JPH03295466A - 免疫分析要素および免疫分析方法 - Google Patents
免疫分析要素および免疫分析方法Info
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- JPH03295466A JPH03295466A JP2096499A JP9649990A JPH03295466A JP H03295466 A JPH03295466 A JP H03295466A JP 2096499 A JP2096499 A JP 2096499A JP 9649990 A JP9649990 A JP 9649990A JP H03295466 A JPH03295466 A JP H03295466A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は均一系酵素免疫測定法を適用した乾式免疫分析
要素及びそれを用いた免疫分析方法に関するものである
。
要素及びそれを用いた免疫分析方法に関するものである
。
（発明の背景）
血液や尿などの体液に含まれる生体成分、薬物等の分析
は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、
臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。このよう
な微量成分（リガンド）の分析方法として、酵素免疫分
析方法（エンザイムイムノアッセイ）がある。酵素免疫
分析方法には、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均−系とＢ／Ｆ分
離が不要な均一系がある。均一系反応は抗体と抗原（リ
ガンド）が結合すると標識酵素の酵素活性が何らかの干
渉を受けることに基づくもので、−Ｍには抗原抗体結合
による阻害作用を利用する。大分子である抗体が酵素標
識抗原中の抗原に結合することにより、酵素の基質に対
する結合が立体障害を受けたり、或いは酵素の立体構造
が変化するために、酵素活性が抑制されるものと考えら
れている。
は、病態の診断や治療経過の判定に非常に有用であり、
臨床検査の分野で重要な役割を果たしている。このよう
な微量成分（リガンド）の分析方法として、酵素免疫分
析方法（エンザイムイムノアッセイ）がある。酵素免疫
分析方法には、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均−系とＢ／Ｆ分
離が不要な均一系がある。均一系反応は抗体と抗原（リ
ガンド）が結合すると標識酵素の酵素活性が何らかの干
渉を受けることに基づくもので、−Ｍには抗原抗体結合
による阻害作用を利用する。大分子である抗体が酵素標
識抗原中の抗原に結合することにより、酵素の基質に対
する結合が立体障害を受けたり、或いは酵素の立体構造
が変化するために、酵素活性が抑制されるものと考えら
れている。
一方、多数の検体試料を取扱いルーティン化している臨
床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操作化もてきる
ことが望まれ、このような観点から、乾式分析要素が提
案されている（例えば特開昭４９−５３８８８、同５９
−７７３５６、同５９−１０２３８８、米国特許４．４
５９，３５８ ）。
床検査では、簡便、迅速に分析でき自動操作化もてきる
ことが望まれ、このような観点から、乾式分析要素が提
案されている（例えば特開昭４９−５３８８８、同５９
−７７３５６、同５９−１０２３８８、米国特許４．４
５９，３５８ ）。
均一系酵素免疫反応を適用した乾式分析要素は知られて
いる（特開平１−３２１３６０）。これはＦＡ＋高分子
化抗原（リガンドまたはその誘導体と高分子化合物との
結合物）、 （Ｂ）水不溶性の高分子基質、 （ｃ） リガンドに対する抗体と、基質に対する酵素
との結合物、 の３つを多層分析要素の同−眉或いは別々の層に含有さ
せたものである。分析要素に点着し供給された抗原は、
高分子化抗原と競争して、抗体−酵素結合物に結合する
。この抗原−抗体一酵累複合体は、水不溶性高分子基質
に反応して、可溶性の低分子生成物を生成する。一方、
高分子化抗原と結合してできた高分子抗原−抗体−酵素
複合体は、高分子基質に対して酵素活性を示すことがて
きない。従って検体中の抗原量が増えるに従って、酵素
反応生成物は増えることになる。この生成物を検出層に
移行させて、その量をその有色化学基が与える吸収の光
学濃度を測定することにより、検体中の抗原量を分析す
る。
いる（特開平１−３２１３６０）。これはＦＡ＋高分子
化抗原（リガンドまたはその誘導体と高分子化合物との
結合物）、 （Ｂ）水不溶性の高分子基質、 （ｃ） リガンドに対する抗体と、基質に対する酵素
との結合物、 の３つを多層分析要素の同−眉或いは別々の層に含有さ
せたものである。分析要素に点着し供給された抗原は、
高分子化抗原と競争して、抗体−酵素結合物に結合する
。この抗原−抗体一酵累複合体は、水不溶性高分子基質
に反応して、可溶性の低分子生成物を生成する。一方、
高分子化抗原と結合してできた高分子抗原−抗体−酵素
複合体は、高分子基質に対して酵素活性を示すことがて
きない。従って検体中の抗原量が増えるに従って、酵素
反応生成物は増えることになる。この生成物を検出層に
移行させて、その量をその有色化学基が与える吸収の光
学濃度を測定することにより、検体中の抗原量を分析す
る。
しかし、この分析要素では、ダイ・スターチのような予
め色素を結合させた高分子基質を用いて、酵素（アミラ
ーゼ）による分解生成物であるアミロースについている
色素（グイ）を測定するので、高分子基質と反応生成物
とは分離して測定しなければならない。そのため未反応
基質を含有する試薬層と、反応生成物を受容する検出層
の間には酸化チタン粒子等を含む光遮蔽層を設けている
。このような層構成の分析要素では、試薬層で生成され
た可溶性反応生成物が、光遮蔽層を経て検出層に十分拡
散するまでの時間を考慮しなければならず、乾式化学分
析の特徴である迅速な定量には好ましくない。
め色素を結合させた高分子基質を用いて、酵素（アミラ
ーゼ）による分解生成物であるアミロースについている
色素（グイ）を測定するので、高分子基質と反応生成物
とは分離して測定しなければならない。そのため未反応
基質を含有する試薬層と、反応生成物を受容する検出層
の間には酸化チタン粒子等を含む光遮蔽層を設けている
。このような層構成の分析要素では、試薬層で生成され
た可溶性反応生成物が、光遮蔽層を経て検出層に十分拡
散するまでの時間を考慮しなければならず、乾式化学分
析の特徴である迅速な定量には好ましくない。
反応生成物の拡散を早めるために、予め基質にカルボキ
シル基やスルホ基のような親水性基を導入しておいて、
反応生成物の拡散性を上げることも考えられる。しかし
、これらの置換基を導入し得る位置は限られており、ま
たその導入により、分析の感度を支配する色素部位の分
子吸光係数を低下させるという新たな不都合が生じるこ
とになる。
シル基やスルホ基のような親水性基を導入しておいて、
反応生成物の拡散性を上げることも考えられる。しかし
、これらの置換基を導入し得る位置は限られており、ま
たその導入により、分析の感度を支配する色素部位の分
子吸光係数を低下させるという新たな不都合が生じるこ
とになる。
（発明の目的）
本発明は、以上のような事情に鑑みなされたものであり
、簡便な操作で高感度にかつ迅速な分析が出来る、１句
−系酵素免疫反応を適用した免疫分析要素を提供するこ
とを目的とする。
、簡便な操作で高感度にかつ迅速な分析が出来る、１句
−系酵素免疫反応を適用した免疫分析要素を提供するこ
とを目的とする。
また本発明は、その分析要素を用いる方法を提供するこ
とも目的とする。
とも目的とする。
（発明の構成）
このような本発明の目的は、リガンドと、リガンドと高
分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応に
より生じた酵素活性の変化を測定することによりリガン
ド量を分析する免疫分析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物
にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えることを
特徴とする免疫分析要素により達成することができる。
分子化合物との結合物と、酵素標識抗体との間の反応に
より生じた酵素活性の変化を測定することによりリガン
ド量を分析する免疫分析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物
にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えることを
特徴とする免疫分析要素により達成することができる。
リガンドと高分子化合物との結合物（すなわち高分子化
抗原）と酵素標識抗体とは、基質層或いは基質層の上に
積層された別の層に予め含有させておくこともできる。
抗原）と酵素標識抗体とは、基質層或いは基質層の上に
積層された別の層に予め含有させておくこともできる。
（作用）
高分子化抗原と結合した酵素標識抗体の酵素は、立体障
害により、非拡散性基質に対する酵素活性が干渉される
。検体中の抗原（リガンド）が結合した酵素標識抗体の
酵素は、非拡散性基質に対する酵素活性は影響されない
。従って、検体中の抗原量に応じた拡散性の反応生成物
が生成される。基質層で生じた拡散性物質は、速やかに
試薬層に移行し、ここでさらに低分子物質に分解される
。この低分子物質を試薬層内で又は次の検出層で検出す
る。未反応の非拡散性基質は基質層に留まる。
害により、非拡散性基質に対する酵素活性が干渉される
。検体中の抗原（リガンド）が結合した酵素標識抗体の
酵素は、非拡散性基質に対する酵素活性は影響されない
。従って、検体中の抗原量に応じた拡散性の反応生成物
が生成される。基質層で生じた拡散性物質は、速やかに
試薬層に移行し、ここでさらに低分子物質に分解される
。この低分子物質を試薬層内で又は次の検出層で検出す
る。未反応の非拡散性基質は基質層に留まる。
（発明の構成の詳細な説明）
析 その層 成
第１図に本発明の免疫分析要素の一実施態様を示す。
この図において符号１０は光透過性支持体であり、その
上には試薬層１２、基質層１４が積層されている。
上には試薬層１２、基質層１４が積層されている。
基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗体に標識とし
て結合された酵素の基質である非拡散性基質を含有する
。この基質は測定対象であるリガンド（抗原）の量に応
じて生成される、抗原−抗体−酵素複合体の存在下で拡
散性物質を生成する。
て結合された酵素の基質である非拡散性基質を含有する
。この基質は測定対象であるリガンド（抗原）の量に応
じて生成される、抗原−抗体−酵素複合体の存在下で拡
散性物質を生成する。
試薬層１２は、水浸透性層で構成され、基質層から拡散
・移行して来た拡散性物質をさらに低分子量の生成物に
する低分子化酵素を含有する。基質層１２はまたこの低
分子生成物を検出するための試薬組成物を含有する。
・移行して来た拡散性物質をさらに低分子量の生成物に
する低分子化酵素を含有する。基質層１２はまたこの低
分子生成物を検出するための試薬組成物を含有する。
瀝足対１
本発明の測定対象は検体に含まれる抗原決定基を有する
リガンドである。
リガンドである。
検体の種類は限定されないが、例えば血液（全血、血漿
、血清）リンパ液、尿などがある。血球などの浮遊物が
ある場合には予め除去しておくのが好ましい。ただし適
当な濾過層を分析要素の最上層に設けた場合にはそのま
ま分析要素に点着・供給してもよい。
、血清）リンパ液、尿などがある。血球などの浮遊物が
ある場合には予め除去しておくのが好ましい。ただし適
当な濾過層を分析要素の最上層に設けた場合にはそのま
ま分析要素に点着・供給してもよい。
リガンドは抗原性があってその抗体を用意できるもので
あれば、本発明の分析要素で分析できる。例えば、ジゴ
キシン、テオフィリン、フエノバルビタール、フェニト
イン、ペニシリン、アミカシン等の薬物の誘導体（例え
ば薬物と蛋白等の生体物質との結合物）、プロスタグラ
ンジン、テストステロン、プロゲステロン、チロキシン
等のホルモン等を挙げることができる。
あれば、本発明の分析要素で分析できる。例えば、ジゴ
キシン、テオフィリン、フエノバルビタール、フェニト
イン、ペニシリン、アミカシン等の薬物の誘導体（例え
ば薬物と蛋白等の生体物質との結合物）、プロスタグラ
ンジン、テストステロン、プロゲステロン、チロキシン
等のホルモン等を挙げることができる。
本発明の分析要素では、リガンド（抗原）と高分子化抗
原との酵素標識抗体への競争的結合反応を利用する。従
ってリガンドは酵素活性にあまり影響を与えない程度の
大きさ、すなわち低分子量のものが好ましい。例えば分
子量２万ダルトン以下のリガンドの分析に本発明の分析
要素は威力を発揮する。
原との酵素標識抗体への競争的結合反応を利用する。従
ってリガンドは酵素活性にあまり影響を与えない程度の
大きさ、すなわち低分子量のものが好ましい。例えば分
子量２万ダルトン以下のリガンドの分析に本発明の分析
要素は威力を発揮する。
ｌ立ヱ止五月
高分子化抗原、即ちリガンドと高分子化合物との結合物
は、抗体と結合することにより、その抗体を標識する酵
素の活性を抑制するものである。
は、抗体と結合することにより、その抗体を標識する酵
素の活性を抑制するものである。
高分子化合物の分子量は分子量５万ダルトン以上のもの
で、かつ水溶性のものが好ましい。このような高分子化
合物として、ゼラチン、ヘモシアニンやフェリチン等の
蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙げることがで
きる。これらはリガンドと結合した状態で前述の条件を
備えていれば十分であり、例えば牛血清アルブミンのよ
うな比較的低分子量のものであっても、それを多量体に
自家重合させるなどして高分子化したものでもよい。
で、かつ水溶性のものが好ましい。このような高分子化
合物として、ゼラチン、ヘモシアニンやフェリチン等の
蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙げることがで
きる。これらはリガンドと結合した状態で前述の条件を
備えていれば十分であり、例えば牛血清アルブミンのよ
うな比較的低分子量のものであっても、それを多量体に
自家重合させるなどして高分子化したものでもよい。
リガンドと高分子化合物との結合方法は双方の官能基を
考慮して決定することができる。官能基は、アミノ基、
カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミグゾール基
、フェニル基などを利用することかできる。例えばアミ
ノ基相互間を結合する方法は、イソシアネート法、グル
タルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノ
ン法等数多く知られている。アミノ基とカルボキシル基
とを結合する方法としては、カルボキシル基をサクシニ
ルイミドエステル化する方法の化カルボジイミド法、ウ
ッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と糖鎖を
架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）も適用で
きる。チオール基を利用する場合には、例えば一方の側
のカルボキシル基をサクシニルイミドエステル化してこ
れにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋剤を用いて双方を結合することが
できる、フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法
、アルキル化法などがある。結合方法はこれらの例に限
られるものではなく、この他例えばｒＭｅｔｈｏｄ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ」Ｖｏｌ、 ｌ （ｃ，Ａ、 Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ、 Ｍ、 Ｗ、 Ｃｈａｓｅ、 Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ１９６７年）あるいは石川、河井、宮
井 編、「酵素免疫測定法」 （医学書院、１９７８年
発行）等の成書に記載されている方法の中から適宜選択
して利用することができる。リガンドと高分子化合物と
の結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意の比率と
することができるのはいうまでもない。結合反応後は、
ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー等により精
製し、必要により凍結乾燥法等により乾燥する。
考慮して決定することができる。官能基は、アミノ基、
カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミグゾール基
、フェニル基などを利用することかできる。例えばアミ
ノ基相互間を結合する方法は、イソシアネート法、グル
タルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノ
ン法等数多く知られている。アミノ基とカルボキシル基
とを結合する方法としては、カルボキシル基をサクシニ
ルイミドエステル化する方法の化カルボジイミド法、ウ
ッドワード試薬法等が知られており、アミノ基と糖鎖を
架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）も適用で
きる。チオール基を利用する場合には、例えば一方の側
のカルボキシル基をサクシニルイミドエステル化してこ
れにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋剤を用いて双方を結合することが
できる、フェニル基を利用する方法としてはジアゾ化法
、アルキル化法などがある。結合方法はこれらの例に限
られるものではなく、この他例えばｒＭｅｔｈｏｄ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ」Ｖｏｌ、 ｌ （ｃ，Ａ、 Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ、 Ｍ、 Ｗ、 Ｃｈａｓｅ、 Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ１９６７年）あるいは石川、河井、宮
井 編、「酵素免疫測定法」 （医学書院、１９７８年
発行）等の成書に記載されている方法の中から適宜選択
して利用することができる。リガンドと高分子化合物と
の結合比は１：１に限らず、目的に応じて任意の比率と
することができるのはいうまでもない。結合反応後は、
ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー等により精
製し、必要により凍結乾燥法等により乾燥する。
また、リガンド自体を重合させて高分子化抗原としても
よい。その場合の重合方法は前述の結合方法に準じて行
なうことができ、例えばカルボジイミド、グルタルアル
デヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。
よい。その場合の重合方法は前述の結合方法に準じて行
なうことができ、例えばカルボジイミド、グルタルアル
デヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。
高分子化合物には、リガンドの代わりに、リガンドに対
する抗体と交差反応性を有するリガンド誘導体を結合さ
せてもよい。ここでいうリガンド誘導体とは、単に化学
構造上の類縁体のみならず、免疫反応性において、リガ
ンドと類似の挙動を示すものを指す。例えば、リガンド
であるテオフィリンに対する抗体がカフェインにも交差
反応する場合には、カフェインの誘導体も高分子化抗原
の材料として用いることができる。
する抗体と交差反応性を有するリガンド誘導体を結合さ
せてもよい。ここでいうリガンド誘導体とは、単に化学
構造上の類縁体のみならず、免疫反応性において、リガ
ンドと類似の挙動を示すものを指す。例えば、リガンド
であるテオフィリンに対する抗体がカフェインにも交差
反応する場合には、カフェインの誘導体も高分子化抗原
の材料として用いることができる。
なおリガンドまたはリガンド誘導体に高分子化合物と結
合させるための適当な官能基がない場合には、これらに
アミン基、カルボキシル基或いはチオール基等が導入し
てもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、高分
子化合物と結合し易くしてもよい。例えばリガンドがテ
オフィリンである場合には、カルボキシル基を導入した
８−プロとルカルボキシルテオフィリンを高分子化合物
に結合することができる。
合させるための適当な官能基がない場合には、これらに
アミン基、カルボキシル基或いはチオール基等が導入し
てもよい。その際にはスペーサーを介して導入し、高分
子化合物と結合し易くしてもよい。例えばリガンドがテ
オフィリンである場合には、カルボキシル基を導入した
８−プロとルカルボキシルテオフィリンを高分子化合物
に結合することができる。
鼎
酵素で標識される抗体は、被検物であるリガンドに対す
る特異抗体を用いる。高分子化抗原にリガンド誘導体を
用いる場合には、リガンドとリガンド誘導体に共通する
抗原決定基に反応するものを用いる。常法により得られ
る抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いれば、より
感度が向上する。またこの抗体はＦ（ａｂ’１２、Ｆａ
ｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントでもよい。
る特異抗体を用いる。高分子化抗原にリガンド誘導体を
用いる場合には、リガンドとリガンド誘導体に共通する
抗原決定基に反応するものを用いる。常法により得られ
る抗体でよいが、モノクローナル抗体を用いれば、より
感度が向上する。またこの抗体はＦ（ａｂ’１２、Ｆａ
ｂ’ 、 Ｆａｂなどのフラグメントでもよい。
酵素〜 拡散 基 −化酵、
抗体に標識として結合された酵素は、高分子からなる非
拡散性基質を分解して、低分子化酵素によりさらに低分
子の生成物を生じるような拡散性生成物を生成する。
拡散性基質を分解して、低分子化酵素によりさらに低分
子の生成物を生じるような拡散性生成物を生成する。
非拡散性基質は、水性検体液に対して非拡散性でそれ自
体は試薬層に拡散しない。
体は試薬層に拡散しない。
低分子化酵素は、抗体に標識として結合された酵素によ
り、非拡散性基質より生成した拡散性生成物を、さらに
検出可能な低分子生成物にするものであり、本発明の分
析要素の試薬層に含有される。
り、非拡散性基質より生成した拡散性生成物を、さらに
検出可能な低分子生成物にするものであり、本発明の分
析要素の試薬層に含有される。
これらの組合わせは、酵素が非拡散性基質に作用して拡
散性物質を生成し、さらにこの拡散性生成物が、後記低
分子化酵素によりさらに低分子の生成物を生じて容易に
検出できるような組合わせから選ぶことができる。
散性物質を生成し、さらにこの拡散性生成物が、後記低
分子化酵素によりさらに低分子の生成物を生じて容易に
検出できるような組合わせから選ぶことができる。
区！
このような酵素としては重合体からなる非拡散性基質か
ら拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があり、
例えば、糖質加水分解酵素を挙げることかできる。この
ような糖質加水分解酵素として、α−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、デキストラナーゼ等がある。その他の加水
分解酵素としては、セルラーゼ、コラゲナーゼ、マンナ
ーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ等がある。
ら拡散性オリゴマーを生成するような分解酵素があり、
例えば、糖質加水分解酵素を挙げることかできる。この
ような糖質加水分解酵素として、α−アミラーゼ、β−
アミラーゼ、デキストラナーゼ等がある。その他の加水
分解酵素としては、セルラーゼ、コラゲナーゼ、マンナ
ーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ等がある。
酵素と抗体との結合は前記した高分子化合物と抗原との
結合方法と同様に行なう。
結合方法と同様に行なう。
これらの酵素はいずれの検体中に存在する妨害因子で影
響されないものが好ましく、また検体中には競合する同
種の酵素がないことが好ましい。
響されないものが好ましく、また検体中には競合する同
種の酵素がないことが好ましい。
ただし、標識酵素を同種の酵素が検体中に含まれている
場合には、この酵素阻害剤を用いてもよい。この酵素阻
害剤は、検体中の酵素を阻害する程度が標識酵素の活性
を阻害する程度より大きいものであればよい。酵素阻害
剤は検体中の酵素を完全に失活させるが、標識酵素を全
く阻害しないものが最も好ましい。しかし実用上は単に
測定時においてブランク値を上昇させなければよく、測
定後には酵素阻害剤が失活するなどして検体中の酵素活
性が回復しても構わない。なお酵素阻害剤は、酵素標識
抗体の酵素を阻害しないものであればよく、遊離状態の
酵素を阻害することば構わない。この酵素阻害剤は、公
知の酵素阻害剤から上記のような特異性を持つものを選
んで用いればよい。或いは検体中の問題となる酵素に対
する抗体を作って、これを酵素阻害剤として用いてもよ
い。
場合には、この酵素阻害剤を用いてもよい。この酵素阻
害剤は、検体中の酵素を阻害する程度が標識酵素の活性
を阻害する程度より大きいものであればよい。酵素阻害
剤は検体中の酵素を完全に失活させるが、標識酵素を全
く阻害しないものが最も好ましい。しかし実用上は単に
測定時においてブランク値を上昇させなければよく、測
定後には酵素阻害剤が失活するなどして検体中の酵素活
性が回復しても構わない。なお酵素阻害剤は、酵素標識
抗体の酵素を阻害しないものであればよく、遊離状態の
酵素を阻害することば構わない。この酵素阻害剤は、公
知の酵素阻害剤から上記のような特異性を持つものを選
んで用いればよい。或いは検体中の問題となる酵素に対
する抗体を作って、これを酵素阻害剤として用いてもよ
い。
非皿１先買
前述のα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナ
ーゼ等に対する基質の例として、カルボキシメチル化澱
粉、澱粉、アミロース、アミロペクチン等がある。
ーゼ等に対する基質の例として、カルボキシメチル化澱
粉、澱粉、アミロース、アミロペクチン等がある。
酵素標識抗体の酵素としてα−アミラーゼ、低分子化酵
素として後述するグルコアミラーゼ又はα−グルコシダ
ーゼを用いる場合には、非還元末端グルコースをカルボ
キシルメチル基で修飾したオリゴサツカライド誘導体（
′特開昭５９−３１６９９）やアミロース誘導体（特開
昭５９−３９３００． Ｃ１ｉｎＣ１１ｎｉｃａＣｈｉ
Ａｃｔａ、１３８．ｐ２１−２９（１９８４１）を用
いてもよい。これらの修飾基質はα−アミラーゼの基質
とはなるが、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼ
の基質とはならない。
素として後述するグルコアミラーゼ又はα−グルコシダ
ーゼを用いる場合には、非還元末端グルコースをカルボ
キシルメチル基で修飾したオリゴサツカライド誘導体（
′特開昭５９−３１６９９）やアミロース誘導体（特開
昭５９−３９３００． Ｃ１ｉｎＣ１１ｎｉｃａＣｈｉ
Ａｃｔａ、１３８．ｐ２１−２９（１９８４１）を用
いてもよい。これらの修飾基質はα−アミラーゼの基質
とはなるが、グルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼ
の基質とはならない。
１立ヱ止皇１
この低分子化酵素は標識酵素と同じ種類の酵素であって
もよいにの場合には標識酵素は分子内部から切断してオ
リゴマーを生成するエンド（ｅｎｄｏ）活性の酵素であ
り、低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生成
するエクソ（ｅｘｏ）活性を持つものとするのが好まし
い。例えば、非拡散性基質が重合体（例えば澱粉）であ
る場合に、標識酵素により生成される拡散性オリゴマー
（例えばマルトース）を単量体（例えばグルコース）に
まで分解できるものが用いられる。このような低分子化
酵素の例として糖加水分解酵素、より具体的には、α−
アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ、グル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ等があげられる。
もよいにの場合には標識酵素は分子内部から切断してオ
リゴマーを生成するエンド（ｅｎｄｏ）活性の酵素であ
り、低分子化酵素は分子の端から作用して単量体を生成
するエクソ（ｅｘｏ）活性を持つものとするのが好まし
い。例えば、非拡散性基質が重合体（例えば澱粉）であ
る場合に、標識酵素により生成される拡散性オリゴマー
（例えばマルトース）を単量体（例えばグルコース）に
まで分解できるものが用いられる。このような低分子化
酵素の例として糖加水分解酵素、より具体的には、α−
アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラナーゼ、グル
コアミラーゼ、α−グルコシダーゼ等があげられる。
非拡散性基質と標識酵素として、カルボキシルメチルセ
ルロースとセルラーゼを用いた場合には、低分子化酵素
として０１エンザイムを用いることができる。また同様
にガラクタンとガラクタナーゼを用いた場合にはβ−ガ
ラクトシダーゼ、ＲＮＡとリボヌクレアーゼを用いた場
合にはエクソリボヌクレアーゼをそれぞれ低分子化酵素
として用いることができる。
ルロースとセルラーゼを用いた場合には、低分子化酵素
として０１エンザイムを用いることができる。また同様
にガラクタンとガラクタナーゼを用いた場合にはβ−ガ
ラクトシダーゼ、ＲＮＡとリボヌクレアーゼを用いた場
合にはエクソリボヌクレアーゼをそれぞれ低分子化酵素
として用いることができる。
これらの標識酵素、非拡散性基質、低分子化酵素の組合
せは、公知文献（例えば、「酵素ハンドブック」 （丸
尾文治、田宮信雄監修、朝食書店１９８２年発行）、「
生化学ハンドブック」 （井村伸正、他線、丸善１９８
４年発行）に記載された酵素、基質から選ぶことができ
る。
せは、公知文献（例えば、「酵素ハンドブック」 （丸
尾文治、田宮信雄監修、朝食書店１９８２年発行）、「
生化学ハンドブック」 （井村伸正、他線、丸善１９８
４年発行）に記載された酵素、基質から選ぶことができ
る。
試薬層において低分子化酵素により生成された低分子生
成物は、公知の検出系試薬により光学的に検出すること
ができる。
成物は、公知の検出系試薬により光学的に検出すること
ができる。
前記低分子化酵素により最終的に生成したグルコースを
検出する方法としては、例えば、グルコースをグルコー
スオキシダーゼ存在下に酸化し生成した過酸化水素を検
出する方法（例えばＡｎｎ。
検出する方法としては、例えば、グルコースをグルコー
スオキシダーゼ存在下に酸化し生成した過酸化水素を検
出する方法（例えばＡｎｎ。
Ｃ１１ｎ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、 旦、２４（１９６
４） 、 Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、。
４） 、 Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、。
２２、２４６ （１９６９）に記載のＴｒｉｎｄｅｒ試
薬、特開昭４９−５０９９１号（対応米国特許３．８８
６．０４５）、米国特許３，９９２．１５８号、特開昭
５５−１６４３５６号（対応米国特許４゜２９２、２７
２）等に記載のＴｒｉｎｄｅｒ試薬、特開昭５３−２６
１８８号（対応米国特許４．０８９．７４７）、特開昭
５８−４５５５７号等に記載のトリアリール置換イミダ
ゾールロイコ色素を含む試薬、特開昭５９−１９３３５
２号（′Ａ応欧州特許公開ＥＰ ０１２２６４１Ａ）、
特開昭６０−２２４６７７号（対応米国特許４゜６６５
．０２３ｊ等に記載のジアリール−モノアラルキル置換
イミダゾールロイコ色素を含む試薬を用いる方法）、グ
ルコースデヒドロゲナーゼとＮＡＤの存在下に生成する
ＮＡＤＨを検出する方法、またへキソキナーゼ存在下に
生成するグルコース−６−リン酸を検出する方法等、公
知の方法を用いることができる。これらの検出方法の中
で、グルコースオキシダーゼ存在下にグルコースを酸化
し生成した過酸化水素をペルオキシダーゼとロイコ色素
を用いて検出する方法が、感度の点で最も望ましい。
薬、特開昭４９−５０９９１号（対応米国特許３．８８
６．０４５）、米国特許３，９９２．１５８号、特開昭
５５−１６４３５６号（対応米国特許４゜２９２、２７
２）等に記載のＴｒｉｎｄｅｒ試薬、特開昭５３−２６
１８８号（対応米国特許４．０８９．７４７）、特開昭
５８−４５５５７号等に記載のトリアリール置換イミダ
ゾールロイコ色素を含む試薬、特開昭５９−１９３３５
２号（′Ａ応欧州特許公開ＥＰ ０１２２６４１Ａ）、
特開昭６０−２２４６７７号（対応米国特許４゜６６５
．０２３ｊ等に記載のジアリール−モノアラルキル置換
イミダゾールロイコ色素を含む試薬を用いる方法）、グ
ルコースデヒドロゲナーゼとＮＡＤの存在下に生成する
ＮＡＤＨを検出する方法、またへキソキナーゼ存在下に
生成するグルコース−６−リン酸を検出する方法等、公
知の方法を用いることができる。これらの検出方法の中
で、グルコースオキシダーゼ存在下にグルコースを酸化
し生成した過酸化水素をペルオキシダーゼとロイコ色素
を用いて検出する方法が、感度の点で最も望ましい。
これらの検出試薬は分析要素の試薬層に低分子化酵素と
一緒に含有させてもよいが、試薬層の下層に設けた別の
層（例えば第２試薬層又は検出層等）に含有させてこの
層で検出するようにしてもよい。なお、ロイコ色素を使
用する場合には、水非混和性溶媒の溶液の親水性バイン
ダー中への分散物とするのが生成した色素の安定性の上
で好ましい。
一緒に含有させてもよいが、試薬層の下層に設けた別の
層（例えば第２試薬層又は検出層等）に含有させてこの
層で検出するようにしてもよい。なお、ロイコ色素を使
用する場合には、水非混和性溶媒の溶液の親水性バイン
ダー中への分散物とするのが生成した色素の安定性の上
で好ましい。
（以下余白）
立上ｊｌＢ耐」１或
本発明の乾式免疫分析要素は、公知の多種の乾式分析要
素と同様の層構成とすることができる。
素と同様の層構成とすることができる。
要素は、基質層、試薬層の他、支持体、展開層、検出層
、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含
む多重層としてもよい。このような分析要素として、特
開昭４９−５３８８８号（対応米国特許３，９９２，１
５８） 、特開昭５１−４０１９１号（対応米国特許４
，０４２，３５３） 、及び特開昭５５−１６４３５６
号（対応米国特許４．２９２．２７２）の各明細書に開
示されたものがある。
、光遮蔽層、接着層、吸水層、下塗り層その他の層を含
む多重層としてもよい。このような分析要素として、特
開昭４９−５３８８８号（対応米国特許３，９９２，１
５８） 、特開昭５１−４０１９１号（対応米国特許４
，０４２，３５３） 、及び特開昭５５−１６４３５６
号（対応米国特許４．２９２．２７２）の各明細書に開
示されたものがある。
光透過性水不透過性支持体を用いる場合には、本発明の
乾式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を取り得
る。ただし本発明の内容はこれに限定はされない。
乾式免疫分析要素は、実用的に次のような構成を取り得
る。ただし本発明の内容はこれに限定はされない。
（１）支持体上に試薬層、その上に基質層を有するもの
。
。
（２）支持体上に検出層、試薬層、基質層をこの順に有
するもの。
するもの。
（３）支持体上に試薬層、光反射層、基質層をこの順に
有するもの。
有するもの。
（４）支持体上に検出層、試薬層、光反射層、基質層を
この順に有するもの。
この順に有するもの。
（５）支持体上に検出層、光反射層、試薬層、基質層を
この順に有するもの。
この順に有するもの。
（６）支持体上に第２試薬層、光反射層、第］試薬層、
基質層をこの順に有するもの。
基質層をこの順に有するもの。
（７）支持体上に検出層、第２試薬層、光反射層、第１
試薬層、基質層をこの順に有するもの。
試薬層、基質層をこの順に有するもの。
上記（１）ないしく５）において試薬層は異なる複数の
層から成ってもよい。また試薬層は後述するように免疫
反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよい。
層から成ってもよい。また試薬層は後述するように免疫
反応し得る成分を含む免疫反応層としてもよい。
支持体と試薬層又は検出層との間には吸水層を設けても
よい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また基
質層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に展開
作用を持たせ展開層として機能させてもよい。
よい。また各層の間には濾過層を設けてもよい。また基
質層の上には展開層を設けてもよく、又は基質層に展開
作用を持たせ展開層として機能させてもよい。
Ｌｉ２
基質層１４は、水浸透性層で構成され、抗体を標識する
酵素の基質である非拡散性基質を含有する。
酵素の基質である非拡散性基質を含有する。
基質層の水浸透性を確保するためには、多孔性媒体から
なる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーから
なる層とするのが好ましい。
なる多孔性層とするか、親水性ポリマーバインダーから
なる層とするのが好ましい。
多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊維質であって
もよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織
物布地（例えば平織布地）、編物布地、（例えばトリコ
ット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができ
る。非繊維質材料としては、特開昭４９−５３８８８等
に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルタ
−１特開昭４９−５３８８８、特開昭５５−９０８５９
１ 、対応米国特許４．２５８．００１）、特開昭５８
−７０１６３ （対応米国特許４．４８６．５３７）等
に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有
粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５
９ （対応欧州公開ＥＰ ０１６６３６５Ａ） 、特開
昭６２−１１６２５８ 、特開昭６２−１３８７５６
（対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ） 、特開昭６２
−１３８７５７ （対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ
） 、特開昭６２−１３８７５８ （対応欧州公開ＥＰ
０２２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多
孔性層の積層物も好適である。
もよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織
物布地（例えば平織布地）、編物布地、（例えばトリコ
ット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができ
る。非繊維質材料としては、特開昭４９−５３８８８等
に記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルタ
−１特開昭４９−５３８８８、特開昭５５−９０８５９
１ 、対応米国特許４．２５８．００１）、特開昭５８
−７０１６３ （対応米国特許４．４８６．５３７）等
に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空隙含有
粒状構造物層等のいずれでもよい。特開昭６１−４９５
９ （対応欧州公開ＥＰ ０１６６３６５Ａ） 、特開
昭６２−１１６２５８ 、特開昭６２−１３８７５６
（対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ） 、特開昭６２
−１３８７５７ （対応欧州公開ＥＰ０２２６４６５Ａ
） 、特開昭６２−１３８７５８ （対応欧州公開ＥＰ
０２２６４６５Ａ）等に記載の部分接着された複数の多
孔性層の積層物も好適である。
多孔性層は供給される液体の量にほぼ比例した面積に液
体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であっ
てもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編
物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭５７−６
６３５９号に記載されたようなグロー放電処理をしても
よい。展開層に展開面積、展開速度等を調節するため、
特開昭６Ｏ−２２２７７０（対応： ＥＰ ０１６２３
０１Ａ 、） 、特開昭６３−２１９３９７ （対応西
独特許公開ＤＥ ３７１７９１３Ａ） 、特開昭６３−
１１２９９９（対応： ＤＥ ３７１７９１３Ａ ）
、特開昭６２−１８２６５２（対応： ＤＥ ３７１７
９１３Ａ ）に記載したような親水性高分子あるいは界
面活性剤を含有させてもよい。
体を展開する、いわゆる計量作用を有する展開層であっ
てもよい。展開層としては、これらのうち織物布地、編
物布地などが好ましい。織物布地などは特開昭５７−６
６３５９号に記載されたようなグロー放電処理をしても
よい。展開層に展開面積、展開速度等を調節するため、
特開昭６Ｏ−２２２７７０（対応： ＥＰ ０１６２３
０１Ａ 、） 、特開昭６３−２１９３９７ （対応西
独特許公開ＤＥ ３７１７９１３Ａ） 、特開昭６３−
１１２９９９（対応： ＤＥ ３７１７９１３Ａ ）
、特開昭６２−１８２６５２（対応： ＤＥ ３７１７
９１３Ａ ）に記載したような親水性高分子あるいは界
面活性剤を含有させてもよい。
例えば紙、布、高分子からなる多孔質膜等に基質を予め
含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層
、例えば試薬層の上に、特開昭５５−１６４３５６号の
ような方法で接着させるのも有用な方法である。また別
の方法として多孔質層を他の水浸透性層（例えば試薬層
）に前記のような方法で接着させた後、基質を含む組成
物を多孔質層に塗布してもよい。多孔質層への含浸又は
塗布には公知の方法を利用できる。塗布には例えばデイ
ツプ塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布
等を適宜選択して用いる。
含浸又は塗布した後、支持体上に設けた他の水浸透性層
、例えば試薬層の上に、特開昭５５−１６４３５６号の
ような方法で接着させるのも有用な方法である。また別
の方法として多孔質層を他の水浸透性層（例えば試薬層
）に前記のような方法で接着させた後、基質を含む組成
物を多孔質層に塗布してもよい。多孔質層への含浸又は
塗布には公知の方法を利用できる。塗布には例えばデイ
ツプ塗布、ドクター塗布、ホッパー塗布、カーテン塗布
等を適宜選択して用いる。
こうして作られる基質層の厚さは特に制限されないが、
塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５０μｍ程度、
好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当である。ラミ
ネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚
さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化し得る。
塗布層として設ける場合には、１μｍ〜５０μｍ程度、
好ましくは２μｍ〜３０μｍの範囲が適当である。ラミ
ネートによる積層など、塗布以外の方法による場合、厚
さは数十μｍから数百μｍの範囲で大きく変化し得る。
親水性ポリマーバインダーからなる水浸透性層で基質層
を構成する場合、使用できる親木性ポリマーとしては、
例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの誘導
体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例
えばヒドロキエチルセルロース）、アガロース、アルギ
ン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体、メタアクリ
ルアミド共重合体、アクリルアミド又はメタアクリルア
ミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体、ポリヒドロ
キシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アク
リル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体などである
。
を構成する場合、使用できる親木性ポリマーとしては、
例えば、以下のものがある。ゼラチン及びこれらの誘導
体（例えばフタル化ゼラチン）、セルロース誘導体（例
えばヒドロキエチルセルロース）、アガロース、アルギ
ン酸ナトリウム、アクリルアミド共重合体、メタアクリ
ルアミド共重合体、アクリルアミド又はメタアクリルア
ミドと各種ビニル性モニマーとの共重合体、ポリヒドロ
キシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポ
リビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、アク
リル酸と各種ビニル性モノマーとの共重合体などである
。
親水性ポリマバインダーで構成される基質層は、特公昭
５３−２１６７７号（対応米国特許３，９９２．１５８
）、特開昭５５−１６４３５６号（対応米国特許４．２
９２．２７２）、特開昭５４−１０１３９８号（対応米
国特許４．１３２．５２８）、特開昭６１−２９２０６
３号（ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ１０６、
２１０５６７：ｙ）等の明細書に記載の方法に従って、
基質その他の試薬組成物と親水性ポリマを含む水溶液又
は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の上に塗布し
乾燥することにより設けることができる。親水性ポリマ
ーをバインダーとする基質層の乾燥時厚さは約２μｍ〜
約５０μｍ、好ましくは約４μｍ〜約３０μｍの範囲、
被覆量では約２ｇ／ｍ ”〜約５０ｇ／ｍ２、好ましく
は約４ ｇ／ｍ２〜約３０ｇ／ｍ２の範囲である。
５３−２１６７７号（対応米国特許３，９９２．１５８
）、特開昭５５−１６４３５６号（対応米国特許４．２
９２．２７２）、特開昭５４−１０１３９８号（対応米
国特許４．１３２．５２８）、特開昭６１−２９２０６
３号（ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ１０６、
２１０５６７：ｙ）等の明細書に記載の方法に従って、
基質その他の試薬組成物と親水性ポリマを含む水溶液又
は水分散液を支持体又は検出層等の他の層の上に塗布し
乾燥することにより設けることができる。親水性ポリマ
ーをバインダーとする基質層の乾燥時厚さは約２μｍ〜
約５０μｍ、好ましくは約４μｍ〜約３０μｍの範囲、
被覆量では約２ｇ／ｍ ”〜約５０ｇ／ｍ２、好ましく
は約４ ｇ／ｍ２〜約３０ｇ／ｍ２の範囲である。
基質層には非拡散性基質の他に、塗布特性、拡散性化合
物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的と
して、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝
剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるい
は無機物からなる各種添加剤を加えることができる。基
質層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日
本化学金線「化学便覧 基礎編」（東京、丸善銖、１９
６６年発行） １３１２−１３２０頁、Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄ
ａｗｓｏｎ ｅｔ ａｉｍ、ｒＤａｔａ ｆｏｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｊ第２版（Ｏ
ｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒ
ｅｓｓ、１９６９年発行）４７６−５０８頁、ｒＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ ５，４６７−４７７頁 （１９
６６年）ｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙＪ １０４．３００−３１０頁（１９８０年）に
記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤の具体例として
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）
を含む緩衝剤：燐酸塩を含む緩衝剤ニホウ酸塩を含む緩
衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤ニゲリシン
を含む緩衝剤；バイシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む緩衝剤
； ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤等がある。
物の拡散性、反応性、保存性等の諸性能の向上を目的と
して、酵素の活性化剤、補酵素、界面活性剤、ｐＨ緩衝
剤組成物、微粉末、酸化防止剤、その他、有機物あるい
は無機物からなる各種添加剤を加えることができる。基
質層に含有させることができる緩衝剤の例としては、日
本化学金線「化学便覧 基礎編」（東京、丸善銖、１９
６６年発行） １３１２−１３２０頁、Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄ
ａｗｓｏｎ ｅｔ ａｉｍ、ｒＤａｔａ ｆｏｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｊ第２版（Ｏ
ｘｆｏｒｄ ａｔ ｔｈｅ Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒ
ｅｓｓ、１９６９年発行）４７６−５０８頁、ｒＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ ５，４６７−４７７頁 （１９
６６年）ｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙＪ １０４．３００−３１０頁（１９８０年）に
記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤の具体例として
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）
を含む緩衝剤：燐酸塩を含む緩衝剤ニホウ酸塩を含む緩
衝剤；クエン酸又はクエン酸塩を含む緩衝剤ニゲリシン
を含む緩衝剤；バイシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含む緩衝剤
； ＨＥＰＥＳを含む緩衝剤等がある。
区至１
試薬層】２は、低分子化酵素、及び必要に応じて、低分
子化酵素により生じた低分子生成物を検出するための検
出試薬組成物を含有する。
子化酵素により生じた低分子生成物を検出するための検
出試薬組成物を含有する。
試薬層は、水浸透性層で構成され、前記基質層の説明で
述べた水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダーか
らなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリマ
ーバインダーは基質層で生成される拡散性生成物や、試
薬層内に含有する発色試薬などを考慮して決められる。
述べた水浸透性層のうち、親水性ポリマーバインダーか
らなる連続層とするのが好ましい。用いる親水性ポリマ
ーバインダーは基質層で生成される拡散性生成物や、試
薬層内に含有する発色試薬などを考慮して決められる。
叉五腟
支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、−Ｍ的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、−Ｍ的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。
光透過性水不透過性支持体の材料として好ましいのもの
はポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。
はポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンである。
親水性層を強固に接着させるため通常、下塗り層を設け
るか、親水化処理を施す。
るか、親水化処理を施す。
立及反Ｚ１
第１図の基質層１４には、拡散性基質のみならず、高分
子化抗原及び酵素標識抗体を併せて含有させ、この基質
層内で免疫反応を併せて行なわせる免疫反応層としても
よい。この場合には、要素に検体を点着するだけで、要
素内で均一系の酵素免疫反応が進行させることができる
。
子化抗原及び酵素標識抗体を併せて含有させ、この基質
層内で免疫反応を併せて行なわせる免疫反応層としても
よい。この場合には、要素に検体を点着するだけで、要
素内で均一系の酵素免疫反応が進行させることができる
。
或いは基質層にこれらいずれかを含有させて残りの方は
基質層の上層に横１された水浸透性層に含有させてもよ
い。
基質層の上層に横１された水浸透性層に含有させてもよ
い。
基質層とは別の複数の層に高分子化抗原と酵素標識抗体
を別々に含有させてもよい。
を別々に含有させてもよい。
例えば第２図に示すように、基質層１４の上に酵素標識
抗体を含有する水浸透性層１６を設け、さらにその上に
高分子化抗原を含有する水浸透性層１８を設けて免疫分
析要素を構成してもよい。
抗体を含有する水浸透性層１６を設け、さらにその上に
高分子化抗原を含有する水浸透性層１８を設けて免疫分
析要素を構成してもよい。
この場合には、検体中のリガンド（抗原）は、層１８の
高分子化抗原と共に、層１６に拡散・浸透する。層１６
では、リガンドと高分子化抗原とはそれぞれ酵素標識抗
体の抗体と結合し、さらに基質層１４に移行する。
高分子化抗原と共に、層１６に拡散・浸透する。層１６
では、リガンドと高分子化抗原とはそれぞれ酵素標識抗
体の抗体と結合し、さらに基質層１４に移行する。
また、基質層とは別の１つの層に高分子化抗原と酵素標
識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在状態
で一緒に含有させてもよい。
識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に水の不存在状態
で一緒に含有させてもよい。
例えば、第３図に示すように、基質層１４の上に高分子
化抗原と酵素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に
水の不存在状態で含有する水浸透性層２０を設けて免疫
分析要素を構成してもよい。この場合には、水が溶媒で
ある被検液が層２０に点着供給された時に、層２０の中
で被検液に由来する水の中で、検体中のリガンド（抗原
）と高分子化抗原とは、それぞれ酵素標識抗体の抗体と
結合し、基質層１４に移行する。１つの層に高分子化抗
原と酵素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に水の
不存在状態で一緒に含有させるには、高分子化抗原と酵
素標識抗体の一方又は両者をアルコールＣ例、エタノー
ル）等の非水溶媒に溶解又は分散させて水浸透性層に含
浸させればよい。
化抗原と酵素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に
水の不存在状態で含有する水浸透性層２０を設けて免疫
分析要素を構成してもよい。この場合には、水が溶媒で
ある被検液が層２０に点着供給された時に、層２０の中
で被検液に由来する水の中で、検体中のリガンド（抗原
）と高分子化抗原とは、それぞれ酵素標識抗体の抗体と
結合し、基質層１４に移行する。１つの層に高分子化抗
原と酵素標識抗体を実質的な乾燥状態又は実質的に水の
不存在状態で一緒に含有させるには、高分子化抗原と酵
素標識抗体の一方又は両者をアルコールＣ例、エタノー
ル）等の非水溶媒に溶解又は分散させて水浸透性層に含
浸させればよい。
−の“６ 法
本発明の乾式免疫分析要素は前述の諸特許明細書に記載
の公知の方法により調製することができる。
の公知の方法により調製することができる。
本発明の分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍの正
方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公
昭５７−２８３３１ （対応米国特許４．１６９．７５
１）、実開昭５６−１４２４５４ （対応米国特許４．
３８７．９９０） 、特開昭５７−６３４５２．実開昭
５８−３２３５０．特表昭５８−５０１１４４（対応国
際公開： Ｗｏ ８３１００３９１）等に記載のスライ
ド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製
造、包装、輸送、保存、測定操作等の観点で好ましい。
方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公
昭５７−２８３３１ （対応米国特許４．１６９．７５
１）、実開昭５６−１４２４５４ （対応米国特許４．
３８７．９９０） 、特開昭５７−６３４５２．実開昭
５８−３２３５０．特表昭５８−５０１１４４（対応国
際公開： Ｗｏ ８３１００３９１）等に記載のスライ
ド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製
造、包装、輸送、保存、測定操作等の観点で好ましい。
使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマ
ガジンに収めて用いたり、または小片を開口のあるカー
ドに貼付または収めて用いることなどもできる。
ガジンに収めて用いたり、または小片を開口のあるカー
ドに貼付または収めて用いることなどもできる。
−による 斤 ゞ
本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作
と同様の操作により液体試料中の被検物であるリガンド
の定量分析ができる。
と同様の操作により液体試料中の被検物であるリガンド
の定量分析ができる。
例えば約５μｍ〜約３０μｍ、好ましくは８〜１５μｌ
の範囲の血漿、尿などの水性液体試料液を基質層１４に
点着する。点着した分析要素を約２゜°Ｃ〜約４５°Ｃ
の範囲の一定温度で、好ましくは約３０°Ｃ〜約４０°
Ｃの範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーショ
ンする。要素内の発色又は変色を光透過性支持体側から
反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の
原理により検体中のリガンド量を求めることができる。
の範囲の血漿、尿などの水性液体試料液を基質層１４に
点着する。点着した分析要素を約２゜°Ｃ〜約４５°Ｃ
の範囲の一定温度で、好ましくは約３０°Ｃ〜約４０°
Ｃの範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーショ
ンする。要素内の発色又は変色を光透過性支持体側から
反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の
原理により検体中のリガンド量を求めることができる。
点着する液体試料の量、インキュベーション時間及び温
度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施でき
る。
度を一定にすることにより定量分析を高精度に実施でき
る。
測定操作は特開昭６０−１２５５４３ 、同６０−２２
０８６２、同６１−２９４３６７ 、同５８−１６１８
６７ （対応米国特許４．４２４、１９１）などに記
載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定
量分析を実施できる。
０８６２、同６１−２９４３６７ 、同５８−１６１８
６７ （対応米国特許４．４２４、１９１）などに記
載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定
量分析を実施できる。
なお、目的や必要精度によっては、目視により発色の度
合いを判定して、半定量的な測定を行なってもよい。
合いを判定して、半定量的な測定を行なってもよい。
分析要素内に、高分子化抗原や酵素標識抗体を含有させ
ていない場合には、要素に点着する前に、水性試料液を
高分子化抗原及び酵素標識抗体を含む溶液と混和して、
結合反応を十分性なわせてから、基質層に点着すればよ
い。
ていない場合には、要素に点着する前に、水性試料液を
高分子化抗原及び酵素標識抗体を含む溶液と混和して、
結合反応を十分性なわせてから、基質層に点着すればよ
い。
（合成例）
（１）酵素標識抗体の合成
■ＣＨＭ化アミラーゼの作製
バチルス・ズブチリスアミラーゼ５ｍｇをｐＨ６，３の
０．１Ｍグリセロ燐酸１ｍｌに溶かし、［４−（マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸コスクシ
ンイミドエステル（ｃＨＭ Ｓ ） ２ｍｇ／ｍｌのＤ
ＭＦ溶液溶液１００奢Ｌえて室温で、１時間反応させた
。この反応液をセファデックスＧ−２５カラムにアプラ
イして、ｐＨ６，３の０，１Ｍグリセロ燐酸を流して素
通り分画を分取、４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボン酸アミド化アミラーゼ（ｃＨＭ化ア
ミラーゼ）を得た。
０．１Ｍグリセロ燐酸１ｍｌに溶かし、［４−（マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸コスクシ
ンイミドエステル（ｃＨＭ Ｓ ） ２ｍｇ／ｍｌのＤ
ＭＦ溶液溶液１００奢Ｌえて室温で、１時間反応させた
。この反応液をセファデックスＧ−２５カラムにアプラ
イして、ｐＨ６，３の０，１Ｍグリセロ燐酸を流して素
通り分画を分取、４−（マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボン酸アミド化アミラーゼ（ｃＨＭ化ア
ミラーゼ）を得た。
■抗テオフィリンマウスＩ ｇ Ｇ Ｆ （ａｂ’）ｚ
の作製抗テオフィリンマウスＩ ｇ Ｇ１０ｍｇ （０
，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５） ） ２ ｍ Ｉ２ニ
ハパイン３ｏｏｕｇを加え、３７℃で１８時間撹拌した
。０．Ｉ Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨを６．０に調節し
たこの反応液を予め０６１Ｍ燐酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液（ｐＨ６，３）で緩衝化したＡｃＡ−４４ゲルカ
ラムに入れ、上記の燐酸緩衝液で溶出した。分子量的ｌ
Ｏ万付近に溶出されたピーク部分を集めて１ｍｆｆに濃
縮し、目的の抗テオフィリンマウスＩ ｇ Ｇ Ｆ （
ａｂ’）ｚを得た。
の作製抗テオフィリンマウスＩ ｇ Ｇ１０ｍｇ （０
，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５） ） ２ ｍ Ｉ２ニ
ハパイン３ｏｏｕｇを加え、３７℃で１８時間撹拌した
。０．Ｉ Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨを６．０に調節し
たこの反応液を予め０６１Ｍ燐酸緩衝１ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ溶液（ｐＨ６，３）で緩衝化したＡｃＡ−４４ゲルカ
ラムに入れ、上記の燐酸緩衝液で溶出した。分子量的ｌ
Ｏ万付近に溶出されたピーク部分を集めて１ｍｆｆに濃
縮し、目的の抗テオフィリンマウスＩ ｇ Ｇ Ｆ （
ａｂ’）ｚを得た。
■α−アミラーゼー抗テオフィリンマウスＩｇＧＦａｂ
’結合物の作製 ■で調製した抗テオフィリンマウスＩｇＧＦ （ａｂ
’ ） ｚ６ｍｇを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有、ｐＨ６，０）１ｍＩ２に１０ｍｇ／ｍｌ
の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μ℃
を加え、３７℃で９０分間撹拌した。この反応液を予め
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ）ｆ ６．３）で緩衝化したセ
ファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２
−メルカプトエチルアミンを除去し、Ｈ３−Ｆａｂ’を
得た。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラーゼ２ｍ
ｇを加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応
液を０．１Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ
７，０）で緩衝化したＡｃＡ−３４カラムでゲル濾過し
て分子量２０万以上の分画な集め、これを濃縮して目的
の結合物を得た。
’結合物の作製 ■で調製した抗テオフィリンマウスＩｇＧＦ （ａｂ
’ ） ｚ６ｍｇを含む０．１Ｍ燐酸緩衝液（１ｍＭ
ＥＤＴＡ含有、ｐＨ６，０）１ｍＩ２に１０ｍｇ／ｍｌ
の２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μ℃
を加え、３７℃で９０分間撹拌した。この反応液を予め
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐ）ｆ ６．３）で緩衝化したセ
ファデックスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２
−メルカプトエチルアミンを除去し、Ｈ３−Ｆａｂ’を
得た。これに■で調製したＣＨＭ化α−アミラーゼ２ｍ
ｇを加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応
液を０．１Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ
７，０）で緩衝化したＡｃＡ−３４カラムでゲル濾過し
て分子量２０万以上の分画な集め、これを濃縮して目的
の結合物を得た。
（２）高分子化抗原（ｉオフィリンーウマフエリチン結
合物）の合成 ８−プロピルカルボキシテオフィリン５ｍｇを１ｍｆ２
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、これにＮ−
ヒドロキシサクシンイミド３ｍｇ、水溶性カルボジイミ
ド５ｍｇを加え室温にて２時間撹拌し活性化テオフィリ
ンを調製した。ウマフェリチン１０ｍｇを０．１Ｍ炭酸
水素ナトリウム水滴液１ｍｆｆに溶かし、上記活性化テ
オフィリン溶液を５００ｕｆ２．加え室温にて１時間放
雷し、予め燐酸緩衝化生理食塩水（Ｐ Ｂ Ｓ ； ｐ
Ｈ７，０）で平衡化したセファデックス−Ｇ２５ゲルカ
ラムにて、未反応物を除去し目的の高分子化抗原（テオ
フィリン−ウマフェリチン結合物）を９ｍｇ得た。
合物）の合成 ８−プロピルカルボキシテオフィリン５ｍｇを１ｍｆ２
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、これにＮ−
ヒドロキシサクシンイミド３ｍｇ、水溶性カルボジイミ
ド５ｍｇを加え室温にて２時間撹拌し活性化テオフィリ
ンを調製した。ウマフェリチン１０ｍｇを０．１Ｍ炭酸
水素ナトリウム水滴液１ｍｆｆに溶かし、上記活性化テ
オフィリン溶液を５００ｕｆ２．加え室温にて１時間放
雷し、予め燐酸緩衝化生理食塩水（Ｐ Ｂ Ｓ ； ｐ
Ｈ７，０）で平衡化したセファデックス−Ｇ２５ゲルカ
ラムにて、未反応物を除去し目的の高分子化抗原（テオ
フィリン−ウマフェリチン結合物）を９ｍｇ得た。
（３）高分子化抗原（テオフィリン−ウシ血清アルブミ
ン結合物）の合成 ８−プロピルカルボキシテオフィリン５ｍｇを１ｍＬＤ
ＭＦに溶かし、これにＮ−ヒドロキシサクシンイミド３
ｍｇ、水溶性カルボジイミド５ｍｇを加え室温にて２時
間撹拌し活性化テオフィリンを調製した。ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇをＯＩＭ炭酸水素ナトリウム
水溶液］、ｍＪ２に溶かし、上記活性化テオフィリン溶
液を５００μ℃加え室温にて１時間放置し、予めＰＢＳ
で平衡化したセファデックス−Ｇ ２５ゲルカラムにて
、未反応物を除去し目的の高分子化抗原（テオフィリン
−ＢＳＡ結合物）を９ｍｇ得た。
ン結合物）の合成 ８−プロピルカルボキシテオフィリン５ｍｇを１ｍＬＤ
ＭＦに溶かし、これにＮ−ヒドロキシサクシンイミド３
ｍｇ、水溶性カルボジイミド５ｍｇを加え室温にて２時
間撹拌し活性化テオフィリンを調製した。ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇをＯＩＭ炭酸水素ナトリウム
水溶液］、ｍＪ２に溶かし、上記活性化テオフィリン溶
液を５００μ℃加え室温にて１時間放置し、予めＰＢＳ
で平衡化したセファデックス−Ｇ ２５ゲルカラムにて
、未反応物を除去し目的の高分子化抗原（テオフィリン
−ＢＳＡ結合物）を９ｍｇ得た。
（実施例１）
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ１８０ｇｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ ）シート（
支持体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬
溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ ）シート（
支持体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬
溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
アルカリ処理ゼラチン １４．５ ｇ／ｍ２ノ
ニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレ
ン単位平均９〜ｌＯ含有）０．２ ｇ／ｍ２ グルコースオキシダーゼ ５０００ ｕ／ｍ”ペ
ルオキシダーゼ １５０００ ｕ／ｍ”グル
コアミラーゼ ５０００ ｕ／ｍ２２−（
４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）４−［
４−（ジメヂルアミノ）フェニル］＝５−フェネチルイ
ミダゾール （ロイコ色素） 酢酸塩 ０．３８ ｇ／ｒｒｉ″
ビス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン ０．１ ｇ／ｍ”この
試薬層の上に下記の被覆１になるように接着層を塗布し
、乾燥して設けた。
ニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレ
ン単位平均９〜ｌＯ含有）０．２ ｇ／ｍ２ グルコースオキシダーゼ ５０００ ｕ／ｍ”ペ
ルオキシダーゼ １５０００ ｕ／ｍ”グル
コアミラーゼ ５０００ ｕ／ｍ２２−（
４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）４−［
４−（ジメヂルアミノ）フェニル］＝５−フェネチルイ
ミダゾール （ロイコ色素） 酢酸塩 ０．３８ ｇ／ｒｒｉ″
ビス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン ０．１ ｇ／ｍ”この
試薬層の上に下記の被覆１になるように接着層を塗布し
、乾燥して設けた。
アルカリ処理ゼラチン １４．５ ｇ／ｍ２ビ
ス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン ０．１ ｇ／ｍ”つい
で接着層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含
有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に５
０デニール相当のＰＥＴ紡績糸３６ゲージ繻みした厚さ
約２５０μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧
力をかけてラミネートして多孔性展開層を設Ｃ−＋た。
ス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン ０．１ ｇ／ｍ”つい
で接着層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含
有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に５
０デニール相当のＰＥＴ紡績糸３６ゲージ繻みした厚さ
約２５０μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧
力をかけてラミネートして多孔性展開層を設Ｃ−＋た。
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチ
レン単位平均９〜１０含有）０．１５ ｇ／ｍ２ ビス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン ０．４ ｇ／ｍ２
次に、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥して
基質層を設けてテオフィリン分析用多層分析要素を調製
した。
レン単位平均９〜１０含有）０．１５ ｇ／ｍ２ ビス［（ビニルスルホニルメチル カルボニル）アミノコメタン ０．４ ｇ／ｍ２
次に、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥して
基質層を設けてテオフィリン分析用多層分析要素を調製
した。
カルボキシメチル化澱粉 ４ ｇ／ｍ２ノニル
フェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレン単
位平均９〜１０含有）０．２ ｇ／ｍ２ 次いでこの分析要素を１５ｍｍ四方のチップに裁断し、
特開昭５７−６３４５２に記載のスライドの枠に収めて
、テオフィリン分析用多層乾式スライド１とした。
フェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレン単
位平均９〜１０含有）０．２ ｇ／ｍ２ 次いでこの分析要素を１５ｍｍ四方のチップに裁断し、
特開昭５７−６３４５２に記載のスライドの枠に収めて
、テオフィリン分析用多層乾式スライド１とした。
江荒ａ艮屈
合成例（１）のアミラーゼ−抗テオフィリンＩｇＧ結合
物及び合成例（２）のテオフィリン−ウマフェリチン結
合物をそれぞれ０．１ｍｇ／ｍρとなるように、既知量
のテオフィリンを含有する５０ ｍＭグリセロ燐酸緩衝
溶液（ｐＨ７）に加え、３７℃で２０分間インキュベー
トした。この後、自溶液１０μ℃を前記スライド１に点
着し、３７°Ｃに保って、中心波長６５０ｎｍの可視光
でＰＥＴ支持体側からスライド１の反射光学濃度を測定
した。点着から３分後および５分後の反射光学濃度の差
〔△ＯＤ、、）を第４図に示す。
物及び合成例（２）のテオフィリン−ウマフェリチン結
合物をそれぞれ０．１ｍｇ／ｍρとなるように、既知量
のテオフィリンを含有する５０ ｍＭグリセロ燐酸緩衝
溶液（ｐＨ７）に加え、３７℃で２０分間インキュベー
トした。この後、自溶液１０μ℃を前記スライド１に点
着し、３７°Ｃに保って、中心波長６５０ｎｍの可視光
でＰＥＴ支持体側からスライド１の反射光学濃度を測定
した。点着から３分後および５分後の反射光学濃度の差
〔△ＯＤ、、）を第４図に示す。
（実施例２）
実施例１と同様にして多層分析要素を作成し、その基質
層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合成
例（１）で合成したアミラーゼ−抗テオフィリンＩｇＧ
結合物を３ｍｇ／ｒｎ″の被覆量となるようにしてエタ
ノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させてテオフィリン分
析用多層免疫スライド２を作成した。
層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合成
例（１）で合成したアミラーゼ−抗テオフィリンＩｇＧ
結合物を３ｍｇ／ｒｎ″の被覆量となるようにしてエタ
ノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させてテオフィリン分
析用多層免疫スライド２を作成した。
１脂五ｌ累１
合成例（３）のテオフィリン−ＢＳＡ結合物（０，１ｍ
ｇ／ｍｌ２）を含み、既知量のテオフィリンを含有する
ｐＨ７の５０ ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０ｕｆ２を
、スライド２に点着した。３７℃に保って、中心波長６
５０ｎｍの可視光でＰＥＴ支持体側からスライド２の反
射光学濃度を測定した。点着から３分後および５分後の
反射光学濃度の差（△ＯＤ５．．３）を第５図に示す。
ｇ／ｍｌ２）を含み、既知量のテオフィリンを含有する
ｐＨ７の５０ ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０ｕｆ２を
、スライド２に点着した。３７℃に保って、中心波長６
５０ｎｍの可視光でＰＥＴ支持体側からスライド２の反
射光学濃度を測定した。点着から３分後および５分後の
反射光学濃度の差（△ＯＤ５．．３）を第５図に示す。
第５図の検量線より、本発明のテオフィリン分析用乾式
免疫分析要素はテオフィリンの定量が精度良く行えるこ
とが明らかである。
免疫分析要素はテオフィリンの定量が精度良く行えるこ
とが明らかである。
（実施例３）
実施例１と同様にして多層分析要素を作成し、その基質
層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合成
例（３）で合成したテオフィリン＝ＢＳＡ結合物を３ｍ
ｇ／ｒｎ″の被覆量となるようにして水溶液を塗布し含
浸させ、次いで合成例（１）で合成したアミラーゼ−抗
テオフィリンＩｇＧ結合物を３ｍｇ／ｍ２の被覆量とな
るようにしてエタノル溶液を塗布し含浸させ乾燥させて
乾燥させてテオフィリン分析用多層免疫スライド３を作
成した。
層兼展開層であるトリコット編物布地層に、さらに合成
例（３）で合成したテオフィリン＝ＢＳＡ結合物を３ｍ
ｇ／ｒｎ″の被覆量となるようにして水溶液を塗布し含
浸させ、次いで合成例（１）で合成したアミラーゼ−抗
テオフィリンＩｇＧ結合物を３ｍｇ／ｍ２の被覆量とな
るようにしてエタノル溶液を塗布し含浸させ乾燥させて
乾燥させてテオフィリン分析用多層免疫スライド３を作
成した。
このスライド３に既知量のテオフィリンを含有するｐＨ
７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０ｕ１２を点着し
、３７℃に保って、支持体側から６５０ｎｍの反射光学
濃度を測定し、点着から３分後および５分後の反射光学
濃度の差（△ＯＤ、３）を求めて、検量線を作成した。
７の５０ｍＭグリセロ燐酸緩衝溶液１０ｕ１２を点着し
、３７℃に保って、支持体側から６５０ｎｍの反射光学
濃度を測定し、点着から３分後および５分後の反射光学
濃度の差（△ＯＤ、３）を求めて、検量線を作成した。
実施例２と同様にテオフィリンの定量が精度良く行える
こと判明した。
こと判明した。
最後に本発明の好ましい態様をまとめると、以下の通り
である。
である。
（１）リガンドと、リガンドと高分子化合物との結合物
と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の
変化を測定することによりリガンド量を分析する免疫分
析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物
にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えることを
特徴とする免疫分析要素。
と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の
変化を測定することによりリガンド量を分析する免疫分
析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物
にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えることを
特徴とする免疫分析要素。
（２）前記酵素標識抗体が、前記基質層または前記基質
層の上に積層された層に含有されていることを特徴とす
る（１）記載の免疫分析要素。
層の上に積層された層に含有されていることを特徴とす
る（１）記載の免疫分析要素。
（３）前記リガンドと高分子化合物との結合物が、前記
基質層または前記基質層の上に積層された層に含有され
ていることを特徴とする（１）記載の免疫分析要素。
基質層または前記基質層の上に積層された層に含有され
ていることを特徴とする（１）記載の免疫分析要素。
（４）前記酵素標識抗体と、前記リガンドと高分子化合
物との結合物とが、前記基質層に含有されていることを
特徴とする（１）記載の免疫分析要素。
物との結合物とが、前記基質層に含有されていることを
特徴とする（１）記載の免疫分析要素。
（５）前記酵素標識抗体の酵素がエンド活性型の糖質分
解酵素であり、前記低分子化酵素がエキソ活性型の糖質
分解酵素であることを特徴とする（１）記載の免疫分析
要素。
解酵素であり、前記低分子化酵素がエキソ活性型の糖質
分解酵素であることを特徴とする（１）記載の免疫分析
要素。
（６）前記低分子生成物がグルコースである（５）記載
の免疫分析要素。
の免疫分析要素。
（７）前記低分子生成物と反応して可視吸収を有する色
素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透
性層に含有していることを特徴とする（１）記載の免疫
分析要素。
素を生成する試薬組成物を、前記試薬層又は他の水浸透
性層に含有していることを特徴とする（１）記載の免疫
分析要素。
（８）前記試薬組成物が、前記低分子生成物と反応して
過酸化物を生成する（７）記載の免疫分析要素。
過酸化物を生成する（７）記載の免疫分析要素。
（９）前記試薬組成物が、酸化により発色するロイコ色
素を含む（８）記載の免疫分析要素。
素を含む（８）記載の免疫分析要素。
（１０）前記試薬組成物が、ロイコ色素の水不溶性溶媒
からなる溶液の水性液中への分散物を含む（９）記載の
免疫分析要素。
からなる溶液の水性液中への分散物を含む（９）記載の
免疫分析要素。
（１１）前記試薬組成物が、グルコースオキシダーゼ、
ペルオキシダーゼ、及びロイコ色素を含む（１０）記載
の免疫分析要素。
ペルオキシダーゼ、及びロイコ色素を含む（１０）記載
の免疫分析要素。
（１２）リガンドと、リガンドと高分子化合物との結合
物と、酵素標識抗体との間の反応により生した酵素活性
の変化を測定することにより、検体中のリガンド量を分
析する免疫分析方法において、ｆａ）前記検体を、前記
酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有す
る基質層に供給し、次いで、 （ｌ〕）前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに
低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移
行させ、 ｆｃｌ試薬層で生成された低分子生成物の量を測定する
、 ことを特徴とする免疫分析方法。
物と、酵素標識抗体との間の反応により生した酵素活性
の変化を測定することにより、検体中のリガンド量を分
析する免疫分析方法において、ｆａ）前記検体を、前記
酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有す
る基質層に供給し、次いで、 （ｌ〕）前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに
低分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移
行させ、 ｆｃｌ試薬層で生成された低分子生成物の量を測定する
、 ことを特徴とする免疫分析方法。
第１図から第３図はそれぞれ本発明に免疫分析要素の一
実施態様例の構成図である。第４図は実施例１の免疫分
析要素の検量線を示す図、第５図は実施例２の免疫分析
要素の検量線を示す図である。 ・・・透光性支持体、 ・・・試薬層、 ・・・基質層、 ・・・酵素標識抗体を含有する水浸透性層、・・・高分
子化抗原を含有する水浸透性層、・・・酵素標識抗体と
高分子化抗原とを含有する水浸透性層。
実施態様例の構成図である。第４図は実施例１の免疫分
析要素の検量線を示す図、第５図は実施例２の免疫分析
要素の検量線を示す図である。 ・・・透光性支持体、 ・・・試薬層、 ・・・基質層、 ・・・酵素標識抗体を含有する水浸透性層、・・・高分
子化抗原を含有する水浸透性層、・・・酵素標識抗体と
高分子化抗原とを含有する水浸透性層。
Claims (6)
- （１）リガンドと、リガンドと高分子化合物との結合物
と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の
変化を測定することによりリガンド量を分析する免疫分
析要素において、 前記酵素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含
有する基質層と、前記拡散性物質をさらに低分子生成物
にする低分子化酵素を含有する試薬層とを備えることを
特徴とする免疫分析要素。 - （２）前記酵素標識抗体が、前記基質層または前記基質
層の上に積層された層に含有されていることを特徴とす
る請求項１記載の免疫分析要素。 - （３）前記リガンドと高分子化合物との結合物が、前記
基質層または前記基質層の上に積層された層に設けられ
た層に含有されていることを特徴とする請求項１又は２
記載の免疫分析要素。 - （４）前記低分子化酵素が、糖分解酵素である請求項１
記載の免疫分析要素。 - （５）前記酵素標識抗体と、前記リガンドと高分子化合
物との結合物とが、前記基質層に含有されていることを
特徴とする（１）記載の免疫分析要素。 - （６）リガンドと、リガンドと高分子化合物との結合物
と、酵素標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の
変化を測定することにより、検体中のリガンド量を分析
する免疫分析方法において、（ａ）前記検体を、前記酵
素により拡散性物質を生成する非拡散性基質を含有する
基質層に供給し、次いで、 （ｂ）前記基質層で生成された拡散性物質を、さらに低
分子生成物にする低分子化酵素を含有する試薬層に移行
させ、 （ｃ）試薬層で生成された低分子生成物の量を測定する
、 ことを特徴とする免疫分析方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2096499A JP2576910B2 (ja) | 1990-04-13 | 1990-04-13 | 免疫分析要素および免疫分析方法 |
| EP91105795A EP0451848B1 (en) | 1990-04-13 | 1991-04-11 | Immunoassay element and process for immunoassay |
| DE69121447T DE69121447T2 (de) | 1990-04-13 | 1991-04-11 | Immuntestelement und Verfahren für Immuntest |
| US08/163,405 US5569589A (en) | 1990-04-13 | 1993-12-07 | Immunoassay element and process and immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2096499A JP2576910B2 (ja) | 1990-04-13 | 1990-04-13 | 免疫分析要素および免疫分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03295466A true JPH03295466A (ja) | 1991-12-26 |
| JP2576910B2 JP2576910B2 (ja) | 1997-01-29 |
Family
ID=14166793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2096499A Expired - Lifetime JP2576910B2 (ja) | 1990-04-13 | 1990-04-13 | 免疫分析要素および免疫分析方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5569589A (ja) |
| EP (1) | EP0451848B1 (ja) |
| JP (1) | JP2576910B2 (ja) |
| DE (1) | DE69121447T2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04276551A (ja) * | 1991-03-04 | 1992-10-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | 免疫分析要素および免疫分析方法 |
| EP0708337A3 (en) * | 1994-10-19 | 1996-06-12 | Fuji Photo Film Co Ltd | Analytical element and analysis method for glycolysed hemoglobin |
| EP2141180A1 (en) | 2008-06-30 | 2010-01-06 | Fujifilm Corporation | Antibody recognizing canine CRP and human CRP |
| EP2336158A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of canine CRP |
| JP2020506395A (ja) * | 2017-02-09 | 2020-02-27 | プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 検体検出イムノアッセイ |
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| US5447846A (en) * | 1992-07-17 | 1995-09-05 | Fuji Photo Film C., Ltd. | Homogeneous Immunoassay process using covalent conjugate of enzyme and plural monoclonal antibodies for different epitopes on analyte |
| BR9713852A (pt) * | 1996-12-05 | 2000-10-31 | Idego Aps | Laminado sensor, processos para produção de um laminado sensor e para detecção de uma molécula alvo selecionada em um fluido biológico, mecanismo de liberação de fluido multiseccionado, e, kit para detecção de uma molécula alvo selecionada em um fluido biológico. |
| US5879951A (en) | 1997-01-29 | 1999-03-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing unidirectional flow |
| US5939252A (en) | 1997-05-09 | 1999-08-17 | Lennon; Donald J. | Detachable-element assay device |
| DE69803627T2 (de) * | 1997-06-13 | 2002-06-20 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Immunoassay-Element |
| US6509196B1 (en) | 2000-01-04 | 2003-01-21 | Response Biomedical Corp. | Compensation for non-specific signals in quantitative immunoassays |
| US7571511B2 (en) | 2002-01-03 | 2009-08-11 | Irobot Corporation | Autonomous floor-cleaning robot |
| US6883201B2 (en) * | 2002-01-03 | 2005-04-26 | Irobot Corporation | Autonomous floor-cleaning robot |
| US7087389B2 (en) * | 2001-02-09 | 2006-08-08 | Council Of Scientific & Industrial Research | Highly cost-effective analytical device for performing immunoassays with ultra high sensitivity |
| US20030162236A1 (en) * | 2001-03-26 | 2003-08-28 | Response Biomedical Corporation | Compensation for variability in specific binding in quantitative assays |
| US8481334B1 (en) | 2001-11-06 | 2013-07-09 | Charm Sciences, Inc. | Method of attaching a ligand to a solid support |
| EP1493029B1 (en) * | 2002-04-10 | 2010-03-31 | Response Biomedical Corporation | Sensitive immunochromatographic assay |
| US7175992B2 (en) * | 2002-04-10 | 2007-02-13 | Response Biomedical Corporation | Sensitive immunochromatographic assay |
| US7875433B2 (en) * | 2007-02-26 | 2011-01-25 | Response Biomedical Corporation | Comparative multiple analyte assay |
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| CA1095819A (en) * | 1977-01-14 | 1981-02-17 | Eastman Kodak Company | Element for analysis of liquids |
| AT362526B (de) * | 1977-09-13 | 1981-05-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagens zur bestimmung von alpha- -amylase |
| DE3000292A1 (de) * | 1980-01-05 | 1981-07-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Indoxylmaltodextrine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| EP0104780B1 (en) * | 1982-08-27 | 1986-11-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Measurement of alpha-amylase activity |
| US4782018A (en) * | 1986-01-17 | 1988-11-01 | Eastman Kodak Company | Detection of hydrolyzing enzymes |
| DE3621271A1 (de) * | 1986-06-25 | 1988-01-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur bestimmung von alpha-amylase |
| EP0347839B1 (en) * | 1988-06-24 | 1994-09-28 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Dry-type analytical element for immunoassay |
-
1990
- 1990-04-13 JP JP2096499A patent/JP2576910B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-04-11 DE DE69121447T patent/DE69121447T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-04-11 EP EP91105795A patent/EP0451848B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-07 US US08/163,405 patent/US5569589A/en not_active Expired - Lifetime
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| EP2336158A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Fujifilm Corporation | Dry analytical element for measurement of canine CRP |
| JP2020506395A (ja) * | 2017-02-09 | 2020-02-27 | プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 検体検出イムノアッセイ |
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|---|---|
| EP0451848A2 (en) | 1991-10-16 |
| DE69121447D1 (de) | 1996-09-26 |
| EP0451848B1 (en) | 1996-08-21 |
| JP2576910B2 (ja) | 1997-01-29 |
| US5569589A (en) | 1996-10-29 |
| EP0451848A3 (en) | 1993-03-03 |
| DE69121447T2 (de) | 1997-01-02 |
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