・ラスミド上のＬｒｐＡ　、　Ｌ
ｒｐＢ遺伝子によりトリプトファンの生合成が可能とな
り、最小培地（Ｋ２ＨＰ０゜７ｇ　、ＫＨ２ＰＯ４２１
Ｊ　、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００゜１ｇ、（ＮＨ＝）２Ｓ
○、１ｇ、グルコース２ｇ、純水ＩＱ）上にて生育可能
となった菌株］を得た。

この菌株を常法に従い液体培養し、培養液よりプラスミ
ドを分離精製した（以下このプラスミドをｐ　Ｂ　Ｒ３
２２ｔｒｐと称する）。

（Ｄ）トリプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｌ）
Ａ％　ｔｒｐＢ）画分のクローニング上記（Ｃ）項で得
られたプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐを制限酵素５ａｃ
Ｉｌと５ａｌＩで３７°Ｃで１時間切断し、ｔｒｐＡ　
、　ｔｒｐＢ遺伝子を含む両分（長さ約３．５ｋｂ）を
得た。ついで制限酵素ＨｉｎｄＴＩを用いて３７°Ｃで
部分的に分解し、ｔｒｐＡｌＬｒｐＢを含む最小区画分
（長さ約２．６ｋｂ）を得、た。この断片に５ａｌＩリ
ンカ−を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させて、両
末端に５ａｌＩ部位をもつｔｒｐＡ　、　ｔｒｐＢ画分
を得た。

（２）トリプト７アナーゼプロモーター及び該プロモー
ターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ
断片の調製 （Ａ）エシェリヒア・コリに一１２系株（ＡＴＣＣ２７
３２５）染色体ＤＮＡの調製 ５ ６ Ｌ培地（トリプトンｌｏｇ、酵母エキス５ｇ、グルコー
ス１ｇ、ＮａＣ１５ｇ、蒸留水ｌＱ；ｐ８７．２）ｌ　
Ｏ０ｍ１２を容量５００ｍ１２の三角フラスコに分注し
、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。この培地にエン
エリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）　Ｋ　−１２系株（ＡＴＣＣ２７３２５）を植菌し、
３７°Ｏ’′ｃ′１５時間培養を行った後、この培養液
２ｍαを採り、新たに上記培地１００ｍｏ。

に接種し、再度３７℃で４時間培養を行った。

培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８゜０００Ｒ
ＰＭ、１５分間、４°ｃ）して集菌し、菌体を５０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８，０）−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　・
２Ｎａ溶液５Ｑｍ１２に懸濁した。

次にリゾチウムを最終濃度が２ｍｇ　／　ｍＱになるよ
うに添加し、５分間静置後、１０％ドデシル硫酸ナトリ
ウム溶液を６ｍ（ｌ添加し、６５°Ｃで３０分間保温し
、溶菌した。この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液１５ｍＱ
を添加し、０℃で１時間冷却し、全量を遠心分離（１２
００Ｏｒｐｍ、　６０分間、４０Ｃ）シ、上清画分を分
取し、２倍量のエタノールを加え、混合後、遠心分離（
５０００ｒｐｍ、　　ｌ　０分間、４℃）した。得られ
た沈澱物を］０ｍＭトリス緩衝液（ｐｌ−１７，５）　
−１ｍＭ　ＥＤＴＡ　・２Ｎａ溶液で溶解させ、フェノ
ール処理（除タンパク処理）およびＲＮＡ分解酵素によ
る処理を行い、最終的にＤＮＡ１．５ｍｇを得た。

（Ｂ）トリプトファナーゼプロモーター及び該プロモー
ターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ
断片の調製 上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡ２５μ９を、制限
酵素Ｈｉｎｄｎ［及びＢａｍＨＩ（各々５　ｕｎｉｔｓ
）を用い３０°Ｏ，１時間反応で切断し、染色体ＤＮＡ
のＨｉｎｄｎＩ及びＢａｍＨＩ分解物溶液を調製した。

この分解物溶液に、プラスミドｐＢＲ３２２１μｇを制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ（各１　ｕｎｉｔ
ｓ）を用い、３０°ＣＳ　１時間反応で切断して得た分
解物溶液を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７゜６
）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、］　
ＯｍＭ　ＭｇＣ＋　２及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１　ｕｎ
ｉＬの各成分、を添加しく各成分の濃度は最終７ ８ 濃度である）、１６°Ｃで１５時間反応させ、結合させ
た。

この溶液を用い、常法［Ｍ　、　Ｍａｎｄｅｌ、　Ａ　
。

Ｈｉｇａ　；　Ｊ　、　Ｍｏ１．　Ｂ　ｉｏｌ、、　５
３．１．５９（１９７０）参照］に従ってエシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃ−ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　
−１２系株（トリプトファナゼ欠損変異およびトリプト
ファン要求性変異株）を形質転換し、選択培地［Ｋ２Ｈ
ＰＯ＋７１？　、ＫＨ２ＰＯｔ２＋？　　（ＮＨ４）　
２ｓｏ、Ｉｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，００，１ｇ、カザミ
ノ酸５ｇ、インドール１０ｍｇ、アデニン２ｇ、寒天２
０ｇ、コハク酸５Ｑ＋＋＋９、純水１α］に塗抹した。

この培地上の生育株をＬ培地に、アンピンリンを最終濃
度で５０μｇ／ｍＱ含む培地に植菌し、３７°Ｃで７時
間培養した後、菌体を遠心分離（８０００ＰＰＭ。

１０分間４°Ｃ）により集めた。この菌体を用いてトリ
プトファナーゼ活性を調べた。

トリプトファナーゼ活性測定用反応液（０，１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ８，０、ｌ０ｍＭトリプトファン、０．１％
トリトンＸ−１Ｘ−１００）１に湿菌体５０１１１１７
を加え、３７℃で３０分間反応させた。

生成するインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒドを
用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株が得られた
。この株より、アルカリ−３ＤＳ法［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　　Ｊ　、　
　Ｓａｍｂｒｏｏｋ；　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　　（１９８２）　ｐ９０−９１参照１により
プラスミドを抽出し、プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ
及びＨｉｎｄｎ［で切断し分子量をアガロースゲルを用
いて調べたところ、グラスミド−ｐＢＲ３２２のＨｉｎ
ｄＩｆｆ及びＢａｍＨＩ部位に約３．２ｋｂの挿入がみ
られた（以下このプラスミドをｐ　Ｂ　Ｒ３２２ｔｎａ
と称する）、。

得られたｐ　Ｂ　Ｒ３２２ｔｎａを制限酵素Ａ、ｌｕＩ
とＲｓａＴで３７°Ｃで１時間切断し、トリゾｉ・ファ
ナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含む長さ
が約６３０ｂｐの両分を得た。さらに、この断片にＢａ
ｍＨＩリンカ−を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合さ
せて、両末端にＢａｍＨ１部位を持つトリプトファナー
ゼプロモーター及び調節遺伝子ＬｎａＣ画分を得た。

９ ０ （３）目的プラスミドの造成 まず、上記（１）項と（２）項で得たＤＮＡ画分を、そ
れぞれプラスミドｐｕｃ１．１９（宝酒造製）の５ａｌ
Ｔ部位及びＢａｍＨＩ部位に常法に従い挿入した。次に
、このプラスミドを制限酵素Ｅｃ。

ＲＩとＨｉｎｄｌＩ［により部分切断を行い、トリプト
ファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ並びに
トリプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＢ、ｔ、
ｒｐＡ）を含むＤＮＡ画分を切り出した。このＤＮＡ画
分を、プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃ。

ＲＴ及びＨｉｎｄｌｌＩ部位に常法に従い挿入した。さ
らに、このプラスミドのＥｅｏＲＩ部位に、実施例１の
（２）項で調製したｍ１ｎｉ−Ｆ画分を常法に従い挿入
し、目的とするプラスミドを作製した。

（４）プラスミドｐＭＴＹ２０によるエシェリヒア・コ
リに一１２系株の形質転換エシェリヒア・コリに一１２
系株（ＡＴＣＣ２７３２５）から常法（分子生物学実験
マニュアル、用上正也監修Ｐ。

２０　１９８４年講談社）に従いトリブトファナゼ欠損
変異株を採取し、これを宿主として上記（３）項で調製
したプラスミドＤＮＡを用いて常法に従って形質転換さ
せ形質転換株を得た。この菌株を常法に従い液体培養し
、該培養液よりプラスミドを分離精製し、このプラスミ
ドをｐＭＴＹ２０と命名した。

このプラスミドｐＭＴＹ２０を各種の制限酵素で分解し
、認識部位数および分解断片の大きさを測定した。その
結果を表４に示した。

表４ ＥｃｏＲ１２５，５（９，２）、４．４（７，４）Ｈ１
ｎｄＩ［３５，６（９，３）、３．０（５，０）、１．
３（２，３）（）内はｋｂを示す。

上記しＩニブラスミドル　Ｍ　Ｔ　Ｙ　２０の制限酵素
切断点地図を第２図に示した。

このプラスミドｐＭＴＹ２０を保持する形質転１ ２− 換株エシェリヒア・コリＹＫ２０１７は、茨城系つくば
電束１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術研究所
に、受託番号、微工研条寄第２８０４号（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−２８０４）として寄託されている。

（５）形質転換株エシェリヒア・コリＹＫ２０１７の安
定性 前記し培地（炭素源、グルコース１ｇ／ｆｆのかわりに
コハク酸２ｇ／Ｑを含有）ｌｏｏｍ（＋を５００ｍ＋２
容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理
したものに、上記（４）項で得た形質転換株エシェリヒ
ア・コリＹＫ２０１７を植菌し、３７°Ｃにて２４時間
振盪培養を行なった後、同様にして調製した培地１００
＋ｎ１２を５００ｍＱ容三角フラスコに分注し１２０°
Ｃで１５分間滅菌したものにｌｍｆｆ当たり５０ｃａｌ
ｌｓの割合になるように植継ぎし、同じく３７°Ｃにて
２４時間振盪培養を行なった。

次に遠心分離を用いて集菌し、菌体を洗浄後、アンピン
リンを５０μｇ／ｍαの割合で添加したＬ培地及び無添
加のＬ培地として調製した平板培地に一定量塗抹し、３
７°Ｃにて１日培養後生育コロニーをカウントした。

その結果、アンピシリン添加及び無添加培地に生育シた
コロニーは同数であること、さらにＬ培地生育コロニー
は全てトリプトファンを含まない最少培地（インドール
１０ｍｇ／Ｑ、を含む）に生育すること、すなわち、該
プラスミドの高度の安定性を確認した。

株の形質転換 （１）プラスミドｐｃＡＴ−１の作製 実施例２（２）で得た、両末端にＢａｍＨ１部位をもつ
トリプトファナーゼプロモーター及びその下流に位置す
るｔｎａＣを含むＤＮＡ断片（約０．６７ｋｂ）を、自
己のプロモーターを持たないクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ構造遺伝子（約０．６６ｋｂ）
を担うプラスミドｐＫＫ２３２−８　（ファルマシア株
より購入）のＢａｍ３ ４ ＨＩ部位に常法に従い挿入し、プラスミドｐＫＫ２３２
−８ＣＡＴを作成した。さらに、ｐＫＫ２３２−８ＣＡ
ＴのＳ　ｍａ　Ｉ部位に、実施例１の（２）で得たｍ１
ｎｉ　−Ｆ　　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（約り、２ｋｂ）を挿入
し、目的とするプラスミドｐＣＡ”ｒ−１を作成しｌこ
。

尚、プラスミドｐＣＡＴ−１を各種制限酵素で切断した
ときの各分解断片の大きさを表−５に、また第３図にｐ
ｃ：ＡＴ−１の制限酵素切断点地図を示す。

衣−） ＥｃｏＲＩ　　　　　３　　　　　６．６（１０，０）
、３．１（４，７）、０．０７（０，１）ＢａｍＨＴ　
　　　　３　　　　　７Ｊ７（１１５）、１．７（２，
６）、０．４（０，７）Ｓａｌ　Ｉ　　　　　　２　　
　　　６．４７（９，８）、３．３（５，０）（）内は
ｋｂを示す。

（２）プラスミドｐＣＡＴ−１によるエシェリヒア・コ
リに一１２系株の形質転換 次に、エシェリヒア・コリに−１２系株（ＡＴＣＣ２７
３２５）を宿主として上記（１）項で調製したプラスミ
ドｐＣＡＴ−ＩＤＮＡを用いて常法に従って形質転換さ
せた。得られた形質転換株を、エシェリヒア・コリＣＡ
Ｔ−１と命名した。

（３）形質転換体エシェリヒア・コリＣＡＴ−１の安定
性 前記り培地（炭素源ニゲルコース１ｇ／Ｑのかわりにコ
ハク酸２ｙ　／Ｑを含有）１００ｍＱを５００ｍ４容三
角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理した
ものに、上記（２）項で得た形質転換株Ｅ　５ｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＣＡ　Ｔ　−１を植菌し、３７
°Ｃにて２４時間振盪培養を行なった後、同様にして調
製した培地Ｌｏｏｍ（２を５００ｍ（２容三角フラスコ
に分注し１２０°Ｃで１５分間滅菌したものに１ｍ７２
当たり５０ｃａｌｌｓの割合になるように植継ぎし、同
じく３７°Ｃにて２４時間振盪培養を行なった。

次に遠心分離を用いて集菌し、菌体を洗浄後、アンピシ
リンを５０μｇ／ｍｆｌの割合で添加したＬ培地及び無
添加のし培地として調製した平板培５ ６ 地に一定量塗抹し、３７°Ｃにて１日培養後生育コロニ
ーをカウントした。

その結果、アンピシリン添加及び無添加培地に生育した
コロニーは同数であること、さらにＬ培地生育コロニー
は全てクロラムフェニコールヲ５０μｇ／ｍＱの割合で
添加したＬ培地で生育すること、すなわち該プラスミド
の高度の安定性を確認した。

表６に示した培地１００ｍｆｆを５００ｍ１２容三角フ
ラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したもの
に５０％（ＷＴ／ＶＯＬ）グルコース溶液（１２０°Ｃ
！１１５分間滅菌）を無菌的に１ｍ＋２添加後、実施例
１で得たトリプトファナーゼ生産菌であるエシェリヒア
・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＹＫ３
００７　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２８０３）を植菌し、３
７°Ｃで１日振盪培養後、該培養物の２０ｍＱを同様に
して、但しグルコースは第６表の各試験区の上限濃度（
ｗｔ／ｖｏ１％）になるように、６７ 調製した培地１００１００Ｏに接種し、通気撹拌培養槽
を用い、３７℃にて回転数６０ＯＲＰＭ、通気量１　ｖ
ｖｍ、　ｐＨ７，２（２８％アンモニア水で調整）にて
８時間培養した。なおグルコースは、５０％　（ＷＴ／
ＶＯＬ）（７）水溶液（１２０°ｃ、　　１５分間滅菌
処理済）を用いて、経時的に培養液中のグルコース濃度
を測定しながら、表７に示した各実験区の濃度上限を越
えないように、且グルコス濃度が０．０１％（ｗｔ／ｖ
ｏｌ）を下まわらないように、無菌的に連続的に添加を
行い、各実験区の全添加量が２０９になった時点で添加
を終了し　ｌこ　。

表　　６ Ｌ−）リブトファン Ｈ２ＰＯ４ に２ＨＰＯ４ （Ｎ　Ｈ１）２　Ｓ　Ｏｔ ＭｇＳＯ，・７Ｈ２０ Ｆ　ｅ　ＳＯａ・７　Ｈ２Ｏ カザミノ酸（ＤＴＦＣ○） 蒸留水を加えて （ｐＨ７゜ ８ ２） ０、５ｇ １．６ｇ ５、５ｇ ３、０ｇ Ｏ，ｉｇ ０ｍｇ ５、０ｇ ０００ｍＱ 培養終了後、各培養液２０ｍ４づつから遠心分離を行い
、前記した方法にてトリプトファナーゼ活性を測定した
。結果を表−７に示す。なお、比較例としては培養初期
にグルコース２０ｇ／ρを添加するのみで培養した菌体
を用いた。

嚢−１− ※　比較例（培養開始時にグルコース２０ｇ／Ｑ添加）
の活性を１とした相対値 隼 実施例４の表６に示した培地１０Ｑｍ（ｌを５０Ｏｍ（
２容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌
処理したものに５０％（ＷＴ／ＶＯＬ）グルコース溶液
（１２０℃、１５分間滅菌）を無菌的に１ｍ＋２添加後
、実施例２で得たトリプトファンシンターゼ生産菌であ
るエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）Ｙ　Ｋ　２０１７　（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　ＢＰ−２８
０４）を植菌し、３７℃で１０振盪培養後、該培養物の
２０ｍＱを同様にして、但しグルコースは表８の各試験
区の濃度上限（ｗｔ／ｖｏ１％）になるように、調製し
た培地１０００ｎ＋１２に接種し、通気撹拌培養槽を用
い、３７°Ｃにて回転数６０ＯＲＰＭ、通気量１　ｖｖ
ｍ、　ｐ　Ｈ７、２（２８％アンモニア水で調整）にて
８時間培養した。なおグルコースは、５０％（ＷＴ／Ｖ
ＯＬ）の水溶液（１２０℃、１５分間滅菌処理済）を用
いて、経時的に培養液中のグルコース濃度を測定しなが
ら、第７表に示した各実験区の濃度上限（ＷＴ／ＶＯＬ
％）を越えないように、且０．Ｏ１％（ＷＴ／ＶＯＬ）
の下限を下回らないように、無菌的に連続的に添加を行
い、各実験区のグルコース全添加量が２０ｇになった時
点で添加を終了した。

９ ０ 培養終了後、各培養液２０ｍ１２づつから遠心分離を行
い、前記した方法にてトリプトファンシンターゼ活性を
測定した。結果を表８に示す。なお、比較例としては培
養初期にグルコース２０ｇ／Ｑを添加するのみで培養し
た菌体を用いた。

Ｌユ ※　比較例（培養開始時にグルコース２０ｇ／Ｑ添加）
の活性を１とした相対値 実施例４の表６に示した培地１００ｍＤ、を５００ｍ０
．容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌
処理したものに５０％（ＷＴ／ｖｏｔ、）グルコース溶
液（１２０°Ｃ１１５分間滅菌）を無菌的に１ｍ＋２添
加後、実施例３で得たエシェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＣＡ　Ｔ　−１を植菌し、
３７°Ｃで１日振盪培養後、該培養物の２０ｍＱを同様
にして、但しグルコースは第８表の各試験区の上限濃度
（ｗｔ／ｖｏ１％）になるように、調製した培地１００
０ｍｆｆに接種し、通気撹拌培養槽を用い、３７°Ｃに
て回転数６００　ｒｐｍ、通気量１　ｖｖｍ、　ｐ　Ｈ
７、２（２８％アンモニア水で調整）にて８時間培養し
た。なおグルコースは、５０％（ｙＨ／ｖｏｌ）の水溶
液（１２０°０１１５分間滅菌処理済）を用いて、経時
的に培養液中のグルコース濃度を測定しながら、表９に
示した各実験区の濃度上限を越えないように且し、グル
コース濃度が０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）を下まわらな
いように、無菌的に連続的に添加を行い、各実験区の全
添加量が２０ｇになった時点で培養を終了した。

培養終了後、各培養液２０ｍＱずつから遠心分離を行い
、前記した方法にてクロラムフエニコー１ ２ ルアセチルトランスフェラーゼ活性を測定した。

結果を表９に示す。なお、比較例としては培養初期にグ
ルコース２０ｇ１０．を添加するのみで培養した菌体を
用いた。

考−旦 ※　比較例（培養開始時にグルコース２０ｇ／Ｑ添加）
の活性を１とした相対値 の産生 実施例４の表６に示した培地１００ｍ（ｌを５０Ｑｍ１
２容三角フラスコに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌
処理したものに５０％（ＷＴ／ＶＯＬ）グルコース溶液
（１２０°Ｃ１１５分間滅菌）を無菌的に］、ｍ＋２添
加後、実施例２で得たトリジ１〜フアンシンターゼ生産
菌であるエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｉ）ＹＫ　−２０１７（Ｆ　Ｅ　ＲＭＢＰ−２
８０４）を植菌し、３７°Ｃで１日振盪培養後、該培養
物の２０ｍ＜１を同様にして調製した培地１０１００Ｏ
，に接種し、通気撹拌培養槽を用い、３７°Ｃにて回転
数６００　ｒｐｍ、通気量１　ｖｖｍ。

ｐＨ７，２（２８％アンモニア水で調整）にて培養した
。なおグルコースは、５０％（ＷＴ／Ｖ○Ｌ）の水溶液
（１２０°Ｃ，１５分間滅菌処理済）を用いて、経時的
に培養液中のグルコース濃度を測定しながら、第２表に
示した各実験区の濃度上限を越えないように、無菌的に
連続的に添加を行い、各実験区の全添加量が２０ｇにな
った時点で培養を終了した。

また、培養液中の溶存酸素濃度は、空気の代わりに酸素
ガスを通気することにより、表１０に示した各実験区の
値に維持した。尚、酸素を通気し３ ４ ない系では、溶存酸素濃度は約４ｈ後に０となつｌこ　
。

培養終了後、各培養液２０ｍＱずつから遠心分離を行い
、前記した方法にてトリプトファンシンターゼ活性を測
定した。尚、比較例としては培養初期にグルコース２０
ｇ／Ｑを添加するのみで培養した菌体を用いた。結果を
表ＩＯに示した。

表１０ ＊１　培養開始時にグルコース２０ｇ／Ｑ添加し培養 ＊２　比較例の酸素濃度コントロール無の活性及び菌体
回収量を１とした時の相対値 ＊３　酸素通気による溶存酸素濃度コントロールを行な
わなかったもの

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＴＰ４の制限酵素切断点地図を
示す。 第２図はプラスミドｐＭＴＹ２０の制限酵素切断点地図
を示す。 第３図はプラスミドｐＣＡＴ−１の制限酵素切断点地図
を示す。 ５ ６

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）中のプロモ
   ーター及び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子
   ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片（ａ）と、該プロモーターに
   よって発現可能な目的構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂ
   ）とを少なくとも含有する組換えプラスミドで形質転換
   された微生物を、Ｌ−又はＤＬ−トリプトファンを含有
   する培地中において、炭素源としてグルコースをその濃
   度が０．０１〜０．３％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内に維
   持されるように連続的又は間欠的に該培地に添加しつつ
   培養し、それによって該微生物に上記目的構造遺伝子を
   発現させることを特徴とする上記形質転換された微生物
   の培養方法。