JPH0751080B2 - ヒト ｃ 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法 - Google Patents
ヒト ｃ 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法Info
- Publication number
- JPH0751080B2 JPH0751080B2 JP3027537A JP2753791A JPH0751080B2 JP H0751080 B2 JPH0751080 B2 JP H0751080B2 JP 3027537 A JP3027537 A JP 3027537A JP 2753791 A JP2753791 A JP 2753791A JP H0751080 B2 JPH0751080 B2 JP H0751080B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hepatitis
- human
- pcr
- virus
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウイルスゲノムの検出法
に係り、殊に生体由来の試料からポリメラーゼ連鎖反応
用試料を簡便に調製し、ポリメラーゼ連鎖反応を利用し
て検出を行なう、ヒト C 型肝炎ウイルスゲノムの簡便
な検出法に係る。
に係り、殊に生体由来の試料からポリメラーゼ連鎖反応
用試料を簡便に調製し、ポリメラーゼ連鎖反応を利用し
て検出を行なう、ヒト C 型肝炎ウイルスゲノムの簡便
な検出法に係る。
【０００２】
【従来技術】近年、ウイルスや遺伝病の診断方法の１つ
として、ポリメラ−ゼ連鎖反応（Polymerase Chain Rea
ction ：以下『PCR 』と略す）法が行われるようになっ
た。PCR 法はプライマ−の特異性に基づく標的ＤＮＡ遺
伝子領域を１００万倍以上に増幅する方法であり（ウイ
ルスゲノムがＲＮＡの場合や mRNA の変異を検出する場
合には、 PCR の実施に先だって RNA から DNA に変
換しておくことが必要である）、ウイルスゲノムや目的
の mRNA が１コピ−あれば原理的には増幅できる高感度
検出法である。従って、 PCR 法は遺伝病における mRN
A の変異やウイルス自体の検出法として、また感染後、
抗体が産生される前の生体試料を検体として用い得る点
で有用性が認められている。
として、ポリメラ−ゼ連鎖反応（Polymerase Chain Rea
ction ：以下『PCR 』と略す）法が行われるようになっ
た。PCR 法はプライマ−の特異性に基づく標的ＤＮＡ遺
伝子領域を１００万倍以上に増幅する方法であり（ウイ
ルスゲノムがＲＮＡの場合や mRNA の変異を検出する場
合には、 PCR の実施に先だって RNA から DNA に変
換しておくことが必要である）、ウイルスゲノムや目的
の mRNA が１コピ−あれば原理的には増幅できる高感度
検出法である。従って、 PCR 法は遺伝病における mRN
A の変異やウイルス自体の検出法として、また感染後、
抗体が産生される前の生体試料を検体として用い得る点
で有用性が認められている。
【０００３】この PCR を確実に行うためには、生体試
料から目的の DNA もしくは RNA を抽出し、 RNA の
場合には逆転写酵素を用いて DNA に変換する工程を如
何に確実にしかもできるだけコンタミネーションなく簡
便におこなうかがポイントである。しかしながらmRNAや
ウイルスゲノムが RNA の場合、抽出が困難であること
に加えて、 PCR 法は高感度検出法であるが故に、わず
かなコンタミネ−ションによっても見かけ上『陽性』と
検出されることが問題となっている。このコンタミネ−
ションは、マイクロチュ−ブの蓋の開閉やピペット操作
等により生ずる mRNA やウイルスゲノム含有物の飛散
や、増幅された標的遺伝子が実験器具や測定者の手や衣
服に付着しキャリ−オ−バ−されることにより生ずる。
料から目的の DNA もしくは RNA を抽出し、 RNA の
場合には逆転写酵素を用いて DNA に変換する工程を如
何に確実にしかもできるだけコンタミネーションなく簡
便におこなうかがポイントである。しかしながらmRNAや
ウイルスゲノムが RNA の場合、抽出が困難であること
に加えて、 PCR 法は高感度検出法であるが故に、わず
かなコンタミネ−ションによっても見かけ上『陽性』と
検出されることが問題となっている。このコンタミネ−
ションは、マイクロチュ−ブの蓋の開閉やピペット操作
等により生ずる mRNA やウイルスゲノム含有物の飛散
や、増幅された標的遺伝子が実験器具や測定者の手や衣
服に付着しキャリ−オ−バ−されることにより生ずる。
【０００４】ウイルスには大きく分けて DNA をゲノム
とする DNA ウイルスと RNA をゲノムとする RNA ウ
イルスの存在が知られている。RNA ウイルスにおいては
成人Ｔ細胞白血病ウイルスやエイズウイルス等のレトロ
ウイルスをはじめとしてインフルエンザウイルスやＣ型
肝炎ウイルス等の診断が必要とされるウイルスが数多く
存在する。一方各種の遺伝病の中には発現される mRNA
の変異によって異常な蛋白質ができることによって発病
するものが知られている。
とする DNA ウイルスと RNA をゲノムとする RNA ウ
イルスの存在が知られている。RNA ウイルスにおいては
成人Ｔ細胞白血病ウイルスやエイズウイルス等のレトロ
ウイルスをはじめとしてインフルエンザウイルスやＣ型
肝炎ウイルス等の診断が必要とされるウイルスが数多く
存在する。一方各種の遺伝病の中には発現される mRNA
の変異によって異常な蛋白質ができることによって発病
するものが知られている。
【０００５】例えば、Lesh-Nyhan (LN) 氏症候群はヒポ
キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ (HPRT)
の遺伝子座における変異に起因する遺伝病であるが、こ
の患者ではリンパ芽球細胞などに発現している HPRT の
mRNA に変異があるといわれている。RNA ウイルスの中
で殊に、ヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは輸血に起因する
肝炎の 90 - 95% を占めており、治療法も未だ確立する
に至っておらず、その診断法、治療法、輸血用血液中に
場合により存在するヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを無害
化する処理剤、予防ワクチン等の開発が強く要望されて
いる。近年に至り、ヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス自体の
研究が進み、感染には 1 本鎖 RNA が関与するのではな
いかとの報告がなされ (特開昭 62 - 24999 及び同63 -
91328 号)、又最近においては米国のカイロン社がヒト
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたチンパンジーの肝
臓から cDNA をクローン化し、これをベクターλgt11
に組込んだ大腸菌で発現させたところ、その産物がヒト
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス感染患者血清と反応することを
見出した。最終的にはこれが約10,000 個のヌクレオチ
ドを有する 1 本鎖 RNA ウイルスであってフラビウイル
スに近いウイルスであることが判明し、前記のカイロン
社は、これをヒトＣ型肝炎ウイルス (Hepatitis C Viru
s : 以下『HCV』と略記する) と命名するとともに、そ
の内の約 7,000 個のヌクレオチドについての cDNA 塩
基配列を公表した(欧州特許公開318216)。
キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ (HPRT)
の遺伝子座における変異に起因する遺伝病であるが、こ
の患者ではリンパ芽球細胞などに発現している HPRT の
mRNA に変異があるといわれている。RNA ウイルスの中
で殊に、ヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスは輸血に起因する
肝炎の 90 - 95% を占めており、治療法も未だ確立する
に至っておらず、その診断法、治療法、輸血用血液中に
場合により存在するヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを無害
化する処理剤、予防ワクチン等の開発が強く要望されて
いる。近年に至り、ヒト非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス自体の
研究が進み、感染には 1 本鎖 RNA が関与するのではな
いかとの報告がなされ (特開昭 62 - 24999 及び同63 -
91328 号)、又最近においては米国のカイロン社がヒト
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたチンパンジーの肝
臓から cDNA をクローン化し、これをベクターλgt11
に組込んだ大腸菌で発現させたところ、その産物がヒト
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス感染患者血清と反応することを
見出した。最終的にはこれが約10,000 個のヌクレオチ
ドを有する 1 本鎖 RNA ウイルスであってフラビウイル
スに近いウイルスであることが判明し、前記のカイロン
社は、これをヒトＣ型肝炎ウイルス (Hepatitis C Viru
s : 以下『HCV』と略記する) と命名するとともに、そ
の内の約 7,000 個のヌクレオチドについての cDNA 塩
基配列を公表した(欧州特許公開318216)。
【０００６】さらに、上記のカイロン社はこの一部の遺
伝子を用いて酵母で発現させたポリペプチドを抗原とし
て、 HCV感染患者の血清中の抗体を測定する方法を開発
した。この測定法において、急性期を過ぎた頃に抗ＨＣ
Ｖ抗体が出現するので、現状ではウイルス性慢性肝疾患
の鑑別や診断並びに輸血用血液のスクリ−ニングに適し
ているとされている。
伝子を用いて酵母で発現させたポリペプチドを抗原とし
て、 HCV感染患者の血清中の抗体を測定する方法を開発
した。この測定法において、急性期を過ぎた頃に抗ＨＣ
Ｖ抗体が出現するので、現状ではウイルス性慢性肝疾患
の鑑別や診断並びに輸血用血液のスクリ−ニングに適し
ているとされている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び発明の目的】慣用の
技術によれば、非常に簡便であり且つ信頼性においてす
ぐれている特に生体試料から RNA ウイルスゲノム及び
mRNA を抽出し DNA に変換し、そのまま PCR 反応が
可能な試料の調製法は未だ確立されていない。
技術によれば、非常に簡便であり且つ信頼性においてす
ぐれている特に生体試料から RNA ウイルスゲノム及び
mRNA を抽出し DNA に変換し、そのまま PCR 反応が
可能な試料の調製法は未だ確立されていない。
【０００８】従来、ウイルスゲノムや mRNA を抽出・分
離するためには、グアニジンイソチオシアネート、フェ
ノール、尿素、クロロフォルムなどの蛋白変性剤および
ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤による処理が
行われているが、除蛋白のための遠心、ウイルスゲノム
や mRNA 含有溶液層を採取して別のチューブへ移し換え
たり、さらに溶液層から処理剤を除くためにアルコール
によりウイルスゲノムや mRNA を沈殿させ乾燥する工程
がある。
離するためには、グアニジンイソチオシアネート、フェ
ノール、尿素、クロロフォルムなどの蛋白変性剤および
ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤による処理が
行われているが、除蛋白のための遠心、ウイルスゲノム
や mRNA 含有溶液層を採取して別のチューブへ移し換え
たり、さらに溶液層から処理剤を除くためにアルコール
によりウイルスゲノムや mRNA を沈殿させ乾燥する工程
がある。
【０００９】これらの操作は手間が要するので多検体の
処理をするには不適当である上に、コンタミネ−ション
の発生の確率を高くする。しかも、ウイルスゲノムや m
RNA が微量である場合のアルコ−ル沈殿による回収率は
低く（50% 以下）、定量性の得られないことに加え、沈
澱を再溶解してから逆転写酵素により RNA をDNA に
変換する必要があるところに大きな課題がある。
処理をするには不適当である上に、コンタミネ−ション
の発生の確率を高くする。しかも、ウイルスゲノムや m
RNA が微量である場合のアルコ−ル沈殿による回収率は
低く（50% 以下）、定量性の得られないことに加え、沈
澱を再溶解してから逆転写酵素により RNA をDNA に
変換する必要があるところに大きな課題がある。
【００１０】本発明の目的は生体試料中にヒト C 型肝
炎ウイルス (HCV) が存在するならば、これを簡便なる
方法で短時間の内に且つコンタミネーションを生じるこ
となしに当該 RNA ウイルスゲノムを抽出し、この RNA
を DNA に変換して PCR 用試料を調製し、この試料を用
いて PCR を実施する、ヒト C 型肝炎ウイルスゲノムの
簡便な検出法を提供することにある。
炎ウイルス (HCV) が存在するならば、これを簡便なる
方法で短時間の内に且つコンタミネーションを生じるこ
となしに当該 RNA ウイルスゲノムを抽出し、この RNA
を DNA に変換して PCR 用試料を調製し、この試料を用
いて PCR を実施する、ヒト C 型肝炎ウイルスゲノムの
簡便な検出法を提供することにある。
【００１１】本発明者等は生体試料から HCV RNA を簡
便に抽出し、これを DNA に変換し、直ちに PCR を行う
ことのできる方法について先ず検討した処、非イオン性
界面活性剤の存在下に蛋白分解酵素により生体試料を処
理し、次いで逆転写酵素により処理すれば PCR 用試料
となし得ることを見い出して、本発明目的の前段階を達
成するに至った。そこで、更に PCR 用のプライマーに
ついて鋭意検討を行った結果、HCV の検出に好適と考え
られるプライマーセットが見い出された。
便に抽出し、これを DNA に変換し、直ちに PCR を行う
ことのできる方法について先ず検討した処、非イオン性
界面活性剤の存在下に蛋白分解酵素により生体試料を処
理し、次いで逆転写酵素により処理すれば PCR 用試料
となし得ることを見い出して、本発明目的の前段階を達
成するに至った。そこで、更に PCR 用のプライマーに
ついて鋭意検討を行った結果、HCV の検出に好適と考え
られるプライマーセットが見い出された。
【００１２】この発明法による抽出法において、上記の
生体試料としては血清、血漿および摘出された組織であ
ることができ、非イオン性界面活性剤としてはノニデッ
ト p-40 等を用いることができ、また蛋白分解酵素とし
てはプロテイナーゼＫ等を用いることができる。
生体試料としては血清、血漿および摘出された組織であ
ることができ、非イオン性界面活性剤としてはノニデッ
ト p-40 等を用いることができ、また蛋白分解酵素とし
てはプロテイナーゼＫ等を用いることができる。
【００１３】従って、本発明によれば、既述の目的は非
イオン性界面活性剤の存在下に蛋白分解酵素により生体
試料を処理し、得られた抽出液中に存在する可能性のあ
るヒト C 型肝炎ウイルス RNA を DNA に変換し、 5' - ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴ
ＡＣＡＴＣＧ - 3' なる塩基配列を有するプライマーと、 5' - ＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＧＴＡＴＣＣ
ＣＧＣ - 3' なる塩基配列を有するプライマー及び Taq ポリメラー
ゼを含有する反応液を添加して、上記の DNA に関して
第 1 回目のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行い、次い
で 5' - ＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ -
3' なる塩基配列を有するプライマーと、 5' - ＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧ -
3' なる塩基配列を有するプライマー及び Taq ポリメラー
ゼを含有する反応液を添加して第 2 回目のポリメラー
ゼ連鎖反応 (PCR) を行い、次いで電気泳動により検出
すべきウイルスゲノムの産物に相当する 176bp のバン
ドが検出されるか否かを調べることを特徴とする、ヒト
C 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法により達成さ
れる。
イオン性界面活性剤の存在下に蛋白分解酵素により生体
試料を処理し、得られた抽出液中に存在する可能性のあ
るヒト C 型肝炎ウイルス RNA を DNA に変換し、 5' - ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴ
ＡＣＡＴＣＧ - 3' なる塩基配列を有するプライマーと、 5' - ＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＧＴＡＴＣＣ
ＣＧＣ - 3' なる塩基配列を有するプライマー及び Taq ポリメラー
ゼを含有する反応液を添加して、上記の DNA に関して
第 1 回目のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行い、次い
で 5' - ＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ -
3' なる塩基配列を有するプライマーと、 5' - ＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧ -
3' なる塩基配列を有するプライマー及び Taq ポリメラー
ゼを含有する反応液を添加して第 2 回目のポリメラー
ゼ連鎖反応 (PCR) を行い、次いで電気泳動により検出
すべきウイルスゲノムの産物に相当する 176bp のバン
ドが検出されるか否かを調べることを特徴とする、ヒト
C 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法により達成さ
れる。
【００１４】本発明者らは反応条件等を鋭意検討した
処、生体試料として血清もしくは血漿を用いる場合には
当該試料の量を 1-20 μl 以内に 、また生体組織を用
いる場合には 10 mg 以内にとどめれば 、変性蛋白の
煩雑な除去処理やアルコ−ル沈殿操作を必要とせず、し
かもチュ−ブの交換が不要であり、１つの反応チュ−ブ
内で、ウイルスゲノムの抽出、 RNA から DNA への逆
転写反応及びPCR 反応を行うことができることが判明
した。
処、生体試料として血清もしくは血漿を用いる場合には
当該試料の量を 1-20 μl 以内に 、また生体組織を用
いる場合には 10 mg 以内にとどめれば 、変性蛋白の
煩雑な除去処理やアルコ−ル沈殿操作を必要とせず、し
かもチュ−ブの交換が不要であり、１つの反応チュ−ブ
内で、ウイルスゲノムの抽出、 RNA から DNA への逆
転写反応及びPCR 反応を行うことができることが判明
した。
【００１５】尚、本発明による検出法は、グアニジンイ
ソチオシアネートを用いる従来のコムクジンスキーらの
方法 ("Analytical Biochemistry", 162, 156 - 159, 1
987)で抽出し、PCR 法を利用してウイルスゲノム産物を
検出した場合に比較して、検出感度の点においても約 1
0 倍優れていることもわかり、生体試料中に数コピーの
RNA があれば充分検出可能なことが判明した。
ソチオシアネートを用いる従来のコムクジンスキーらの
方法 ("Analytical Biochemistry", 162, 156 - 159, 1
987)で抽出し、PCR 法を利用してウイルスゲノム産物を
検出した場合に比較して、検出感度の点においても約 1
0 倍優れていることもわかり、生体試料中に数コピーの
RNA があれば充分検出可能なことが判明した。
【００１６】
【実施例等】次に実施例、試験例及び比較試験例により
本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
【００１７】実施例(a) ヒ ト生体試料からのウイルスゲノムの抽出 0.5ml 容量のマイクロチューブに、生体由来の試料とし
て HCV 患者の血 漿10μl を注入し、これに 1μl の溶
解液 [500mM トリスヒドロキシアミノメタン-塩酸緩衝
液 (pH 8.0)、250mM 塩化カリウム、30mM 塩化マグネシ
ウム、0.5% ノニデット p-40、及び 10mg/ml プロティ
ナーゼ K を含有] を添加して混和する。次いで 35℃
において 1 時間、続いて 94℃ で 10 分間インキュベ
ートすることにより RNA ウイルスゲノム抽出液を得
た。
て HCV 患者の血 漿10μl を注入し、これに 1μl の溶
解液 [500mM トリスヒドロキシアミノメタン-塩酸緩衝
液 (pH 8.0)、250mM 塩化カリウム、30mM 塩化マグネシ
ウム、0.5% ノニデット p-40、及び 10mg/ml プロティ
ナーゼ K を含有] を添加して混和する。次いで 35℃
において 1 時間、続いて 94℃ で 10 分間インキュベ
ートすることにより RNA ウイルスゲノム抽出液を得
た。
【００１８】生体試料である血漿が 10 μl 以下の場合
は、ノニデット p-40 とプロテイネ−スＫを含有してい
ない点を除き上記溶解液と同様の溶液を10倍希釈した溶
液を添加することにより容量が 10μl となす。尚、組
織を試料とする場合には、組織 10 mgに対してノニデッ
ト p-40 とプロテイネ−スＫを含有していないことを除
き上記溶解と同様の溶液を10倍に希釈した溶液を10μl
添加し、以下同様にインキュベートする。
は、ノニデット p-40 とプロテイネ−スＫを含有してい
ない点を除き上記溶解液と同様の溶液を10倍希釈した溶
液を添加することにより容量が 10μl となす。尚、組
織を試料とする場合には、組織 10 mgに対してノニデッ
ト p-40 とプロテイネ−スＫを含有していないことを除
き上記溶解と同様の溶液を10倍に希釈した溶液を10μl
添加し、以下同様にインキュベートする。
【００１９】(b) RNA から DNA への変換及び PCR によ
る DNA の増幅この抽 出液 11μl に 20pmol のプライマー (後述す
る)、14 単位の逆転写酵素を含有する反応液 [50mM ト
リスヒドロキシアミノメタン-塩酸緩衝液 (pH8.0)、25m
M 塩化カリウム及び 3mM 塩化マグネシウム、各 250μM
の 4 種のデオキシリボヌクレオチド (dATP、dGTP、dC
TP 及び dTTP)、2.5mM ジチオスレイトール及び 40 単
位の RNasin を含有] 14μl を添加し、40℃ において
1 時間インキュベーションすることにより RNA と相補
的な DNA を合成した。
る DNA の増幅この抽 出液 11μl に 20pmol のプライマー (後述す
る)、14 単位の逆転写酵素を含有する反応液 [50mM ト
リスヒドロキシアミノメタン-塩酸緩衝液 (pH8.0)、25m
M 塩化カリウム及び 3mM 塩化マグネシウム、各 250μM
の 4 種のデオキシリボヌクレオチド (dATP、dGTP、dC
TP 及び dTTP)、2.5mM ジチオスレイトール及び 40 単
位の RNasin を含有] 14μl を添加し、40℃ において
1 時間インキュベーションすることにより RNA と相補
的な DNA を合成した。
【００２０】この RNA と相補 DNA とを含有するこの
混合溶液に、5 単位の Taqポリメラ−ゼを含む反応液
[50 mM トリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝液(pH
8.0), 50 mM 塩化カリウム,1.5 mM 塩化マグネシウ
ム,0.001% ゼラチン] 75μl を加え、94℃で30秒、55℃
で1 分、72℃で1 分を１サイクルとして、20サイクルか
らなる１回目のＰＣＲを行った。さらに、１回目のＰＣ
Ｒ反応液10μl を別の0.5 mlマイクロチュ−ブに移し、
20 pmol のプライマ−（後記参照）及び 5単位Taq ポリ
メラ−ゼを含む反応液[ 10 mM トリスヒドロキシアミノ
メタン−塩酸緩衝液(pH 8.0), 50 mM 塩化カリウム,1.5
mM塩化マグネシウム, 各200 μM の４種デオキシリボ
ヌクレオチド(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)] 90 μl を加え、
１回目の PCR と同様の系からなる30サイクルの第２回
目の PCR を行った。次いで、電気泳動後エチジウムブ
ロマイド染色した処、 HCV 産物に相当する所定塩基対
の長さのバンドが存在することを確認した。 尚、 HCV
の検出の際しては、図１に示され且つ本発明者らがク
ロ−ン化した HCV の cDNA 配列（特願平1-344876）の
一部をプライマ−としてに用いた。
混合溶液に、5 単位の Taqポリメラ−ゼを含む反応液
[50 mM トリスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝液(pH
8.0), 50 mM 塩化カリウム,1.5 mM 塩化マグネシウ
ム,0.001% ゼラチン] 75μl を加え、94℃で30秒、55℃
で1 分、72℃で1 分を１サイクルとして、20サイクルか
らなる１回目のＰＣＲを行った。さらに、１回目のＰＣ
Ｒ反応液10μl を別の0.5 mlマイクロチュ−ブに移し、
20 pmol のプライマ−（後記参照）及び 5単位Taq ポリ
メラ−ゼを含む反応液[ 10 mM トリスヒドロキシアミノ
メタン−塩酸緩衝液(pH 8.0), 50 mM 塩化カリウム,1.5
mM塩化マグネシウム, 各200 μM の４種デオキシリボ
ヌクレオチド(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)] 90 μl を加え、
１回目の PCR と同様の系からなる30サイクルの第２回
目の PCR を行った。次いで、電気泳動後エチジウムブ
ロマイド染色した処、 HCV 産物に相当する所定塩基対
の長さのバンドが存在することを確認した。 尚、 HCV
の検出の際しては、図１に示され且つ本発明者らがク
ロ−ン化した HCV の cDNA 配列（特願平1-344876）の
一部をプライマ−としてに用いた。
【００２１】即ち、第１回目の PCR には、配列表の配
列番号１における 22 番目から 49番目までの配列であ
る 5' - ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴ
ＡＣＡＴＣＧ - 3'の塩基配列を有するプライマーと 、203 番目から 227
番目までの配列と相補鎖の配列である 5' - ＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＧＴＡＴＣＣ
ＣＧＣ - 3' なる塩基配列を有するプライマーとが用いられ、また第
２回目の PCR には、配列表の配列番号１における 37
番目から 57 番目までの配列である 5' - ＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ -
3'の塩 基配列を有するプライマーと、174 番目から 194
番目までの配列と相補鎖の配列である 5' - ＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧ -
3' なる塩基配列を有するプライマーとが用いられた。尚、
HCV ゲノム産物に相当する塩基対の長さは 176bp であ
る。
列番号１における 22 番目から 49番目までの配列であ
る 5' - ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴ
ＡＣＡＴＣＧ - 3'の塩基配列を有するプライマーと 、203 番目から 227
番目までの配列と相補鎖の配列である 5' - ＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＧＴＡＴＣＣ
ＣＧＣ - 3' なる塩基配列を有するプライマーとが用いられ、また第
２回目の PCR には、配列表の配列番号１における 37
番目から 57 番目までの配列である 5' - ＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ -
3'の塩 基配列を有するプライマーと、174 番目から 194
番目までの配列と相補鎖の配列である 5' - ＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧ -
3' なる塩基配列を有するプライマーとが用いられた。尚、
HCV ゲノム産物に相当する塩基対の長さは 176bp であ
る。
【００２２】試験例 ウイルスゲノムの抽出に必要なプロティナーゼ K の濃
度範囲の設定 ウイルスゲノムの抽出に必要なプロティナーゼ K の濃
度範囲を求めるため、実施例において言及の溶解液 1μ
l 中のプロティナーゼ K の濃度を変化させ且つ同一の
HCV 患者の血漿を試料として PCR によりウイルスゲノ
ム産物を検出した。結果は図 1 に示される通りであっ
た。
度範囲の設定 ウイルスゲノムの抽出に必要なプロティナーゼ K の濃
度範囲を求めるため、実施例において言及の溶解液 1μ
l 中のプロティナーゼ K の濃度を変化させ且つ同一の
HCV 患者の血漿を試料として PCR によりウイルスゲノ
ム産物を検出した。結果は図 1 に示される通りであっ
た。
【００２３】プロティナーゼ K の濃度を 0 - 10mg/ml
に設定してウイルスゲノム産物の検出を行った処、図 1
における電気泳動パターンのレーン番号 5 - 11 で示
されるように、2.5 - 10mg/ml の範囲内で目的とする H
CV ゲノム産物のバンドが検出され、従ってプロティナ
ーゼ K の濃度は 5mg/ml 以上であれば充分であること
が判明した。 比較試験例 本発明法と従来法での検出感度の比較 本発明法において採用されているウイルスゲノム抽出法
と、従来のグアニジンイソチオシアネートを用いるコム
クジンスキー等の抽出法 ["AnalyticalBiochemistry",
Vol. 162, page 156 - 159 (1987)] を用いた場合にお
ける検出感度を比較するために HCV 患者由来の血漿を
試料とし、PCR によりウイルスゲノム産物の検出を行っ
た。
に設定してウイルスゲノム産物の検出を行った処、図 1
における電気泳動パターンのレーン番号 5 - 11 で示
されるように、2.5 - 10mg/ml の範囲内で目的とする H
CV ゲノム産物のバンドが検出され、従ってプロティナ
ーゼ K の濃度は 5mg/ml 以上であれば充分であること
が判明した。 比較試験例 本発明法と従来法での検出感度の比較 本発明法において採用されているウイルスゲノム抽出法
と、従来のグアニジンイソチオシアネートを用いるコム
クジンスキー等の抽出法 ["AnalyticalBiochemistry",
Vol. 162, page 156 - 159 (1987)] を用いた場合にお
ける検出感度を比較するために HCV 患者由来の血漿を
試料とし、PCR によりウイルスゲノム産物の検出を行っ
た。
【００２４】図 2 は上記の両方法で HCV ゲノムを抽出
し、PCR により検出を行った結果を示すものである。本
発明方法の場合には血漿 10μl の使用で目的とする HC
V ゲノム産物が検出されたが、コムジンスキー等の方法
でゲノム抽出を行なう場合には血漿 10μl ではゲノム
産物検出が不可能であり、検出には 100μl 程度又はそ
れ以上の血漿が必要であるので、この従来法と比較する
場合に本発明方法は検出感度において約 10 倍優れてい
ることが判明した。
し、PCR により検出を行った結果を示すものである。本
発明方法の場合には血漿 10μl の使用で目的とする HC
V ゲノム産物が検出されたが、コムジンスキー等の方法
でゲノム抽出を行なう場合には血漿 10μl ではゲノム
産物検出が不可能であり、検出には 100μl 程度又はそ
れ以上の血漿が必要であるので、この従来法と比較する
場合に本発明方法は検出感度において約 10 倍優れてい
ることが判明した。
【００２５】図 3 及び 4 は HCV 患者を含む 12 例の
血漿を使用し、既述の両方法でゲノム抽出を行い PCR
によりゲノム産物を検出した結果を示すものである。図
3 は本発明方法に使用されている抽出法を血漿 10μl
に適用した場合であり、一方図 4 はコムジンスキー等
の抽出法を 100μl の血漿に適用した場合である (図3
及び 4 において、共通のレーン番号は同一の HCV 患者
又は健常人由来の血漿を試 料として使用した場合の結
果を示している)。
血漿を使用し、既述の両方法でゲノム抽出を行い PCR
によりゲノム産物を検出した結果を示すものである。図
3 は本発明方法に使用されている抽出法を血漿 10μl
に適用した場合であり、一方図 4 はコムジンスキー等
の抽出法を 100μl の血漿に適用した場合である (図3
及び 4 において、共通のレーン番号は同一の HCV 患者
又は健常人由来の血漿を試 料として使用した場合の結
果を示している)。
【００２６】これらの結果から、両方法共に電気泳動の
パターンのレーン番号1,3,4,5,7で使用した同じ患者血
漿で目的とする PCR 産物のバンドが検出され、本発明
法でウイルスゲノムを抽出しても、従来法と比して同等
以上の信頼性をもった検出が可能であることが明かとな
った。
パターンのレーン番号1,3,4,5,7で使用した同じ患者血
漿で目的とする PCR 産物のバンドが検出され、本発明
法でウイルスゲノムを抽出しても、従来法と比して同等
以上の信頼性をもった検出が可能であることが明かとな
った。
【００２７】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２４０ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：ｓｉｎｇｌｅ トポロジー：ｌｉｎｅａｒ 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ｈｕｍａｎ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ：ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧ ＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ ＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＧＣＴＧＣ ＴＧＣＡＡＡＣＡＧＣ ＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴ ＧＧＴＡＧＡＧＴＣＣ 150 ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＧ ＣＣＣＴＴＧＡＧＧＣ ＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＣＴＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＧＴＡＴＣＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣ ＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴ 240 配列番号：２ 配列の長さ：２４０ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：ｓｉｎｇｌｅ トポロジー：ｌｉｎｅａｒ 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ｈｕｍａｎ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ：ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＣＧＧＧＡＧＴＴＣＧ ＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ ＧＧＡＧＴＧＣＧＣＴ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＧＣＴＧＴ ＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ ＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＡＧＣＴＣＣＣＧＴ ＧＧＴＣＧＡＧＴＣＴ 150 ＡＡＡＴＧＧＣＧＧＧ ＣＴＣＴＴＧＡＧＡＣ ＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＧＴＡＣＣＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣ ＣＡＣＴＣＴＧＣＣＴ 240 配列番号：３ 配列の長さ：２４０ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：ｓｉｎｇｌｅ トポロジー：ｌｉｎｅａｒ 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ｈｕｍａｎ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ：ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓＣＡ
ＡＧＡＧＴＴＣＧ ＡＣＧＡＡＡＴＧＧＡ ＡＧＡＧＴＧＣＧＣＣ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＴＴＴＧＣ ＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ ＴＡＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＴ ＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣ 150 ＡＡＧＴＧＧＣＧＧＧ ＣＣＣＴＴＧＡＧＡＣ ＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＡＴＡＣＴＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＡＴＣ ＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴ 240 配列番号：４ 配列の長さ：２４０ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：ｓｉｎｇｌｅ トポロジー：ｌｉｎｅａｒ 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ｈｕｍａｎ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ：ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧ ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＡ ＡＧＡＧＴＧＴＧＣＣ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＧＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＧＴＴＧＣ ＴＧＣＡＡＡＣＧＧＣ ＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＣＧＣＴＣＣＣＧＴ ＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣ 150 ＡＡＧＴＧＧＣＧＴＡ ＣＣＣＴＴＧＡＧＧＣ ＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＡＴＡＣＣＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣ ＣＡＣＴＣＴＧＣＣＴ 240 配列番号：５ 配列の長さ：２４０ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：ｓｉｎｇｌｅ トポロジー：ｌｉｎｅａｒ 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ｈｕｍａｎ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ：ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧ ＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ ＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＧＣＴＧＣ ＴＧＣＡＡＡＣＧＧＣ ＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴ ＧＧＴＡＧＡＧＴＣＣ 150 ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＧ ＣＣＣＴＴＧＡＧＧＣ ＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＧＴＡＴＣＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣ ＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴ 240
ＡＧＡＧＴＴＣＧ ＡＣＧＡＡＡＴＧＧＡ ＡＧＡＧＴＧＣＧＣＣ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＴＴＴＧＣ ＴＧＣＡＧＡＣＡＧＣ ＴＡＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＡＧＣＣＣＣＣＧＴ ＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣ 150 ＡＡＧＴＧＧＣＧＧＧ ＣＣＣＴＴＧＡＧＡＣ ＴＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＡＴＡＣＴＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＡＴＣ ＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴ 240 配列番号：４ 配列の長さ：２４０ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：ｓｉｎｇｌｅ トポロジー：ｌｉｎｅａｒ 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ｈｕｍａｎ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ：ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧ ＡＴＧＡＡＡＴＧＧＡ ＡＧＡＧＴＧＴＧＣＣ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＧＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＧＴＴＧＣ ＴＧＣＡＡＡＣＧＧＣ ＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＣＧＣＴＣＣＣＧＴ ＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣ 150 ＡＡＧＴＧＧＣＧＴＡ ＣＣＣＴＴＧＡＧＧＣ ＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＴＴＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＡＴＡＣＣＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣ ＣＡＣＴＣＴＧＣＣＴ 240 配列番号：５ 配列の長さ：２４０ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ 配列の型：核酸 鎖の数：ｓｉｎｇｌｅ トポロジー：ｌｉｎｅａｒ 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ｈｕｍａｎ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ：ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧ ＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ ＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣ 30 ＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣ ＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡ ＡＣＡＡＧＧＡＡＴＧ 60 ＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧ ＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡ ＧＣＡＧＡＡＧＧＣＧ 90 ＣＴＣＧＧＧＣＴＧＣ ＴＧＣＡＡＡＣＧＧＣ ＣＴＣＣＡＡＧＣＡＡ 120 ＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧ ＣＴＧＣＴＣＣＣＧＴ ＧＧＴＡＧＡＧＴＣＣ 150 ＡＡＧＴＧＧＣＡＡＧ ＣＣＣＴＴＧＡＧＧＣ ＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧ 180 ＡＡＧＣＡＣＡＴＧＴ ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴ ＣＡＧＣＧＧＧＡＴＡ 210 ＣＡＧＴＡＴＣＴＡＧ ＣＡＧＧＣＴＴＧＴＣ ＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴ 240
【００２８】
【発明の効果】本発明の mRNA 及びウイルスゲノム抽出
法によれば、変性蛋白質の除去処理やアルコールによる
沈澱処理操作を必要としない。従って、生体由来の試料
からの特定の mRNA 及びウイルスゲノムの検出に際して
は、当該試料と蛋白分解酵素及び非イオン性界面活性剤
との反応に始まり、必要に応じて行われる RNAから DNA
への逆転写反応及びポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 処
理に至るまでの過程を連続して唯1 本の反応チューブ
で行うことができるので、操作の簡素化がもたらされる
と共に、コンタミネーションの確立を大幅に低下させる
ことができる。
法によれば、変性蛋白質の除去処理やアルコールによる
沈澱処理操作を必要としない。従って、生体由来の試料
からの特定の mRNA 及びウイルスゲノムの検出に際して
は、当該試料と蛋白分解酵素及び非イオン性界面活性剤
との反応に始まり、必要に応じて行われる RNAから DNA
への逆転写反応及びポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 処
理に至るまでの過程を連続して唯1 本の反応チューブ
で行うことができるので、操作の簡素化がもたらされる
と共に、コンタミネーションの確立を大幅に低下させる
ことができる。
【００２９】本発明の場合に mRNA 及びウイルスゲノム
の抽出所要時間は 2 時間以内に短縮され、これは従来
法の半分以下の時間であり、またヒトＣ型肝炎ウイルス
(HCV) を PCR 法を利用してHCV ゲノム産物として検
出する場合に、従来法によれば 2 日間を要していた
が、本発明方法を利用すれば 8 時間以内に行うことが
でき、更に本発明は簡便であるために検出の自動化乃至
半自動化が可能である。
の抽出所要時間は 2 時間以内に短縮され、これは従来
法の半分以下の時間であり、またヒトＣ型肝炎ウイルス
(HCV) を PCR 法を利用してHCV ゲノム産物として検
出する場合に、従来法によれば 2 日間を要していた
が、本発明方法を利用すれば 8 時間以内に行うことが
でき、更に本発明は簡便であるために検出の自動化乃至
半自動化が可能である。
【図 １】図１はウイルスゲノムの抽出に必要とするプ
ロテイネ−スＫの濃度を調べるため、HCV 肝炎患者血漿
を用い、実施例 2 に記載の要領でウイルスゲノム産物
の検出を行った結果を示すものであり、電気泳動のパタ
ーンを模写したものである。
ロテイネ−スＫの濃度を調べるため、HCV 肝炎患者血漿
を用い、実施例 2 に記載の要領でウイルスゲノム産物
の検出を行った結果を示すものであり、電気泳動のパタ
ーンを模写したものである。
【図 ２】図２は本発明の方法と従来法とによりウイル
スゲノムを抽出し、 PCR によりウイルスゲノム産物の
検出を行い検出感度を比較した結果を示す電気泳動パタ
ーンを模写したものである。
スゲノムを抽出し、 PCR によりウイルスゲノム産物の
検出を行い検出感度を比較した結果を示す電気泳動パタ
ーンを模写したものである。
【図 ３】
【図 ４】図３及び図４は本発明による方法と、グアニ
ジンイソチオシアネ−トを用いたコムクジンスキ−らの
方法［AnalyticalBiochemistry 162,156-159,(1987) ］
を HCV 患者血漿に、但し血漿の使用量は本発明の場合
が 1/10 であるが、適用してウイルスゲノムの抽出を行
い、次いで実施例２に記載の要領でウイルスゲノムの検
出を行った結果を示すものであり、それぞれの電気泳動
パターンを模写したものである。
ジンイソチオシアネ−トを用いたコムクジンスキ−らの
方法［AnalyticalBiochemistry 162,156-159,(1987) ］
を HCV 患者血漿に、但し血漿の使用量は本発明の場合
が 1/10 であるが、適用してウイルスゲノムの抽出を行
い、次いで実施例２に記載の要領でウイルスゲノムの検
出を行った結果を示すものであり、それぞれの電気泳動
パターンを模写したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＮＡ Ａ 9453−4Ｂ (72)発明者 城森 孝仁 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社 三和化学研究所 内 (72)発明者 高橋 治雄 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社 三和化学研究所 内 (72)発明者 林 祐 二 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社 三和化学研究所 内 (72)発明者 鈴木 栄二 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社 三和化学研究所 内
Claims (4)
- 【請求項１】 非イオン性界面活性剤の存在下に蛋白分
解酵素により生体試料を処理し、得られた抽出液中に存
在する可能性のあるヒト C 型肝炎ウイルス RNA を DNA
に変換し、 5' - ＧＡＧＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴ
ＡＣＡＴＣＧ - 3' なる塩基配列を有するプライマーと、 5' - ＡＡＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＴＧＴＡＴＣＣ
ＣＧＣ - 3' なる塩基配列を有するプライマー及び Taq ポリメラー
ゼを含有する反応液を添加して、上記の DNA に関して
第 1 回目のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行い、次い
で 5' - ＣＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡ -
3' なる塩基配列を有するプライマーと、 5' - ＴＴＣＣＡＣＡＴＧＴＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧ -
3' なる塩基配列を有するプライマー及び Taq ポリメラー
ゼを含有する反応液を添加して第 2 回目のポリメラー
ゼ連鎖反応 (PCR) を行い、次いで電気泳動により検出
すべきウイルスゲノムの産物に相当する 176bp のバン
ドが検出されるか否かを調べることを特徴とする、ヒト
C 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法。 - 【請求項２】 生体試料が血清、血漿及び摘出された組
織から選択されたものであることを特徴とする、請求項
1 に記載のヒト C 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出
法。 - 【請求項３】 蛋白分解酵素がプロティナーゼ K であ
ることを特徴とする、請求項 1 又は 2 に記載のヒト C
型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法。 - 【請求項４】 生体試料として血清又は血漿を用いる場
合には、当該試料の量を 1 - 20μg 以内に、また生体
組織を用いる場合には 10mg 以内にとどめることを特徴
とする、請求項 1、2 又は 3 に記載のヒト C 型肝炎ウ
イルスゲノムの簡便な検出法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3027537A JPH0751080B2 (ja) | 1991-02-21 | 1991-02-21 | ヒト ｃ 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法 |
| EP91120311A EP0488243A1 (en) | 1990-11-30 | 1991-11-27 | Method of extracting virus genome from sample derived from living body infected with the virus and detecting the genome |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3027537A JPH0751080B2 (ja) | 1991-02-21 | 1991-02-21 | ヒト ｃ 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04267899A JPH04267899A (ja) | 1992-09-24 |
| JPH0751080B2 true JPH0751080B2 (ja) | 1995-06-05 |
Family
ID=12223848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3027537A Expired - Lifetime JPH0751080B2 (ja) | 1990-11-30 | 1991-02-21 | ヒト ｃ 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0751080B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999030167A1 (en) * | 1997-12-06 | 1999-06-17 | Genox Research, Inc. | Sample data managing system |
| CN114080456A (zh) * | 2019-07-18 | 2022-02-22 | 株式会社岛津制作所 | Rna病毒检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04200400A (ja) * | 1990-11-30 | 1992-07-21 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | ヒト生体由来の試料からのウイルスゲノムの抽出法及び該ウイルスゲノムの検出法 |
-
1991
- 1991-02-21 JP JP3027537A patent/JPH0751080B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04267899A (ja) | 1992-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3490724B2 (ja) | 核酸の定量化 | |
| Muir et al. | Rapid diagnosis of enterovirus infection by magnetic bead extraction and polymerase chain reaction detection of enterovirus RNA in clinical specimens | |
| Young et al. | Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription-polymerase chain reaction assay | |
| US5534406A (en) | Method of detecting antigenic nucleic acid-containing macromolecular entities | |
| Young et al. | Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription PCR assay: comparison with nested amplification and antibody testing | |
| US20100209903A1 (en) | Method for measuring resistance of a patient HIV-2 to protease inhibitors | |
| US20120219941A1 (en) | Identification of Oligonucleotides for the Capture, Detection and Quantitation of Hepatitis A Viral Nucleic Acid | |
| US20030143527A1 (en) | Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis B viral DNA | |
| US20030044771A1 (en) | Method for discovering new infectious particles | |
| Zein et al. | Hepatitis C genotypes in liver transplant recipients: distribution and 1-year follow-up | |
| US6531588B1 (en) | Methods for HIV sequencing and genotyping | |
| JP3494509B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| CN117106971A (zh) | 用于检测丁型肝炎病毒的核酸组合及试剂盒和应用 | |
| JPH04267899A (ja) | ヒト ｃ 型肝炎ウイルスゲノムの簡便な検出法 | |
| JPH04200400A (ja) | ヒト生体由来の試料からのウイルスゲノムの抽出法及び該ウイルスゲノムの検出法 | |
| KR100386135B1 (ko) | 신증후성출혈열바이러스의검출방법 | |
| JP7803271B2 (ja) | 改良されたウイルスの検出方法 | |
| JPH07250700A (ja) | 競合ｐｃｒ法による核酸の簡易定量法 | |
| JP3940446B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプの判別方法 | |
| CN113025756A (zh) | 一种用于检测hcv 1型耐药突变基因的检测方法及应用 | |
| Abe et al. | Direct polymerase chain reaction for detection of hepatitis B, C and G virus genomes from serum without nucleic acid extraction—simple, rapid and highly sensitive method | |
| Forčić et al. | Detection of hepatitis C virus RNA in alpha interferon derived from in vitro culture of leukocytes of human origin | |
| JP2003174878A (ja) | 核酸合成法 | |
| JPH05176773A (ja) | オリゴヌクレオチド、オリゴペプタイド、ならびに抗ｃ型肝 炎ウイルス抗体検出・鑑別方法 | |
| AU2002348426A1 (en) | Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis B viral DNA |