JPH0331299A - 特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野における９４ ｋＤａの細胞表面蛋白質、その単離方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特に９４　ｋＤａの細胞表面蛋白質に対する
抗体であり且つ全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹
患している患者の血清中に存在する抗体の検出方法の実
施のための、９４　ｋＤａの細胞表面蛋白質及びその使
用に関する。

ＳＬＥは、組織病変の原因である抗二本鎖ＤＮＡ抗体の
産生を引き起こす免疫系の障害を特徴とする自己免疫疾
患である。

したがって、ヒトＳＬＥの症例で観察されるｉｌｌ織病
変の大半は、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ免疫複合体の形成並びに
、腎臓及びその他の組織内でのそれらの沈着によるもの
であると考えられる（　ＩＩＥ　Ｉ　ＫＫ　Ｉ　ＬＡ。

Ｒ１ら、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
　３２８，４４５〜４４９　　；ＨＡＲ［ＥＬ−ＢＩＥ
ＬＬＡＮ　Ａ、ら（１９８８）　Ｊ、ＩＭＭＵＮＯＬ、
、　１４０　。

２４３１〜２４３５）　　。

Ｉ： れまでＳＬＥの特徴的マーカーであると考えられてきた
。

この疾患がヒトと同じ方法で発症し得る自己免疫マウス
は、ＳＬＥの原因であると推定される免疫機構の研究の
良好なモデルとなる。特に、Ｂ／Ｗ　　Ｍ　ＲＬ　／　
１自己免疫マウスは、ヒトＳＬＥと同一のＳＬＥを持つ
。ＳＬＥに罹患した患者の血清は、異なる核酸に対する
抗体の混合物を含有する。したがって、抗ＤＮＡ抗体の
特異性をより良く特徴付けるために、ハイブリドーマ法
の使用が正当化された。

これにより、−本鎖ＤＮＡに対する抗体と二本鎖ＤＮＡ
に対する抗体との区別が試みられた。

この区別は、それに起因する臨床的相関によっである種
の成功を得ていたが、−本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡに
関してＤＮＡを特徴づけることは技術的に困難であるた
め、かなり不満足なものであることがたちまち判明した
。

さらに、ＳＬＥに罹患した患者の血清は、ＤＮＡだけで
な（ＲＮＡ（リボ核酸）及び核蛋白質と反応可能な抗体
の混合物を含有することが観察された。対応する抗原が
明白に定義されない時には、生じた抗体の個々の意義を
評価することは難しかった。

ＳＬＥマウスに自発的に産生された抗ＤＮＡ抗体の詳細
な分析に対する障害が、近年、抗−本鎖ＤＮＡモノクロ
ーナル抗体（Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．　（１９８０）　。

１２４　、１４９９〜１５０２）及び二本鎖ＤＮＡに対
する抗体（Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、　（１９８２）　、　
１２８　、８９５〜８９ｇ　）を合成するハイブリドー
マの産生によって持ち上がってきた。

その実験は、Ｌｌｌｅ　Ａｌｌ１ｅｒｉｃａｎ　Ｒｈｅ
ｕｍａｔｉｓｍ＾５ｓｏｃｌａＬＩｏｎ　Ｔａｎ　ｒＥ
Ｍ　Ｃｏｈｅｎ　Ａｓ　、　　Ｆｒ１ｅｓ　Ｊ、Ｆ、ら
（１９ｇ２）が報告した疾患の臨床的進行の評価に関す
る修正された規準とこれらの力価とが相関し得ないこと
を示しただけではなかった。全身性エリテマトーデスの
分類のための修正された判定基準；それらは、ＳＬＥの
臨床上の徴候を有するある患者が抗ＤＮＡ抗体のキャリ
アでないことを示した。

そのすべてに関して、予め考慮されたＤＮＡ−抗ＤＮＡ
免疫複合体の形成に際してのＤＮＡの関与は既に論議さ
れている。

したがって、二本鎖ＤＮＡ　（以後、例えばＭ　Ａ　ｂ
　　Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７と呼称されるもの）に対する特異
的なモノクローナル抗体であり且つ自己免疫Ｂ／Ｗマウ
スから得られたモノクローナル抗体（ＭＡｂと略記する
）が、Ｒａｊ　ＩのヒトＢリンパ芽球様細胞の表面に結
合したこと、並びにこの結合が、ＤＮＡ５ａ・Ｉ　（２
００ｔｔ　ｇ／ｍｌ）　　（ＤＮＡを開裂する酵素）で
の処理によってではなく、プロテアーゼＫ（１０％ｇ　
／　ｍｌ　）を用いた限定的処理によって廃除されたこ
とはすでに認められていたことであり、細胞表面で認識
される抗原が天然においては蛋白質であることが実証さ
れている（　ＰＮＡＳ。

８１．３Ｂ４３〜３Ｂ４５　（１９８４）　　；　Ｅｕ
ｒ、Ｊ、Ｉ＋ｎｌｌ１ｕｎｏ１．、１４゜２８３〜２８
Ｂ、　（１９Ｈ）　）。いくつかの抗原に対するモノク
ローナル抗ＤＮＡ抗体がリン脂質類（ＬＡＰＥＩ？。

Ｅ、Ｍ、ら（１９８１）　Ｊ、ＥＢ、Ｍｃｄ、、　１５
３　、　８９７〜９０９　）又はプロテオグリカン類（
ＰＡＡＢＥＲ，Ｐ、ら（１９８６）Ｊ、ＣｌＩｎ、１ｎ
ｖｅｓｔ、、　７７、１８２４〜１８２７）のような分
子と反応するという事実は、ＤＮＡ自身以外の標的抗原
がＳＬＥに関係し得る可能性があることを示唆している
。

さらにまた、上記の限定処理後に得られた細胞上清の分
析から、後者のプロテオグリカンが他の多数の蛋白質と
の混合物中に、ゲル電気泳動及びイムノトランスファ後
、ＭＡｂ　　ＰＭＥ７７によっって認識され得る５つの
ポリペプチドを含有することが分かった。それらの分子
量は順番に、それぞれ３４，０００．３３□０００．１
７，０００．１８．０００及び１４，０００（ＪＡＣＯ
Ｂ、Ｌ、ら（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｊ、、（ＵＳＡ）８１、３８４３〜３８４５　
、　ＪＡＣＯＢ、Ｌら（１９８Ｂ）　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ
ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ１．、（ＵＳＡ）　８３．６９７０〜６
９７４）である。使用した戦術に鑑みて、これらのポリ
ペプチドは細胞表面に分布することが示唆された。

（上記のＪＡＣＯＢ　Ｌ、ら（１９８［ｉ）　）ことも
示唆された。

白血球又は単核球の細胞膜に関して行われた最ると考え
られた（ＲＥＫＶＩＣ，Ｏ，Ｐ、ら（１９８０）　＋Ｊ
、Ｅｘｐ。

Ｍｃｄ、、　　１５２　、　１７２０〜１７３３　；　
ｌｌ０ＬＥＲ８，Ｖ、Ｍ、ら（１９８５）。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、、　　７８．　９９１　
〜９９８　　；　　ｌ３ＥＮＮＥＴＴ、Ｒ，Ｍ。

ら（１９８７）　、　Ｊ、Ｅｘｐ、）４ａｄ、、　１６
８　、８５０〜８６３　）。

最近、オリゴ（ｄＴ）（デオキシチミジンから成るオリ
ゴヌクレオチド）に結合させたセルロースカラム上で精
製することによって、８’ＯｋＤａの細胞表面蛋白質が
検出された。この細胞表面蛋白質は細胞の外部から内部
へのオリゴヌクレオチドの輸送にある役割を演じ得るが
、このモデルで示唆されるインターナリゼーションは長
い工程（約５０時間）であるため、正式には立証されな
かった（ＬＯＫＩＥ、　Ｓ、Ｌ、ら（１９８９）　、　
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｌ。

（ＵＳＡ）　、　８６．３４７４〜３４７ｇ）。

しかしながら、最近の種々の研究はいずれも、ＳＬＥの
発症原因の病態学的機序を推論させることができなかっ
た。

本発明は正に、ＳＬＥの発症に関係がある細胞膜の結果
である。

さらに詳細には、本発明は生物学的因子の発見の結果に
よるものであり、特に４固体の血液中における該因子の
Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ険出をＳＬＥと相関させ得る。

本発明は、特に、ＳＬＥのｉｎ　ｖｌｔｒｏ診断の新規
方法に関する。

本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法により、効果的に個
体内のＳＬＥを監視することができる。これによ内 り、特に個体中のＳＬＥ発症を明らかにすることができ
るし、又はさらにこの個体における急性期から、緩解期
に向かうＳＬＥの進行を監視することができる。

本発明の対象はニ 御粘製モノクローナル抗体Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７と免疫学的
複合体を形成できるか又は、前記抗体がヌクレオチドム
（ポリヌクレオソーム、オリゴヌクレオチドム及びモノ
ヌクレオソーム）と若しくはＤＮＡ及びヒストンから成
る複合体と結合する場合、モ疫学的複合体を形成するこ
とが可能であること、−ヌクレオチドムの非存在下で又
はＤＮＡ及びヒストンから成る複合体の非存在下で精製
モノクローナル抗体ＰＭＥ７７によって認識されないこ
とを特徴とする９４　ｋＤａの細胞膜蛋白質又は上記の
免疫学的性質を保持することが可能な前記蛋白質の任意
の断片である。

具体的には、上記ヒストンは、Ｈ，Ｈ２Ａ。

■ ＨＢ、Ｈ３又はＨ４型のものである。生体内では、ヒス
トンとＤＮＡとが結合してモノヌクレオソーム（クロマ
チンの単位粒子）を形成する。

本発明の９４　ｋＤａ蛋白質は、抗体Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７
がヒストンと任意の種類のＤＮＡ、特にファージλのＤ
ＮＡとで形成された複合体と結合する場合には、抗体Ｐ
　Ｍ　Ｅ　７７と免疫学的複合体を形成することが可能
である。

既に上記に指摘した通り、本発明の９４　ｋＤａ蛋白質
はまた、抗体Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７がヌクレオソーム、特に
Ｌ　１２１０型マウス白血病細胞から得られたヌクレオ
ソームと結合する場合には、抗体Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７と免
疫学的複合体を形成することも可能である。

より詳細には、本発明の９４　ｋＤａ蛋白質は：−Ｒａ
ｊｉヒト細胞、サル線維芽細胞（ＣＶＩ細胞）　　ＲＩ
Ｎｍラットの膵臓腫瘍細胞のような細胞の表面から単離
することが可能であること、−疎水性であること、 一界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）　、特にＴｒｌＬ
ｏｎＸ−１１４又はＸ　−Ｉｏｎ型の溶液に不溶性の細
胞膜構成成分を含有しないこと、 −°　　−細胞表面に該蛋白質を含有すると思われる細
胞を界面活性剤で処理した後、界面活性剤用特にＴｒｌ
ｔｏｎＸ　−１１４中に見出されること、 トリプシンの作用により、細胞表面から取出されること を特徴とする。

本発明はまた、ＳＬＥに罹患した患者の血清と免疫学的
複合体を形成することが可能であることを特徴とする、
上記９４　ｋＤａ蛋白質又はこの蛋白質の任意の断片に
関する。

本発明の別の対象はニ ー細胞記載のポリペプチドを含有すると思われる精製し
た動物又はヒト細胞の膜をＴｒｌｔｏｎＸ　−１１４型
界面活性剤を用いて処理し、その後前記蛋白質を含有す
る界面活性剤用を回収することによる前記蛋白質の抽出
、 一前記蛋白質を含有する相を精製ヌクレオソーム又は、
核酸と精製ヒストンとから形成した複合体と接触させる
こと、但し、これらのヌクレオソーム又は複合体を担体
（特にアフィニティクロマトグラフィー担体若しくはイ
オン交換カラム）上に固定化すること、 一前記蛋白質及び上記腹合体の分離に導く溶液と担体と
を接触させることによって前記担体上に保持される前記
蛋白質を回収すること を包含する９４　ｋＤａ蛋白質の単離並びに回収方法で
ある。具体的には、この溶液は以下のものである：２Ｍ
ＮａｃΩ、Ｏ，１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩バッファ、　ｐＨ
９，３Ｍ尿素。

上記に規定した単離方法は、本発明の９４　ｋＤａ蛋白
質に対する又は、上記の任意のこの蛋白質断片に対する
特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用い
て有利に実施される。

この場合、上記のアフィニティクロマトグラフィー担体
中に使用するヌクレオソーム又は、核酸とヒストンから
成る複合体を、抗体、特に本発明の蛋白質に対する特異
的なモノクローナル抗体で九１６゜ 上記のＬＯＫＥ　Ｓ、Ｌ、（１９８９）の論文に記載の
方法によるオリゴ（ｄＴ）を包むアフィニティクロマト
ダラフィー担体及びゲル濾過を用いて、本発明の蛋白質
の単離方法を行うことも可能である。

本発明はまた、本発明の９４　ｋＤａ蛋白質に対して又
は、上記の任意のこの蛋白質断片に対して形成される抗
体自体にも関する。

この産生がポリクローナル抗体に限定されるものでない
ことは明白であろう。

このようなモノクローナル抗体をハイブリドーマ法によ
って産生じてもよく、その一般的原理を以下に述べる。

動物を先ず上記の９４　ｋＤａ蛋白質又はこの蛋白質の
断片で免疫すると、やがて動物のＢリンパ球はこの蛋白
質に対する抗体を産生ずる。次に、これらの抗体産生リ
ンパ球を「永久増殖性」骨髄腫細胞と融合してハイブリ
ドーマを生成する。このようにして得られた細胞の不均
質混合物から出発し、次いで、特定の抗体を産生じ且つ
際限なく増殖することができる細胞の選択を行う。各ハ
イブリドーマをクローンの形態で増殖させ、各々にモノ
クローナル抗体を産生させ、本発明の蛋白質に関してそ
の認識特性を、例えば−次元又は二次元でのイムノトラ
ンスファ及び、免疫螢光法によりテストし得る。

本発明はまた、ポリペプチド画分が同一のモノクローナ
ル抗体によって認識され得る抗原部位を有すると反定し
た場合には、９４　ｋＤａ蛋白質より低い分子量をもつ
ポリペプチド画分に関するということは明白であろう。

上記に考慮したタイプのモノクローナル抗体が入手し得
る場合には、例えば、特異的部位でより大きなポリペプ
チドを開裂することができる酵素によるポリペプチドの
公知の開裂方法によって、上記抗原からの同一の抗原部
位を含有するより短いペプチド配列の単離をもくろむこ
とができることは当業者にとって明白であろう。このよ
うな蛋白質の具体例として、酵素５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ａｕｒｃｕｓ　Ｖ８．　　ａキモトリプシン
。

Ｂｏｃｈｒｉｎｇｃｒ）ｆから市販されているマウス顎
下腺プロテアーゼ、前記ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ及びｃ
ｒｙＡＲａ等を特異的に認識するＶｌｂｒｌ。

ａｌｇｉｎｏｌｙＬＩｃｕｓ　ｃｈｅｍｏｖａｒ　Ｉｏ
ｐｈａ　ｕｓのコラゲナーゼが挙げられる。

さらに、本発明の蛋白質のペプチド配列決定後に、対応
するヌクレオチド配列を再構築できるようになる；これ
らの対応するヌクレオチド配列をその順に合成しクロー
ニングすることができる。

本発明はさらに、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と
相関し得る、ヌクレオソームに結合した抗体から成る複
合体を、それらを含有すると思イ〕れる組織又は生物学
的体液中でＩｎ　ｖｉｔｒｏ検出する方法に関するが、
この手順は、組織又は生物学的体液中におそらく存在す
る前記複合体と前記蛋白質との間でＩｎ　ｖｉｔｒｏで
の免疫反応を起こさせる条件下で、この組織又は生物学
的体液を本発明の９４　ｋＤａ蛋白質又はこの蛋白質の
任意の断片と接触させること、並びに、一方の前記蛋白
質と、他方のヌクレオソームに結合した抗体との間にお
そヂらく形成する免疫学的複合体のｉｎ　ｖｌｔｒｏ検
出を包含する。

好ましくは、ヒト血清により又はＳＬＥ患者の腎糸球体
により生体媒質を構成する。

このような検出の実施には任意の標準方法を用いてもよ
い。

免疫（ＲＩ　Ａ）法、又は同等の方法がある。

したがって、本発明はまた、酵素、螢光物質、放射性物
質等のタイプの適当なマーカーを用いて標識した、上記
定義の９４　ｋＤａ蛋白質又はこの蛋白質に任意の断片
に関する。

このような方法は、例えば、以下の段階：ミクロ滴定プ
レートのウェル中に限定量の本発明蛋白質を沈着させる
段階と、 一診断を要する血清を希釈倍率を漸増させた希釈液とし
て前記ウェル中に導入する段階と、ミクロプレートをイ
ンキュベーションする段階と、 ミクロプレートを繰り返し洗浄する段階と、−血中イム
ノグロブリンに対する標識抗体をミクロプレートウェル
中に導入する段階であり、ここで基質を加水分解し、し
たがって少なくとも特定の波長でこの基質のエネルギー
吸収を変化させることが可能なものから選択した酵素を
用いてこれらの抗体の標識を実施する段階と、 一対照との比較によって、加水分解された基質の量を検
出する段階と を包含する。

本発明はまたＳＬＥのｔｎ　ｖｔｔｒｏ診断用キットに
も係り、このキットはニ 一本発明の９４　ｋＤａ蛋白質（標識又は未標識）又は
上記の任意のこの蛋白質断片を含有する組成物と、 一免疫学的反応を行うのに適した媒質を構成するための
試薬と、 一前記蛋白質と上記抗体−ヌクレオソーム複合体との間
に形成された免疫学的反応により産生された複合体の検
出を構成するための試薬であり、但しこのような試薬は
マーカーを含んでもよく又は、上記蛋白質が標識されて
いないより特定的な場合には、標識試薬により順次認識
され得るものである試薬と、 一上記蛋白質によって認識される抗体を欠く対！邑 ソーム複合体を含有する対象サンプルとを含む。

本発明の別の対象は、一方の特定の核酸と他方のヒスト
ンとの間に形成された複合体を、本発明の蛋白質を細胞
表面に現出させ得る細胞と接触させて、特定の核酸、ヒ
ストン及び前記ポリペプチドから成る完全体の前記細胞
内でインターナリゼーションを構成するためのことを包
含する細胞トランスフェクションの方法である。

を利な特徴によれば、上記のＬＯＫＢ　Ｓ、Ｌ、ら（１
９８９）の論文に記載の手順においては数時間を要して
いるが、上記のトランスフェクション法は数分間以内で
前記核酸のインターナリゼーションを起こすことができ
る。

本発明は、より詳細には、前記の特定の核酸が特異的ポ
リペプチドをコードする核酸配列と、もし必要ならば、
細胞宿主中でこの核酸断片の発現を構成するための調節
エレメント、特に前記細胞宿主のポリメラーゼによって
認識されるプロモーターとを含有する、上記のようなト
ランスフェクション法に関する。

培養中の形質転換宿主細胞を適切な培養培地中に置き、
その後これらの細胞から又は培養培地から特異的ポリペ
プチドを回収することにより、特異的ポリペプチドの単
離を行う。

本発明はまた、生理学的に許容可能な賦形剤とともに、
ヒストン又はヌクレオチドムに結合した特定治療上活性
な核酸を含有する医薬組成物に関する。

グ活性な任意のヌクレオチド（特にオリゴヌクレオチド
）を意味する。

「選択的遮断」とは、１種以上の遺伝子の転写中の核酸
の複製の開始、増殖（ｐｒｏｐａｇａｔ　ｔｏｎ）又は
終止に関連する配列の遮断、及び／又はそれらの遺伝子
に対応するＲＮＡメツセンジャーの翻訳の両方を意味す
る。

それはまた、「遮断された」配列に蛋白質、例えば酵素
又は化学物質を得させないようにする保物又は腫瘍起源
の疾患の治療にこれらの医薬組成物を利用することであ
る。

本発明はまた、上記の本発明モノクローナル抗体に対す
る抗イデオタイブモノクローナル抗体に関する。

本発明はさらに、上記のような抗イデオタイブ抗体及び
生理学的に許容可能な賦形剤を包含する医薬組成物、並
びに特にＳＬＥの治療にこれらの組成物を利用すること
に関する。

本発明はまた、当業者に公知の手法に従って、限定量の
９４　ｋＤａの蛋白質又は本発明のこの蛋白質の１千意
の断片に共有結合されたヒト若しくは動物の膵臓細胞に
よって構成された組成物に関する。

４半半これらの組成物を生理学的に許容可能な賦形剤と
ともに使用して、宿主（ヒト又は動物）に導入後、９４
　ｋＤａ蛋白質に特異的なサプレッサーＴ細胞を誘導す
ることが可能である。

所望の免疫抑制筒度の関数として、膵臓細胞に結合した
９４　ｋＤａ蛋白質の量を定める。

特に興味深い実施態様によれば、本発明は、ＳＬＥと相
関し、おそらくヌクレオソームと結合した抗体を、それ
を含有すると思われる生物学的組織又は体液中でＩｎ　
ｖｌｔｒｏ検出する方法に係り、この方法は： 前記生物学的組織若しくは体液を２ ・上記の９４　ｋＤａ蛋白質とヌクレオソームとの間に
形成される複合体と接触させるか、・又はこの蛋白質断
片がヌクレオソームと結合しているとした場合にはヌク
レオソームとこの１４　ｋＤａ蛋白質の任意の断片との
間に形成される複合体と接触させることであって、必要
ならば、この断片は、〜ＩＡｂ　　ＰＭＥ７７によって
及び／又はＳＬＥ患者の血ｌｉｔ中に存在する抗体によ
って認識可能な１個又は数個の部位を有すること、 一生物学的組織又は体液中におそらく存在する前記抗体
と上記の複合体との間にｉｎ　ｖｉｔｒｏでの免疫学的
反応を起こさせる条件下でこの接触を実施すること、並
びに 一前記複合体と前記抗体との間に形成される免疫学的複
合体をＩｎ　ｖｉｔｒｏ’検出することを包含すること
を特徴とする。

本発明はより詳細には上記の方法に係り、この方法は； 一前記９４　ｋＤａ蛋白質又は上記のようなこの蛋白質
断片を、固体担体、特にＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着
アッセイ）で使用されるミクロ滴定プレートニようなプ
レートのウェルに結合すること、−前記固体担体に結合
している担体に結合していない９４　ｋＤａ蛋白質又は
その断片を除去すること、一固体担体に結合したこの９
４　ｋＤａ蛋白質又はその断片をヌクレオンームとイン
キュベーションして、前記９４　ｋＤａ蛋白質又はその
断片とヌクレオソームとの間に複合体（以後これらの複
合体を、９４　ｋＤａ−ヌクレオワーム１夏合体と呼称
する）を形成すること、 一固体担体に結合している９４　ｋＤａ蛋白質又はこの
蛋白質の断片に結合していないヌクレオソームを除去す
ること、 一固体担体に結合した９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複
合体を前記の生物学的組織又は体液とインキュベーショ
ンすること、 一固体担体に結合している９４　ｋＤａ−ヌクレオソー
ム複合体に結合していない生物学的組織又は体液の構成
成分を除去すること、 一生物学的組織又は体液中に存在すると思われるヌクレ
オソームにおそらく結合する抗体と９４ｋＤａ−ヌクレ
オソーム複合体との間に形成される免疫複合体がもし存
在すれば、これを検出するこを包含する。

本発明はまた上記方法に係り、この方法は：固 −９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を、列体担体、特
にＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）で使用され
るミクロ滴定プレートのようなプレートのウェルに結合
すること、但しこれらの９４　ｋＤａ　−ヌクレオソー
ム複合体を、前記９４　ｋＤａ蛋白質又は上記のその蛋
白質断片をヌクレオソームと結合することにより予め形
成すること。

一固体担体に結合している担体に結合しない上記９４　
ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を除去すること、一固体
担体に結合した９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を
前記生物学的組織又は体液とインキュベーションするこ
と、 一固体担体に結合している９４　ｋＤａ−ヌクレオソー
ム複合体を前記生物学的組織又は体液の構成成分を除去
すること、 一生物学的組織又は体液中に存在すると思われるヌクレ
オソームとおそらく結合する抗体と　９４ｋＤａ−ヌク
レオソーム複合体との間に形成すると思われる免疫学的
複合体を検出することを包含する。

上記の方法を実施する好ましい方法によれば、生物学的
組織又は体液中におそらくは存在する抗体と免疫学的に
反応すると思われる好ましくはヒトの抗イムノグロブリ
ンを用いて、ＳＬＥに特異的な抗体の検出段階を実施す
る。これらの抗イムノグロブリンは、特にアルカリ性ホ
スファターゼのような酵素を用いて標識される。

「ヌクレオソーム」という表現は、ポリヌクレオソーム
（数百側のヌクレオソームを含有する）、オリゴヌクレ
オソーム（約１０〜２０個のヌクレオソームを含有する
）、モノヌクレオソーム、クロマチン、又はＤＮＡとヒ
ストンとで形成する複合体を包含する。

好ましくは、９４　ｋＤａ蛋白質は、１５０〜２００塩
基対のＤＮＡ断片と特にＨＡ、ＨＢ、Ｈ３又は２ Ｈ４型のヒストンとで構成される、特に白血病マウスＬ
　１２１０由来のモノヌクレオソームと結合する。

本発明の対象は、ＳＬＥのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断のため
に、より詳細には急性期から緩解期に向かうＳＬＥの進
行を監視するために、上記の方法を適用することである
。

好ましくは、ヒト血清によって又はＳＬＥ患者の腎糸球
体によって生物学的媒質を構成する。

本発明はまた、上記の９４　ｋＤａの蛋白質とヌクレオ
ソームとの間で形成される生物学的複合体に関する。

本発明の好ましい生物学的複合体は、前記９４ｋＤａ蛋
白質が白血病マウスＬ　１２１０から得られ、１５０〜
２００塩基対のＤＮＡ断片によって構成されるモノヌク
レオソームと結合することを特徴としている。

９４　ｋＤａ蛋白質とヌクレオソームとの間の複合体に
おいては、これらのヌクレオソームと前記蛋白質との間
に生じると思われるあらゆるタイプの結合（共有的又は
非共有的）であると理解されるべきである。

本発明はまた、これらのポリペプチド画分がヌクレオソ
ームによって認識されると思われる結合部位を有し、且
つもし必要ならば結合部位を、９４ｋＤａ蛋白質を認識
するものと同じモノクローナル抗体によって認識するこ
とができると仮定する場合には、９４　ｋＤａ蛋白質よ
り低分子量のポリペプチド画分にヌクレオソームを結合
することによって形成される複合体に関する。

本明細書中で使用するｒ９４ｋＤａ−ヌクレオソ−ム複
合体」という表現は、ヌクレオソームと　９４ｋＤａの
細胞表面蛋白質との間に形成される複合体、並びにヌク
レオソームと上記の９４　ｋＤａ蛋白質の断片との間に
形成される複合体に対して呼称する。

本発明の別の対象は、特に本明細書中に記載の方法を実
施するための、上記定義の生物学的複合体を包含する生
物学的試薬（又は実験室試薬）及びこれらの試薬の使用
である。

本発明はさらにＳＬＥに結合した抗体をｉｎ　ｖｌｔｒ
ｏで検出するための診断キットに関し、このキ・ソトは
ニ ー必要に応じて固体担体に結合させた上記の９４　ｋＤ
ａ蛋白質又はこの蛋白質の任意の断片と、−ヌクレオソ
ームと上記９４　ｋＤａ蛋白質との間の複合体又は、ヌ
クレオソームと上記のこの蛋白質の断片との間の複合体
の形成に適した媒質を構成するための試薬及びヌクレオ
ソームと、−おそらく生物学的組織又は体液中に存在す
る抗体と上記９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と、
−生物学的組織又は体液中におそらく存在するたの みの試薬と、 一前記抗体と９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体との
間の免疫学的反応中に形成される複合体の検出を構成す
るための試薬と を包含する。

ＳＬＥに結合した抗体をＩｎ　ｖｌｔｒｏで検出するた
めの特に有益な本発明の診断キットはニー必要に応じて
固体担体に、結合させた、上記の生物学的９４　ｋＤａ
−ヌクレオソーム複合体と、−生物学的組織又は体液中
におそらくは存在する抗体と上記９４　ｋＤａ−ヌクレ
オソーム複合体との間の免疫学的反応を実施するのに適
した媒質を（１′４成するための試薬と、 一前記抗体と９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体との
間のの免疫学的反応グ中に形成される複合体の検出を構
成するための試薬と を包含する。

前記抗体と９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体との間
で形成される複合体の検出を効果的に構成するための試
薬は、マーカーを担持するか又は標識試薬によって順次
認識され得る。

本発明はまた、ヌクレオソームと、結合した９４　ｋＤ
ａ蛋白質により構成される複合体に対する又は、ヌクレ
オソームと結合した上記のようなこの蛋白質の任意の断
片により構成される複合。（２３）特許請求の範囲第１
７項又はモノクローナル抗体に関する。

上記の定義の９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と免
疫学的に反応することが可能なこれらの抗体は、より一
般的には「抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体」とい
う表現で示される。

ハイブリドーマ法によりこのようなモノクローナル抗体
を産生じてもよく、その一般的な原理を以下に述べるる
。

動物を、先ず上記の９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合
体を用いて免疫すると、やがてその動物のＢリンパ球は
これらの複合体に対する抗体を産生ずる。

次に、これらの抗体産生リンパ球を「永久増殖性」骨髄
腫細胞と融合してハイブリドーマを生成する。

このようにして得られた細胞の不均質混合物から出発１
．て、次に、特定の抗体を産生ずることができ、且つ際
限なく増殖することができる細胞の選択を行う。各ハイ
ブリドーマをクローン形態に増殖させ、各々をモノクロ
ーナル抗体の産生に導き、本発明の複合体に関し、その
認識特性を、例えば本発明の特に有効な特徴によれば、
上記の抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体は、生物学
的サンプル中に含有すると思われるＳＬＥに結合した抗
体のＩｎ　ｖｌｔｒｏでの定量分析（又は投与、又は滴
定）方法を実施するうえで非常に興味深いものである。

本発明は、より詳細には生物学的組織又は体液中に含有
すると思われる、ＳＬＥと相関可能な抗体の量をｉｎ　
ｖｉｔｒｏで測定する方法に関し、この方法はニ ー上記複合体の全部を上記抗体との免疫学的結合に従事
させるといった方法で、確定量の抗９４ｋＤａ−ヌクレ
オソーム抗体に９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を
接触させること、 一生物学的組織又は体液中におそらく存在する抗体と、
上記９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体に対する抗９
４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体との間の競合反応の実
施を構成するための条件下で、先の免疫学的反応の生成
物即ち（９４ｋＤａ−ヌクレオソーム）（抗９４　ｋＤ
ａ−ヌクレオソーム）複合体を生物学的組織又は体液と
接触させること、 −９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と結合していない
抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量が又は、依然
としてこれらの複合体と結合している前記抗体の量のい
ずれかを１ｎ　ｖｌｔｒｏで検出すること、但し検出さ
れるこの抗体量は生物学的組織又は体液中に含まれるＳ
ＬＥに結合した抗体量と相関すること を包含することを特徴とする。

上記のＩｎ　ｖｉｔｒｏでの投与方法は、以下の段階：
−９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を、固体担体、
特にＥＬＩＳＡに使用されるミクロ滴定プレートのよう
なプレートのウェルに結合する段階と、一固体担体に結
合している担体に結合していない上記９４　ｋＤａ−ヌ
クレオソーム複合体を除去する段階と 一担体と結合した先の複合体を、前記複合体の笛より過
剰の、確定量の抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体と
インキュベーションする段階と、−９４ｋＤａ−ヌクレ
オソームと抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体との間
で、先のインキュベーション段階中に形成される複合体
（９４ｋＤａ−ヌクレオソーム）−（抗９４　ｋＤａ−
ヌクレオソーム）を、生物学的組織又は体液とインキュ
ベーションする段階と、 担体に結合している９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合
体にもはや結合してｊいない抗９４　ｋＤａ−ヌクレオ
ソーム抗体を除去し、必要ならば該抗体を洗浄液中に回
収する段階と、 −９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と結合していない
抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量か又は、依然
としてこれらの複合体と結合している前記抗体の量のい
ずれかをＩｎ　ｖｌｔｒｏで検出する段階であって、但
し検出される抗体量は、生物学的組織又は体液中に含ま
れるＳＬＥに結合した抗体量と相関する段階 に従って実施すると効果的である。

上記ｉｎ　ｖＨｒｏ投与を実施する有効な方法によれば
、抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体を特に酵素を用
いて標識する。生物学的組織又は体液中におそらく存在
するＳＬＥ特異抗体の量の測定を：−上記方法の最終洗
浄段階後に回収された標識９４　ｋＤａ−ヌクレオソー
ム抗体の量を直接検出することによって；この場合、Ｓ
ＬＥ特異抗体量は洗浄液中に回収される標識抗９４　ｋ
Ｄａ−ヌクレオソーム抗体の量に直接対応する、 −又は、９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体に結合し
た標識抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量を間接
的に検出することによって；この場合、ＳＬＥ特異抗体
の量は、一方における生物学的組織又は体液とのｌイン
キュベーション段階前に９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複
合体に結合した標識抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体
の量と、他方における生物学的組織又は体液とのインキ
ュベーション及び、上記のｌｎ　ｖｉｔｒｏ投与方法に
従った洗浄の最終段階後の９４　ｋＤａ−ヌクレオソー
ム複合体に結合した抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗
体の量との間の差に対応する、 実施する。

上記のｌｎ　ｖｉｔｒｏでの投与方法を実施する別の方
法では、抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体を標識し
ないで、並びに最終洗浄段階後に洗浄液中に回収される
抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量又は、生物学
的組織又は体液とのインキュベーション及び洗浄の最終
段階後に依然として９４　ｋＤａ−ヌクレオワーム１Ｍ
。合体に結合しているこれらの抗体の量を、これらの抗
体と免疫学的に反応すると思われる漂識抗−イムノプロ
プリンを用いて検出する。

本発明はまた、上記のＳＬＥ特異抗体の１ｎＶＩｔｒＯ
検出用キツトの全構成成分Ｖを包含することを特徴する
ＳＬＥに特異的な抗体のＩｎ　ｖｔｔｒｏ検出及び投与
のための診断キット、並びに必要に応じて特に酵素又は
放射性物質マーカーを用いて標Ｊ’Ｊ 識した抗９４　ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の確定量に
関する。

本発明の９４　ｋＤａ−ヌクレオソームの検出方法を具
体例を用いて以下に説明する。

ヌクレオソームは、イムノブロッティングにより、９４
　ｋＤａの蛋白質と直接結合する、ＴｒｉｔｏｎＸ　−
１１４で抽出後、（材料と方法の項に記載の）膜画分の
界面活性剤ト目を、５ＤＳ−ポリアクリルアミド（７，
５％）上でのゲル電気泳動で分離し、次いでニトロセル
ロースシート上に移動させる。ヌクレ、ｔ−ソーム（１
μｇ）を、室温で１時間、このシート上でインキュベー
ションした後、このシートを緩衝液Ｔ　Ｂ　Ｓ　Ｔ　（
Ｔｒｉｓ　ｌｏＯｍＭ、　Ｎ　ａ　Ｃ１）　１５０ｍＭ
　。

７ｗｅｅｎ　０．０５％　、　ｐＨ８）で１０分間に３
回洗浄する。

次いで、このシートを精ＴＡＭＡｂ　　ＰＭＥ７７（１
０μｇ）と−緒にインキュベーションする。

洗浄後、このシートを、アルカリ性ホスファターゼで標
識した　１／　１０００希釈のマウス抗イムノグロブリ
ンと一緒にインキュベーションする。洗浄後、シートに
結合した抗イムノグロブリンを、Ｔｒｉｓ　ｌｏＯｍＭ
、　Ｎ　ａ　ＣΩ１００ｍＭ及びＭｇＣΩ２５ＩｆｉＭ
から成るｐＨ９，５のＶ！衝液を用いて可視化する。

Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１０ＩＩＩＭを用いて反応を停止する
。

ＭＡｂ　　ＰＭＥ７７を分泌するハイブリドーマを、寄
託番号１−５５５として、パリ（フランス）のパスツー
ル研究所のｔｈｅ　Ｃｏ１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎ
ａｌｅ　ｄｅｓＣｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ−
Ｏｒｇａｎｌｓｎｅｓ　（ＣＮＣＭ）に寄託した。

本発明の生物学的複合体中の、９４　ｋＤａ蛋白質又は
上記の該蛋白質断片に結合したヌクレオソーム、及びよ
り詳籟１にはモノヌクレオソームは、９４　ｋＤａの蛋
白質に結合していると思われるものの中から一般に選択
される。

特にＬｕｔｔｃｒ　Ｃ，（１９７８）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ
ｌｏｌ、、　１２４．３９１〜４２０りに記載の方法に
従って、細胞核からヌクレオソームを得るために用いる
古典的手法により、ヌクレオソームを含有すると思われ
るすべての生物学的組織又は体液からヌクレオソームを
得る。

上記と同様に得られたヌクレオソーム調製物のアリコー
トを、これらのヌクレオソームを本発明の複合体に用い
ることができるかを立証するために、９４　ｋＤａ蛋白
質のヌクレオソームへの結合テストに使用することがで
きる。

具体例として、このテストは、これらのヌクレオソーム
を固体担体に結合した９４　ｋＤａ蛋白質と接触させる
こと、次に洗浄して、９４　ｋＤａ蛋白質に結合してい
ないヌクレオソームを除去すること、その後、９４　ｋ
Ｄａ蛋白質に結合したヌクレオソームを麺 特異的に認識すると思われる任意の標記試薬、特にＭＡ
ｂ　　ＰＭＥ７７並びに上記方法に従ってアルカリ性ホ
スファターゼで標識した抗イムノグロブリンを用いて９
４　ｋＤａ′ｆｆｉ白質に結合したヌクレオソームを検
出することを包含する。

さらに本発明の特徴は、本発明に従って前記蛋白質を得
る手法及び条件を説明する過程で明らかにするつもりで
ある。

■−材料と方法 一細胞系 ラット膵臓ランゲルハンス島腫瘍細胞のＲＩ　Ｎａ系（
ＧＡＺＤＡＲＡ、Ｆ、ら（１９８０）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｌ。

（ＵＳＡ）７７、３５１９〜３５２３）　、Ｒａｊｌヒ
トリンパ芽球様細胞系及びサル線維芽細胞（ＣＶＩ細胞
）を、ＴＲ０Ｎ　Ｆ、ら（１９８４）　ＩＥｕｒ、Ｊ、
Ｉ＋ｎ＋ｕｕｎｏ１．、１４．２８３〜２８Ｇの記載と
同様に取得し、維持した。

−マウスモノクローナル抗体（ＭＣＡ）ＤＮＡ抗体を分
泌するハイブリドーマＰ　Ｍ　Ｅ　７７を、非分泌性骨
髄腫系（Ｐ　３　Ｘ　１３３Ａ　ｇ　８．０５）と（Ｎ
　Ｚ　Ｂ　Ｘ　Ｎ　Ｚ　Ｗ　）　Ｆ　Ｉ　Ｂ　／　Ｗ型
牌臓細胞とを融合した後に単離した。ハイブリッドの選
択、この細胞系のクローニング及びサックローリング、
抗体の精製、抗体のクラス及びサブクラスの特徴付け、
並びに抗体の特異性は、１”ｌ？ＯＮ　Ｆ、ら（１９８
０）Ｊ、１ｍｎ＋ｕｎｏ１．．１２５　、２８０５〜２
８０９；及びＪＡＣＯＢｌ７．ら（１９８２）　Ｊ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、＋　１２８　、８９５〜８９ｇに詳細に
３己裁されている。ＭＣＡ　　ＰＭＥ７７は、Ｉ　ｇＧ
２ｂ抗体であり、二本鎖（＋ｌ５ＤＮＡ）に特異的であ
ると記載されている（上記）ＪＡＣＯＢ　Ｌ、ら（１９
ｇ２））。

−精製膜画分の調製 ＧＡＳＴＩＮＥＬ　Ｌ、Ｎ、　　（１９８２）　Ｂｌｏ
ｃｈ！ｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ。

６８４．１１７〜１２６に記載された方法に従って、精
製膜両分を調製した。１０００万個の生細胞をリン酸塩
緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で３回洗浄した。この細胞を′１
゜ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣΩ、　　ｌｏｍＭのＣａＣΩ２
及び０．２５Ｍのショ糖を含゛ｕし、ｐＨ７，４に調整
した緩衝液Ａ７ｍｌ中に懸濁した。プロテアーゼ阻害剤
の存在下、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー中でホモジナイ
ゼーションを実施した。このホモジネートヲ１０００×
ｇテ２０分間遠心分離した。次に、この上清を２（１，
（１０（ＩＸ　ｇでむ調製物に相当する。

−ＴｒｌｔｏｎＸ　−１１４（Ｔ　Ｘ　−１１４）によ
る精製膜画分の抽出 上記と同様に調製した両分をＰＢＳ中１％のＴ　Ｘ　−
１１４（Ｆｌｕｋａ）　（ＢＯＲＤＩＩＥＲＪ、　（１
９８１）　Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈａｎｔ、　２５Ｇ　、　
１１３０４〜１８０７）を用いて４℃で可溶化し、２０
％ショ糖液中、４℃で１時間１００．０００　Ｘ　ｇで
遠心分離し、次いで３７℃の試験管に移して３分間イン
キュベーションした。室温で３分間３．００Ｏｒｐｍで
遠心分離した後、ペレット及び上清を保存して分ト斤し
た。疎水性膜蛋白質（ペレット）を界面活性剤相中に回
収し、また可溶性蛋白質（上清）を水ｔｎに回収した。

！・リブシン処理 ＲＩ　Ｎｍ生細胞をＯ℃テ５．ｔＯ及び２０分１１４７
．５０Ｍｇ　／　ｍｌのトリプシンで処理した。トリパ
ンブルー排除試験によって細胞の生育性を評価した：こ
の生育性は全ての調製物中で９８％であり、トリプシン
処理終了時にも依然として変化しながった。

細胞抽出物を上記と同様にＴ　Ｘ　−１１４を用いて抽
出した。トリプシン処理によって得た界面活性剤相をイ
ムノトランスファ法で分析した。

モノクローナル抗体Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７の上清をＤＮＡセ
ルロース（Ｓｉｇｍａ）カラム上に載置した。ＰＢＳで
洗浄した後、ＭＡｂ　　ＰＭＥ７７を２ＭＮａ（１！（
ｐｌ＋８）で溶出した。

ＭｇＣｊ７２　（２０Ｏｕｇ）を含むＩｔ　ａ　ｎ　ｋ
　ｓ液に溶解したＤ　Ｎ　Ａ　ｓｃ　Ｉ　（Ｗｏｒｔｈ
ｌｎｇｔｏｎ）を用いて４℃で１時間処理した。

一イムノトランスファ分析 ＪＡＣＯＢ　Ｌ、ら（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＩＩＳＡ）。

Ｈ，３８４３〜８８４５に記載の方法に従って、この分
析ＤＮＡ−セルロースカラムから溶出したＭＡｂＰ　Ｍ
　Ｅ　７７を、ＰＢＳ緩衝液中、活性化トリスアクリル
ビーズ（ＩＢＦ）に共有結合したヒストンから成るカラ
ムに通した。その溶出物はこれらの実験に用いる精製Ｍ
Ａｂ　　ＰＭＥ７７に相当する。

−ＤＮＡ及びヒストンのよ１製 λファージ（Ｂｏｅｂｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ
　）のＤＮＡを、プロテアーゼＫ　（Ｂｏｅｈｒｌｎｇ
ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｌｍ　　；　４℃で１時間１００μ
ｇ　／　ｍｌ　）で消化し、その後フェノールで抽出し
て精製した。ヒストンを、ｌＯμＨ性細胞をパラホルム
アルデヒドの新鮮な調製溶液で固定し、ＭＡｂ　　ＰＭ
Ｅ７７と一緒にインキュベーションし、フルオレセイン
（ＢＩｏｓｙｓ、ＣｏＬＩｌｐｌｃｇｎｃ−フランス）
で標識したマウス抗ＩｇＧを用いて顕現化した。

一クロマチン及びヌクレオソームの調製ＬＵＴＴＥＲＣ
，（１９７８）　　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　　１２
４．　３９１　〜４２０に記載の方法で細胞培養し増殖
した白血病細胞Ｌ　１２１０の咳からクロマチン及びヌ
クレオソームを調製した。調製物の純度を分析するため
に、０．８９６アガロースゲル及び臭化エチジウム中の
３．６％Ｎ　ａ　ＤｏｄＳ　Ｏ４／ポリアクリルアミド
ゲルでの電気泳動を行った。モノヌクレオソームに関す
る１つのバンドが可視化された。それらの純度は少なく
とも９５９６である。

ＫＯ’ｒ’ＺＩＮ　１３．Ｌ、ら（１９８４）　Ｊ、Ｉ
ｍＩＩＩｕｎｏｌ、、　１３３　。

２５５４〜２５５７による論文に記載の方法に従って、
この方法を実施した。

■、−結果 抗ＤＮＡ抗体が細胞表面蛋白質を認識し得る機構を解析
するために、エラスターゼの作用により放出され、イム
ノトランスファ中のモノクローナル抗体により認識され
るポリペプチドの部分配列を測定した。

これらのポリペプチドは無傷のヒストンと同一の配列を
有し、ＭＡｂ　　ＰＭＥ７７の細胞培養物の上清はイム
ノトランスファによって精製されたヒストンとも反応す
る。これらの結果は、細胞表面でのモノクローナル抗体
Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７の結合がＤＮＡ−ヒストン複合体の形
成を意味し得ることを示唆している。

ＭＡｂ　　ＰＭＥ７７はＤＮＡ−ヒストン複合体に対し
て高い親和性を有し得るために、慣用的精製方法によっ
ては遊離抗体を得ることができない。

その結果、引き続きＭＡｂ　　Ｐ〜ＩＥ７７の精製方法
を選択してきた。この抗体を先ずＤＮＡ−セルロースカ
ラムに結合した。２ＭＮａＣｇで溶出したモノクローナ
ル抗体は、ＮａＤｏｄＳＯ４／ポリアクリルアミドゲル
での電気泳動上Ｈ鎖及びＬ鎖を含むが、ヒストンを含ま
ない。次に、溶出した抗体を、任意の汚染ＤＮＡを除去
するために、活性化トリスアクリルに共有結合したヒス
トンのカラム上に載置した。

得られた溶出物を、以後、精製ＭＡｂＰＭＥ７７（Ｐｍ
Ａｂ）と呼称する。ＰｍＡｂは、ｄｓＤ　Ｎ　Ａ（第１
図）と反応するが、イムノトランスファ（第４Ａ図、ラ
インＣ参照）によって及びＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ（第１図
）によって精製されたヒストンと反応しない。ＰｍＡｂ
＋ＤＮＡはイムノトランスファ（第４Ａ図、ラインｄ参
照）及びＥＬ　Ｉ　ＳＡによって精製されたヒストンと
反応するが、これは、ＤＮＡ非存在下でＰｍＡｂとの反
応で起こるものと対比される（第４Ａ、ラインＣ参照）
。したがって、ＰｍＡｂはＤＮＡ及びヒストンと複合体
を形成することができる。ＰｍＡｂは、ＥＬＩＳＡにお
いて、ＤＮＡ単独とよりも精製ヒストンと結合したｄｓ
Ｄ　Ｎ　Ａとより良く反応する（第１図）。

ＰｍＡｂはＤＮＡ−ヒストン複合体と反応するために、
ＰｍＡｂがクロマチン及びヌクレオソームとも反応する
という可能性もテストした。第２図に示すように、ＥＬ
ＩＳＡにおいて、ＰｍＡｂはクロマチン、ポリヌクレオ
ソーム、オリゴヌクレオソーム及びモノヌクレオソーム
に結合する。これらの結果は、ＰｍＡｂがＤＮＡ単独に
対してよりもＤＮＡ−ヒストン複合体に対して、特にモ
ノヌクレオソーム及びオリゴヌクレオソームに対して高
い親和性を有することを示唆している。

−細胞表面へのＰｍＡｂ−ＤＮＡ−ヒストン複合体の結
合 に結合しない（第３Ｃ図）。しかしながら、もし精製ヒ
ストンと結合したｄｓＤ　Ｎ　ＡをＰｍＡｂに付加する
ならば、形成された複合体は細胞表面で強く且つ一様に
反応する（第３ａ図）。ＤＮＡ又はヒストンが欠けてい
る場合には有為な反応は全く観察されない。これらの結
果は、ＰｍＡｂがＤＮＡ−ヒストン複合体の媒介によっ
て細胞表面に結合することを実証している。

９４　ｋＤａ蛋白質は細胞表面蛋白質に対応する性質を
もつ。

この９４　ｋＤａｆｆｌ白質は、可溶化されるためには
界面活性剤の使用を必要とし並びに、界面活性剤ＤＮＡ
−ヒストン複合体の存在中又は非存在中でのＰｍＡｂの
結合を、精製ＲＩ　Ｎｍ細胞の膜画分から得た、界面活
性剤Ｔ　Ｘ　−１１４に富む相中でテストした。ＰｍＡ
ｂ−ＤＮＡ−ヒストン複合体をニトロセルロース帯に塗
布するとき、イムノトランスファ実験により単一の９４
　ｋＤａ蛋白質が検出された（第４Ｂ図、ラインＣ）。

もしＤＮＡを欠く場合には、ポリペプチドは全く検出さ
れなかった（第４Ｂ図、ラインａ）　。ＰｍＡｂ−ＤＮ
Ａ複合体の存在下では、弱い反応が観察された（第４Ｂ
図、ラインｂ）。

動をする（第５Ａ図、ラインｂ）。さらに、細胞の生育
性を変えないトリプシンで生細胞を簡単にいることを示
している（第５Ｂ図）。トリプシン処理後に得られた上
清のイムノトランスファ分析により、トリプシン分解さ
れた断片が全く見出されなかったことは、ヌクレオソー
ムの９４　ｋＤａ蛋白質への結合部位がトリプシンに非
常に感受的であることを示唆している。９４　ｋＤａ蛋
白質は、異なるタイプの細胞：　ＲａｊｌのヒトＢリン
パ芽球様細胞系の細胞、ＣＶＩサル細胞、及びＲＩＮＩ
１１ラットＳ瘍細胞系の膵臓ランゲルハンス島の表面で
見出された。

Ｐ　Ｍ　Ｅ　７フ−ヌクレオソーム複合体と９４　ｋＤ
ａ蛋白質との結合 精製クロマチン、ポリヌクレオソーム、オリゴヌクレオ
ソーム、及びモノヌクレオソームをランスファによって
、先に得られたのと同じ結果が観察された。しかしなが
ら、イムノトランスファによって、モノヌクレオソーム
ーＰｍＡｂ複合ら細胞表面と、またイムノトランスファ
から細胞表面の９４　ｋＤａ蛋白質と反応することを立
証している。

−ＤＮＡ−ヒストン複合体の媒介による、活性期ＳＬＥ
に罹患した患者の血清をＤＮＡ−セルロースカラムに通
した。抗体を２Ｍ　　ＮａＣΩで溶出した。ＤＮＡ−ヒ
ストン複合体を添加した場合には、精製抗体は９４　ｋ
Ｄａ蛋白質と免疫学的反応を引き起こす（第６図、ライ
ンＣ）。ＤＮＡ及びヒストンで構成される抗体を含有す
ると思われる、急性期の患者の３種の血清から得た溶出
物は９４ｋＤａ蛋白質と反応するが、一方、不活性期（
又は、緩解期）の２種の血清から得た溶出物は９４　ｋ
Ｄａ蛋白質と反応しない。

以下に、図面の説明をするニ ー第１図：　ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおけるＰｍＡｂと、ｄｓ
Ｄ　Ｎ　Ａ　、ヒストン、及びｄｓＤ　Ｎ　Ａ＋ヒスト
ンとの反応。

ムは：　ＤＮＡ　（１ｕ　ｇ／ｍｌ）＋ヒストン（２，
５μｇ　／　ｍｌ　）　　・ 閣は：　ＤＮＡ　（１ｕ　ｇ／ｍｌ）、○は：ヒストン
（２，５μｇ　／　ｍｌ　）を示す。

−箱２図：ＥＬＩＳＡにおけるＰｍＡｂ（１５ｕ　ｇ　
／　ｍｌ　）と、ｄｓＤＮＡ（Δ）、り０７チン（・）
、ポリヌクレオソーム（ム）、オリゴヌクレオソーム（
０）、及びモノヌクレオンーム（■）るＰｍＡｂと細胞
表面との結合。

（ａ）ＰｍＡｂ　（２０ｕｇ）　十ＤＮＡ　（ｌμｇ）
＋ヒストン（５μｇ）。

（ｂ）　ＰｍＡｂ　（２０ｕｇ）＋モノヌクレオソーム
（８μ　ｇ）。

（ｃ）　ＰｍＡｂ　（２０ｕｇ）。

−第４図ニ ー第４Ａ図：　ＤＮＡの存在下又は非存在下でのイムノ
トランスファによる、ＰｍＡｂとＲａｊｌ細胞抽出物及
び精製ヒストンとの反応。

ライン（又はカラム又は垂直列）： ａ、　　ＰｍＡｂ　（２０ｕｇ）とＲａｊ！細胞抽出物
との反応； ｂ、　ＰｍＡｂ　（２０ｕｇ）　＋ＤＮＡ　（ｌμｇ）
と１？ａｊｌ細胞抽出物との反応； ｃ、ＰｍＡｂ　（２０ｕｇ）と精製ヒストン（１μｇ）
との反応； ｄ、　ＰｍＡｂ　（２０ｕｇ）　＋ＤＮＡ　（１，ｃｚ
ｒ）と精製ヒストン（１μｇ）との反応。

−第４Ｂ図；イムノトランスファによるＤＮＡ−ヒスト
ン複合体の存在下又は非存在下におけるＰｍＡｂと９４
　ｋＤａ蛋白質との結合。ＲＩ　Ｎｍ細胞から得られた
精製膜両分の抽出は、Ｔ　Ｘ　−１１４により行った。

界面活性剤Ｔ　Ｘ　−１１４に富む相を、これらの実験
で抗原として用いた。

ラインニ ａ、　　ＰｍＡｂ　　（２０μ　ｇ）　　；ｂ、　　Ｐ
ｍＡｂ　　（２０μｇ）＋ＤＮＡ　　（ｔ　μ　ｇ）　
　；ｃ、ＰｍＡｂ　（２０μｇ）＋ＤＮＡ　（ｌμｇ）
＋ヒストン（１μｇ）。

ＬＭＷ（低分子量マーカー）は、使用した低分子存在。

スファによる９４　ｋＤａ蛋白質の検出。イムノトラン
スファにおけるトリプシン処理前のＰｍＡｂ（２０μｇ
）＋ＤＮＡ　（ｌμｇ）＋ヒストン（１μｇ）の結合。

ライン（垂直）： ａ、相分離前のＴ　Ｘ　−１１４上清；ｂ、界面活性剤
Ｔ　Ｘ　−１１４に富む相：ｃ　、　Ｔ　Ｘ　−１１４
水相（ＬＭＷは第４図に関して先に示したものと同じ意
味を有する）。

−第５Ｂ図：イムノトランスファによる０℃で５．１０
および２０分間の５０μｚ　／　ｍｌ濃度でのトリプシ
ン処理後のＰｍＡｂ　（２０，ｕ　ｒ）　＋ＤＮＡ　（
１μｇ）＋ヒストン（１μｇ）の結合。

垂直ライン： ａ、　　トリプシンを含まない界面活性剤Ｔ　Ｘ　−１
１４に富む相； ｂ、　　トリプシン（５０μｇ　／　ｍｌで５分間）処
理後の界面活性剤Ｔ　Ｘ　−１１４に富む相；ｃ、）リ
ブシン（５０μｇ　／　ｍｌで１０分間）処理後の界面
活性剤Ｔ　Ｘ　−１１４に富む相：ｄ、トリプシン（５
０μｚ　／　ｍｌで２０分間）処理後の界面活性剤Ｔ　
Ｘ　−１１４に富む相；１立合体存在下又は非存在下で
の、ＳＬＥ　（活性）に罹患した個体の血清から精製し
たポリクローナル抗ＤＮＡ抗体と細胞表面９４　ｋＤａ
蛋白質との結合。

ＲＩＮＯＩ細胞から精製した膜画分から得た界面活性剤
Ｔ　Ｘ　−１１４に富む相を抗原として使用した。

ＳＬＥに罹患した個体の血清を、先ずＤＮＡ−セルロー
スカラムに結合させた。次に、溶出したポリクローナル
抗体を、活性化トリスアクリルに共ａ結合したヒストン
から成るカラムに通した。得られた溶出物は精製抗ＤＮ
Ａポリクローナル抗体に相当する。

ライン（垂直）； ａ、ＰｍＡｂ　（２０μｇ）＋ＤＮＡ　（ｌμｇ）＋ヒ
ストン（１μｇ）； ｂ、ＰｍＡｂ　（２０μｇ）； Ｃ１精製ポリクローナル抗ＤＮＡ抗体（２０μｇ）＋Ｄ
ＮＡ　（１μｇ）＋ヒストン（１μｇ）；ｄ、精製ポリ
クローナル抗ＤＮＡ抗体（２０μｇ）

【図面の簡単な説明】

本発明を、以下の図面を用いてさらに詳細に説明する： 第１図は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法
により、精製モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＰＭＥ７７
と二本鎖ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）との及びヒストンと結
合したｄｓＤＮＡとの反応を示し、 第２図は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法による精製ＭＡｂＰ　Ｍ　
Ｅ　７７と、ｄｓＤ　Ｎ　Ａ　、り０７チン、ポリヌク
レオソーム、オリゴヌクレオソーム及びモノヌクレＤＮ
Ａ及びヒストン存在下で（ｍＢａ図）又はモノヌクレオ
ソーム存在下で（第３ｂ図）又は単独で（第３Ｃ図）、
精製ＭＡｂ　　ＰＭＥ７７をＣＶＩ細胞に結合する研究
を示し、 第４Ａ図は、ＤＮＡの存在下又は非存在下での、精製Ｍ
Ａｂ　　ＰＭＥ７７とＲａｊ　ｉ細胞及び精製ヒストン
との反応のイムノトランスファによる研究を示し、 第４Ｂ図は、ＤＮＡとヒストンとの複合体の存在下又は
非存在下での、９４　ｋＤａ蛋白質と精製ＭＡｂ　　Ｐ
ＭＥ７７との反応のイムノトランスファ面蛋白質との結
合を示す。 ７ンズテイテ】・　ｌぐストクーｔＶ ７ンステイテユ・ナシ７７）し・ドック・プ７テエ出屑
魚人Ｙり・う・ＩレシエＩレジｌ　メｊイｌ＋７膜両分
中の９４　ｋＤａ蛋白質の存在研究を示し、第６図は、
イムノトランスファ実験の結果として、ＤＮＡとヒスト
ンの複合体の存在下又は非存在下でのＳＬＥに罹患した
個体の血清から精製したポリクローナル抗ＤＮＡ抗体と
９４　ｋＤａの細胞表図面の浄書（内容に変更なし。 ｉｇｕｒｅ ｉｇｕｒｅ ｐｇ／ｍｌ　　（ａｎヒ１ｂｏｄｙ） 凶／ｍｌ　（ａｎｔｉｇｅｎ 図面の浄書（内容に変更なし） 図面の浄書（内容に変更なし） １０７９− ■出 アンステイテユ・ナシ オナル・ドウ・う・サ ンテ・工・ドウ・う・ ルシエルシュ・メディ カル フランス国、 ７５６５４・パリ・セデクス・１３、 トルビアツク、 ０１ リュ・ドウ・ ｉｏｓｏ− 事件の表示 手続補正書 （方式） ％式％ ７、補正の内容 （１）明細書中、第８３頁第２行目、同頁第５行目から
第６行目にかけて、同頁第１０行目及び同頁第１３行目
に「研究を示し、」とあるを、それぞれ「研究を示す写
真。」と補正する。 又、間中、第８４頁第１行目に「結合を示す。」とある
を「結合を示す写真。」と補正する。 （２）黒色で鮮明に描いた適正な図面を別紙の通り補充
する。 （内容に変更なし） 発明の名称 特に全身性エリテマトーデス（Ｓ　Ｌ　Ｅ）のｏ　ｗｉ
ｌｒｏ診断の分野における９４　ｋＤｔの細胞表面蛋白
質、その単離方法及びその使用補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）９４ｋＤａの細胞膜蛋白質であって：−精製モノ
   クローナル抗体ＰＭＥ７７と又は、モノクローナル抗体
   ＰＭＥ７７がヌクレオソームと若しくはＤＮＡ及びヒス
   トンから成る複合体と結合する時には、モノクローナル
   抗体ＰＭＥによって認識されるものと同様のエピトープ
   を認識することが可能な任意の他の抗体と免疫学的複合
   体を形成することができること、 −ヌクレオソームの非存在下で又はＤＮＡ及びヒストン
   から成る複合体の非存在下で精製モノクローナル抗体Ｐ
   ＭＥ７７によって認識されないことを特徴とする蛋白質
   又は、上記免疫学的性質を保持し得る前記蛋白質の任意
   の断片。 （２）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹患した患
   者の血清と免疫学的複合体を形成することができること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質。 （３）蛋白質が： −９４ｋＤａの分子量を有すること、 −Ｒａｊｉヒト細胞、サル線維芽細胞（ＣＶＩ細胞）、
   ＲＩＮ＿ｍラットの膵臓腫瘍細胞のような細胞の表面か
   ら単離可能であること、 −疎水性であること、 −特にＴｒｉｔｏｎＸ−１１４又はＸ−１００型の界面
   活性剤溶液に不溶性の細胞膜構成成分を含まないこと、 −トリプシンの作用により、細胞表面から取り出される
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記
   載の蛋白質。 （４）特許請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載
   の蛋白質に対するモノクローナル抗体又はポリクローナ
   ル抗体。 （５）特許請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載
   の蛋白質の単離及び回収の方法であって：−Ｔｒｉｔｏ
   ｎＸ−１１４型の界面活性剤を用いて細胞表面に前記蛋
   白質をおそらく含む動物又はヒト細胞の精製膜を処理し
   、その後前記蛋白質を含有する界面活性剤相を回収する
   ことによる前記蛋白質の抽出と、 −前記蛋白質を含有する相を精製ヌクレオソームと又は
   、精製核酸及びヒストンから成る複合体と接触させ、こ
   れらのヌクレオソーム又は複合体を担体上に固定化する
   ことと、並びに −前記担体を、前記蛋白質及び上記複合体の分離に導く
   溶液と接触させることにより前記担体上に保持された前
   記蛋白質を回収することと を包含する単離及び回収方法。 （６）アフィニティクロマト グラフィー担体中に使用されるヌクレオソーム担体中に
   核酸及びヒストンから成る複合体を、特許請求の範囲第
   １〜３項のいずれか一項に記載の蛋白質に対する特異抗
   体、特に特許請求の範囲第４項に記載のモノクローナル
   抗体と置き替えることを特徴とする特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。 （７）ＳＬＥと相関可能な複合体で、ヌクレオソームに
   結合した抗体から成る複合体を、それらが含有すると思
   われる組織又は生物学的体液中で￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥で
   検出する方法であって、前記蛋白質と組織又は生物学的
   体液中におそらく存在する前記複合体との間で￥ｉｎｖ
   ｉｔｒｏ￥での免疫学的反応に導く条件下で、特許請求
   の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の蛋白質をこの
   組織又は生物学的体液と接触させること、並びに前記蛋
   白質とヌクレオソームに結合した抗体との間で形成可能
   な複合体の￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥検出を包含する方法。 （８）ＳＬＥに特徴的な抗体−ヌクレオソーム複合体の
   ￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥検出用診断キットであって：−特許
   請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載の蛋白質と
   、 −免疫学的反応の実施に適した媒質を構成するための試
   薬と、 −免疫学的反応により生成される、前記蛋白質と上記抗
   体−ヌクレオソーム複合体との間に形成される複合体の
   検出を可能にする試薬と、 −必要に応じて、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか
   一項に記載の蛋白質によって認識される抗体−ヌクレオ
   ソーム複合体を欠く組織又は生物学的体液と、 −さらに必要に応じて、これらの抗体−ヌクレオソーム
   複合体を含有する比較用サンプルとを含む診断キット。 （９）前記蛋白質と前記抗体−ヌクレオソーム複合体と
   の間に形成される複合体の検出を可能にする試薬が、マ
   ーカーを有するか又は標識試薬により順次認識され得る
   ことを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の診断キ
   ット。 （１０）ＳＬＥと相関可能な抗体で、ヌクレオソームと
   結合可能な抗体を、それらを含有すると思われる生物学
   的組織又は体液中で￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥検出する方法で
   あって、 この方法が： −前記生物学的組織又は体液を： ・前記モノクローナル抗体がヌクレオソームと結合する
   時にそれ自体精製モノクローナル抗体ＰＭＥ７７と免疫
   学的複合体をおそらく形成する９４ｋＤａ蛋白質とヌク
   レオソームとの間に形成される複合体と、 ・又は、９４ｋＤａ蛋白質の断片がヌクレオソームとお
   そらく結合するとした場合には、必要に応じて、ＭＡｂ
   ＰＭＥ７７によって及び／又はＳＬＥ患者の血清中に存
   在する抗体によって認識され得る１個又は数個の部位を
   有する断片である９４ｋＤａ蛋白質の任意の断片とヌク
   レオソームとの間で形成される複合体と 接触させること、 −この接触を、生物学的組織又は体液中におそらく存在
   する前記抗体と上記複合体との間で￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥
   での免疫学的反応に導く条件下で実施すること、並びに −前記複合体と前記抗体との間に形成される免疫学的複
   合体の￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥検出 を包含することを特徴とする方法。 （１１）方法が： −９４ｋＤａの蛋白質又は特許請求の範囲第１項記載の
   前記蛋白質断片を、固体担体、特にＥＬＩＳＡ（酵素結
   合免疫吸着アッセイ）で使用されるミクロ滴定プレート
   のようなプレートのウェルと結合させること、 −前記固体担体を洗浄して、担体に結合していない９４
   ｋＤａ蛋白質又はその断片を除去すること、−前記固体
   担体に結合したこの９４ｋＤａ蛋白質又はその断片をヌ
   クレオソームとインキュベーションして、前記９４ｋＤ
   ａの蛋白質又はその断片とヌクレオソームとの複合体（
   以後、これらの複合体を９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複
   合体と呼称する）を形成すること、 −固体担体を洗浄して、９４ｋＤａの蛋白質又はこの蛋
   白質の断片と結合していないヌクレオソームを除去する
   こと、 −固体担体に結合した９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合
   体を、前記生物学的組織又は体液とインキュベーション
   すること、 −固体担体を洗浄して、９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複
   合体と結合していない生物学的組織又は体液の構成成分
   を除去すること、 −生物学的組織又は体液中に多分存在しヌクレオソーム
   とおそらく結合する抗体と９４ｋＤａ−ヌクレオソーム
   複合体との間に形成される免疫複合体が存在すればこれ
   を検出すること を包含することを特徴とする特許請求の範囲第１０項に
   記載の方法。 （１２）方法が： −９４ｋＤａ蛋白質又は特許請求の範囲第１項記載の前
   記蛋白質断片をヌクレオソームと結合することにより予
   め形成された９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を、固
   体担体、特にＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）
   に使用するミクロ滴定プレートのようなプレートのウェ
   ルに結合させること、−固体担体を洗浄して、担体と結
   合していない上記の９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体
   を除去すること、 −固体担体に結合している９４ｋＤａ−ヌクレオソーム
   複合体を前記生物学的組織又は体液とインキュベーショ
   ンすること、 −固体担体を洗浄して、９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複
   合体と結合していない生物学的組織又は体液の構成成分
   を除去すること、 −生物学的組織又は体液中に多分存在しヌクレオソーム
   とおそらく結合する該抗体と、９４ｋＤａ−ヌクレオソ
   ーム複合体との間に形成され得る免疫学的複合体を検出
   すること を包含することを特徴とする特許請求の範囲第１０項に
   記載の方法。 （１３）ＳＬＥ特異抗体の検出段階を、特にアルカリ性
   ホスファターゼのような酵素を用いて標識された抗イム
   ノグロブリンであって、生物学的組織又は体液中におそ
   らく存在する前記抗体と免疫学的に多分反応する、好ま
   しくはヒトの抗イムノグロブリンを用いて実施すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１０〜１２項のいずれか
   一項に記載の方法。 （１４）１５０〜２００塩基対のＤＮＡ断片により構成
   されるヌクレオソームで、特に白血病マウスＬ１２１０
   由来のモノヌクレオソームと結合する９４ｋＤａ蛋白質
   を用いて９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を形成する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１０〜１２項のいず
   れか一項に記載の方法。 （１５）生物学的体液がヒト血清サンプルであることを
   特徴とするＳＬＥの￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥診断のための、
   特許請求の範囲第７項及び第１０〜１４項のいずれか一
   項に記載の方法。 （１８）急性期から緩解期に向かうＳＬＥの進行を監視
   するための、特許請求の範囲第７項及び第１０〜１４項
   のいずれか一項に記載の方法。 （１７）複合体がヌクレオソームと結合している、９４
   ｋＤａ蛋白質又は特許請求の範囲第１項記載の前記蛋白
   質断片により構成されることを特徴とする生物学的複合
   体。 （１８）９４ｋＤａ蛋白質又はその断片を、白血病マウ
   スＬ１２１０から得た及び、１５０〜２００塩基対のＤ
   ＮＡ断片で構成されるモノヌクレオソームと結合するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の生物学
   的複合体。 （１９）特許請求の範囲第１０〜１６項のいずれか一項
   に記載の方法を実施するための、特許請求の範囲第１７
   項又は第１８項記載の複合体を包含する生物学的試薬。 （２０）ＳＬＥに特徴的な抗体の￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥検
   出用診断キットであって： −必要に応じて固体担体と結合させた、９４ｋＤａ蛋白
   質又は特許請求の範囲第１項記載の前記蛋白質断片と、 −ヌクレオソーム及び、前記ヌクレオソームと上記９４
   ｋＤａ蛋白質との複合体又は、ヌクレオソームと上記の
   この蛋白質断片との複合体の形成に適した媒質を構成す
   るための試薬と、 −生物学的組織又は体液中におそらく存在する抗体と上
   記９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体との間の免疫学的
   反応の実施に適した媒質を構成するための試薬と、 −前記抗体と９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体との間
   で、上記免疫学的反応の間に形成される複合体の検出を
   可能にする試薬と を包含する診断キット。 （２１）ＳＬＥに特徴的な抗体の￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥検
   出用診断キットであって： −必要に応じて固体担体に結合させた、特許請求の範囲
   第１７項若しくは第１８項記載の生物学的９４ｋＤａ−
   ヌクレオソーム複合体、又は特許請求の範囲第１９項記
   載の試薬と、 −生物学的組織又は体液中におそらく存在する抗体と上
   記９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体との間の免疫学的
   反応の実施に適した媒質を構成するための試薬と、 −前記抗体と９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体との間
   で、上記免疫学的反応中に形成される複合体の検出を可
   能にする試薬と を包含する診断キット。 （２２）前記抗体と９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体
   との間で形成される複合体の検出を可能にする試薬がマ
   ーカーを担持し又は、標識試薬により順次認識され得る
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２０項及び及び第２
   １項に記載の診断キット。 （２３）特許請求の範囲第１７項又は第１８項記載の複
   合体に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗
   体。 （２４）生物学的組織又は体液中に多分含まれる、ＳＬ
   Ｅと相関可能な抗体の量の￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥での測定
   方法であって、この方法が： −特許請求の範囲第１７項又は第１８項記載の９４ｋＤ
   ａ−ヌクレオソーム複合体を、特許請求の範囲第２３項
   記載の確定量の抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体と、
   上記複合体の全てが上記抗体との免疫学的結合に従事す
   るような方法で接触させること、−免疫学的反応の生成
   物即ち（９４ｋＤａ−ヌクレオソーム）−（抗９４ｋＤ
   ａ−ヌクレオソーム）複合体を、生物学的組織又は体液
   中におそらく存在す抗体と、上記９４ｋＤａ−ヌクレオ
   ソーム複合体に対する抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗
   体との間の競合反応の実施を可能にする条件下で、生物
   学的組織又は体液と接触させること、 −９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と結合していない
   抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量か又は、依然と
   してこれらの複合体と結合している前記抗体の量の￥ｉ
   ｎｖｉｔｒｏ￥検出であり、検出されるこの抗体量が、
   生物学的組織又は体液中に含まれるＳＬＥの特徴を示す
   抗体の量と相関し得ること を包含することを特徴とする方法。 （２５）方法が以下の段階： −特許請求の範囲第１７項又は第１８項記載の９４ｋＤ
   ａ−ヌクレオソーム複合体を、固体担体、特にＥＬＩＳ
   Ａに使用するミクロ滴定プレートのようなプレートのウ
   ェルに結合させる段階と、 −固体担体を洗浄して、担体に結合していない上記の９
   ４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体を除去する段階と、 −担体に結合している先の複合体を、前記複合体の量よ
   り過剰の確定量の、特許請求の範囲第２３項記載の抗９
   ４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体と一緒にインキュベーシ
   ョンする段階と、 −９４ｋＤａ−ヌクレオソームと抗９４ｋＤａ−ヌクレ
   オソーム抗体との間で、先のインキュベーション段階中
   に形成された複合体（９４ｋＤａ−ヌクレオソーム）−
   （抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム）を、生物学的組織又
   は体液と一緒にインキュベーションする段階と、 −担体を洗浄してもはや９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複
   合体と結合していない抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗
   体を除去し、及び必要に応じて洗浄液中に回収する段階
   と、 −９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と結合していない
   抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量か又は、依然と
   してこれらの複合体と結合している前記抗体の量の￥ｉ
   ｎｖｉｔｒｏ￥検出段階であり、検出される抗体の量が
   生物学的組織又は体液中に含まれるＳＬＥの特徴を示す
   抗体の量と相関し得ることを包含することを特徴とする
   特許請求の範囲第２４項に記載の方法。 （２６）特許請求の範囲第２３項記載の抗体を、特に酵
   素を用いて標識することを特徴とし、並びに生物学的組
   織又は体液中におそらく存在するＳＬＥ特異抗体の量の
   測定を： −特許請求の範囲第２５項記載の方法の最終洗浄段階後
   に回収される標識抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の
   量の検出によって直接的に実施する、但しその場合、Ｓ
   ＬＥ特異抗体の量は洗浄液中に回収された標識抗９４ｋ
   Ｄａ−ヌクレオソーム抗体の量に直接相当する、 −又は、９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と結合する
   標識抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量の検出によ
   って間接的に実施する、但しその場合、ＳＬＥ特異抗体
   の量は、一方の、生物学的組織又は体液とのインキュベ
   ーション段階前に９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と
   結合した標識抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量と
   、他方の、生物学的組織又は体液とのインキュベーショ
   ン及び、特許請求の範囲第２５項記載の洗浄の最終段階
   後の９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複合体と結合した抗９
   ４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量との間の差に相当す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の方
   法。 （２７）特許請求の範囲第２３項記載の抗体を標識しな
   いこと並びに、最終洗浄段階後に洗浄液中に回収された
   抗９４ｋＤａ−ヌクレオソーム抗体の量又は、生物学的
   組織若しくは体液とのインキュベーションの及び洗浄の
   最終段階後に依然として９４ｋＤａ−ヌクレオソーム複
   合体と結合しているこれらの抗体の量を、これらの抗体
   と免疫学的に反応し得る標識抗イムノグロブリンを用い
   て検出することを特徴とする特許請求の範囲第２５項に
   記載の方法。 （２８）診断キットが特許請求の範囲第２０〜２２項の
   いずれか一項に記載のキットの構成成分と、必要ならば
   標識された、特許請求の範囲第２３項記載の確定量の抗
   体とを包含することを特徴とするＳＬＥ特異抗体の￥ｉ
   ｎｖｉｔｒｏ￥検出及び投与用診断キット。 （２９）一方の特定の核酸と他方のヒストンとの間で形
   成された複合体を、特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
   か一項に記載の蛋白質を細胞表面に現出すると思われる
   細胞と接触させて、特定の核酸、ヒストン及び前記蛋白
   質から成る完全体の前記細胞内でインターナリゼーショ
   ンを可能にすることを包含する細胞トランスフェクショ
   ン方法。 （３０）前記の特定の核酸が、特異的ポリペプチドをコ
   ードする核酸配列及び、必要に応じて宿主細胞内でこの
   核酸断片を発現させることが可能な調節エレメント、特
   に前記細胞宿主のポリメラーゼによって認識されるプロ
   モーターを含むことを特徴とする特許請求の範囲第２９
   項に記載の方法。 （３１）培養中の形質転換宿主細胞を適切な培養培地中
   に置くことによる特異的ポリペプチドの産生及び、これ
   らの細胞又は培養培地からの特異的ポリペプチドの回収
   に適用する特許請求の範囲第３０項に記載の方法。 （３２）特許請求の範囲第４項記載のモノクローナル抗
   体に対する抗イデオタイプ抗体。 （３３）生理学的に許容可能な賦形剤を伴う特許請求の
   範囲第３２項に記載の抗体を含む医薬組成物。 （３４）特にＳＬＥの治療における特許請求の範囲第３
   ２項に記載の抗体の治療上への使用。 （３５）ヒト又は動物起源の膵臓細胞と結合した特許請
   求の範囲第１項記載の９４ｋＤａ蛋白質により構成され
   た組成物。 （３６）免疫抑制治療目的のための特許請求の範囲第３
   ５項記載の組成物の使用。