JPH06511471A

JPH06511471A - インスリンの燐酸化の方法およびそれによって製造された物

Info

Publication number: JPH06511471A
Application number: JP4504822A
Authority: JP
Inventors: ローグヒ−ド・ウィリアム・デー
Original assignee: ディアベコア・メディカル・インコーポレイテッド
Priority date: 1991-02-26
Filing date: 1992-02-26
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2018-05-19
Also published as: EP0573499A1; ES2101089T3; DE69217359T2; WO1992014754A1; ATE148709T1; DK0573499T3; AU1322592A; EP0573499B1; CA2103889A1; JP3407885B2; GB9104037D0; DE69217359D1; US5453417A; CA2103889C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

薬剤の治療指数は致死量と効果的な投与量の比で規定される。インスリンに関してはこの比が極めて低い（Ｂｒａｎｇｅ、Ｙ、　インスリンの本草医学、スブリンガーーベルラーグ、ニューヨーク、１９８７）。この理由によりインスリンは危険な薬剤である。過剰な投与による臨床的結果は昏睡か死である。苛立たしいこの過敏な臨床像はインスリンの皮下吸収の割合と持続時間の実質的な日々の変化である（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌ、Ｊｏ等、臨床薬理学の教本、Ｈａｓｓｅｌｂｌａｔｔ　Ａ、（！ｉ）、ＸＸＸＩＩ／２，１９７５．スプリンガーーベルラーグ、ニューヨーク）。これは臨床現場において通常観察される血糖の大きな変化の主な原因である。日々のインスリン吸収に影響する多くの要素が研究されてきている（Ｂｉｎｄｅｒ、Ｃ，、Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌ　（Ｃｏｐｎｈ）（別冊２）２７：　１−８７．１９６９．；Ｂｉｎｄｅｒ。Ｃ９等、５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　１９：１５６−６３．１９６７　；Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｏ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ　５ニア７−９１．１９８２；５ｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌｌ、Ｊ、等、Ａｃｔａ　Ｐａｅｄｉａｔｒ　５ｃａｎ　（別冊）２７０：９７−１０２．１９７７）、低い治療指数と避けかたり用々の投与量の変化の複合結果のため、インスリン治療は控えめに実施されなければならない。控えめなインスリン治療では血糖を通常の範囲に管理することはほとんど不可能に近い。その結果、インスリン依存糖尿患者の糖と他の代謝物質の管理は普通通常値から遠いものとなる。科学的結果大部分が、この乏しい糖管理は全てでは無いにしても大部分この病気の衰弱と潜在的に致命的であることの複合化に起因していることを示している。手始めに、インスリン依存患者の平均生存期待年数は、インスリンが発見された７１年前のように、３５年に留まっている。吸収率の日々の変動が血糖へのより少ない影響をもつインスリンの生産と使用は糖尿薬の処置と管理に大きな利益となるだろう。ある種の燐酸化インスリンの使用はより優れた血糖管理と、少なくとも部分的に、燐酸化インスリンの皮下吸収における与えられた％変化のために、現在用いることができるインスリンより顕著に低い血糖変化をもたらす。インスリンは以前には燐酸を用いる方法によって燐酸化されていた（Ｆ　ｅ　ｒ　ｒｅｌＲ，Ｅ、等、Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｅａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、７０．２１０７−７．１９４８）、あるいはカップリング剤を用いた非水系有機溶媒中で燐酸とＰＯＣｌ、を用いる方法によって燐酸化されていた（Ｃｅｒａｍｉ　Ａ、等、米国特許番号４，５３４，８９４および４，７０５，８４５）あるいは燐酸アミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｃｌａｔｅ）を用いる方法によって燐酸化されていた（Ｒａｔｈｌｅｖ、ＶとＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｔ、、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、６５．３１９−３３９．１９５６）ｏＦｅｒｒｅｌ等やＲａｔｈｌｅｖとＲｏｓｅｎｂｅｒｇによって作られた燐酸化インスリンは燐酸化の過程をより深く理解するために、特に燐酸化がどのように生材学系と関係しているかという知識を増加するために計画された研究の一部である。この燐酸化インスリンの臨床的優位性は何ら述べられていない。Ｃｅｒａｍｉ等に許可された特許は、インスリン搬送システム中に保存された場合、重合しないという優位性を持つ硫酸化および燐酸化インスリンの生産を含む。このようにこれらのインスリンはＣｅｒａｍｉ等によって述べられているようにインスリンポンプを詰まらせないという優位性をもつ、そしてインスリンポンプを用いている患者が少ないため、これらインスリンは血糖のより良い管理をもたらすべきである。しかしながら、前記インスリンは議論すべき血糖のより良き管理をもたらす生理特性について何も示していない。それ故この効果に合わせて作られるべきフレイムは存在しない。ここで説明される本方法との差異に関し、Ｃｅｒａｍｉ等の特許は、方法の改善が非水系溶媒中で燐酸化を実施することにより達成されたことを強調している。Ｃｅｒａｍｉ等は、米国特許４，７０５，８４５の第１欄、３９−５１行に、水系の条件は過酷でインスリンの崩壊を導くと指摘している。すなわち、彼らは、非水系極性有機溶媒中の硫酸あるいは燐酸と脱水剤の使用が非崩壊の状態でインスリンを効果的に変性することを教える。以後に述べる本発明の方法は差異として　１）水系溶媒中で実施される、２）過酷でないＰＨの条件下で実施される、そして、３）実質的に低下した等電点の燐酸化インスリンを含む方法あるいは精製化によって生産され、Ｃｅｒａｍｉ等の生産物のように反応しないインスリンは実質上含んでいない（米国特許４，７０５．８４５の第４欄表１，２を参照）。物に関する差異としては、Ｃｅｒａｍｉ等の特許はインスリンの自由水酸基上のみでの燐酸化をフレイムしている（米国特許４，７０５，８４５の第２欄、２９ −３１行）。本願発明の物では主要な燐酸化はチロシン−〇Ｈ基、セリーンの水酸基およびスレオニン残基と同様に自由アミノ基上で生ずる。本願発明は、全ての知られた従来技術から異なっているばかりでな（生産された燐酸化インスリンは、顕著な異なった薬理学による血糖のコントロールが優れている。皮下に注入された時に見られる血糖コントロールのこの優れた特性は、燐酸化インスリンに関するどの従来技術にも見られない。血糖をコントロールする改善された能力は少なくとも部分的に、不変性インスリンと比較しインスリン投与における血糖％変化の減少した変化に起因していると信じられる。発明の概要広い見地から見るとインスリンのようなペプチドの燐酸化のための方法を提供するもので、この方法は前記ペプチド水溶液を有効量の）すスフォラスオキシクロライド（オキシ塩化燐）と前記ペプチドの好ましい燐酸化の条件での反応を含む。インスリンの水溶液は好ましくは２°Ｃから４°Ｃの範囲の温度で、２から１０の範囲より好ましくは６．９から９．５の範囲のｐＨでフオスフオラスオキシクロライドと、１５分から４時間の範囲の時間反応し、インスリンの燐酸化が成され、不変性のインスリンが実質的に無いインスリンが生産される。この方法は付加的に燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液による透析あるいはゲル濾過を含みえる。これらの透析あるいはゲル濾過は微量の反応物質、不純物や塩を除去するためであり、さらに燐酸化インスリンを含む透析物あるいは濾過物を得るためである。好ましくは得られた透析物あるいは濾過物を凍結乾燥し凍結乾燥物を得る。そして得られた凍結乾燥物を、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび生産的等電点電気泳動捕集の少なくとも一つにより、分離し精製する。そしてそこから得られたものをゲル濾過、透析および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する。糖尿病の治療に使用する燐酸化インスリンはこのように調製される。その燐酸化インスリンはより低い等電点、好ましくは４より低い等電点を持つように調製されあるいは精製されるべきである。その燐酸化インスリンはそのインスリンのチロシン残基上に置換された少な（とも一つの燐酸基をもつ。そしてその燐酸化インスリンはおそら（付加的にＡ１グリシン、Ｂ１フェニルアラニン、Ｂ２９リジン、Ｂ２２アルギニンそしてＡ１８、Ａ２１、およびＢ３アスパラギンから選ばれたそのインスリン中の自由アミノ基上に燐酸化されているだろう。その燐酸化インスリンは付加的にスレオニン残基の少な（とも一つ、セリン残基の少な（とも一つに燐酸化されているだろう。人間の糖尿病の治療法はその人間に対して効果的な治療上の投与量の燐酸化インスリンを施薬することを含む。その燐酸化インスリンは実質的に不変性のインスリンを含むものではなく、大いに減少（低下）した等電点を持つ。そのインスリンは皮下注射、静脈注入あるいは注射により施薬さね、鼻腔あるいは直腸に施、薬されるだろう。図面の簡単な説明本発明の方法は添付図面を参照して説明される。その図面中国１から図４は、糖尿病に罹った犬の燐酸化インスリンを用いて達成された血糖の優れたコントロールを示すグラフである。図５から７そして図１２は、糖尿病に罹った犬の特定量だけインスリン投与割合を変化させたときの燐酸化されたインスリンが通常のインスリンに対して血糖変化が小さいことを示すグラフである。図８は、通常の犬に通常のおよび燐酸化インスリンのいずれかを投与量を変え図９と図１０は、個々に通常のおよび燐酸化インスリンの赤外スペクトラを示すグラフである。そして図１１は、図１０の拡大図であるグラフである。発明の詳細な説明本発明の方法によれば、インスリンの燐酸化は水溶液中でオキシ塩化燐と接触させることで燐酸化できる。ベブチッドや蛋白質に含まれるアミノ基（ＮＨｔ’）または水酸基（ＯＨ）が上記の反応により燐酸化される。インスリンの反応は、アルカリのｐＨでおこなう時や、次の例でのべるようにインスリンの遊離のアミノ基やインスリンのチロシン、セリン、スレオニンの水酸基が燐酸化される。インスリン中のチロシン残基の燐酸化はｐＨを９．０以上にすることで反応が著しく進行しｐＨが９．　０−９．　５での反応が２７６ｎｍの吸収が消失することで確認された。セリン、スレオニン残基の脱燐酸化は、中性またはアルカリのｐＨで貯蔵されているときにおきるので、アルカリ性ではセリン、スレオニンの燐酸化が抑制される。セリン、スレオニンの燐酸エステルはアルカリのｐＨでは不安定であり、酸性のｐＨでは安定である。このためアルカリではアミノ酸の燐− アミノ誘導体に変化する。ｐＨ２，０〜３，０で４℃または２２℃の貯蔵では燐酸化インスリンの脱燐酸化の速度は４〜５倍となり、アミノ基が水酸基から燐酸化される。ここで述べられる燐酸化インスリンは、１）脂肪族水酸基（セリン、スレオニン）、２）芳香族水酸基（チロシン）、３）遊離アミノ基の燐酸化であることを吸収バンドにより明かに示される。豚のインスリンの遊離水酸基は八８とＢ２７のスレオニン、Ａ９、Ａ１２、Ｂ９のセリン、芳香族水酸基はＡ１４、Ａ１９、Ｂ２６のチロシン、遊離のアミノ基は囲まれたＡ１のグリシン、Ｂ１のフェニールアラニン、Ｂ２２のアルギニン、Ｂ２９リジン、Ａ１８、Ａ２１．Ｂ３のアスパラギンである。表１に他の人および他のインスリンのアミノ酸組成を示す。人と豚のインスリンの燐酸化では８３０位に付加されているスレオニンを除いておなしとなる。

【表１】豚　人間　牛　ネズミ１　ネズミ２ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＩ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＧＬＹ　ＰＨＥＧＬＹ　ＰＨＥＧＬＹ　ＰＨＥ２　ＩＬＥ　ＶＡＬ　’ＩＬＥ　ＶＡＬ　工ＬＥ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　ＶＡＬ３　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＡＳＮＶＡＬ　ＬＹＳＶＡＬ　ＬＹＳ４　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＮ　ＧＬＵ　ＧＬＮＡＳＰ　ＧＬＮＧＬＵ　ＧＬＮ５　ＧＬＮ　ＨＩＳ　ＧＬＮ　ＨＩＳ　ＧＬＮ　Ｈ工５ＧＬＮＨ工ＳＧＬ？ＪＨ工Ｓ６　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＬＥＵＣＹＳ　ＬＥＵＣＹＳ　ＬＥＵ７　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＣＹＳＣＹＳ　ＣＹＳＣＹＳ　ＣＹＳ８　ｍｍ　ＧＬＹ　ＴＨＲＧＬＹ　ＴＨＲＧＬＹＡＬＡ　ＧＬ、ＹＡＬＡ　ＧＬＹ９　ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＳＥＲＳＥＲ５ＥＲ５ＥＲＰＲＯＳＥＲ５ＥＲ１０ＩＬＥ　ＨＩＳ　ＸＬＥ　ＨＩＳ　ＶＡＬ　ＨＸＦ；ＸＸ２．　Ｈ工５ＩＬＥ　ＨＸＳ１２　ＳＥＲＶＡＬ　ＳＥＲＶＡＬ　ＳＥＲｖＡＬｓＥＲＶＡＩ、ＳＥＲＶＡＬｌ、３ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＧＩ、Ｕ　ＬＥＵ　ＧＬＵＬＥＵ　ＧＬＵ都Ｕ　ＧＬｔ）１４　ＴＹＲＡＬＡ　ＴＹＲＡＬＡ　ＴＹＲＡＬＡＴＹＲ’　ＡＬＡＴＹＲＡＬＡ１５　Ｇゴ　ＬＥＵ　Ｇゴ　征ＵＧ耐　都ＵＧ漆　部υＧ鮒　都Ｕ１６　ＬＥＵ　ＴＹＲ本Ｕ　ＴＹＲ部Ｕ　ＴＹＲ画　ＴＹＲ部Ｕ　ＴＹＲ１７ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＥＵ　ＧＬＵ　ＬＥＵＧＬＵ　ＬＥＵＧＬＵ　ＩＪ：Ｕ１８　ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＶＡＬＡＳＮ　ＶＡＬＡＳＮ　ＶＡＬｌ９　ＴＹＲＣＹＳ　ＴＹＲＣＹＳ　ＴＹＲＣＹＳＴＹＲＣＹＳＴＹＲＣＹＳ２０　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＧＬＹＣＹＳ　ＧＬＹＣＹＳ　ＧＬＹ２１　ＡＳＮ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＧＬＵＡＳＮ　ＧＬＵＡＳＮ　ＧＬＵ豚　人間　牛　ネズミ１　ネズミ２ＡＢ　ＡＢＡＢＡＢＡＢ２２　人ＲＧ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＡＲＧ２：ｌ　ＧＬＹ　ＧＬＹ　ＧＬＹ　ＧＬＹ　ＧＬＹ２４　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ２５　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＰＨＥ２６　ＴＹＲＴＹＲＴＹＲ，ＴＹＲＴＹＲ２７Ｔ）ｔＲＴＨＲＴＨＲＴＨＲＴＨＲ２Ｂ　ＰＲＯＰＲＯＰＲＯＰＲＯＰＲＯ２９ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＭＥＴ３０　ＡＬＡ　ＴＨＲＡＬＡ　ＳＥＲＳＥＲ本発明の方法による燐酸化反応の程度が増加するに従い、生成物はそのスペクトルにおいて、以下の変化を示す。　：１）紫外領域における吸収の減少、特にチロシンの燐酸化を示す２７６　ｎｍにおける吸収の減少　、２）赤外領域での吸収の増加、特に１０．７．１１．４５ｎｍでの吸収の増加（遊離アミノ基の燐酸化反応）、３）９９０−’の吸収の増加（セリン、スレオニンの水酸基の燐酸化反応）。従来の水溶液中の反応とは異なり、この方法では、温和なｐＨ条件と温度と時間とを組み合わせて反応させることでインスリンを安定化している。好ましい反応はオキシ塩化燐を徐々に添加し、インスリン溶液のｐＨを２〜１１より好ましくは６．５〜９．５に保持して反応を進行させる。さらに好ましくは緩衝液またはｐＨが制御できる適当な緩衝液が使用できる。クエン酸塩、酢酸塩、グリシンなどが酸性のｐＨの反応に使用できる。燐酸塩、グリシン、ＴＲＩＣＩＮＥ（商標）　、ＨＥＰＥＳ　（商標）などがアルカリのｐＨの時の反応に使用できる。ｐＨは反応中に塩基を添加して制御できる。しかしこのことは、その方法を一層困難にする。反応温度は０〜４°Ｃが好ましい。好ましい反応時間は１５分から４時間である。しかしそれには拘束されずオキシ塩化燐の添加速度の基づく。オキシ塩化燐の濃度、ｐＨ１反応時間、温度が燐酸化の度合いを決める。得られる燐酸化インスリンの大部分が実質的に未変性インスリンの等電点（原料の種類によるが未変性インスリンの等電点は５．３〜５．５）より低い等電点を有する燐酸化インスリンを製造するためには、反応は十分なオキシ塩化燐との反応と／または十分な長さの時間（実施する温度での）を含む。さらに燐酸化インスリンは精製、燐酸化の違いを分けて単離する工程を含み、これにより等電点は低（なる。さらに、燐酸化インスリンの精製の工程を含み、これにより燐酸化されていないインスリンがすべて除かれる。未変性インスリンはここで述べた燐酸化インスリンから得られる温和な薬理学的利点を打ち消してしまうため、この未反応のインスリンの除去（Ｃｅｒａｍｉ等の特許では開示されていない）は必要である。動物からのインスリンまたは再結合方で製造されたインスリンでも上記の方法で燐酸化できる。皮下注射において、作用を持続させるためにプロタミンや亜鉛を添加することができる。さらにこの方法において塩化ナトリウム、燐酸ナトリウムなどの塩や防腐剤としてメタクレゾール、メチルパラベン、フェノールを配合することができる。この燐酸化インスリンは水の媒体中で保存すると脱燐酸化がおきる。ＥＤＴＡなどのキレート剤を安定剤として加えて脱燐酸化を防ぐことができる。塩化ナトリウム、燐酸ナトリウムなどの塩も脱燐酸化の抑制効果があるが、その濃度が２５ｍＭ−０，５Ｍでは十分でなく部分的に有効である。以下に本発明の具体的方法および生成物の効能を例示するがこれに限定されるものではない。〔実施例１〕４０ｍｇの単一組成の豚のインスリンを蒸留脱イオン水（１０ｍｌ）に溶解してｐＨを２．５とした。この溶液を激しく攪拌しながら０．２６８ｇの燐酸ナトリウム（Ｎａ　２ＨＰ０４　・７Ｈ２０）またはＩＯＮの水酸化ナトリウムを加えてｐＨを７〜９まで上げた。この溶液をドライアイス／氷／エタノール浴中で０〜２℃に冷却し、０〜２°Ｃに予め冷却した１７５μｍのオキシ塩化燐を滴状かつ一定速度で８０分かけて添加した。反応混合物は常に攪拌しながら０〜２℃に冷却したＩＯＮの水酸化ナトリウムを添加しその間のｐＨのふれを６．５と９．５の間に保つようにした。オキシ塩化燐を添加している間、反応混合物は０℃〜４℃に保った。上記８０分間の反応中には、０．９２ｇのトリスヒドロキシアミノメタン（商標トリス）緩衝液を反応混合物に加えた。オキシ塩化燐の添加後４０分したところで０〜２℃に冷却したＩＯＮの水酸化ナトリウムを反応混合物中に滴下してｐＨを７〜８に制御し、室温になるまで放置した。生成物は４°Ｃで２．３ｇ／ｌの食塩水と脱イオン水とに代え平衡になるまで透析を繰り返した。なお蒸留水には予め透析物に対して０．２５容量％のメタクレーゾルが添加されている。〔実施例２．３．４．５．６〕各実施例の合成例は、オキシ塩化燐の量を次のように代えた他は、実施例１と同じ条件で実施された。（ａ）実施例２のオキシ塩化燐の量は３５０μｍ、（ｂ）実施例３のオキシ塩化燐の量は２４０μｍ、（ｃ）実施例４のオキシ塩化燐の量は１００μｍ、（ｄ）実施例５のオキシ塩化燐の量は５０μｍ、（ｅ）実施例６のオキシ塩化燐の量は６００μｍである。〔実施例７〕実施例１の条件において燐酸ナトリウムの緩衝液を使用しない他は、実施例１と同じ条件で実施された。〔実施例８〕実施例１の反応工程においてトリス緩衝液を加えなかった。上記のｐＨの調整はＩＯＮの水酸化ナトリウムのみでおこなった。〔実施例９〕実施例２の条件においてオキシ塩化燐添加後の反応混合物を０〜４℃に４時間保持し、ｐＨはその時点のまま保持して反応を完結させた他は、実施例２と同じ条件で実施された。［実施例１０］実施例２の条件において豚のインスリンの代わりに人のインスリンを使用した以外は実施例２と同じ条件で実施された。〔実施例１１〕実施例１の条件において牛のインスリンを使用した以外は実施例１と同じ条件で実施された。〔実施例１２〕実施例２の条件で亜鉛を含まないナトリウム−インスリンを使用した以外は、実施例２と同じ条件で実施された。〔実施例１３）実施例３に記載した方法でインスリンを製造し、０．２５％のメタクレゾールを含む２５ｍＭ燐酸緩衝液でｐＨ７，２〜７．４で再構成し、腐敗防止と食塩による等張（ｉｓｏｔｏｎｉｃ）溶液とした。〔実施例１４〕実施例２に記載した方法でインスリンを製造し、０．２５％のメタクレゾールを含む１５０ｍＭ燐酸緩衝液でｐＨ７，２で液状に戻し、食塩による等張溶液とした。〔実施例１５〕実施例１３０条件においてインスリンとプロタミンのモル比を６：１の割合でプロタミンを燐酸化インスリンに加えた以外は実施例１３に記載した方法でインスリンを製造した。〔実施例１６〕実施例１２の条件においてインスリンとプロタミンのモル比を１：１の割合でプロタミンを加えた以外は実施例１２に記載した方法でインスリンを製造した。〔実施例１７〕Ｚｎ−の全濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように酢酸亜鉛を添加上以外は、実施例１６に記載した方法で製造した。〔実施例１８〕プロタミンを省いた以外は実施例１７に記載した方法で製造した。濃度０．１ｍｇ／ｍｌのＺｎ”＋の存在は、効果を延ばすことができる。〔実施例１９〕実施例１の方法においてオキシ塩化燐の添加を５分間隔で等量添加した以外は、実施例１の条件で製造をおこなった。〔実施例２０〕上記の実施例１〜１９の方法で得た生成物を、ＢＩＯＲＡＤ（商標）ｍｉｎｔ− ＩＥＦセルを用いて４％のポリアクリルアミドゲルを含み３．５および／または５／７の両性電解質でｐＨの傾斜（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を確立させ等電点電気泳動法（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｓｉｎｎｇ）で分析した。生成物の等電点は２．　１〜５．２の範囲であった。燐酸化の度合いが増加した１０個の燐酸化インスリンが確認できた。生成物の燐酸化の度合いと異質生成物とは、反応物濃度や反応時間および温度を変化させることで制御できる。燐酸化の異なる生成物はイオン交換クロマトグラフィーで分離できる。特にＡ２５セフアセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）を用いｐＨ５，０〜７．５の範囲で塩化ナトリウムの濃度を０から０．４Ｍにするリニアー傾斜（１１ｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）で分離できる。〔実施例２１〕インスリン分子に導入された燐酸基の数は、表２、表３に示した様に反応液中に添加するオキシ塩化燐の量を変えることで制御できる。表２に示すように、１００μｍのオキシ塩化燐を添加した実施例４の場合には、主成分が等電点（ｐｌ）　４．　７でインスリンモノマーに対して１．８の燐酸基が導入されていた。オキシ塩化燐の量を増した実施例２の方法では、生成物の５５％がｐＩが３．５の燐酸化インスリンであった（５燐酸基／インスリンモノマー）。表３に示すようにこの方法では燐酸化インスリンの燐酸基は１．　１〜１１．３の範囲で導入された。

【表２】

【表３】等電点　インスリンモノマーに（ＰＩ）　対する燐酸基の平均個数〔実施例２２〕オキシ塩化燐の量を増加させていくと、増加したオキシ塩化燐がチロシン残基を燐酸化させる。このことが、２７６ｎｍ　（ＵＶ）の吸収が減少することで確かめられる。実施例３．２．６での２７６　ｎｍの吸収は、燐酸化されていないインスリンの吸収のそれぞれ８２％、５３％、３５％であった。このことは、２４０μｍのオキシ塩化燐を使用して燐酸化すると、チロシン残基が平均１個燐酸化される（実施例３参照）、実施例６の様にオキシ塩化燐の量を増すと平均３個のチロシン残基が燐酸化されることとなる。〔実施例２３〕実施例２．３．６で得た生成物についてフーリエ変換赤外線スペクトル（ＦＴＩＲ）を調べた。９９０ｃｍ−’　（ＣＨ２０Ｐ→０　結合、すなわち、インスリン中のセリン、スレオニン）と１０６０ｃｍ−１（芳香族燐酸、チロシン）の透過の減少（吸収の増加）が認められた。実施例４の燐酸化生成物のＦＴＲＩスペクトルを図１０．１１に、未処理のインスリンのＦＴＲＩを図９に示す。９９０　ｃｍ−！の吸収はＣＨ２ｏｐｏ　結合の伸縮振動に起因するのだろう。この９９０　ｃｍ−１の吸収ピークは９００〜ｌ　Ｏ５０ｃｍ−’の間に表れる。〔実施例２４〕実施例２．３．６で得た生成物のＦＴＩＲの９２５〜９４０　ａｍ−’の吸収はＮ−Ｐ結合の生成を示すもので、インスリンのアミノ基が燐酸化されたことになる。この吸収の増加はオキシ塩化燐が１００μｍでの反応の生成物には認められない。燐酸化インスリンは燐酸化の進行とともにニンヒドリンとの反応が低下し、燐酸化の度合いが進んでいることを示す。このことはインスリンの遊離のアミノ基がオキシ塩化燐の量の増加により燐酸化されていることを示している。〔実施例２５〕等電点電気泳動（ＩＦ）（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）で測定した結果、上記の全ての燐酸化物を４℃または２２℃で（ａ）ｐＨ３，０か（ｂ）ｐ）（！１１．０の水中で貯蔵することにより、全ての燐酸化物は脱燐酸化した。燐酸エステルは、一般に酸性のｐＨ下では安定であり、Ｎ−フォスフェート化合物はアルカリのｐＨ下で安定である。したがって前記の知見でアミン基および燐酸エステル（セリン、スレオニン）の脱燐酸化が調べられる。〔実施例２６〕上記の脱燐酸化の進行は塩類の添加により抑制される。塩化ナトリウムや燐酸ナトリウムは２５ｍＭ−０，５Ｍの濃度範囲でこの効果を示す。しかしながらこの抑制効果は完全ではなり２２°Ｃで８日放置後に、上記の溶液の脱燐酸比誘められた。〔実施例２７〕キレート剤は遊離の金属イオンと効率的に結合する。遊離の金属イオンは良く知られているようにフォスフェートと結合し、脱燐酸化の触媒となる。５０ｍＭのキレート剤のエチレンヂアミンーテトラー酢酸（ＥＤＴＡ）を含む燐酸化インスリンの溶液は、ｐＨ７〜９での貯蔵において脱燐酸化に対して著しく安定であった。５０ｍＭのＥＤＴＡと２５ｍＭ〜１５０ｍＭの食塩または燐酸ナトリウムを含む燐酸化インスリン溶液は、２２℃で６０日貯蔵した後でも脱燐酸化が認められなかった。〔実施例２８〕実施例２．３．４．６で得た燐酸化インスリンは、精製とそれぞれの成分への分離をイオン交換クロマトグラフィーでおこなった。ＤＥＡＥセファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）　、セファセル（ｓｅｐｈａｃｅｌ）　、類似のゲルなどが使用できるが、最も良い分離はＱ　５ｅｐａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ（商標）であった。分離はｐＨ６，５〜８．５で４〜２２℃でおこなった。好ましい分離条件は、１５ｍＭのビストリス（ＢＩＳＴＲＩＳ商標）でｐＨ６，５１５ｍ１／ｈｒ４°ＣＯ，１〜０．３５ＭのＮａＣ１の傾斜（ｇｒ　ａｄ　ｉ　ｅｎ　ｔ）。生成物は生産的等電点電気泳動捕集（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）法により精製できる。例えば商標ＲＯＴＯＦＯＲＩＥＦのセルを用い３１５．５／７の両性電解質でｐＨの傾斜を確立しておこなった。分離は８００〜２００ボルトで２〜６時間でおこなった。〔実施例２９〕部分精製はアセトニトリルを含むＨＰＬＣ傾斜を用いることでおこなうことができる。〔実施例３０〕前記の方法で得た生成物を精製または等電点を４以下に処理した実質的主成分の物質を長時間効能と短時間効能の燐酸化インスリンとして用いて２か月にわたって糖尿病の犬に皮下注射処理をした。犬は、長時間、短時間効能の未変性の市販インスリンを使用する時以外は、自己の制御に代え同一の管理体制にきりかえた。血糖は２４時間／日でモニターした。３６の実験を２４時間持続して各人におこなった。犬には全ての試験用こ１田こ３度の食事を同じカロリー（３４０ｋｃａｌ）内容で午前８時、１２時、午後４時に与えた。犬には、短時間効能のインスリンを午前８時３０分、午後１２時３０分、午後４時３０分に長時間効能のインスリンを午前８時３０分、午後１０時３０分に注射した。測定された無糖値の範囲は燐酸化インスリンを受けた犬は未変性の市販のインスリンを受けた犬に比べて図１および図２に示すように顕著に少ない。図３、図４に示すように血糖は、動物の燐酸化処理したインスリンと正常範囲に近い値である。コントロールの向上は１日中の２４点の中から２１が統計的に重要である（ｐ＜０．０５）。血漿（プラズマ）グルコースの平均値（太線）と標準偏差（ＳＤ　線で囲まれた面積部）をこの図は示す。〔実施例３１）この実施例は実施例３の方法で製造した燐酸化インスリン（実質的に低い平均等電点をもつように製造、精製されたもの）を４匹の糖尿病（膵臓の切除された）の犬に１日２４時間連続注入した。実験の最初の段階では、通常または燐酸化インスリンのどちらかを用いて、断食状態で、プラズマグルコースを午前７時３０分時の正常値から２−４時間後６０ｍｇ％の定準化するに必要な注射インスリン量を決めた。図５に示すように、これにより燐酸化および通常インスリン共に実験の２時間後にはｅＯｍｇ％の平準化（ｐｌａｔｅａｕ）を延ばすことができた。各インスリンで達成されたグルコースの平準化に意味ある違いはなかった。この血糖の６０ｍｇ％への低減過程の割合をＭａｘ　Ｒａｔｅと名付は九　その後の日こ、１）図６に示す６２％のＭＡＸ　ＲＡＴＥか、２）図７に示す３６％のＭＡＸ　ＲＡＴＥのどちらかに匹敵するインスリン注射の低減割合の処理を受けた以外の、４匹の糖尿病の大全ては、同じ条件の実験を受けた。図６に示す様に６２％の通常インスリンの注射率での低減は、犬のグルコースを上昇させ平均１５０ｍｇ％の平準化となる。同じように燐酸化インスリンの低減結果の平準化は８０〜８５ｍｇ％である（図６）。図７に示したように、ＭＡＸ　ＲＡＴＥを３６％にさらに割合を下げても類似した結果が得られた。この試験では、通常のインスリンが注射された犬のグルコースのしきい値は１８０ｍｇ％（腎臓のしきい値は腎臓がグルコースを尿中に流しだしはじめる値）であった。燐酸化インスリンを注射した犬のグルコースのレベルの平均は低く１２０〜１３０ｍｇ％に達した。この例は、通常のインスリンと比較し、インスリンの投与量を変えることに起因する血糖やプラズマグルコースの低い変化を示すためになされたものである。すべての実験は全ての犬に対して３回実施された。〔実施例３２〕実施例２で製造した燐酸化インスリンと通常のインスリン（Ｉｌｅｔｉｎ　ＩＩ　ｐｕｒｅ　Ｐａｒｋ　）を静脈注射で４匹の正常で断食したピーグル犬に投与した。各インスリンは投与量を広く変えた投与であり、−田こ各人につき１回の試験を行い２回以上の試験はしなかった。各人の血漿グルコースを注射後１５分間２分間隔で測定した（ＹＳＩ）。通常値からのグルコースの減少速度を各インスリンの投与量ついて測定した。結果を図８に示す。図８のデータを解析すると、グルコースの低下速度を増加させるために必要とするインスリン投与量の増大％変化は通常のインスリンに比較し燐酸化インスリンは大きい。たとえば、表４に示す様に、３．５ｍｇ％／ｍｉｎ、のグルコースの低下をもたらすため、通常のインスリンの投与量を２８％増加した時、グルコースの低下速度の増加は３．５〜４．０ｍｇ％／ｍｉｎ、　となる。同じ効果を得るために必要とする燐酸化インスリンの投与量の増加は６６％であった。この事は以下のことを示す：１）通常のインスリンの投与量の変化は、燐酸化インスリンの投与量の変化に比較し、グルコース低下の低下速度において顕著に大きな変化をもたらす（例えば、等しい投与量とした場合）。２）表４に示す様に、検討した全ての投与量の範囲において上記のことが事実適合する。

【表４】この表は、表の左側の欄に示すグルコースの低下速度の変化をもたらすのに必要なインスリンの投与量の増量％を示す。〔実施例３３〕２匹の糖尿病の犬に、１日１回、毎日午後２時に１１００ｋｃａｌの食事と食事時に通常の（例えば、即効性の）インスリンを所定量与えた。さらに犬には２４時間毎に通常のインスリンまたは実施例６により調製した燐酸化インスリンを連続して注入した。この実験を続けている間、最小のインスリン注入の必要割合は、平均午前８時に断食プラズマグルコースが９５ｍｇ％となるように各インスリン量を調整した。一度この割合を決定すると、インスリンの注入割合は各次の日の午前８時までに断食時のプラズマグルコースが６５−７５ｍｇ％となるまで増加を続けた（最高　３日連続）。図１２に示すように、インスリンの注入割合は断食時のグルコースを９５から７５ｍｇ％に低下させるためには、燐酸化インスリンを７０％増加させることが必要があるが、通常のインスリンでは２０％増加が必要であるのみである。終わりの３例に述べた好ましい投与結果の生理学上の効果として、全体または一部分から前記の燐酸化インスリンは優れたグルコース制御が得られるといえる。プラズマグルコース（ＰＧ）の管理 −日の時間図２プラズマグルコース（ＰＧ）の管理リン酸化対不変性インスリンＭ −日の時間図３プラズマグルコース（ＰＧ）の管理リン酸化対不変性インスリンリン酸化対不変性インスリンＡｒ／１一日の時間（％、Ｎ）　Ｙ−ｒ：’＋（ＡｈＸ’−１４（％肥）　’ｒ−Ｃ’１（Ｉｔム、Ｘ’−／（９６３［［１）　Ｍ−ｃ４ｔ（、、＝ｚｒ−１（仔／％加）面取土１）■’１−Ｃ（＋　Ｊ：／ＡＸ（：１：：−（％）＊薪値図１２グルコースを１００から７０■％に低下させるために通常インスリン　リン酸化インスリンポンプの翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示ＰＣＴ／ＣＡ９２１０００８２２、発明の名称インスリンの燐酸化の方法およびそれによって製造された物３、特許出願人住所（居所）　カナダ、オンタリオ、トロント、エルムストリート８８、エム５ジー１エツクス８代表者　フリーセン・ジェームズ・デー国籍　カナダ４、代理人〒４５０　愛知県名古屋市中村区名駅３丁目２番５号１９９３年２月９日６、添付書類の目録補正書の翻訳文　１通Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、　６５．３１９−３３９．１９５６）。Ｆｅｒｒｅｌ等やＲａｔｈｌｅｖとＲｏｓｅｎｂｅｒｇによって作られた燐酸化インスリンは燐酸化の過程をより深く理解するために、特に燐酸化がとのように生材学系と関係しているかという知識を増加するために計画された研究の一部である。この燐酸化インスリンの臨床的優位性は何ら述べられていない。Ｃｃｒａｍｉ等に許可された特許は、インスリン搬送システム中に保存された場合、重合しないという優位性を持つ硫酸化および燐酸化インスリンの生産を含む。このようにこれらのインスリンはＣｅｒａｍｉ等によって述べられているようにインスリンポンプを詰まらせないという優位性をもつ、そしてインスリンポンプを用いている患者が少ないため、これらインスリンは血糖のより良い管理をもたらすべきである。しかしながら、前記インスリンは議論すべき血糖のより良き管理をもたらす生理特性について何も示していない。それ故この効果に合わせて作られるべきフレイムは存在しない。インスリンはまた過剰のビリデンとオキシ塩化燐とにより燐酸化されるというＺ、Ｒｏｕｂａｌ　（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　６８．１９６８（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、０ｈｉｏ、Ｕ、Ｓ、））の開示がある。この開示では燐酸化は無水の媒体中でおこなわれ低血糖を変える効果を有しない。ここで説明される本方法との差異に関し、Ｃｅｒａｍｉ等の特許は、方法の改善が非水系溶媒中で燐酸化を実施することにより達成されたことを強調している。Ｃｅｒａｍｉ等は、米国特許４，７０５，８４５の第１欄、３９−５１行に、水系の条件は過酷でインスリンの崩壊を導くと指摘している。すなわち、彼らは６、微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物あるいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液による透析あるいはゲル濾過工程、凍結乾燥物を得るため、前記透析物あるいは濾過物を凍結乾燥する工程、前記凍結乾燥物を、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少なくとも一つにより、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾過、透析および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方法。７、微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物あるいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液による透析あるいはゲル濾過工程、面記透析物あるいは濾過物を高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少なくとも一つにより、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾過および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方法。８、　糖尿病の治療に使用するためクレーム２の方法にしたがって製造され〜実質的に低下した等電点をもつように製造あるいは精製された燐酸化インスリン。９　等電点は４より小さい請求項８の燐酸化インスリン。１０、請求項２の方法で作られた燐酸化インスリン。１１、請求項３の方法で作られた燐酸化インスリン。１２、請求項５の方法で作られた燐酸化インスリン。１３、請求項６の方法で作られた燐酸化インスリン。国際調査報告ｍｍｌｌａｍｍ１ｌａ＃Ｉｈ（１ｗＭＩＩｓρＣＴ／ＣＡ９２１０００８２国際調査報告フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ペプタイドの水溶液を有効量のオキシ塩化燐と前記ペプタイドの燐酸化に好ましい条件で反応させることを含むペプタイドの燐酸化方法。
２．前記ペプタイドはインスリンである請求項１の方法。
３．前記インスリンの水溶液が前記オキシ塩化燐と２から４℃の温度範囲の湿度で２から１０のｐＨ範囲のｐＨで反応させる請求項２の方法。
４．前記ｐＨは６．９から９．５の範囲内にある請求項３の方法。
５．不変性のインスリンが実質的に無いインスリンをつくるための燐酸化は、前記インスリンの水溶液が前記オキシ塩化燐と１５分から４時間の時間範囲の時間反応される請求項３の方法。
６．微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物あるいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液による透析あるいはゲル濾過工程、凍結乾燥物を得るため、前記透析物あるいは濾過物を凍結乾燥する工程、前記凍結乾燥物を、高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少なくとも一つにより、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾過、透析および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方法。
７．微量の反応物質、不純物や塩を除去し、前記燐酸化インスリンを含む透析物あるいは濾過物を得るため、燐酸化されたインスリンの水または適当な緩衝液による透析あるいはゲル濾過工程、前記透析物あるいは濾過物を高性能液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動捕集の少なくとも一つにより、分離し精製する工程、およびそこから得られたものをゲル濾過および凍結乾燥の少なくとも一つで処理する工程を付加的に含む請求項５の方法。
８．糖尿病の治療に使用するための実質的に低下した等電点をもつように製造あるいは精製された燐酸化インスリン。
９．等電点は４より小さい請求項８の燐酸化インスリン。
１０．請求項２の方法で作られた燐酸化インスリン。
１１．請求項３の方法で作られた燐酸化インスリン。
１２．請求項５の方法で作られた燐酸化インスリン。
１３．請求項６の方法で作られた燐酸化インスリン。
１４．糖尿病の治療に使用するためのインスリンのチロシン残基に置換された少なくとも１つの燐酸基をもつ燐酸化インスリン。
１５．Ａ１グリシン、Ｂ１フェニルアラニン、Ｂ２９リジン、Ｂ２２アルギニンおよびＡ１８、Ａ２１、とＢ３アスパラギンのグループから選ばれたインスリンの自由アミノ基の少なくとも１つが付加的に燐酸化された請求項１４の燐酸化インスリン。
１６．少なくとも１つのスレオニン残基に付加的に燐酸化された請求項１５の燐酸化インスリン。
１７．少なくとも１つのセリン残基に付加的に燐酸化された請求項１６の燐酸化インスリン。
１８．実質的に不変性インスリンの無いかつ低い等電点をもつ燐酸化インスリンを人間に対して処方することを含む人間の糖尿病の治療のための方法。
１９．請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６あるいは請求項７の方法で作られた燐酸化インスリンを人間に対して所定量処方することを含む人間の糖尿病の治療のための方法。
２０．実質的に不変性インスリンの無いかつ低い等電点をもつ燐酸化インスリンを人間に対して皮下注射、静脈注入あるいは注射により施薬され、鼻腔あるいは直腸に処方することを含む人間の糖尿病の治療のための方法。
２１．請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６あるいは請求項７の方法で作られた燐酸化インスリンを人間に対して皮下注射により処方することを含む人間の糖尿病の治療のための方法。