JPH0595788A - 組換えプラスミド及びそれを含む微生物 - Google Patents
組換えプラスミド及びそれを含む微生物Info
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- JPH0595788A JPH0595788A JP25626591A JP25626591A JPH0595788A JP H0595788 A JPH0595788 A JP H0595788A JP 25626591 A JP25626591 A JP 25626591A JP 25626591 A JP25626591 A JP 25626591A JP H0595788 A JPH0595788 A JP H0595788A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 トリプトファナーゼオペロン中のプロモータ
ー及び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎ
ａＣを含むＤＮＡ断片と、該ＤＮＡ断片の下流に結合し
たトリプトファンオペロン由来のトリプトファンシンタ
ーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とから成るＤＮＡ断片
の少なくとも２個と、ＣｏｌＥ１系プラスミド由来の自
律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片から成る組換え
プラスミド並びにこのプラスミドで形質転換されたエシ
エリヒア・コリＫ１２系微生物。 【効果】 この発明のエシエリヒア・コリＫ１２系微生
物を用いてＬ−トリプトファンを効率的に製造すること
ができる。
ー及び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎ
ａＣを含むＤＮＡ断片と、該ＤＮＡ断片の下流に結合し
たトリプトファンオペロン由来のトリプトファンシンタ
ーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とから成るＤＮＡ断片
の少なくとも２個と、ＣｏｌＥ１系プラスミド由来の自
律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片から成る組換え
プラスミド並びにこのプラスミドで形質転換されたエシ
エリヒア・コリＫ１２系微生物。 【効果】 この発明のエシエリヒア・コリＫ１２系微生
物を用いてＬ−トリプトファンを効率的に製造すること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トリプトファナーゼオ
ペロン由来のプロモーター及び該プロモーターの下流に
位置する調節遺伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシン
ターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）を含むＤＮＡ
断片を含有するプラスミド及びそれを含む微生物に関す
る。
ペロン由来のプロモーター及び該プロモーターの下流に
位置する調節遺伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシン
ターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）を含むＤＮＡ
断片を含有するプラスミド及びそれを含む微生物に関す
る。
【０００２】本発明のプラスミドは、コピー数が多く、
トリプトファンシンターゼを高発現し、細胞増殖に際し
て脱落することなく、親細胞から娘細胞に確実に受け継
がれる、トリプトファン製造上有用なプラスミドであ
る。
トリプトファンシンターゼを高発現し、細胞増殖に際し
て脱落することなく、親細胞から娘細胞に確実に受け継
がれる、トリプトファン製造上有用なプラスミドであ
る。
【０００３】
【従来の技術】トリプトファナーゼオペロンにおけるト
リプトファナーゼ構造遺伝子の発現機構は、トリプトフ
ァンにより発現制御を受けることが知られている（Ｍ．
Ｃ．Ｄｅｅｌｅｙ ａｎｄ Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ；
Ｊ．Ｂａｃ．，１９８１，１４７，ｐ７８７−７９６参
照）。該トリプトファナーゼオペロンを保有する菌体を
培養する際にトリプトファンを含む培地を用いた場合、
トリプトファナーゼ構造遺伝子の極めて強い発現が認め
られている。本機構は、トリプトファナーゼプロモータ
ーとトリプトファナーゼ構造遺伝子ｔｎａＡの間に位置
する調節遺伝子ｔｎａＣを含む約３００ｂｐのＤＮＡ領
域で機能する。従って、本領域を利用することにより、
トリプトファンによる新たな遺伝子発現調節が可能とな
る。
リプトファナーゼ構造遺伝子の発現機構は、トリプトフ
ァンにより発現制御を受けることが知られている（Ｍ．
Ｃ．Ｄｅｅｌｅｙ ａｎｄ Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ；
Ｊ．Ｂａｃ．，１９８１，１４７，ｐ７８７−７９６参
照）。該トリプトファナーゼオペロンを保有する菌体を
培養する際にトリプトファンを含む培地を用いた場合、
トリプトファナーゼ構造遺伝子の極めて強い発現が認め
られている。本機構は、トリプトファナーゼプロモータ
ーとトリプトファナーゼ構造遺伝子ｔｎａＡの間に位置
する調節遺伝子ｔｎａＣを含む約３００ｂｐのＤＮＡ領
域で機能する。従って、本領域を利用することにより、
トリプトファンによる新たな遺伝子発現調節が可能とな
る。
【０００４】本発明者らは、先に、トリプトファナーゼ
オペロン（ｔｎａ）中のプロモーターの強力な遺伝子発
現機構に着目し、その有効利用について鋭意研究を行な
った。その結果、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎ
ａ）中のプロモーター及び該プロモーターの下流に位置
する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片の下流側に、
トリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片
を結合すると、該プロモーターによりトリプトファナー
ゼ構造遺伝子のみならず、トリプトファンシンターゼ構
造遺伝子もまた、強力に発現されうることを見い出し、
提案した（ヨーロッパ公開特許公報３９７０９７号参
照）。
オペロン（ｔｎａ）中のプロモーターの強力な遺伝子発
現機構に着目し、その有効利用について鋭意研究を行な
った。その結果、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎ
ａ）中のプロモーター及び該プロモーターの下流に位置
する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片の下流側に、
トリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片
を結合すると、該プロモーターによりトリプトファナー
ゼ構造遺伝子のみならず、トリプトファンシンターゼ構
造遺伝子もまた、強力に発現されうることを見い出し、
提案した（ヨーロッパ公開特許公報３９７０９７号参
照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らはさらに、
トリプトファンシンターゼ構造遺伝子の高発現化を達成
すべく検討を行った。その結果、今回、トリプトファナ
ーゼオペロンのプロモーター及び該プロモーターの下流
に位置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片と、該
ＤＮＡ断片の下流に結合したトリプトファンオペロン由
来のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ
断片とからなるＤＮＡ断片を複数個連結したＤＮＡ断片
を、ある種のプラスミドに導入することにより、トリプ
トファンシンターゼの発現量が顕著に増大することを見
い出し、本発明を完成するに至った。
トリプトファンシンターゼ構造遺伝子の高発現化を達成
すべく検討を行った。その結果、今回、トリプトファナ
ーゼオペロンのプロモーター及び該プロモーターの下流
に位置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片と、該
ＤＮＡ断片の下流に結合したトリプトファンオペロン由
来のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ
断片とからなるＤＮＡ断片を複数個連結したＤＮＡ断片
を、ある種のプラスミドに導入することにより、トリプ
トファンシンターゼの発現量が顕著に増大することを見
い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】本発明の新規なプラスミドは、トリプトフ
ァンによるトリプトファンシンターゼ構造遺伝子の誘導
が可能であり、かつコピー数が多く、継代的に安定に分
配可能なプラスミドであり、該プラスミドによりエシエ
リヒア・コリＫ１２系微生物の育種改良が可能となる。
ァンによるトリプトファンシンターゼ構造遺伝子の誘導
が可能であり、かつコピー数が多く、継代的に安定に分
配可能なプラスミドであり、該プラスミドによりエシエ
リヒア・コリＫ１２系微生物の育種改良が可能となる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、（１）トリプトファナーゼオペロン中のプロモータ
ー及び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎ
ａＣを含むＤＮＡ断片と、該ＤＮＡ断片の下流に結合し
たトリプトファンオペロン由来のトリプトファンシンタ
ーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とから成るＤＮＡ断片
の少なくとも２個と、ＣｏｌＥ１系プラスミド由来の自
律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片から成ることを
特徴とする組換えプラスミド、（２）このプラスミドで
形質転換されたエシエリヒア・コリＫ１２系微生物が提
供される。
ば、（１）トリプトファナーゼオペロン中のプロモータ
ー及び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎ
ａＣを含むＤＮＡ断片と、該ＤＮＡ断片の下流に結合し
たトリプトファンオペロン由来のトリプトファンシンタ
ーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とから成るＤＮＡ断片
の少なくとも２個と、ＣｏｌＥ１系プラスミド由来の自
律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片から成ることを
特徴とする組換えプラスミド、（２）このプラスミドで
形質転換されたエシエリヒア・コリＫ１２系微生物が提
供される。
【０００８】以下、本発明の組換えプラスミド、宿主微
生物、宿主微生物の形質転換、形質転換微生物の培養に
ついてさらに詳細に説明する。
生物、宿主微生物の形質転換、形質転換微生物の培養に
ついてさらに詳細に説明する。
【０００９】Ｉ．組換えプラスミド 本発明のプラスミドを構成する「トリプトファナーゼオ
ペロン中のプロモーター及び該プロモーターの下流に位
置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片」（以下、
「Ｐ断片」と略称することがある）には、トリプトファ
ナーゼオペロン中のトリプトファナーゼの構造遺伝子で
あるｔｎａＡを発現させうるプロモーター機能をもつＤ
ＮＡ断片（以下、「トリプトファナーゼプロモーター」
ということがある）及び該プロモーターの下流に位置す
る調節遺伝子ｔｎａＣをもつＤＮＡ断片を結合したＤＮ
Ａ断片が包含される。
ペロン中のプロモーター及び該プロモーターの下流に位
置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片」（以下、
「Ｐ断片」と略称することがある）には、トリプトファ
ナーゼオペロン中のトリプトファナーゼの構造遺伝子で
あるｔｎａＡを発現させうるプロモーター機能をもつＤ
ＮＡ断片（以下、「トリプトファナーゼプロモーター」
ということがある）及び該プロモーターの下流に位置す
る調節遺伝子ｔｎａＣをもつＤＮＡ断片を結合したＤＮ
Ａ断片が包含される。
【００１０】かかるＰ断片としては、実用的には大腸菌
由来のものが好適に使用される。このＰ断片の供給源と
しては特に制限はないが、例えば、エシエリヒア・コリ
ＡＴＣＣ２７３２５、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３
２８２、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３４３７、エシ
エリヒア・コリＡＴＣＣ２３４６１等の菌株の染色体Ｄ
ＮＡが有利に使用される。
由来のものが好適に使用される。このＰ断片の供給源と
しては特に制限はないが、例えば、エシエリヒア・コリ
ＡＴＣＣ２７３２５、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３
２８２、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３４３７、エシ
エリヒア・コリＡＴＣＣ２３４６１等の菌株の染色体Ｄ
ＮＡが有利に使用される。
【００１１】これら供給源微生物からＰ断片を調製する
ための基本的操作法を簡単に述べれば次のとおりであ
る。上記供給源微生物であるエシエリヒア・コリの培養
物からトリプトファナーゼオペロンを含有する染色体Ｄ
ＮＡを常法〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，７２，ｐ６１９ (１９６３）参
照〕で抽出し、その染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切
断し、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）中のプロ
モーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片をク
ローニングする。しかして、例えば、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＨｉｎｄ IIIを用いて切り出せば、長さが約３．
２ｋｂのトリプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）ＤＮＡ
断片を得ることができ、それをさらに制限酵素ＡｌｕＩ
及びＲｓａＩを用いて切り出せば、長さが約６３０ｂｐ
のトリプトファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎ
ａＣを含むＤＮＡ断片を調製することができ、このＤＮ
Ａ断片はＰ断片として使用することができる。
ための基本的操作法を簡単に述べれば次のとおりであ
る。上記供給源微生物であるエシエリヒア・コリの培養
物からトリプトファナーゼオペロンを含有する染色体Ｄ
ＮＡを常法〔Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，７２，ｐ６１９ (１９６３）参
照〕で抽出し、その染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切
断し、トリプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）中のプロ
モーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片をク
ローニングする。しかして、例えば、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＨｉｎｄ IIIを用いて切り出せば、長さが約３．
２ｋｂのトリプトファナーゼオペロン（ｔｎａ）ＤＮＡ
断片を得ることができ、それをさらに制限酵素ＡｌｕＩ
及びＲｓａＩを用いて切り出せば、長さが約６３０ｂｐ
のトリプトファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎ
ａＣを含むＤＮＡ断片を調製することができ、このＤＮ
Ａ断片はＰ断片として使用することができる。
【００１２】また、上記プラスミドを構成する「トリプ
トファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片」
（以下、「Ｔ断片」と略称することがある）には、イン
ドールとＬ−又はＤＬ−セリンからＬ−トリプトファン
の合成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む領域が
包含され、しかして、Ｔ断片には、例えば、トリプトフ
ァンオペロン中のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子
を含むＤＮＡ領域、すなわちｔｒｐＡ及びｔｒｐＢを含
むＤＮＡ断片が挙げられる。これらのＴ断片として実用
的にはエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）由来のものが好適に使用される。
トファンシンターゼの構造遺伝子を含むＤＮＡ断片」
（以下、「Ｔ断片」と略称することがある）には、イン
ドールとＬ−又はＤＬ−セリンからＬ−トリプトファン
の合成を触媒する酵素をコードする遺伝子を含む領域が
包含され、しかして、Ｔ断片には、例えば、トリプトフ
ァンオペロン中のトリプトファンシンターゼ構造遺伝子
を含むＤＮＡ領域、すなわちｔｒｐＡ及びｔｒｐＢを含
むＤＮＡ断片が挙げられる。これらのＴ断片として実用
的にはエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）由来のものが好適に使用される。
【００１３】このＴ断片の供給源となる微生物として
は、例えば、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２７３２５、
エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３２８２、エシエリヒア
・コリＡＴＣＣ２３４３７、エシエリヒア・コリＡＴＣ
Ｃ２３４６１等が有利に使用される。これら供給源微生
物からＴ断片を調製するための基本操作を簡単に述べれ
ば次のとおりである。
は、例えば、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２７３２５、
エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２３２８２、エシエリヒア
・コリＡＴＣＣ２３４３７、エシエリヒア・コリＡＴＣ
Ｃ２３４６１等が有利に使用される。これら供給源微生
物からＴ断片を調製するための基本操作を簡単に述べれ
ば次のとおりである。
【００１４】上記の供給源微生物であるエシエリヒア・
コリの染色体ＤＮＡ中にファージφ８０を感染させた後
誘発し、ファージＤＮＡ中にトリプトファンオペロンを
取り込んだファージを大量に調製し、次にファージＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて長さが約２０
ｋｂのトリプトファンオペロンＤＮＡ断片を切り出し、
このＤＮＡ断片をさらに制限酵素ＨｉｎｃIIで部分分解
を行なえば、長さが約２．６ｋｂのトリプトファン・シ
ンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）含有ＤＮＡ
断片を調製することができ、このＤＮＡ断片はＴ断片と
して使用することができる。
コリの染色体ＤＮＡ中にファージφ８０を感染させた後
誘発し、ファージＤＮＡ中にトリプトファンオペロンを
取り込んだファージを大量に調製し、次にファージＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩを用いて長さが約２０
ｋｂのトリプトファンオペロンＤＮＡ断片を切り出し、
このＤＮＡ断片をさらに制限酵素ＨｉｎｃIIで部分分解
を行なえば、長さが約２．６ｋｂのトリプトファン・シ
ンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）含有ＤＮＡ
断片を調製することができ、このＤＮＡ断片はＴ断片と
して使用することができる。
【００１５】さらに、本発明において上記Ｐ断片及びＴ
断片と組合わせて使用される「ＣｏｌＥ１系プラスミド
由来の自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以
下、「Ｓ断片」と略称することがある）には、コピー数
が１細胞染色体当り２０〜３０個であるＣｏｌＥ１系プ
ラスミドの自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片が包
含される。そのようなＳ断片の代表例としては、例え
ば、約４．３ｋｂの長さを有するプラスミドｐＢＲ３２
２由来のＳ断片が挙げられ、その他にプラスミドｐＢＲ
３２２等由来のＳ断片を例示することができる。
断片と組合わせて使用される「ＣｏｌＥ１系プラスミド
由来の自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以
下、「Ｓ断片」と略称することがある）には、コピー数
が１細胞染色体当り２０〜３０個であるＣｏｌＥ１系プ
ラスミドの自律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片が包
含される。そのようなＳ断片の代表例としては、例え
ば、約４．３ｋｂの長さを有するプラスミドｐＢＲ３２
２由来のＳ断片が挙げられ、その他にプラスミドｐＢＲ
３２２等由来のＳ断片を例示することができる。
【００１６】本発明のプラスミドは、上記したＰ断片、
Ｔ断片、Ｓ断片の３つのＤＮＡ断片のうち、Ｐ断片の下
流にＴ断片が結合したＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）の少く
とも２個と、Ｓ断片を有する限り、他の遺伝情報を担う
ＤＮＡ断片、例えば抗生物質耐性マーカーであるアンピ
シリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、カナマイシン耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片等をさらに含有しうる。また、
本発明のプラスミドが含有しうるＰ＋Ｔ断片の数は一般
に２〜３個が最も好ましい。
Ｔ断片、Ｓ断片の３つのＤＮＡ断片のうち、Ｐ断片の下
流にＴ断片が結合したＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）の少く
とも２個と、Ｓ断片を有する限り、他の遺伝情報を担う
ＤＮＡ断片、例えば抗生物質耐性マーカーであるアンピ
シリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片、カナマイシン耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片等をさらに含有しうる。また、
本発明のプラスミドが含有しうるＰ＋Ｔ断片の数は一般
に２〜３個が最も好ましい。
【００１７】かかるＤＮＡ断片からの組換えプラスミド
の構築は、遺伝子操作技術に関する標準的テキストに記
載されている如きそれ自体既知の方法で行なうことがで
きる〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ
ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）等の文献参
照〕。
の構築は、遺伝子操作技術に関する標準的テキストに記
載されている如きそれ自体既知の方法で行なうことがで
きる〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ
ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）等の文献参
照〕。
【００１８】本発明の組換えプラスミドの典型的な具体
例は、２個のＰ＋Ｔ断片とＳ断片から実質的になり、分
子量が約６．４５メガダルトン（約９．８ｋｂ）のプラ
スミドで、本発明者らが「プラスミドｐＭＴＹ２１」と
命名したもの（後記実施例１参照）を挙げることができ
る。プラスミドｐＭＴＹ２１は下記表１に記載する如き
制限酵素の認識部位数及び該制限酵素による分解断片の
長さ（ｋｂ）を示す。
例は、２個のＰ＋Ｔ断片とＳ断片から実質的になり、分
子量が約６．４５メガダルトン（約９．８ｋｂ）のプラ
スミドで、本発明者らが「プラスミドｐＭＴＹ２１」と
命名したもの（後記実施例１参照）を挙げることができ
る。プラスミドｐＭＴＹ２１は下記表１に記載する如き
制限酵素の認識部位数及び該制限酵素による分解断片の
長さ（ｋｂ）を示す。
【００１９】 表１ プラスミドｐＭＴＹ２１ 制 限 酵 素 認識部位の数 分解断片の長さ（ｋｂ） ＥｃｏＲＩ １ 9.8 ＳｍａＩ １ 9.8 Ｈｉｎｄ III ３ 2.7, 2.0, 5.1 ＳａｌＩ ５ 2.1, 2.1, 0.6, 0.6, 4.4 ＢａｍＨＩ ５ 0.6, 0.6, 2.1, 2.4, 4.1 以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミドｐＭＴ
Ｙ２１は、例えば次のようにして製造することができ
る。
Ｙ２１は、例えば次のようにして製造することができ
る。
【００２０】まず、トリプトファナーゼプロモーター及
び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａＣ
を含むＤＮＡ断片（Ｐ断片）の調製は、例えば、染色体
遺伝子中にトリプトファナーゼオペロンをもつ大腸菌、
例えば、エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２３
２８２、ＡＴＣＣ２３４３７、ＡＴＣＣ２７３２５、Ａ
ＴＣＣ２３４６１）などから染色体ＤＮＡを抽出し、そ
れから常法〔Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８
２）ｐ．１６４〜１６５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照〕に従って、制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ IIIを用いてトリプトフ
ァナーゼオペロンＤＮＡ断片を切り出し、さらに制限酵
素ＲｓａＩ、ＡｌｕＩにより約６３０ｂｐのトリプトフ
ァナーゼプロモーター及びこのプロモーターの下流に位
置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片が得られ
る。さらに、ＢａｍＨＩリンカーを付与することにより
Ｐ断片が得られる。
び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａＣ
を含むＤＮＡ断片（Ｐ断片）の調製は、例えば、染色体
遺伝子中にトリプトファナーゼオペロンをもつ大腸菌、
例えば、エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２３
２８２、ＡＴＣＣ２３４３７、ＡＴＣＣ２７３２５、Ａ
ＴＣＣ２３４６１）などから染色体ＤＮＡを抽出し、そ
れから常法〔Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８
２）ｐ．１６４〜１６５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照〕に従って、制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄ IIIを用いてトリプトフ
ァナーゼオペロンＤＮＡ断片を切り出し、さらに制限酵
素ＲｓａＩ、ＡｌｕＩにより約６３０ｂｐのトリプトフ
ァナーゼプロモーター及びこのプロモーターの下流に位
置する調節遺伝子ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片が得られ
る。さらに、ＢａｍＨＩリンカーを付与することにより
Ｐ断片が得られる。
【００２１】また、トリプトファンシンターゼ構造遺伝
子を含むＤＮＡ断片（Ｔ断片）の調製は、例えば染色体
遺伝子中にトリプトファンオペロンをもつ大腸菌、例え
ば、エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２
５、ＡＴＣＣ２３２８２、ＡＴＣＣ２３４３７、ＡＴＣ
Ｃ２３４６１）などに、ファージ、例えばファージφ８
０ (ＡＴＣＣ１１４５６ａ−Ｂ１）などを感染させ、溶
原化及び誘発現象を利用して、ファージＤＮＡ中にトリ
プトファンオペロンを取り込んだファージを大量に調製
し〔Ｒ．Ｍ．Ｄｅｎｎｙ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ；Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１８，ｐ５０５ (１９７４）
参照〕、それから常法〔Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（１
９８２）ｐ１６４〜１６５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照〕に従ってフ
ァージＤＮＡを抽出し、制限酵素、例えばＢａｍＨＩ、
ＥｃｏＲＩ等を用いてトリプトファンオペロンＤＮＡ断
片を切り出し、このＤＮＡ断片をさらに制限酵素Ｈｉｎ
ｄIIで部分切断を行い、ｔｒｐＡ及びｔｒｐＢ遺伝子を
含むＤＮＡ断片が得られる。
子を含むＤＮＡ断片（Ｔ断片）の調製は、例えば染色体
遺伝子中にトリプトファンオペロンをもつ大腸菌、例え
ば、エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２
５、ＡＴＣＣ２３２８２、ＡＴＣＣ２３４３７、ＡＴＣ
Ｃ２３４６１）などに、ファージ、例えばファージφ８
０ (ＡＴＣＣ１１４５６ａ−Ｂ１）などを感染させ、溶
原化及び誘発現象を利用して、ファージＤＮＡ中にトリ
プトファンオペロンを取り込んだファージを大量に調製
し〔Ｒ．Ｍ．Ｄｅｎｎｙ，Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ；Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１８，ｐ５０５ (１９７４）
参照〕、それから常法〔Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（１
９８２）ｐ１６４〜１６５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照〕に従ってフ
ァージＤＮＡを抽出し、制限酵素、例えばＢａｍＨＩ、
ＥｃｏＲＩ等を用いてトリプトファンオペロンＤＮＡ断
片を切り出し、このＤＮＡ断片をさらに制限酵素Ｈｉｎ
ｄIIで部分切断を行い、ｔｒｐＡ及びｔｒｐＢ遺伝子を
含むＤＮＡ断片が得られる。
【００２２】次に得られるＤＮＡ断片とＳａｌＩリンカ
ーを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させるとｔｒｐ
Ａ及びｔｒｐＢ断片の両末端にＳａｌＩ部位をもつＴ断
片が得られる。他方、ＣｏｌＥ１系プラスミド由来の自
律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｓ断片）の供給
源としては、ＣｏｌＥ１系プラスミドとして代表的なプ
ラスミドｐＢＲ３２２を使用するのが便利である。
ーを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させるとｔｒｐ
Ａ及びｔｒｐＢ断片の両末端にＳａｌＩ部位をもつＴ断
片が得られる。他方、ＣｏｌＥ１系プラスミド由来の自
律増殖を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ｓ断片）の供給
源としては、ＣｏｌＥ１系プラスミドとして代表的なプ
ラスミドｐＢＲ３２２を使用するのが便利である。
【００２３】上記の如くして調製されたＰ断片及びＴ断
片をそれぞれプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＢ
ａｍＨＩ部位及びＳａｌＩ部位に挿入後、再びＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄIII で部分切断を行うことによりトリプト
ファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ及びト
リプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐ
Ｂ）を含有する画分（Ｐ＋Ｔ断片）が得られる。かくし
て得られるＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）を、プラスミドｐ
ＢＲ３２２ (Ｓ断片）のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部
位に挿入する事によりＰ＋Ｔ断片にＳ断片が結合したプ
ラスミドを構築することができる。
片をそれぞれプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＢ
ａｍＨＩ部位及びＳａｌＩ部位に挿入後、再びＥｃｏＲ
ＩとＨｉｎｄIII で部分切断を行うことによりトリプト
ファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ及びト
リプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐ
Ｂ）を含有する画分（Ｐ＋Ｔ断片）が得られる。かくし
て得られるＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）を、プラスミドｐ
ＢＲ３２２ (Ｓ断片）のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部
位に挿入する事によりＰ＋Ｔ断片にＳ断片が結合したプ
ラスミドを構築することができる。
【００２４】上記の如くして構築されるプラスミドを、
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで切り出すことによっ
て大きさが約７．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ＋Ｓ断
片）を、制限酵素ＳｐｈＩで切り出し末端平滑化した後
さらに制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出すことによって大き
さが約２．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）を得るこ
とができる。かくして得られるＰ＋Ｔ＋Ｓ断片とＰ＋Ｔ
断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結することによ
り、目的とする２個のＰ＋Ｔ断片と１個のＳ断片より成
るプラスミドｐＭＴＹ２１を得ることができる。
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで切り出すことによっ
て大きさが約７．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ＋Ｓ断
片）を、制限酵素ＳｐｈＩで切り出し末端平滑化した後
さらに制限酵素ＥｃｏＲＩで切り出すことによって大き
さが約２．７ｋｂのＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）を得るこ
とができる。かくして得られるＰ＋Ｔ＋Ｓ断片とＰ＋Ｔ
断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結することによ
り、目的とする２個のＰ＋Ｔ断片と１個のＳ断片より成
るプラスミドｐＭＴＹ２１を得ることができる。
【００２５】かくして造成されるプラスミドを用いて、
上記したプラスミドの構築方法を繰り返すことにより、
Ｐ＋Ｔ断片が３個またはそれ以上含有するプラスミドを
得ることができる。なお、プラスミドｐＭＴＹ２１の具
体的調製法については、後記実施例１でさらに詳細に説
明する。
上記したプラスミドの構築方法を繰り返すことにより、
Ｐ＋Ｔ断片が３個またはそれ以上含有するプラスミドを
得ることができる。なお、プラスミドｐＭＴＹ２１の具
体的調製法については、後記実施例１でさらに詳細に説
明する。
【００２６】II．宿主微生物 前項Ｉに述べた組換えプラスミドで形質転換することが
できる宿主微生物としては、エシエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物が好適
であり、例えば、エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴ
ＣＣ２７３２５、ＡＴＣＣ２３２８２、ＡＴＣＣ２３４
３７、ＡＴＣＣ２３４６１等）が使用できる。
できる宿主微生物としては、エシエリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物が好適
であり、例えば、エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴ
ＣＣ２７３２５、ＡＴＣＣ２３２８２、ＡＴＣＣ２３４
３７、ＡＴＣＣ２３４６１等）が使用できる。
【００２７】III.形質転換 前項Ｉに述べた組換えプラスミドの前項IIに述べた如き
宿主微生物への導入はそれ自体既知の方法、例えば、
Ｍ．Ｍａｎｄｅｌ，Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，５３，１５９（１９７０）等の文献に記載の方法
で行うことができる。
宿主微生物への導入はそれ自体既知の方法、例えば、
Ｍ．Ｍａｎｄｅｌ，Ａ．Ｈｉｇａ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，５３，１５９（１９７０）等の文献に記載の方法
で行うことができる。
【００２８】このようにして形質転換された微生物の具
体例としては、前記プラスミドｐＭＴＹ２１を保有する
エシエリヒア・コリＹＫ２０１８ (ＦＥＲＭ Ｐ−１２
２３１）を挙げることができる。上記の形質転換された
エシエリヒア・コリＫ１２系株は、茨城県つくば市東１
丁目１番３号、通商産業省微生物工業技術研究所に、前
記カッコ内の寄託番号で寄託されている。
体例としては、前記プラスミドｐＭＴＹ２１を保有する
エシエリヒア・コリＹＫ２０１８ (ＦＥＲＭ Ｐ−１２
２３１）を挙げることができる。上記の形質転換された
エシエリヒア・コリＫ１２系株は、茨城県つくば市東１
丁目１番３号、通商産業省微生物工業技術研究所に、前
記カッコ内の寄託番号で寄託されている。
【００２９】IV．形質転換微生物の培養 本発明の組換えプラスミドで形質転換された微生物の培
養は、Ｌ又はＤＬ−トリプトファンを含有する培地中に
おいて行なわれる。このＬ又はＤＬ−トリプトファンの
添加によって、形質転換微生物はトリプトファナーゼオ
ペロン（ｔｎａ）中のプロモーターの遺伝子発現機構を
強力に働かせることができる。
養は、Ｌ又はＤＬ−トリプトファンを含有する培地中に
おいて行なわれる。このＬ又はＤＬ−トリプトファンの
添加によって、形質転換微生物はトリプトファナーゼオ
ペロン（ｔｎａ）中のプロモーターの遺伝子発現機構を
強力に働かせることができる。
【００３０】培地中のＬ−又はＤＬ−トリプトファンの
濃度は、厳密に制限されるものではないが、好ましくは
０．０５〜２％（ｗｔ／ｖｏｌ）さらに好ましくは０．
１〜０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内である。Ｌ−又
はＤＬ−トリプトファンの添加時期は培養初期でも培養
中期でもよいが、好ましくは対数増殖後期以前に添加す
る。
濃度は、厳密に制限されるものではないが、好ましくは
０．０５〜２％（ｗｔ／ｖｏｌ）さらに好ましくは０．
１〜０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の範囲内である。Ｌ−又
はＤＬ−トリプトファンの添加時期は培養初期でも培養
中期でもよいが、好ましくは対数増殖後期以前に添加す
る。
【００３１】また、培地には、さらに炭素源、窒素源、
無機塩、成長促進物質等の栄養分が適宜配合される。し
かして炭素源としては、グルコース、グリセロール、フ
ラクトース、シュクロース、糖蜜等の種々の炭水化物や
コハク酸、ピルビン酸、フマール酸、乳酸等の各種の有
機酸が使用できる。培地に含ませうる窒素源としては、
例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム等のアンモニウム塩；硝
酸カリ、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸
塩；グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アス
パラギン等の有機窒素；アンモニアなどが挙げられ、こ
れらは単独もしくは混合して用いることができる。
無機塩、成長促進物質等の栄養分が適宜配合される。し
かして炭素源としては、グルコース、グリセロール、フ
ラクトース、シュクロース、糖蜜等の種々の炭水化物や
コハク酸、ピルビン酸、フマール酸、乳酸等の各種の有
機酸が使用できる。培地に含ませうる窒素源としては、
例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム等のアンモニウム塩；硝
酸カリ、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等の硝酸
塩；グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アス
パラギン等の有機窒素；アンモニアなどが挙げられ、こ
れらは単独もしくは混合して用いることができる。
【００３２】また無機塩としては、例えば、リン酸−水
素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸鉄、硫酸マンガンなどを単独もしくは混合して
用いることができる。さらに、成長促進物質としては特
に限定されるものではないが、例えば、サイアミン、ビ
オチン等のビタミン類；メチオニン、システイン等のア
ミノ酸；あるいはこれらを全部若しくは部分的に含有す
る酵素エキス、ポリペプトン、肉エキス、コーンスティ
ーブリカー、カザミノ酸等を用いることができる。
素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸鉄、硫酸マンガンなどを単独もしくは混合して
用いることができる。さらに、成長促進物質としては特
に限定されるものではないが、例えば、サイアミン、ビ
オチン等のビタミン類；メチオニン、システイン等のア
ミノ酸；あるいはこれらを全部若しくは部分的に含有す
る酵素エキス、ポリペプトン、肉エキス、コーンスティ
ーブリカー、カザミノ酸等を用いることができる。
【００３３】以上に述べた如き組成の培地での微生物の
培養は、通常用いられていると同様の培養装置を用い
て、好気的条件下に実施することができる。特に空気そ
の他の酸素含有ガスを培地に通気及び／又は攪拌するこ
とによって、培地中の溶存酸素濃度を一般に１〜８ｐｐ
ｍ、好ましくは２〜７ｐｐｍの範囲内に維持することに
よって、培養をより効率的に行なうことができる。
培養は、通常用いられていると同様の培養装置を用い
て、好気的条件下に実施することができる。特に空気そ
の他の酸素含有ガスを培地に通気及び／又は攪拌するこ
とによって、培地中の溶存酸素濃度を一般に１〜８ｐｐ
ｍ、好ましくは２〜７ｐｐｍの範囲内に維持することに
よって、培養をより効率的に行なうことができる。
【００３４】培養温度は、約１０〜約４５℃、好ましく
は約２５〜約４０℃の範囲内とすることができ、また、
培地のｐＨは約３〜約１０、好ましくは約５〜約９の範
囲内とすることができる。培養中培地のｐＨが変化する
場合には、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸ソ
ーダ、重炭酸ソーダ等のアルカリ、或いは硫酸、塩酸等
の酸を適宜添加してｐＨ調整を行なうことが望ましい。
培養時間は通常約５〜約４８時間程度とすることができ
る。
は約２５〜約４０℃の範囲内とすることができ、また、
培地のｐＨは約３〜約１０、好ましくは約５〜約９の範
囲内とすることができる。培養中培地のｐＨが変化する
場合には、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カリ、炭酸ソ
ーダ、重炭酸ソーダ等のアルカリ、或いは硫酸、塩酸等
の酸を適宜添加してｐＨ調整を行なうことが望ましい。
培養時間は通常約５〜約４８時間程度とすることができ
る。
【００３５】以上述べた如くして培養を行ない、トリプ
トファンシンターゼを菌体内に充分に生産蓄積させた
後、インドールとＬ−又はＤＬ−セリンとからＬ−トリ
プトファンを製造する際の酵素反応に利用することがで
きる。培養された菌体を該酵素反応に利用する場合、該
菌体はそのままで使用することができるが、該菌体を超
音波処理等で破砕した破砕物、又はその破砕物をさらに
水等で抽出した抽出物、或いは該抽出物をさらに硫安等
で処理して酵素成分を沈殿させた粗精製物の形で使用す
ることもでき、さらに、該菌体又はこれら処理物は必要
により固定化して用いることもできる。
トファンシンターゼを菌体内に充分に生産蓄積させた
後、インドールとＬ−又はＤＬ−セリンとからＬ−トリ
プトファンを製造する際の酵素反応に利用することがで
きる。培養された菌体を該酵素反応に利用する場合、該
菌体はそのままで使用することができるが、該菌体を超
音波処理等で破砕した破砕物、又はその破砕物をさらに
水等で抽出した抽出物、或いは該抽出物をさらに硫安等
で処理して酵素成分を沈殿させた粗精製物の形で使用す
ることもでき、さらに、該菌体又はこれら処理物は必要
により固定化して用いることもできる。
【００３６】該菌体又はその処理物の存在下でのインド
ールとＬ−又はＤＬ−セリンとの反応は、通常の酵素反
応と同様に例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜
９．０）あるいは水（ｐＨ７．０〜９．０）等の溶媒中
で、約２０〜約５０℃、好ましくは約３０〜約４０℃の
温度で通常約１０〜約７２時間行なわれる。インドール
とＬ−又はＤＬ−セリンの反応時の使用量には特に制限
はないが、一般にはそれぞれを０．１〜２０％（ｗｔ／
ｖｏｌ）の濃度範囲で使用するのが適当である。また、
該菌体又はその処理物の使用量も特に制限されるもので
はないが、一般に１〜１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の温度で
使用することができる。
ールとＬ−又はＤＬ−セリンとの反応は、通常の酵素反
応と同様に例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜
９．０）あるいは水（ｐＨ７．０〜９．０）等の溶媒中
で、約２０〜約５０℃、好ましくは約３０〜約４０℃の
温度で通常約１０〜約７２時間行なわれる。インドール
とＬ−又はＤＬ−セリンの反応時の使用量には特に制限
はないが、一般にはそれぞれを０．１〜２０％（ｗｔ／
ｖｏｌ）の濃度範囲で使用するのが適当である。また、
該菌体又はその処理物の使用量も特に制限されるもので
はないが、一般に１〜１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の温度で
使用することができる。
【００３７】上記のような培養方法によって得られる菌
体又はその処理物を用いてインドールとＬ−又はＤＬ−
セリンを反応せしめて得られる反応液中に生成したＬ−
トリプトファンの分離・精製は、イオン交換樹脂、活性
炭等による吸着、脱着処理等のそれ自体既知の方法によ
り行うことができる。
体又はその処理物を用いてインドールとＬ−又はＤＬ−
セリンを反応せしめて得られる反応液中に生成したＬ−
トリプトファンの分離・精製は、イオン交換樹脂、活性
炭等による吸着、脱着処理等のそれ自体既知の方法によ
り行うことができる。
【００３８】また、本発明のプラスミドで形質転換され
た微生物は、発酵法によるＬ−トリプトファンの生産に
も利用することができる。すなわち、本発明のプラスミ
ドで形質転換された微生物をインドールを含む培地で培
養すれば、培地中にＬ−トリプトファンが生産蓄積し、
これを採取することによりＬ−トリプトファンを製造す
ることができる。次に実施例により本発明のプラスミド
の調製についてさらに具体的に説明する。
た微生物は、発酵法によるＬ−トリプトファンの生産に
も利用することができる。すなわち、本発明のプラスミ
ドで形質転換された微生物をインドールを含む培地で培
養すれば、培地中にＬ−トリプトファンが生産蓄積し、
これを採取することによりＬ−トリプトファンを製造す
ることができる。次に実施例により本発明のプラスミド
の調製についてさらに具体的に説明する。
【００３９】
【実施例】下記の実施例において、制限酵素による認識
部位数及び分解断片の大きさは次に示す方法で測定し
た。制限酵素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又は
プラスミドを、過剰の制限酵素の存在下で完全分解し、
それらの分解物をそれ自体既知の方法に従い１％アガロ
ースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供し、分離可能な断片の数から決定した。
部位数及び分解断片の大きさは次に示す方法で測定し
た。制限酵素による「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又は
プラスミドを、過剰の制限酵素の存在下で完全分解し、
それらの分解物をそれ自体既知の方法に従い１％アガロ
ースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル電気泳
動に供し、分離可能な断片の数から決定した。
【００４０】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシエリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得られ
る分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での
泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシエリヒア
・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φ×１７４
ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIII で切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルア
ミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切
断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを
算出した。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの
大きさを加算して求めた。なお、各ＤＮＡ断片の大きさ
の決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
ドの大きさは、アガロースゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシエリヒア・コリのラムダファージ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断して得られ
る分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロースゲル上での
泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシエリヒア
・コリのファイ・エックス１７４ファージ（φ×１７４
ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素ＨａｅIII で切断して
得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリアクリルア
ミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基づき、切
断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の大きさを
算出した。プラスミドの大きさは、切断断片それぞれの
大きさを加算して求めた。なお、各ＤＮＡ断片の大きさ
の決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさについて
は、１％アガロースゲル電気泳動によって得られる結果
を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の大きさ
については４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て得られる結果を採用した。
【００４１】実施例１：プラスミドｐＭＴＹ２１の造成
及び該プラスミドによるエシエリヒア・コリＫ１２系株
の形質転換 （１）トリプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐ
Ａ、ｔｒｐＢ）を含むＤＮＡ断片（Ｔ断片）の調製
及び該プラスミドによるエシエリヒア・コリＫ１２系株
の形質転換 （１）トリプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐ
Ａ、ｔｒｐＢ）を含むＤＮＡ断片（Ｔ断片）の調製
【００４２】（Ａ）ファージφ８０ｐｔの調製 エシエリヒア・コリＫ−１２系株（ＡＴＣＣ２７３２
５）を１００ｍｌのＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、グルコース１ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１
リットル；ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で約４時間振
盪した培養物０．２ｍｌと、ファージφ８０ (ＡＴＣＣ
１１４５６ａ−Ｂ１）水溶液（１０5 ケ／ｍｌ）の０．
１ｍｌとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培地＋寒天沫）中に混合
したのち、Ｌ培地寒天プレート上に重層する。該プレー
トを３７℃にて約５時間培養するとプラーク（溶菌斑）
を生じ、さらに２〜３日間３７℃にて培養を継続する
と、プラーク中にファージφ８０溶原菌の生育コロニー
を生ずる。該溶原菌をＬ培地にて３７℃で４時間培養
後、上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗沫したのち、
紫外線照射（４００〜８００ｅｒｇｓ／ｍｍ2 、１０〜
２０秒）による溶原ファージの誘発によりファージφ８
０ｐｔ（トリプトファンオペロンを含むファージＤＮ
Ａ）を調製した。
５）を１００ｍｌのＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、グルコース１ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、蒸留水１
リットル；ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で約４時間振
盪した培養物０．２ｍｌと、ファージφ８０ (ＡＴＣＣ
１１４５６ａ−Ｂ１）水溶液（１０5 ケ／ｍｌ）の０．
１ｍｌとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培地＋寒天沫）中に混合
したのち、Ｌ培地寒天プレート上に重層する。該プレー
トを３７℃にて約５時間培養するとプラーク（溶菌斑）
を生じ、さらに２〜３日間３７℃にて培養を継続する
と、プラーク中にファージφ８０溶原菌の生育コロニー
を生ずる。該溶原菌をＬ培地にて３７℃で４時間培養
後、上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗沫したのち、
紫外線照射（４００〜８００ｅｒｇｓ／ｍｍ2 、１０〜
２０秒）による溶原ファージの誘発によりファージφ８
０ｐｔ（トリプトファンオペロンを含むファージＤＮ
Ａ）を調製した。
【００４３】（Ｂ）トリプトファンオペロン画分の調製 エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２５）
を１リットルのＬ培地（組成は前記と同じ）に接種し、
約３７℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に２５％
（ｗ／ｖ）グルコース溶液１０ｍｌと上記で調製したフ
ァージφ８０ｐｔ溶液を１０11ケ／ｍｌの濃度で添加し
（ｍｏｉ２０）、５時間振盪を継続後常法通りクロロホ
ルムの添加により、ファージφ８０ｐｔを大量に調製し
た〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）
ｐ７６，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ参照〕。
を１リットルのＬ培地（組成は前記と同じ）に接種し、
約３７℃で約３時間振盪培養し、対数増殖期に２５％
（ｗ／ｖ）グルコース溶液１０ｍｌと上記で調製したフ
ァージφ８０ｐｔ溶液を１０11ケ／ｍｌの濃度で添加し
（ｍｏｉ２０）、５時間振盪を継続後常法通りクロロホ
ルムの添加により、ファージφ８０ｐｔを大量に調製し
た〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）
ｐ７６，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ参照〕。
【００４４】次に取得したファージφ８０ｐｔ溶液をト
リス緩衝液（ｐＨ７．８）にて透析後、フェノール法に
より、ＤＮＡ抽出法〔上記“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏ
ｎｉｎｇ”ｐ．８５参照〕によってファージＤＮＡを抽
出精製し、これに制限酵素ＢａｍＨＩを与え３０℃で３
０分間反応させ、長さ約２０ｋｂのトリプトファンオペ
ロン遺伝子画分を得た。
リス緩衝液（ｐＨ７．８）にて透析後、フェノール法に
より、ＤＮＡ抽出法〔上記“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏ
ｎｉｎｇ”ｐ．８５参照〕によってファージＤＮＡを抽
出精製し、これに制限酵素ＢａｍＨＩを与え３０℃で３
０分間反応させ、長さ約２０ｋｂのトリプトファンオペ
ロン遺伝子画分を得た。
【００４５】（Ｃ）プラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐの調
製 前記（Ｂ）項で得たトリプトファンオペロン画分に制限
酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩを３７にて１時間反応させ長
さ約７．４ｋｂのＤＮＡ画分を切り出し、次いで反応液
を６５℃で５分間熱処理して制限酵素を失活させた後、
同様に制限酵素ＳａｌＩで処理したプラスミドｐＢＲ３
２２を添加混合した。次いで該失活溶液中の成分が最終
濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになる
ように各成分を強化し、１６℃で１５時間保温すること
によってＤＮＡを結合させた。
製 前記（Ｂ）項で得たトリプトファンオペロン画分に制限
酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩを３７にて１時間反応させ長
さ約７．４ｋｂのＤＮＡ画分を切り出し、次いで反応液
を６５℃で５分間熱処理して制限酵素を失活させた後、
同様に制限酵素ＳａｌＩで処理したプラスミドｐＢＲ３
２２を添加混合した。次いで該失活溶液中の成分が最終
濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔになる
ように各成分を強化し、１６℃で１５時間保温すること
によってＤＮＡを結合させた。
【００４６】再結合後のＤＮＡを用いてエシエリヒア・
コリＫ１２系株（トリプトファン要求変異株：ＡＴＣＣ
２３７１８）を常法に従い形質転換させ、形質転換株
〔ｔｒｐ要求性の消失、すなわちプラスミド上のｔｒｐ
Ａ、ｔｒｐＢ遺伝子によりトリプトファンの生合成が可
能となり、最小培地（Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
２ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、（ＫＨ4 ）2
ＳＯ4 １ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水１リットル）上に
て生育可能となった菌株〕を得た。この菌株を常法に従
い液体培養し、培養液よりプラスミドを分離精製した
（以下このプラスミドをｐＢＲ３２２ｔｒｐと称す
る）。
コリＫ１２系株（トリプトファン要求変異株：ＡＴＣＣ
２３７１８）を常法に従い形質転換させ、形質転換株
〔ｔｒｐ要求性の消失、すなわちプラスミド上のｔｒｐ
Ａ、ｔｒｐＢ遺伝子によりトリプトファンの生合成が可
能となり、最小培地（Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4
２ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ、（ＫＨ4 ）2
ＳＯ4 １ｇ、グルコース２ｇ、蒸留水１リットル）上に
て生育可能となった菌株〕を得た。この菌株を常法に従
い液体培養し、培養液よりプラスミドを分離精製した
（以下このプラスミドをｐＢＲ３２２ｔｒｐと称す
る）。
【００４７】（Ｄ）トリプトファンシンターゼ構造遺伝
子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）画分のクローニング 上記（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐ
を制限酵素ＳａｃIIとＳａｌＩで３７℃で１時間切断
し、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ遺伝子を含む画分（長さ約３．
５ｋｂ）を得た。ついで制限酵素ＨｉｎｃIIを用いて３
７℃で部分的に分解し、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢを含む最小
区画分（長さ約２．６ｋｂ）を得た。この断片にＳａｌ
Ｉリンカーを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させ
て、両末端にＳａｌＩ部位をもつｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ画
分（Ｔ断片）を得た。
子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）画分のクローニング 上記（Ｃ）項で得られたプラスミドｐＢＲ３２２ｔｒｐ
を制限酵素ＳａｃIIとＳａｌＩで３７℃で１時間切断
し、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ遺伝子を含む画分（長さ約３．
５ｋｂ）を得た。ついで制限酵素ＨｉｎｃIIを用いて３
７℃で部分的に分解し、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢを含む最小
区画分（長さ約２．６ｋｂ）を得た。この断片にＳａｌ
Ｉリンカーを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させ
て、両末端にＳａｌＩ部位をもつｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ画
分（Ｔ断片）を得た。
【００４８】（２）トリプトファナーゼプロモーター及
び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａＣ
を含むＤＮＡ断片（Ｐ断片）の調製 （Ａ）エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３
２５）染色体ＤＮＡの調製 Ｌ培地（組成は前記と同じ）１００ｍｌを容量５００ｍ
ｌの三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処
理した。この培地にエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２
５）を植菌し、３７℃で１５時間培養を行った後、この
培養液２ｍｌを採り、新たに上記培地１００ｍｌに接種
し、再度３７℃で４時間培養を行なった。
び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子ｔｎａＣ
を含むＤＮＡ断片（Ｐ断片）の調製 （Ａ）エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３
２５）染色体ＤＮＡの調製 Ｌ培地（組成は前記と同じ）１００ｍｌを容量５００ｍ
ｌの三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処
理した。この培地にエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２
５）を植菌し、３７℃で１５時間培養を行った後、この
培養液２ｍｌを採り、新たに上記培地１００ｍｌに接種
し、再度３７℃で４時間培養を行なった。
【００４９】培養終了後、この培養液全量を遠心分離
（８，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）して集菌し、菌
体を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５０ｍｌに懸濁した。次にリゾチ
ウムを最終濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように添加し、５
分間静置後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を６ｍ
ｌ添加し、６５℃で３０分間保温し、溶菌した。この溶
菌液に、５ＭＮａＣｌ溶液１５ｍｌを添加し、０℃で１
時間冷却し、全量を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、６０
分間、４℃）し、上清画分を分取し、２倍量のエタノー
ルを加え、混合後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分
間、４℃）した。得られた沈澱物を１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液で溶
解させ、フェノール処理（除タンパク処理）およびＲＮ
Ａ分解酵素によりプラスミドを抽出し〔Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、（１９８２）ｐ．１３０〜１４
０参照〕、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄ IIIで切断し、分子量をアガロースゲル電気泳動
を用いて調べたところ、プラスミドｐＢＲ３２２のＨｉ
ｎｄIII 及びＢａｍＨＩ部位に約３．２ｋｂのＤＮＡの
挿入がみられた（以下このプラスミドをｐＢＲ３２２ｔ
ｎａと称する）。
（８，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）して集菌し、菌
体を５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５０ｍｌに懸濁した。次にリゾチ
ウムを最終濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように添加し、５
分間静置後、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を６ｍ
ｌ添加し、６５℃で３０分間保温し、溶菌した。この溶
菌液に、５ＭＮａＣｌ溶液１５ｍｌを添加し、０℃で１
時間冷却し、全量を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、６０
分間、４℃）し、上清画分を分取し、２倍量のエタノー
ルを加え、混合後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分
間、４℃）した。得られた沈澱物を１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液で溶
解させ、フェノール処理（除タンパク処理）およびＲＮ
Ａ分解酵素によりプラスミドを抽出し〔Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、（１９８２）ｐ．１３０〜１４
０参照〕、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨ
ｉｎｄ IIIで切断し、分子量をアガロースゲル電気泳動
を用いて調べたところ、プラスミドｐＢＲ３２２のＨｉ
ｎｄIII 及びＢａｍＨＩ部位に約３．２ｋｂのＤＮＡの
挿入がみられた（以下このプラスミドをｐＢＲ３２２ｔ
ｎａと称する）。
【００５０】得られたｐＢＲ３２２ｔｎａを制限酵素Ａ
ｌｕＩとＲｓａＩで３７℃で１時間切断し、トリプトフ
ァナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含む長
さが約６３０ｂｐの画分を得た。さらに、この断片にＢ
ａｍＨＩリンカーを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合
させて、両末端にＢａｍＨＩ部位を持つトリプトファナ
ーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含む画分
（Ｐ断片）を得た。
ｌｕＩとＲｓａＩで３７℃で１時間切断し、トリプトフ
ァナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含む長
さが約６３０ｂｐの画分を得た。さらに、この断片にＢ
ａｍＨＩリンカーを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合
させて、両末端にＢａｍＨＩ部位を持つトリプトファナ
ーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣを含む画分
（Ｐ断片）を得た。
【００５１】（３）目的プラスミドの造成 （Ａ）プラスミドｐＢＲ３２２Ｐｔｎａ−ｔｒｐの調製 まず、上記（１）項と（２）項で得たＤＮＡ画分を、そ
れぞれプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳａｌＩ
部位及びＢａｍＨＩ部位に常法に従い挿入した。次ぎ
に、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄII
I により部分切断を行い、トリプトファナーゼプロモー
ター及び調節遺伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシン
ターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）を含むＤＮＡ
画分を切り出した。このＤＮＡ画分を、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部位に常法に従
い挿入し、トリプトファナーゼプロモーター及び調節遺
伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシンターゼ構造遺伝
子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）とプラスミドｐＢＲ３２２を
含むプラスミドを得た（以下このプラスミドをｐＢＲ３
２２Ｐｔｎａ−ｔｒｐと称する）。
れぞれプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳａｌＩ
部位及びＢａｍＨＩ部位に常法に従い挿入した。次ぎ
に、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄII
I により部分切断を行い、トリプトファナーゼプロモー
ター及び調節遺伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシン
ターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）を含むＤＮＡ
画分を切り出した。このＤＮＡ画分を、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII 部位に常法に従
い挿入し、トリプトファナーゼプロモーター及び調節遺
伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシンターゼ構造遺伝
子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）とプラスミドｐＢＲ３２２を
含むプラスミドを得た（以下このプラスミドをｐＢＲ３
２２Ｐｔｎａ−ｔｒｐと称する）。
【００５２】（Ｂ）目的プラスミドの造成 まず上記（Ａ）項で得たプラスミドｐＢＲ３２２Ｐｔｎ
ａ−ｔｒｐをＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで切断し、トリプ
トファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ並び
にトリプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔ
ｒｐＢ）を含むＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２とから成るＤ
ＮＡ断片を含むＤＮＡ断片で断片の一方がＥｃｏＲＩ切
断末端、他方が平滑末端をもつ断片（Ｐ＋Ｔ＋Ｓ断片）
を得た。
ａ−ｔｒｐをＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで切断し、トリプ
トファナーゼプロモーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ並び
にトリプトファンシンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔ
ｒｐＢ）を含むＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２とから成るＤ
ＮＡ断片を含むＤＮＡ断片で断片の一方がＥｃｏＲＩ切
断末端、他方が平滑末端をもつ断片（Ｐ＋Ｔ＋Ｓ断片）
を得た。
【００５３】また、プラスミドｐＢＲ３２２Ｐｔｎａ−
ｔｒｐを制限酵素ＳｐｈＩでトリプトファナーゼプロモ
ーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシ
ンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）断片及びｐ
ＢＲ３２２の一部分を含む大きさが約６．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片を切り出し、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡポリメラ
ーゼで３７℃、５分間反応させ、７０℃で５分間失活処
理後、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、末端平
滑化された該ＤＮＡ断片を含む画分を得た。
ｔｒｐを制限酵素ＳｐｈＩでトリプトファナーゼプロモ
ーター及び調節遺伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシ
ンターゼ構造遺伝子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）断片及びｐ
ＢＲ３２２の一部分を含む大きさが約６．６ｋｂのＤＮ
Ａ断片を切り出し、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡポリメラ
ーゼで３７℃、５分間反応させ、７０℃で５分間失活処
理後、フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、末端平
滑化された該ＤＮＡ断片を含む画分を得た。
【００５４】次にこのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断し、トリプトファナーゼプロモーター及び調節遺
伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシンターゼ構造遺伝
子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）のみを含む大きさが約２．７
ｋｂのＤＮＡ断片で、断片の一方がＥｃｏＲＩ切断末
端、他方が平滑末端をもつＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）を
得た。
で切断し、トリプトファナーゼプロモーター及び調節遺
伝子ｔｎａＣ並びにトリプトファンシンターゼ構造遺伝
子（ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ）のみを含む大きさが約２．７
ｋｂのＤＮＡ断片で、断片の一方がＥｃｏＲＩ切断末
端、他方が平滑末端をもつＤＮＡ断片（Ｐ＋Ｔ断片）を
得た。
【００５５】上記のＰ＋Ｔ＋Ｓ断片とＰ＋Ｔ断片につい
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃、１５時間反応
させることによりＤＮＡの結合を行ない、目的とするプ
ラスミドを作製した。 （４）プラスミドｐＭＴＹ２１によるエシエリヒア・コ
リＫ１２系株の形質転換エシエリヒア・コリＫ１２系株
（ＡＴＣＣ２７３２５）から常法〔分子生物学実験マニ
ュアル（１９８４）講談社〕に従いトリプトファナーゼ
欠損変異株を採取し、これを宿主として上記（３）項で
調製したプラスミドＤＮＡを用いて常法に従って形質転
換させ形質転換株を得た。この菌株を常法に従い液体培
養し、該培養液よりプラスミドを分離精製し、このプラ
スミドをｐＭＴＹ２１と命名した。
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃、１５時間反応
させることによりＤＮＡの結合を行ない、目的とするプ
ラスミドを作製した。 （４）プラスミドｐＭＴＹ２１によるエシエリヒア・コ
リＫ１２系株の形質転換エシエリヒア・コリＫ１２系株
（ＡＴＣＣ２７３２５）から常法〔分子生物学実験マニ
ュアル（１９８４）講談社〕に従いトリプトファナーゼ
欠損変異株を採取し、これを宿主として上記（３）項で
調製したプラスミドＤＮＡを用いて常法に従って形質転
換させ形質転換株を得た。この菌株を常法に従い液体培
養し、該培養液よりプラスミドを分離精製し、このプラ
スミドをｐＭＴＹ２１と命名した。
【００５６】このプラスミドｐＭＴＹ２１を各種の制限
酵素で分解し、認識部位数及び分解断片の大きさを測定
した。その結果は前記表１に示したとおりであった。ま
た、プラスミドｐＭＴＹ２１の制限酵素切断点地図を図
１に示した。このプラスミドｐＭＴＹ２１を保持する形
質転換株エシエリヒア・コリＹＫ２０１８は、茨城県つ
くば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術研
究所に、受託番号：微工研菌寄第１２２３１号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２２３１）として寄託されている。
酵素で分解し、認識部位数及び分解断片の大きさを測定
した。その結果は前記表１に示したとおりであった。ま
た、プラスミドｐＭＴＹ２１の制限酵素切断点地図を図
１に示した。このプラスミドｐＭＴＹ２１を保持する形
質転換株エシエリヒア・コリＹＫ２０１８は、茨城県つ
くば市東１丁目１番３号の工業技術院微生物工業技術研
究所に、受託番号：微工研菌寄第１２２３１号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２２３１）として寄託されている。
【００５７】実施例２：形質転換株エシエリヒア・コリ
ＹＫ２０１８のトリプトファンシンターゼ活性の測定 前記Ｌ培地（炭素源としてグルコース１ｇ／リットルの
かわりにコハク酸２ｇ／リットルを含有）１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分
間滅菌処理した後、実施例２で得た形質転換株エシエリ
ヒア・コリＹＫ２０１８ (ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３１）
又はその親株エシエリヒア・コリＫ−１２系株（ＡＴＣ
Ｃ２７３２５）を植菌し、３７℃にて１日振盪培養後、
同様に調製した培地にトリプトファンを５０ｍｇ添加及
び無添加した培地に５ｍｌ接種し、同じく３７℃にて８
時間振盪培養した。該培養液を遠心分離することにより
菌体を集菌し、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
５０ｍｌにて洗浄し、再び遠心分離を行い集菌後、湿菌
体を２００ｍｇ採取し、１ｍｌの１００ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．０）に懸濁し超音波処理を行なった。
ＹＫ２０１８のトリプトファンシンターゼ活性の測定 前記Ｌ培地（炭素源としてグルコース１ｇ／リットルの
かわりにコハク酸２ｇ／リットルを含有）１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分
間滅菌処理した後、実施例２で得た形質転換株エシエリ
ヒア・コリＹＫ２０１８ (ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３１）
又はその親株エシエリヒア・コリＫ−１２系株（ＡＴＣ
Ｃ２７３２５）を植菌し、３７℃にて１日振盪培養後、
同様に調製した培地にトリプトファンを５０ｍｇ添加及
び無添加した培地に５ｍｌ接種し、同じく３７℃にて８
時間振盪培養した。該培養液を遠心分離することにより
菌体を集菌し、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
５０ｍｌにて洗浄し、再び遠心分離を行い集菌後、湿菌
体を２００ｍｇ採取し、１ｍｌの１００ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８．０）に懸濁し超音波処理を行なった。
【００５８】処理後の菌体破砕物を適当に１００ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈して常法〔Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ，Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６２），ｖｏ
ｌ ５，ｐ７９４〜８０６参照〕に従い残存するインド
ールを定量した。その結果を下記表２に示した。
リス緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈して常法〔Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ，Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６２），ｖｏ
ｌ ５，ｐ７９４〜８０６参照〕に従い残存するインド
ールを定量した。その結果を下記表２に示した。
【００５９】 表 ２ トリプトファンシンターゼ活性（Ｕｎｉｔ* ） 菌 株 トリプトファン添加 トリプトファン無添加 ATCC27325 ＜１ ３ YK2018 ２５０ ４ ＊１ Unit ＝１μmole生成インドール量／１時間
【００６０】実施例３ Ｌ−トリプトファンの製造 実施例２で調製したＬ培地１００ｍｌを５００ｍｌ用三
角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理した
ものに前記実施例２で得た形質転換株エシエリヒア・コ
リＹＫ２０１８ (ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３１）又はその
親株エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２
５）を植菌し３７℃にて１日振盪培養後、同様にして調
製した培地５０ｍｌを容三角フラスコに分注し、１２０
℃で１５分間滅菌処理したものにトリプトファンを５０
ｍｇ添加した培地に２ｍｌ接種し、同じく３７℃にて５
時間振盪培養した。遠心分離を用いて菌体を回収し、こ
れをインドール２．５ｇ、ＤＬ−セリン１０．０ｇおよ
びピリドキサールリン酸０．５ｍｇを含む１００ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．８）５０ｍｌに懸濁し振盪しなが
ら３７℃で２４時間反応を行なった。
角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理した
ものに前記実施例２で得た形質転換株エシエリヒア・コ
リＹＫ２０１８ (ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３１）又はその
親株エシエリヒア・コリＫ１２系株（ＡＴＣＣ２７３２
５）を植菌し３７℃にて１日振盪培養後、同様にして調
製した培地５０ｍｌを容三角フラスコに分注し、１２０
℃で１５分間滅菌処理したものにトリプトファンを５０
ｍｇ添加した培地に２ｍｌ接種し、同じく３７℃にて５
時間振盪培養した。遠心分離を用いて菌体を回収し、こ
れをインドール２．５ｇ、ＤＬ−セリン１０．０ｇおよ
びピリドキサールリン酸０．５ｍｇを含む１００ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．８）５０ｍｌに懸濁し振盪しなが
ら３７℃で２４時間反応を行なった。
【００６１】反応終了物を水で１０倍に希釈したのち遠
心分離により得た上澄液について高速液体クロマトグラ
フィーで生成したＬ−トリプトファンの分析を行なっ
た。また、反応終了後５０ｍｌの１０倍希釈液５００ｍ
ｌをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオン
ＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプ
トファンの粗結晶を析出させたのち、これをアセトンで
洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶重量を測定し
た。
心分離により得た上澄液について高速液体クロマトグラ
フィーで生成したＬ−トリプトファンの分析を行なっ
た。また、反応終了後５０ｍｌの１０倍希釈液５００ｍ
ｌをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオン
ＳＫ−１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプ
トファンの粗結晶を析出させたのち、これをアセトンで
洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶重量を測定し
た。
【００６２】その結果を下記表３に示した。 表 ３ Ｌ−トリプトファン Ｌ−トリプトファン菌 株 生成量（ｇ／リットル） 結晶重量（ｇ） ATCC27325 ＜０．１ ＜０．１ YK2018 ３．９ １．４
【図１】本発明のプラスミドｐＭＴＹ２１の制限酵素切
断点地図である。
断点地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (3)
- 【請求項１】 トリプトファナーゼオペロン中のプロモ
ーター及び該プロモーターの下流に位置する調節遺伝子
ｔｎａＣを含むＤＮＡ断片と、該ＤＮＡ断片の下流に結
合したトリプトファンオペロン由来のトリプトファンシ
ンターゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片とから成るＤＮＡ
断片の少なくとも２個と、ＣｏｌＥ１系プラスミド由来
の自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片から成るこ
とを特徴とする組換えプラスミド。 - 【請求項２】 プラスミドｐＭＴＹ２１である請求項１
記載の組換えプラスミド。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の組換えプラスミ
ドで形質転換されたエシエリヒア・コリＫ１２系微生
物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25626591A JPH0595788A (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | 組換えプラスミド及びそれを含む微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25626591A JPH0595788A (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | 組換えプラスミド及びそれを含む微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595788A true JPH0595788A (ja) | 1993-04-20 |
Family
ID=17290247
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25626591A Pending JPH0595788A (ja) | 1991-10-03 | 1991-10-03 | 組換えプラスミド及びそれを含む微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0595788A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913642A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-30 | 天津科技大学 | 大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产l-色氨酸与l-缬氨酸的用途 |
-
1991
- 1991-10-03 JP JP25626591A patent/JPH0595788A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913642A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-11-30 | 天津科技大学 | 大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产l-色氨酸与l-缬氨酸的用途 |
| CN108913642B (zh) * | 2018-07-27 | 2021-08-24 | 天津科技大学 | 大肠杆菌基因工程菌及其发酵同步生产l-色氨酸与l-缬氨酸的用途 |
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