JPH0332356B2

JPH0332356B2 -

Info

Publication number: JPH0332356B2
Application number: JP58118809A
Authority: JP
Inventors: Masanori Sugiura; Nobuo Kondo; Tsutomu Fukaya; Kazumasa Yokoyama; Shoichi Myake
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 1983-06-29
Filing date: 1983-06-29
Publication date: 1991-05-10
Also published as: JPS6011427A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は血栓溶解性蛋白の疾患局所親和性向上
方法に関するものであり、より詳細には血栓溶解
性蛋白を高分子多糖類を介して、塩基性アミノ酸
またはそのアルキルエステルと化学的に結合させ
ることを特徴とする血栓溶解性蛋白の疾患局所親
和性向上方法である。ウロキナーゼなどの血栓溶解剤は、血栓溶解剤
としてのみならず抗癌剤としても併用されるが、
その疾患局所への親和性を向上させることによつ
て、少量の投量でより優れた薬効を発揮させるこ
とができる。また、ウロキナーゼ等の血栓溶解性
蛋白は生体内投与後、血中より速やかに消失し、
その半減期は数分である。さらに投与されたウロ
キナーゼ等の血栓溶解性蛋白は血中のインヒビタ
ーの作用をうけるので、ある程度以上を投与しな
ければ効果の発現が乏しい。そのため、現在では
大量投与が一般化しつつある。また、ウロキナー
ゼ等の血栓溶解性蛋白は熱安定性に欠けるきらい
がある。従つて、本発明の第一の目的は、血栓溶解性蛋
白の疾患部位（血栓部位、癌発生部位）への親和
性を向上させる方法を提供することである。本発
明の第二の目的は血栓溶解性蛋白の熱に対する安
定性および血中における安定性を向上させる方法
を提供することである。本発明の第三の目的は安
定な血栓溶解性蛋白およびその製造方法を提供す
ることである。本発明のその他の目的は以下の記
述から明らかとなろう。而して、本発明者らは、種々研究を重ねてきた
ところ、血栓溶解性蛋白を、高分子多糖類を介し
て、塩基性アミノ酸またはそのアルキルエステル
と化学的に結合させることによつて血栓溶解性蛋
白の血中における安定性、熱に対する安定性が高
まり、また疾患部位への親和性が高まることを見
い出して本発明を完成せしめた。本発明で用いられる血栓溶解性蛋白としては、
たとえばウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組
識プラスミノーゲンアクチベーター（メラノーマ
細胞由来のもの、人腎細胞由来のもの等）などが
あげられ、これらは高度精製、特に医療用として
精製されたものであれば、その由来などには制限
されず、たとえばウロキナーゼとしてはヒト尿、
組識腎臓培養、遺伝子組み換えなどの由来のもの
があげられる。その分子量は、例えばウロキナー
ゼにあつては一般に25000〜60000の範囲のものが
好ましい。本発明で用いられる塩基性アミノ酸としては、
アルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげら
れ、好適にはアルギニン、リジンが用いられる。
また塩基性アミノ酸アルキルエステルにおけるア
ルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イ
ソプルピル、ブチル、イソブチル、などの炭素数
１〜４のものがあげられ、特に好ましくはメチル
があげられる。高分子多糖類としては、デキストラン、コンド
ロイチン硫酸、デンプンなどが例示され、好適に
はデキストランが使用される。本発明で用いられるデキストランもその由来を
特に制限されるものではなく、好ましくは高度精
製されたもの、特に医療用のものが用いられる。
その好ましい分子量は一般に1000〜200万である。本発明の方法は、たとえば次のようにして実施
される。即ち、塩基性アミノ酸（たとえば、アルギニ
ン、リジン、これらのアルキルエステル）と高分
子多糖類（たとえば、デキストラン）とを反応さ
せ、さらに血栓溶解性蛋白を反応させる。塩基性アミノ酸またはそのアルキルエステルと
の反応においては、高分子多糖類の水酸基をあら
かじめ酸化してアルデヒド基に活性化させておく
ことが好ましく、その際の酸化剤としては、通常
過ヨウ素酸ナトリウムが使用される。本反応は通
常室温にておこなわれ、溶媒としては、通常、水
性溶媒〔好ましくは、リン酸緩衝液（特に、
0.1Mリン酸ナトリウム）〕が用いられ、またPHは
４〜８、好ましくは５〜７程度であり、反応時間
は２〜10時間、好ましくは４〜６時間である。さ
らに高分子多糖類と塩基性アミノ酸またはそのア
ルキルエステルとの添加割合は高分子多糖類約10
mgに対して、塩基性アミノ酸またはそのアルキル
エステル）0.1〜50μmol、特に１〜30μmolとなる
ような割合である。本反応においては、還元剤と
して、たとえば水素化シアノホウ素ナトリウムが
使用される。かくして得られた反応生成物を血栓溶解性蛋白
と反応させる。この反応においては、還元剤とし
て、たとえば水素化シアノホウ素ナトリウムが使
用される。溶媒としては、通常、リン酸緩衝液
（通常、PH５〜９、好ましくはPH６〜８程度）が
使用され、反応温度は一般に０〜20℃、好ましく
は１〜10℃程度であり、反応時間は５〜40時間、
好ましくは10〜25時間程度である。血栓溶解性蛋
白（たとえば、ウロキナーゼ）の添加量は通常高
分子多糖類１mg当り100IU〜100000IUである。当
該反応の後、末反応のアルデヒド基を水酸基に還
元する。その際の還元剤としては、たとえば水素
化ホウ素ナトリウムがもちいられる。この反応の一例を模式的に示せば次の通りであ
る。（式中、−NH−AAは塩基性アミノ酸またはその
アルキルエステル残基を示す。ここに塩基性アミノ酸またはそのアルキルエス
テル残基とは当該アミノ酸中のアミノ基の水素原
子が一個とれることによつて形成された基を意味
する。なお、本発明の方法による結合物は上記模
式の如きものに限定されず、例えば複数のアミノ
基を有する塩基性アミノ酸またはそのアルキルエ
ステルを用いた場合には、高分子多糖類と結合し
なかつたアミノ基に血栓溶解性蛋白が結合したも
のであつてもよく、要するに上記三成分が化学的
に結合したものであればよい。本発明における三成分の結合割合は、好ましく
は高分子多糖類、例えばデキストラン１mgに対し
て塩基性アミノ酸またはそのアルキルエステル、
例えばアルギニン（又はそのアルキルエステル）
が0.1〜3μmol、好ましくは0.5〜2.5μmol、血栓溶
解性蛋白、例えばウロキナーゼが100〜
100000IU、好ましくは5000IU〜100000IUに相当
する割合である。本発明によつて生成した結合物は水性溶媒
（例、水、生理的塩類水溶液）に易溶性であり、
また人フイブリン標準平板法（B.B.A.、24、
278、1976年）による力価測定が血栓溶解性蛋白
（たとえば、ウロキナーゼの場合）１mgあたり
5000〜140000IU程度である。血栓溶解性蛋白
（例、ウロキナーゼ）と高分子多糖類、たとえば
デキストランの結合比は血栓溶解性蛋白中のアミ
ノ基の40〜70％が修飾されていることが好まし
い。なお、アミノ基の定量はアルギニンまたはそ
のアルキルエステルの場合はR.Fields（Biochem.
J.、124、581、1971年）の方法に従つて、また、
リジンまたはそのアルキルエステルの場合は結合
物を6N塩酸中、110℃、24時間加水分解後、アミ
ノ酸分析することによつて測定したものである。
また、結合比は血栓溶解性蛋白と未反応高分子多
糖類をDEAE（ジエチルアミノエチル）−トヨパー
ル650M（東洋ソーダ製）にて除いた後測定したも
のである。実験例１本発明の方法による結合物の熱安定性をウロキ
ナーゼを例として調べた。ウロキナーゼの最も安
定なPH8.0において60℃の加熱をおこなうと、第
１図に示すようにウロキナーゼ約２時間の加熱で
完全に活性を失つたが、実施例１にて生成した結
合物は８時間の加熱においても約90％の活性を保
つていた。実験例２人の新鮮なプラズマを用いて、血中の血栓溶解
性蛋白インヒビターに対する安定性を調べた。試
験方法は次の通りである。すなわち、フイブリン
平板による線溶活性にて、１mlあたり100IUおよ
び200IUとなるよう希釈したウロキナーゼあるい
は実施例１にて得られた結合物に、その４倍量の
プラズマを加え、37℃にて１時間インキユベーシ
ヨン後、フイブリン平板法にて残存活性を測定し
た。その結果は第２図に示す通りである。即ち、
100IU／mlの場合ウロキナーゼはすべての活性を
消失してしまうのに対して実施例１の結合物は10
〜13％、200IU／mlの場合、ウロキナーゼが約10
％の残存活性しか示さないのに対して実施例１の
結合物は20％程度の残存活性を保持している。実験例３実施例１の結合物とウロキナーゼ自体との血栓
溶解能の比較をウサギを用いてin vivoにて行つ
た。 ¹²⁵Iを用い、クロラミンＴ法（Biochem.J.、
89、114、1963年）により、フイブリノーゲン
（ウサギ血液より精製した。）をラベルした。
¹²⁵I−フイブリノーゲンをウサギの血液とまぜた
のちチヤンドラーの装置を用い、 ¹²⁵I−血栓を
作成した。 ¹²⁵I−血栓を、第３図に示すように
ウサギの大腿動脈と大腿静脈とに入れたカテーテ
ルを結び循環させる際に、結合部位に注射筒をゴ
ム栓にてつないだものの中にいれる（ ¹²⁵I−血
栓は釣針につるしてある。）。そして、ウサギの体重を正確に測定し、３Kgあ
たり線溶活性にて10⁵IUのウロキナーゼあるい
は、このウロキナーゼの蛋白量に等しい実施例１
の結合物を血液循環開始１時間後に静脈側の三方
コツクより投与し、投与後10、20、30、45、60、
90、120、150、180分に動脈側の三法コツクより
採血し、血中の放射活性をγ−シンチレーシヨン
カウンターにて測定し、血栓の溶解率を求めた。
その結果は第４図に示した。この結果から本発明
方法によつて血栓の溶解率が２倍以上向上するこ
とが理解できよう。実施例１デキストランＴ−10、Ｔ−40、Ｔ−70、Ｔ−
500またはＴ−2000（フアルマシア社製）のいずれ
か１ｇを秤量し20mlの蒸溜水に溶解する。これを
30℃の水浴につけた後、過ヨウ素酸ナトリウム
1.078ｇを固体のまま加える。30℃にて30分間反
応させたのち1N水酸化ナトリウムにて中和し、
蒸溜水に対し充分透析、凍結乾燥し、酸化デキス
トラン（活性化デキストラン）を得た。アルギニン、リジンまたはこれらのメチルエス
テル13μmolを0.2mlの0.1Mリン酸ナトリウム（PH
6.1）に溶かした後、同緩衝液0.8mlに9.3mgの酸化
デキストランおよび13μmolの水素化シアノホウ
素ナトリウム〔６mgの試薬を１mlの0.1Mリン酸
ナトリウム（PH6.1）にとかしたもの〕を加え、
室温にて４〜６時間反応させる。この間、前記ア
ミノ酸またはこれらのエステルがデキストランに
結合したことをシリカゲルの薄層クロマトグラフ
イーにて確認する。反応後、５℃にて冷却し、同
緩衝液に溶かし、ウロキナーゼ0.1μmol（１〜２
ml）、続いて26μmolの水素化シアノホウ素ナトリ
ウムを加え、５℃にて５〜24時間反応させる。反
応後、36μmolの水素化ホウ素ナトリウム（10mg
を0.1Mのリン酸ナトリウム（PH7.0）に溶かした
もの）を加え５℃にて６時間反応させ、アルデヒ
ド基を完全に還元する。還元後、0.1Mリン酸ナ
トリウム（PH7.0）にて充分透析後、ミリポアフ
イルターによる除菌濾過を行い力価を測定して凍
結乾燥し、ウロキナーゼ結合物を得る。この結合
物は前述したウロキナーゼ・デキストラン・前記
アミノ酸またはそれらのメチルエステル結合物の
特性を有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法による血栓溶解性蛋白の熱
安定性向上性を示す線図、第２図は本発明による
血栓溶解性蛋白の人血中のインヒビターに対する
安定性を示す線図、第３図は血栓溶解能試験（in
vivo）のためのウサギを使用した動脈−静脈シヤ
ントの模式図、第４図は第３図の実験系で行つた
血栓溶解能試験の結果を示した線図である。１：実施例１の結合物（アルギニンメチルエス
テル、デキストランＴ−40を使用）、２：実施例
１の結合物（アルギニン、デキストランＴ−40を
使用）、３：ウロキナーゼ自体、４：大腿動脈、
５：大腿静脈、６：カテーテル、７：三方コツ
ク、８：ゴムのチユーブ、９： ¹²⁵I−血栓、１
０：釣針、１１：注射筒。

Claims

【特許請求の範囲】１血栓溶解性蛋白を高分子多糖類を介して、塩
基性アミノ酸またはそのアルキルエステルと化学
的に結合させることを特徴とする血栓溶解性蛋白
の疾患局所親和性向上方法。２高分子多糖類がデキストランである特許請求
の範囲第１項記載の方法。３デキストランの分子量が1000〜200万である
特許請求の範囲第２項記載の方法。４塩基性アミノ酸がアルギニン、リジンである
特許請求の範囲第１乃至２項記載のいずれかに記
載の方法。５高分子多糖類１mgに対して塩基性アミノ酸ま
たはそのアルキルエステルを0.1〜3μmol、血栓
溶解性蛋白を100〜100000IUに相当する割合で結
合させることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の方法。６高分子多糖類に塩基性アミノ酸またはそのア
ルキルエステルを結合させた後、血栓溶解性蛋白
を結合させることを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の方法。７血栓溶解性蛋白がウロキナーゼである特許請
求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。