JPH0334992A - 表皮成長因子を含有する安定化された組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）を含有する製剤
学的１１戊物、およびこのような組成物を調製する方法
に関する。とくに、本発明は、金属カチオン、例えば、
亜鉛と組み合わせた結果、増加した安定性を有するこの
ような製剤学的組成物に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである二本発明は、製
剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）および、
前記ＥＧＦの劣化を防止するために十分な量の製剤学的
に許容されうる金属、カチオンからなる製剤学的組成物
を提供する。

ヒトＥＧＦ　（また、ウロガストロンとして知られてい
る）は、上皮細胞および間葉細胞を包含する、ある数の
種類の細胞についてミトゲン活性を有する、５３アミノ
酸のポリペプチドの成長因子である。ヒトＥＧＦポリペ
プチドの変異型、例えば、５２アミノ酸のガンマ−ウロ
ガストロンは報告された。ＥＧＦは、そのミトゲン効果
の結果、創傷の治癒速度の増加において有用であると報
告された。ＥＧＦは、また、胃潰瘍の処置に有用である
と、報告された。ＥＧＦの概観は次の文献に記載されて
いる二カーペンタ−（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ）　　ｅｔ　
　ａｌ、、「表皮成長因子、その受容体および関係する
タンパク質（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　　Ｇｒｏｗｔｈ　　
Ｆａｃｔｏｒ、Ｉｔｓ　　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　　ａ、ｎ
ｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ、エキ
スベリメンタル・セル・３ リサーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｓ、）、−ヒ」。

４：１−１０　　（１９８６）　　。

ＥＧＦの治療学的使用における重要な目的は、長い貯蔵
寿命を有しそして、長い時間にわたってＥＧＦの主とし
て活性な単一の種としてとどまることができる、安定な
製剤学的ＥＧＦの配合物の開発である。しかしながら、
ＥＧＦの固有の不安定性のために、このような安定なＥ
ＧＦ配合物の開発において困難に直面した。例えば、Ｅ
ＧＦは湿気の存在下に生物学的活性を損失する。米国特
許第４，７１７，７１７号は、このような生物学的活性
の損失に対してＥＧＦを安定化する組成物および方法を
記載している。まプこ、ヒトＥＧＦは経時的に活性を損
失しそして、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）により同定された、ＥＧＦ分子の多数の種を産生ずる
。ＥＧＦのこれらの多数の種は、ＥＧＦの化学的変性か
ら生ずる、ＥＧＦまたは誘導の劣化から生ずる破壊産生
物であると信じられる。少なくとも３つのこのような劣
化産生物が存在すると信じられ、それらのあるののまた
はすべてはＥＧＦ生物学的活性を有する。

４５°ＣにおけるＥＧＦのインキュベーションは、周囲
温度における長期間の貯蔵で通常発見される劣化産生物
の形成を促進する。このような劣化、およびＥＧＦの生
物学的活性の関連する損失は、ＥＧＦの水性または固体
の調製物の延長した時間にわたって貯蔵することを不可
能とするので、不利である。

本発明は、ＥＧＦ分子の劣化および生物学的活性の生ず
る損失を減少する手段を提供する。

本発明は、製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（ＥＧ
Ｆ）および前記ＥＧＦの劣化を防止するために十分な量
の製剤学的に許容されうる金属カチオンからなる製剤学
的組成物を提供する。好ましい実施態様において、金属
カチオンは二価の亜鉛イオンである。また、劣化および
生物学的活性損失に対して安定化された亜鉛およびＥＧ
Ｆの複合体の塩からなる、結晶質ＥＧＦ組成物を提供さ
れる。本発明は、さらに、ＥＧＦの劣化を防止すること
ができる、適当な金属カチオンとＥＧＦを混合すること
によって、ＥＧＦを安定化する方法を提供する。

ヒトＥＧＦは、次の文献に記載されているような、ポリ
ペプチド配列またはそれらの任意の実質的な部分を有す
るＥＧＦを呼ぶ：ウルデア（Ｕｒｄｅａ）、Ｍ、Ｓ、ｅ
ｔ　　ａｔｌ、プロシーデインダス・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡＸ　８０：６４６１−６４６５　　（
１９８３）。ヒトＥＧＦは、また、ヒトＥＧＦ変異型、
例えば、ガンマ−ウロガストロンを呼ぶ。ＥＧＦは、組
み換えＤＮＡ技術を使用して産生されたか、あるいは化
学的合成により調製された、自然源から分離することが
できる。ＥＧＦの生物学的活性な断片、類似体または人
造の化学的脅威された誘導体を、全体の天然に産生ずる
分子の代わりに、本発明において使用することができる
が、ただしこのような断片、類似体または誘導体は天然
に産生ずるＥＧＦの生物学的活性を保持することを条件
とする。ＥＧＦの生物学的活性は、上皮細胞および間葉
細胞についてのミトゲン活性および胃酸分泌の抑制を呼
ぶ。ここで使用するとき、ＥＧＦは、前述の方法および
生物学的に活性な断片、類似体または誘導体および関係
するそれらのポリペプチドにより産生されるＥＧＦを包
含する。

ＥＧＦの用語「類似体」は、ｌまたは２以上のアミノ酸
が化学的に類似するアミノ酸で置換されている、ＥＧＦ
に実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
呼ぶ。用語「類似体」は、また、■または２以上のアミ
ノ酸がＥＧＦのポリペプチドから欠失されているか、あ
るいはそれに付加されたいるが、なおＥＧＦに対するア
ミノ酸の実質的相同性保持する、ポリペプチドを包含す
るであろう。実質的な配列の相同性は５０％より大きい
相同性である。ＥＧＦの用語「断片」は、少なくとも１
０のアミノ酸残基およびＥＧＦと同の生物学的活性を有
する、ＥＧＦのより短いバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）
を呼ぶ。句「化学的誘導体」は、ｌまたは２以上のアミ
ノ酸がアミノ酸の官能的側基の反応により合成的に化学
的に誘導 ４化された、天然に産生ずるＥＧＦのポリペプチドから
誘導されるポリペプチドを呼ぶ（すなわち、それは１ま
たは２以上の工程により親ＥＧＦ分子から誘導される）
。

ＥＧＦの「製剤学的的に有効量」は、種々の投与の養生
法において治療学的効果を与える量を呼ぶ。例えば、創
傷の治癒に使用するとき、それは創傷の治癒速度を増強
する量である。約０．Ｏ１〜約１０００μｇ　／　ｍ　
Ｑ水性配合物の範囲内の量のＥＧＦを含有する、本発明
の組成物を、調製することができる。好ましくは、濃度
は１〜５００　ｐ　ｇ／ｍＱ　、より好ましくはｌｌ−
１Ｏ０ｐ／ｍＱの範囲である。

前述のように、ＥＧＦは経時的に劣化して、劣化した産
生物であると信しられるＥＧＦ分子の多数の種を形成す
る。ＥＧＦの劣化は、自然の老化プロセスを呼び、この
プロセスにより出発物質として使用するＥＧＦ分子の分
子構造（例えば、５３アミノ酸の形態またはその変異型
）は、（ａ）化学的に変性して、天然に産生ずるまたは
環境的に誘発された化学反応、例えば、異性化、酸化ま
たは脱アミド化の結果として、ＥＧＦ変異型を形成する
か、あるいは（ｂ）破壊または分解してより小さい分子
となる。このような劣化は、次の環境的因子の結果とし
て自然に起こる：例えば、光、これは光酸化を引き起こ
し得る；ｐＨの変化；イオン強度の変化：温度の変化：
および分子の物理学的操作。３つのこのような劣化産生
物はこの時点において同一された。第１図はＥＧＦの逆
相ＨＰＬＣのクロマトグラムを描写し、逆相ＨＰＬＣ上
に自然ＥＧＦ　（ピークＤ）、ならびに３つの劣化産生
物（ピークＣ１ＸおよびＹ）を示す。ＥＧＦの主要な老
化産生物は、ビークＸおよびＹにより表されるものであ
ると思われる。本発明は、ビークＸおよびＹの形成を形
成することが示され、こうしてＥＧＦの主に活性な種の
維持に寄与し、すなわち、出発物質の９０％より多くは
不変化である。

本発明の方法は、また、亜鉛の結合で活性アミノ酸残基
の遮断により他のタンパク質を安定化することかできる
と考えられる。このような他のタンパク質は、タンパク
質構成体内のアミノ酸残基が劣化産生物、例えば、異性
化した中間体を安定化する作用をするものを包含する。

また、このような他のタンパク質は、ＥＧＦに対して同
様な作用するアミノ酸ドメインを有するもの、例えば、
他の他の成長因子、例えば、線維芽威長因子を包含する
。

過去において、ある種の濃度の亜鉛は中性インスリン溶
液へ安定化作用を及ぼすことが報告された。参照、米国
特許第４，４７６．１．１８号：およびラーフヒード（
Ｌｏｕｇｈｅｅｄ）、Ｗ、Ｄ。

、ダイアベトロギア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）１９
：　１−９　（１９８０）。しかしながら、亜鉛はイン
スリン分子の劣化（その用語がここで使用されるように
）を防止するために使用されなかったが、むしろ溶液か
らの凝集したインスリンの沈澱を防止した。インスリン
は不均質に凝集し、そしてより大きい分子量の凝集物、
例えば、インスリンヘキザマーを形成する傾向があり、
そして前記凝集物は非常には可溶性ではなく、そして溶
液から沈澱する傾向がある。亜鉛は、インスリンの可溶
性がより低いヘキサマーの形態をより可溶性とすること
によって、それを「安定化した」。亜鉛のこのような安
定化作用を報告した早期の参考文献において、インスリ
ンは経時的生物学的活性の有意の減少を示すことが報告
されていないので、用語「安定化」は溶解度の増加を意
味するために使用されたが、劣化を意味するために使用
されなかった。亜鉛は、また、インスリンおよび亜鉛−
インスリン結晶の形成のための結晶化促進金属として使
用された。参照、米国特許第４，７６４゜５９２号。

ここで使用するとき、用語「亜鉛」、「亜鉛陽イオン」
、または「亜鉛イオン」のすべては、二価の亜鉛イオン
を意味する。本発明は亜鉛の二価陽イオンの使用により
例示されるが、他の適当な陽イオンは同一効果を達成す
ることができると考えられる。このような適当な陽イオ
ンは「製薬学的に許容されうる」ものでなくてはならな
ず、こ１ れは前記陽イオンがヒトに対して無毒でありかつ、ヒト
に投与したとき、有害なまたは望ましくない副作用をも
たないことを意味する。このような適当な陽イオンはＥ
ＧＦの劣化を引き起こしてはならず、むしろこのような
劣化を防止することかできなくてはならない。また、こ
のような陽イオンはフリーラジカルの形成を引き起こす
か、あるいは誘発してはならない。また、陽イオンはＥ
ＧＦの生物学的活性に悪影響を及ぼしてはならす、むし
ろこのような性質を維持しなくてはならない。

こうして、適当な陽イオンは、製剤学的に許容されうろ
ことができ、フリーラジカルの形成を引き起こさず、そ
してＥＧＦの生物学的活性の防止性質およびＥＧＦの生
物学的活性を維持する性質を有するものである。このよ
うな性質を有する一価、二価または三価の陽イオンは本
発明の範囲内であると考えられる。ランタン（三価）は
ＥＧＦを使用する結晶質沈澱を形成することが示された
。次の物質の陽イオンは、フリーラジカルの形成を引き
起こないので、適当ではない、マンガン、銅、２ 鉄およびコバルト。適当でありうる他の陽イオンは、マ
ンガン、ノＪルシウム、カドミウム、ニッケル、スズ、
カリウムおよびリチウム。

ここで使用するとき、「亜鉛−ＥＧＦＪまたは「亜鉛−
ＥＧＦ複合体」は、亜鉛がＥＧＦに配位結合をしている
複合体のイオンを意味する。水溶液において、亜鉛−Ｅ
ＧＦ複合体はｐＨ４，０〜７．０、好ましくは５．５〜
６．０の範囲内に維持しなくてはならない。この範囲外
では、亜鉛ＥＧＦ複合体はモノマーのＥＧＦおよび亜鉛
陽イオンに解離する。こうして、亜鉛−ＥＧＦの水溶液
を緩衝化してこのようなｐＨを維持することが好ましい
。ｐＨを４．０〜７．０、好ましくは５゜５〜６．０の
範囲内に維持する任意の系は適当であるが、ただし緩衝
液中に存在する反対イオンは亜鉛をキレ−１・化しない
か、そうでなければそれを溶液から沈澱させない。例え
ば、リン酸塩または炭酸塩を含有する緩衝液系は、亜鉛
を沈澱させるであろうから、適当ではない。適当な緩衝
液系（ま、次の反対イオンに基づくものである：酢酸、
コハク酸、塩素、硫酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸
のイオンなど。好ましい緩衝液系は酢酸塩の緩衝液系で
ある。好ましい実施態様において、酢酸亜鉛はＥＧＦの
溶液に添加して、ＥＧＦを安定化する。酢酸亜鉛は亜鉛
イオンを提供してＥＧＦおよび酢酸塩の反対イオンに結
合させて、ｐＴ−１を好ましい範囲内に維持するという
二重の機能を有する。別の実施態様において、他の可溶
性の亜鉛塩、例えば、塩化亜鉛を使用する場合、緩衝液
は、また、使用することができる。

約■０〜２０ミリモルの亜鉛陽イオンを約２５０μｇ／
ｍＱの濃度であるＥＧＦの水溶液に添加するとき、ＥＧ
Ｆの最大の安定性が得られる決定された。こうして、本
発明の好ましい実施態様において、１０〜２０ミリモル
の亜鉛を各２５０　ｐｇのＥ　Ｇ　Ｆ　／　ｍ　Ｑにつ
き使用する。これらの量は、当業者により、安定化すべ
きＥＧＦの量または所望の結晶質亜鉛−ＥＧＦの量に依
存して変化させることができる。例えば、ＥＧＦの濃度
を増加するとき、亜鉛の濃度を比例的に増加することが
必要である。より高い量、例えば、各２５０μｇのＥＧ
Ｆ／ｍＱについて５０ミリモルまでの亜鉛は、また、反
応を完結することができる。より少ない量を使用するこ
とができるが、ＥＧＦのすべては安定化される必要はな
い。このような変化を行うことは、当業者の技量の範囲
内である。

本発明は、また、長期間の貯蔵可能性の利点を有する、
亜鉛およびＥＧＦの複合体の塩からなる、結晶質ＥＧＦ
ｉ戒物を提供する。亜鉛−ＥＧＦ塩の陽イオンは、亜鉛
−ＥＧＦの塩の形成を行う任意の陽イオンであることが
でき、それらの例は次の通りである：ナトリウム、カリ
ウム、リチウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシ
ウムまたはバリウム。前述のように、ｐＨが４．０〜７
．０の範囲内であるかぎり、亜鉛−ＥＧＦ複合体は溶液
から沈澱するであろう。この範囲外で、複合体は解離す
る。ＥＧＦは解離して、それが生体内の生物学的効果を
もたなくてはならない。こうして、亜鉛−ＥＧＦは、水
性または結晶の形態で、創傷または他の生物学的表面に
直接適用して、ＥＧＦ５ の解放を遅くすることができる。体液の生理学的ｐ　Ｈ
は、すなわち、中性のｐ　Ｈは、亜鉛−ＥＧＦをゆっく
り解離させてモノマーのＥ　Ｇ　Ｆを解放するであろう
。

結晶質亜鉛−ＥＧＦは任意の数の方法において調製する
ことができる。一般に、可溶性亜鉛塩は、例えば、酢酸
亜鉛または塩化亜鉛をＥＧＦの水性混合物に添加する。

必要に応じて、ｐＨは４．７〜７．０、好ましくは５．
５〜６０の範囲内に調節する。次いで、結晶質亜鉛−Ｅ
ＧＦを室温において混合せずに溶液から沈澱する。ある
いは、任意の形態、例えば、凍結乾燥した形態でＥＧＦ
を緩衝化した亜鉛イオンの溶液に添加することができる
。

亜鉛−ＥＧＦ結晶はこの分野において知られている方法
で回収することができる。例えば、結晶を含有する水溶
液を遠心して結晶を詰めることができる。次いで、上澄
み液を注ぎ出し、そして結晶を濾過し、洗浄し、次いで
乾燥した。

ＥＧＦは創傷の治癒において使用すると記載し６ てきたので、本発明の組成物を使用して創傷を処置して
、その治癒速度を増加することができる。

本発明の組成物を使用して治癒することができる創傷の
種類は、上皮の損傷を引き起こす偶発的または医学的損
傷から生ずるものであり、それらの例は次の通りである
：目の創傷、例えば、角膜の潰瘍、ラジアルケラトトミ
ー（ｒａｄｉａｌｋｅｒａｔｏｔｏｍｙ）、角膜移植、
エビケアラド７アキア（ｅｐｉｋｅｒａｔｏｐｈａｋｉ
ａ）および目における他の外科的に誘発される創傷；お
よび皮膚の創傷、例えば、熱傷、皮膚移植からの供与部
位および潰瘍（皮膚、とこずれ、うっ血および糖尿病）
。さらに、皮膚が損傷された皮膚科学の状態、例えば、
乾解、日焼けおよび皮膚の発疹を本発明の組成物で処理
することができる。組成物は創傷部位に、創傷のタイプ
に依存して、局所的にあるいは内部的に適用することが
できる。

創傷を治癒する速度を増加する方法は、本発明お組成物
を創傷部位に局所的に適用することによって創傷部位に
直接適用または接触することからなる。組成物を創傷と
十分な時間接触させて維持して、創傷部位における細胞
の増殖速度を増加することである。このような方法は、
本発明の組成物を、製剤学的に許容されうる制御された
解放する組成物、例えば、クリーム、ゲル、エアゾール
スプレー、マイクロカプセル、フィルムまたは凍結乾燥
した泡または水性配合物中に混入するか、あるいはガー
ゼ包帯を組成物の水溶液でソーキングし、次いでこのよ
うな配合物または包帯を創傷部位に適用することを包含
する。

本発明の組成物は、点眼配合物、目のゲル、目のクリー
ム、リポソームまたはミセルの配合物、水性賦形剤、ソ
ーキングしたガーゼ包帯、熱傷の包帯、人工的皮膚、縫
合糸およびステープルコーティングのための水性賦形剤
、軟膏またはクリーム、ゲル配合物、泡などにおいて有
用である。追加の材料、例えば、緩衝液、防腐剤、張度
調節剤、酸化防止性、粘度調節または増量剤硫酸アンモ
−ラム溶液使用するポリマー、および賦形剤を組成物に
おいて使用することができる。このような他の材料の特
定の例は、次のものを包含する：酢酸塩またはホウ酸塩
；ヂメロゾル、ソルビン酸、メチルまたはプロピルパラ
ベンおよびクロロブタロールの防腐剤；張度を調節する
ための塩化ナトリウムおよび／または糖：および賦形剤
、例えば、マンニトール、ラクトースまたはスクロース
。

金属の結合の結果としてＥＧＦの構造的安定性は、ＥＧ
Ｆ、および媒質のｐＨおよびイオン強度に対する金属の
化学量論の関数である。金属−タンパク質複合体の形成
における他の重要な変数は、誘電率（Ｄ　Ｉ　Ｅ）およ
びタンパク質の表面上の水活性である。中性の化合物は
、水の構造および媒質中のＤＩＥに影響を及ぼすことが
示された。ＤＩＲの減少はイオンの相互作用（例えば、
金属ＥＧＦ複合体）を増加させ、これにより金属のＥＧ
Ｆへの結合を増加し、そして安定性を増加する。

ＤＩＥを減少するという二次効果は分子間の水素結合を
増加することであり、これはまたＥＧＦの安定性に寄与
するであろう。こうして、ＤＩＥを減少する因子は水の
極性を変化させ、タンパク質１９ の回りの水利のエンベロープを変更しそしである場合に
おいてタンパク質の表面と直接相互作用することによっ
て、ＥＧＦタンパク質への安定化作用を有する。ＤＩＥ
を減少することができる中性化合物の例は、次の通りで
ある２１価および多価のアルコール、例えば、エタノー
ル、イン７０パノール、マンニト−ル、ソルビＩ・−ル
、イソシ［・−ル、スクロース、ラクトース、グリセリ
ンなど；ポリヒドロキシル化合物、例えば、グリセロル
、ポリエチレングリコール、フロピレンゲリコール、ポ
リオキシマー：ＰＩｕｒｏｎｉｃ　　Ｆ１ａ）、ポビド
ン、ヒドロキシメチル（エチルまたはプロピル）セルロ
ース、オクトキシノール９など：界面活性剤、例えは、
ポリソルベー）　（Ｔｗｅｅｎ）、Ｂｒ１ｊｓ　ポリオ
キシエチレンソルビタンモノエステルおよびトリエステ
ルなどニアミノ酸、例えば、グリシン、ロイシン、ポリ
アミノ酸など；および他の化合物、例えば、ゼラチンま
たは加水分解したゼラチンおよびデキストラン。

このような化合物はすべてＦＤＡ承認でありかつ０ 水溶性である。本発明の組成物へのこれらの中性の帯電
した製剤学的化合物のいずれの添加も、ＥＧＦの安定化
をさらに増加すると信じられる。

本発明の組成物は、また、抗バクテリア化合物、例えば
、スルファジアジン化合物および、とくに、銀スルファ
ジアジンおよび亜鉛スルファジアジンと組み合わせるこ
とができる。亜鉛スル７アジアジン化合物は、抗バクテ
リアを提供しかつ組成物の性質を安定化するという二重
の目的を有するであろう。

本発明の組成物は凍結乾燥して、ＥＧＦをさらに安定化
することができる。凍結乾燥の方法はこの分野において
よく知られている。成長因子を含有する安定な凍結乾燥
した配合物は、本出願人に係る同時係属の米国特許出願
第０９８，８１７号に記載されている、その開示をここ
に引用によって加える。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

本発明は、特許請求の範囲による以外、これらの実施例
により限定されない。

実施例１ 組み換え的に産生されたヒトＥＧＦ　（Ｃｈ　ｉ　ｒｏ
ｎ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔ　ｉｏｎ、カリフォルニア州エ
メリービレ）を、次の実験において使用した。

亜鉛イオンを有するＥＧＦの安定性をｐＨ５，５〜６．
５において試験した。凍結乾燥したＥＧＦを５０ミリモ
ルの酢酸すＩ・リウム中でｐＨ５，５において再構成し
た。次いで、塩化亜鉛の溶液をこのＥＧＦ溶液に添加し
た。あるいは、酢酸亜鉛の溶液または亜鉛塩の結晶を添
加した。ｐＨを５゜５〜６．５の範囲に維持し、そして
亜鉛−ＥＧＦを室温において溶液から沈澱させた。

試料を２８日間にわたって老化させ、次いでＨＰＬＣ分
析を使用して、種々の貯蔵条件下に新規な配合物の存在
下にＥＧＦの新しい種（例えば、ピークＣ１ＸおよびＹ
）の配合物を包含する構造の変化を研究した。逆相ＨＰ
ＬＣはＥＧＦの定量的および定性的分析に使用すること
ができる。ＨＰＬＣの結果を下表１に記載する。

亜鉛−ＥＧＦ複合体は、ＨＰＬＣカラム上にそのままで
展開することができないので、ＨＰＬＣ分析前に解離し
なくてはならない。したがって、ＨＰ　Ｌ　Ｃの前に、
分析ずべき試料のｐＨを３．０に調節した。あるいは、
ＥＤＴＡ　（キレート化剤）を使用して、結晶化を逆転
することができる。逆相ＨＰＬＣはバイダク（Ｖｙｄａ
ｃ）Ｃ−４カラム（４，６ｍｍＸ２５ｃｍ、５μｍ）を
使用して実施した。流速は２６℃において２６分にわた
って２６％〜３２％のアセトニトリル（０，１％のＴＦ
Ａ）の直線の勾配を使用して０．８ｍＱ／分であった。

表１ ３ 表１から理解できるように、ピークＹおよびＸにより表
される劣化の種の形成は、亜鉛イオンの存在下に配合し
たとき、亜鉛イオンを含有しない配合物と比較して、大
きく減少した。それ以上の試験おいて、ピークＸおよび
Ｙの種はビークＤの自然ＥＧＦより生物学的活性が４０
％損失したことが示された。ピークＣの種は生物学的活
性の変化を示さなかった。こうして、亜鉛によるＥＧＦ
の安定化は、ピークＸおよびＹの種の形成を減少させる
ことによってＥＧＦの生物学的活性の有意に増加させる
。

実施例２ この実験は、亜鉛−ＥＧＦ複合体の安定性が大きい不溶
性の複合体による水の排除から生ずるか、あるいはタン
パク質中で特定のアミノ酸との亜鉛イオンの直接の相互
作用から生ずるかという問題を解決するために案出され
た。亜鉛−ＥＧＦ溶液および対照を実施例１におけるよ
うに調製し、そして試料をｐＨ４，６に調節した。この
ｐＨにおいて、ＥＧＦは、その等電点にあるので、溶液
か４ ら自然に沈澱した。酢酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ４，
６において沈澱したＥＧＦの２つの組を４６℃において
７日間インキュベーションしＩこ。

方の組は存在する亜鉛イオンを含有したが、他方はを含
有しなかった。ＨＰＬＣの結果を表２に記載する。

表２ ４６°Ｃにおいて７日間の ｐＨ４，６におけるＥＧＦ Ｚｎ十十を含む　　　Ｚｎ＋十を含まずピーク％ ２ Ｄ　　　　　　　　　９１ Ｏ ７ 表２が示すように、亜鉛−ＥＧＦ複合体は、沈澱した形
態のＥＧＦ単独を含有する配合物と比較して、ビークＸ
およびＹを有意に減少させた。これが示唆するように、
ＥＧＦと亜鉛との直接の相互作用は重要であり、そして
亜鉛−ＥＧＦ複合体は水性および結晶の形態の両者にお
いて安定である。

実施例３ この適用の目的のため、亜鉛−ＥＧＦ複合体の生物学的
活性を受容体結合アッセイ（ＲＢ　Ａ）において試験し
た。このアッセイはＥＧＦのその受容体への結合を測定
し、そしてアッセイは１５〜３０％の変動性の範囲を有
する。それはＥＧＦの生物学的活性を決定する認められ
た方法である。

使用した受容体結合アッセイは、サベイジ（Ｓａｖａｇ
ｅ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、ｌｌ上、ｐ、１９５以降
（１９８１）に記載されている方法である。ＲＢＡは、
また、米国特許第４７１７．７１７号に記載されており
、その開示をここに引用によって加える。ＥＧＦを１０
０μｇ／ｍＤ、の濃度で亜鉛イオンと混合して、沈澱を
形成する。沈澱した物質を２つの等しい体積に分割した
。ＥＤＴＡを試料に亜鉛イオンのモルレベルの２倍で添
加した。これは沈澱を含有しない透明溶液を生成した。

他方の試料は沈澱した形態で変化させないで放置し、そ
して３つの試料をＲＢＡでアッセイし、そして結果を表
３に記載する。ＲＢＡにおいて使用した緩衝液はリン酸
塩緩衝液ｐＨ７，４であった。このｐＨにおいて、亜鉛
−ＥＧＦはそのモノマーの形態に解離し、そして亜鉛は
亜鉛リン酸塩として沈澱した。亜鉛を含まないＥＧＦを
対照として処理した。

表３ （μｇ／ｍＱ　） 表３における結果が示すように、沈澱した形態の亜鉛の
存在下のＥＧＦ活性の損失は存在せず、亜鉛−ＥＧＦ複
合体が可逆であることを示唆する。

本発明をある種の好ましい実施態様および実施例を参照
してここに記載した。明らかな変化は当業者にとって可
能であり、本発明はそれらに限定７ されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１、製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）お
よび前記ＥＧＦの劣化を防止するために十分な量の亜鉛
イオンからなる製剤学的組成物。

２、亜鉛およびＥＧＦの複合体の塩からなる、結晶質Ｅ
ＧＦ組成物。

３、前記ＥＧＦおよび亜鉛イオンを配合する工程からな
る、上記第１項記載の組成物の調製方法。

４、ＥＧＦを含有する製剤学的組成物中に、生物学的活
性の損失に対して前記ＥＧＦを安定化するために十分な
量の亜鉛イオンを混入することからなる、前記製剤学的
組成物を安定化する方法。

、、緩衝化水溶液である、上記第１項記載の組成物。

６、ゲルである、上記第１項記載の組成物。

７、クリームである、上記第１項記載の組成物。

８、中性の誘電率減少化合物をさらに含む、上記第１項
記載の組成物。

８ ９、約４．０〜約７．０の範囲内のｐＨを有する、上記
第１項記載の化合物。

１Ｏ１ｐＨは約５．５〜約６．０の範囲内である、上記
第９項記載の組成物。

ｌＬ約１０〜２０ミリモルの亜鉛陽イオン／２５０ｐｇ
のＥ　Ｇ　Ｆ　／　ｍ　Ｑを有する、上記第１項記載の
組成物。

１２、緩衝液は酢酸塩の緩衝液である、上記第５項記載
の組成物。

１３、工程： ａ）ＥＧＦの水溶液を準備し、 ｂ）亜鉛を水性または固体の形態で前記ＥＧＦの溶液に
添加して、亜鉛およびＥＧＦの混合物を形成し、ここで
ｌＯ〜２０ミリモルの亜鉛を２５０ｍｇのＥ　Ｇ　Ｆ　
／　ｍ　Ｑ当たりに使用し、Ｃ）前記混合物のｐ　Ｈを
４．０〜７．０の範囲内に調節し、 ｄ）亜鉛−ＥＧＦの結晶の形成を起こさせ、そして ｅ）前記混合物から結晶質亜鉛−ＥＧＦを回収する、 からなる、結晶質ヒトＥＧＦを生成する方法。

１４、ＥＧＦを十分な亜鉛イオンと組み合わせて、前記
ＥＧＦを劣化に対して安定化することからなる、安定化
されたＥＧＦ組成物を調製する方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、老化させたＥＧＦの溶液を逆相■−■ＰＬＣ
によって分析した後のＥＧＦピークＣＸＤ。 ＸおよびＹの関係を示したクロマトグラムである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、製剤学的に有効量のヒト表皮成長因子（ＥＧＦ）お
   よび前記ＥＧＦの劣化を防止するために十分な量の亜鉛
   イオンからなる製剤学的組成物。 ２、亜鉛およびＥＧＦの複合体の塩からなる、結晶質Ｅ
   ＧＦ組成物。 ３、前記ＥＧＦおよび亜鉛イオンを配合する工程からな
   る、特許請求の範囲第１項記載の組成物の調製方法。 ４、ＥＧＦを含有する製剤学的組成物中に、生物学的活
   性の損失に対して前記ＥＧＦを安定化するために十分な
   量の亜鉛イオンを混入することからなる、前記製剤学的
   組成物を安定化する方法。 ５、、工程： ａ）ＥＧＦの水溶液を準備し、 ｂ）亜鉛を水性または固体の形態で前記ＥＧＦの溶液に
   添加して、亜鉛およびＥＧＦの混合物を形成し、ここで
   １０〜２０ミリモルの亜鉛を２５０ｍｇのＥＧＦ／ｍｌ
   当たりに使用し、 ｃ）前記混合物のｐＨを４．０〜７．０の範囲内に調節
   し、 ｄ）亜鉛−ＥＧＦの結晶の形成を起こさせ、そして ｅ）前記混合物から結晶質亜鉛−ＥＧＦを回収する、 からなる、結晶質ヒトＥＧＦを生成する方法。 ６、ＥＧＦを十分な亜鉛イオンと組み合わせて、前記Ｅ
   ＧＦを劣化に対して安定化することからなる、安定化さ
   れたＥＧＦ組成物を調製する方法。