JPH0335625B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は改善されたジゴキシン免疫定量、そし
て詳細にはインデイケーター試薬としての標識一
価または二価抗ジゴキシン抗体および分離を行う
手段としての不動化ウアバインカラムからなる非
拮抗的不均質系免疫定量用テストキツトに関す
る。 迅速にそして正確に生物流体中に存在するジゴ
キシンの濃度を測定しうる臨床検査室診断テスト
に対する大きくそして広い市場がある。ジゴキシ
ンは往々にしてナノモルまたはそれ以下の濃度で
存在している。 近年、臨床的に重要なリガンドの測定のための
多くの免疫定量技術が開発された。代表的には、
拮抗的結合免疫定量法は結合反応に関与する結合
成分に結合した標識物質のコンジユゲートよりな
つていて、結合したものおよび遊離したものの二
種の標識コンジユゲートを生成させる。結合した
ものおよび遊離したものを与える標識コンジユゲ
ートの相対量はテスト試料中の検出させるべきリ
ガンド濃度の函数である。 結合したものにおける標識コンジユゲートと遊
離したものの標識コンジユゲートが標識物質測定
に使用される手段によつて本質的に識別可能でな
い場合には、その結合したものと遊離したものを
物理的に分離させなくてはならない。このタイプ
の検定は不均質系と呼ばれる。 ２つの最も広く使用されている不均質系免疫定
量法は放射免疫定量法（RIA）および酵素結合免
疫吸着検定（ELISA）である。RIAにおいては
未知量の抗原を含有する試料を既知量の放射標識
抗原および抗体と混合させる。系を平衡に近い点
まで反応せしめ、次いで抗体結合抗原を非結合抗
原から分離させる。試料抗原は限定された数の抗
体結合部位に対して標識抗原と拮抗するので、試
料中の抗原が多くなればなる程、結合分画中の標
識抗原はますます少なくなる（または非結合分画
中ではますます多くなる）。この方法は一般に時
間がかかり（１〜３時間）そして労力を要するも
のである。 極く最近になつて、多孔性担体上での抗体の不
動化によつてRIAは自動化された。抗原を含有す
ると疑われる試料を既知量の標識抗原と混合させ
た後、限定された数の不動化抗体結合部位を有す
るカラムにこの試料を通す。遊離または結合され
た標識を定量化させることができる。迅速ではあ
るけれどもこの検定法はそれを再現性のあるもの
とするためには抗体の厳密な測量を必要とする。 RIAは２つの主なる不利点を有している。第一
に使用される標識物質はその取扱い、保存および
投棄に関して多くの問題を有する放射性同位元素
である。第二にRIAは拮抗様式で実施され（すな
わちアナライトと標識アナライトは抗体上の限定
された数の結合部位に対して拮抗する）、従つて、
抗体親和性定数が検定法の感度を代表的には
10^-8M¹〜10^-11M¹の範囲に限定する。 ELISAはその標識物質が放射性同位元素より
はむしろ酵素であるという以外は原則において
RIAと同様である。それも感度がなお抗体親和性
定数の厳密な函数であるという制限を受ける。 同位元素および酵素に加えてその他の標識物質
が記載されている。これらとしては螢光発生団、
補酵素、生物発光物質、酵素抑制剤があげられ
る。 不均質系免疫定量法における分離段階の種々の
実施法が知られている。これらとしては過、遠
心分離、クロマトグラフイーその他があげられ
る。 分離段階を実施するためのアフイニテイーカラ
ムの使用はフランス特許出願第79 15992号明細書
に記載されている。それは標識物質に対して親和
性を有し、そして更に分子ふるい性を有している
リガンドをそれにカツプリングさせたゲルの使用
を記載している。標識物質よりはむしろ関心のあ
るリガンドに対して親和性を有し、そして分子ふ
るい性を有するゲルの使用もまた開示されてい
る。記載されている検定法は拮抗的または非拮抗
的様式で実施することができる。 米国特許第4298687号明細書は不均質系免疫定
量法を開示しているが、この場合測定すべき物質
を標識一次結合対応成分と反応させ、そして未反
応結合対応成分の量をその一次結合対応成分に対
する特異的結合性を与えた固体相上への吸収によ
つて測定する。この一次結合対応成分は限定され
た量で存在させる。 米国特許第3654090号明細書は人絨毛膜ゴナド
トロピン（HCG）に対する非拮抗的不均質系免
疫定量法を開示しているがこれはその分離段階を
実施するために過剰の酵素標識二価抗体と不動化
HCGカラムを使用している。この検定法は１モ
ルHCG結合抗体とHCG結合のない抗体とを区別
できないという事実によりその感度において限定
されている。両種のものがアフイニテイーカラム
により保持される。 米国特許第4134792号明細書は関心あるリガン
ドに対する標識特異的結合対応成分を過剰に存在
させる不均質系免疫定量法を開示している。標識
特異結合対応成分は二価抗体であり、そしてこれ
は前記と同一の不利点を有している。 「British J.Haematol.」第47巻第269頁
（1981）は凝固因子に対する二部位免疫放射能
測定検定法（IRMA）を開示しているがここでは
一価Fab抗体フラグメントが使用されている。そ
れらの結果は二価抗体よりはむしろ一価抗体を使
用する場合に10倍のより高い感度が得られること
を示している。 米国特許第4200436号明細書は標識一価抗体を
使用する免疫定量法を開示しているが、この場合
不動化抗原（測定すべきものと同一の抗原）を使
用して結合分画および遊離分画を分離させる。測
定されるのは第一義的には結合分画なのでこの検
定は拮抗様式で通常実施される。従つて感度は検
定が好ましい様式で実施される場合には抗体の親
和性定数によつて限定される。 ある場合には免疫定量におけるアナライトをア
ナライト同族体に代えることができる。一般に性
能はアナライトの使用とアナライト同族体の使用
との間に差はなく等しいものと予想される。意外
なことに本発明のジゴキシン検定においては、不
動化抗原としてのジゴキシンをウアバインに代え
ることによつて検定の感度および精度を顕著に改
善することが発見された。本改善をもたらす正確
な機構はわかつてはいないが、それは抗原−抗体
反応の性質にあるものと考えられる。 当該技術においてはその感度および精度が抗体
の親和性定数によつて限定されないジゴキシンの
不均質系免疫定量法に対する要求がある。 本発明の非拮抗的不均質系免疫定量法は次の段
階すなわち、 (a) モル過剰の標識一価または二価抗ジゴキシン
抗体をジゴキシンを含有する疑いのあるテスト
試料に接触させることによつて反応混合物を生
成させ、それによつて前記抗体の一分画がジゴ
キシンとコンプレツクスを形成し、そして一分
画が遊離状態に留まり、 (b) この反応混合物を遊離抗体の全部を結合させ
うる量で存在する、固体担体上で不動化させた
ウアバインを有する固体相と接触させて遊離抗
体をこの反応混合物から分離し、そして (c) 標識を測定することによつて固体相から溶出
したコンプレツクスの量を測定すること を包含する。次いで試料中のジゴキシン量を標準
曲線を比較することにより決定することができ
る。 その他の態様においては、拮抗的不均質系免疫
定量法が提供されるが、これは次の一連の段階、
すなわち (a) ジゴキシンを含有する疑いのある試料を固体
相上に不動化させたモル過剰のウアバインと接
触させることにより反応混合物を生成させ、 (b) この反応混合物をジゴキシンに対してモル過
剰の、但しウアバインに対してはモル以下の標
識一価または二価抗ジゴキシン抗体と接触さ
せ、 (c) 反応を行わせ、それによつて抗体の一分画が
ジゴキシンと第一コンプレツクスを形成しそし
て第二の分画が不動化ウアバインとコンプレツ
クスを形成するようにし、 (d) 第二分画から第一分画を分離し、そして (e) 第一分画または第二分画のいずれか一つに存
在する標識量を測定すること を包含している。 一般に抗体を免疫定量法で使用する前に抗体を
免疫学的に精製することが望ましい。動物血清、
腹水または組織培養媒体からのIgG単離法および
アフイニテイークロマトグラフイーによるその免
疫学的精製法もまた当該技術では知られている。
簡単にIgG分画を硫酸アンモニウム沈殿により調
製する。IgG分画を次いでイオン交換、ゲル過
または蛋白質Ａクロマトグラフイーにより調製す
る。アフイニテイー精製は抗原カラムからの溶出
により実施される。 抗体は多クローン性または単一クローン性のい
ずれであつてもよい。一価抗体は当該技術におい
て既知の方法で調製することができる。例えば
FabフラグメントはIgGのパパイン消化により得
られ、Fab′フラグメントはIgGのペプシン消化に
より得られたＦ（ab′）₂フラグメントのジサルフア
イド還元により得られる。 抗体への標識物質のカツプリングに対しては任
意の多数の方法を使用しうる。標識物質は酵素、
放射性同位元素、発色団、螢光発生団、または単
独でまたはその他の試薬と組合せた場合に検出可
能なシグナルを発生しうる任意のその他の物質で
ありうる。一般に各抗体に対して少くとも一つの
標識を好ましくは共有結合的に、そして抗体の免
疫反応性および標識物質の活性を保存するような
方法でカツプリングさせるべきである。Fab′フ
ラグメント中に存在する遊離のスルフヒドリル基
は標識の共有結合的結合に対して特異的な反応性
の基を与える。マレイミドまたはチオピリジル基
を有する複素二官能交叉結合試薬がこの目的には
有用である。一般に免疫学的活性の保持を確実に
するために、標識抗体の合成の最終段階は免疫学
的精製段階であるのが望ましい。 ウアバインまたはそのコンジユゲートは例えば
「Biohemistry」第９巻第331頁（1970）による当
該技術に既知の方法によつて適当な担体上に不動
化させることができる。一般に、担体はその流れ
特性で選ばれ、そしてその例としてはビーズ化ア
ガロース、ビーズ化デキストラン、ポリアクリル
アミドまたはガラスをあげることができる。ウア
バインは直接にまたは蛋白質、ポリアミノ酸また
は合成結合成分でありうるスペーサアームを介し
てその担体に共有結合的に結合させることができ
る。通常、アフイニテイーカラム物質は一回使用
すると捨てられるがしかし所望によりそれを再循
環させることはできる。担体が分子ふるい特性を
有していることは一般に望ましくない。それはも
し標識抗体が試料アナライトから解離した場合、
分子ふるいはそれらが相互に再び出会う可能性を
減じさせる傾向があるからである。 非拮抗性様式においては、本発明の検定は次の
ようにして実施することができる。未知量のジゴ
キシンを含有する通常は5μ〜500μの血清で
ある患者試料の既知の容量をジゴキシンに対して
明らかに過剰な量の標識付けした一価または二価
の抗体を含有する溶液と混合させる。通常標識付
けした抗体はジゴキシンに比べて約10〜100モル
過剰で存在させる。ジゴキシンおよび抗体を通常
は少くとも５分、そして30分未満のある特定の時
間の長さの間、４℃〜45℃の間の一定の温度、通
常は37℃で前培養（preincubation）させる。ジ
ゴキシン結合抗体と非結合抗体を含有するこの溶
液の既知の容量（通常5μ〜500μ）を好まし
くは２mm×10mmの寸法を有する、多孔性担体上に
不動化させたウアバインよりなるカラムに通過さ
せる。すべての遊離の標識付き抗体を結合させる
に充分なウアバイン−カツプリング担体が使用さ
れる。カラムを0.2〜5.0ml／分の流速で、通常は
１〜５ml全量の適当なバツフアーで溶出させる。
カラムから溶出する分画は患者血清からのジゴキ
シンでコンプレツクス化された標識付き抗体を含
有している。この分画中の標識活性を次いで測定
する。或いはまたこの分画を捨て、そしてケイオ
トロピツク（chaotropic）剤または極端な値のPH
によつてカラムから保持されている抗体を溶出さ
せることができる。第一の場合には標識の量は試
料中のジゴキシン濃度に直接比例する。第二の場
合はそれは逆比例する。 本発明の検定法は手動的に実施しうるしまたは
それは種々の自動式または半自動式装置例えば
aca 独立臨床アナライザー（デユポン社製）に
適応することができる。この場合には患者試料お
よび過剰の標識一価または二価抗体を装置の外で
前培養させる。既知の容量のこの混合物を分析テ
ストパツク（ここに参考として包含されている
Re29725に記載されている）中に、この装置の充
填ステーシヨンにおいて自動的に注入し、次いで
最終パツク内容量を５mlとするに充分な量のバツ
フアーを注入する。この試料混合物をパツク通水
管（header）に置いた多孔性担体上で不動化さ
せたウアバインのカラムに通しそして直接パツク
中に溶出させる。この溶出された分画は患者血清
中のアナライトでコンプレツクス化された標識抗
体を含有している。このパツクは自動的に37℃で
ブレーカー／ミキサーまたはブレーカー／ミキ
サーのいずれかでシグナル発生反応に必要な試
薬を添加し、そして、そのシグナル光度計による
読出しを行なう。 本発明の検定法はまた、拮抗様式でも実施させ
うるが、これは抗体を試料ジゴキシンとウアバイ
ンに、連続的というよりはむしろ同時に露出させ
ることを意味している。 拮抗様式においては検定法は以下のように実施
される。ジゴキシンを含有する疑いのある試料の
一区分量、通常は10〜100μを固体相上に不動
化させたモル過剰のウアバインを含有する試験管
に加える（一般にはアフイニテイーカラム樹脂例
えば交叉結合アガロースまたはデキストランの
100〜1000μ充填容量）。次いで一価または二価
標識抗ジゴキシン抗体溶液を試料中に予想される
ジゴキシンの最大値よりモル過剰の、但しウアバ
インに対してはモル以下の量で加える。この抗体
溶液の量は一般には５〜50μである。このよう
にして生成された反応混合物を23℃〜45℃、好ま
しくは37℃の温度で、15〜60分、好ましくは15分
間、静かに撹拌しつつ培養する。抗体−ジゴキシ
ンコンプレツクスを次いで抗体／不動化ウアバイ
ンコンプレツクスから分離させる。親和性樹脂が
使用される場合には約３分間の2000×ｇの遠心が
好ましい。次いで上澄流体を吸引する。固体相上
に吸着された標識の量または上澄流体中の標識の
量のどちらかを測定してテスト試料中に最初に存
在したジゴキシンの量を決定することができる。
標識が酵素である場合には酵素をその基質と反応
させて検出可能な生成物を生成させることによつ
て測定を実施することができる。非酵素標識例え
ば螢光発生団、発色団、および放射性同位元素は
当該技術でよく知られた技術により測定すること
ができる。 固体相上でジゴキシンよりはむしろウアバイン
を使用することの利点は次の実施例によつて説明
されている。これら実施例中では種々の実験条件
下にジゴキシン（アナライト）およびウアバイン
（アナライト同族体）カラムの両方が調製され、
そしてそれらのジゴキシンアフイニテイーカラム
を使用する免疫学的検定における性能がバツクグ
ラウド、感度および精度に関して評価された。各
樹脂の合成に対する至適条件は異つているけれど
も、最良のウアバイン樹脂は一貫して最良のジゴ
キシン樹脂よりも秀れた性能を示した。 本明細書中ではウアバインのみが特定的に例示
されているけれども、均等物としてジギトキシ
ン、デスラノシド、ジゴキシゲニン、およびスト
ロフアンチンが予想される。 例 １ Ａ 一価抗体−酵素コンジユゲートの合成 ウアバイン−HSA免疫吸着剤を使用して兎
全血清から直接ジゴキシン特異抗体を免疫精製
した。 ウアバインは蛋白質（HSA、人血清アルブ
ミン）スペーサーアームを介してアガロースマ
トリツクスに結合させた。第一の段階はウアバ
イン−アルブミンコンジユゲートの合成を包含
する。ウアバイン（0.56ミリモルを20mlの水に
溶解）を暗所で室温で一時間、メタ過沃素酸ナ
トリウム（1.02ミリモル）で酸化した。定量酸
化は酢酸エチル：メタノール：H₂O（75：25：
１）で展開させたシリカゲルＧプレート上での
薄層クロマトグラフイーによつて証明された。
ダウエツクスAG−1X8イオン交換樹脂の３ml
のカラム上にこの水性混合物を通すことによつ
て過剰の過沃素酸塩を除去した。ウアバインの
定量的回収は放射能標識（トリチウム化）ウア
バインを追跡することにより証明された。0.4
mlの５％Na₂CO₃を添加することによつて酸化
ウアバインの溶液をPH9.5にバツフアー化させ、
そして20mlのHSA溶液（28mg／ml）と合した。
45分後、このコンジユゲートを20mlの水に新た
に溶解させた0.3ｇのナトリウムボロハイドラ
イドを添加することによつて還元させた。３時
間後８mlの１モル蟻酸を加えてそのPHを6.5に
下げた。PH6.5で１時間置いた後、１モル、
NH₄OHでそのPHを7.5に上昇させた。全反応
混合物を蒸留水で完全に透析させ次いで最後に
0.015モル燐酸ナトリウムバツフアー（PH7.8）、
0.15モルNaClで透析した。このコンジユゲー
トをアミコンPM−30膜で濃縮させて、4.2mg／
mlとした。蛋白質濃度は当該技術では既知のロ
ーリー法により測定された。 ウアバイン−HSAコンジユゲートを「Bio−
Radmanual」に記載の方法を使用してアフイ
ゲル 10（ビオ−ラド・ラボラトリーズ社製）
上で不動化させた。25mlのアフイゲル 10を75
mlの氷冷水で洗つた。このゲルを透析ウアバイ
ン−HSAコンジユゲートに加えそして４℃で
ロツカー上で一晩混合せしめた。過剰の活性エ
ステル基を0.1mlの１モルエタノールアミン
（PH8.0）を室温で一時間加えることにより急冷
させた。最後に、このゲルを蒸留水で完全に、
次いで順に500mlの0.5モルNaCl、400mlの0.1モ
ルグリシン（PH2.5）、300mlの2.5モル
NH₄SCN、1000mlのホスフエートバツフアー
化塩水で洗つた。ウアバイン親水製樹脂を６ml
のベツド容積になるようにカラム（0.7×15cm）
中に充填して、そして燐酸バツフアー化塩水で
平衡化した。抗血清（4.5mg／mlモノ特異性抗
体のカペル抗ジゴキシン血清10ml）を１ml／分
以下の流速で適用した。カラムをその280nｍ
の吸光度がベースライン（＜0.01）に達するま
で燐酸バツフアー化塩水で洗つた。次いで60ml
の３モルNH₄SCN（PH7.5）でこのカラムから
抗体を溶出させ、そして直ちに４℃で２燐酸
バツフアー化塩水で４回透析した。 アミコン撹拌セル装置（PM−30膜）上でこ
の27mlのアフイニテイー精製抗ジゴキシン抗体
を2.7mlに濃縮した。最終蛋白質濃度は10mg／
mlであつた。試料を0.1モル酢酸ナトリウム
（PH4.5）1000mlで４℃で４時間透析した。透析
後、同一酢酸ナトリウムバツフアーに溶解させ
た10mg／mlのペプシン溶液20μを加え、そし
て温度を37℃に加温して20時間保つた。この消
化時間の後、短時間遠心分離させることにより
試料を清澄化させ、次いで0.015モル燐酸ナト
リウム（PH7.4）、0.15モルNaCl（燐酸バツフア
ー化塩水）中で平衡化させたセフアデツクスＧ
−150カラム（1.5×90cm）上でクロマトグラフ
イーに付した。ゲル電気泳動により同定された
（Fab′）₂フラグメントを含有するカラム分画を
プールし（19.2ml）、次いで加圧過（PM−30
アミコン膜）で2.7mlに濃縮した。濃縮後この
（Fab′）₂フラグメントを55μの１モルジチオ
スレイトール溶液を加えることにより還元させ
て相当するFab′フラグメントとした。還元は
25℃で90分間実施された。次いで４℃で0.15モ
ルNaCl、0.015モル燐酸ナトリウム、PH5.6（２
×1000ml）で透析を実施した。 このようにして調製されたFab′フラグメン
トを次いで20倍モル過剰のｍ−マレイミド安息
香酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル
（MBS）と反応させた。テトラヒドロフラン中
の79ミリモルのMBS溶液85μを２mlの
Fab′フラグメントの溶液に加え、そして25℃
でアルゴン下に１時間反応させた。この混合物
を燐酸バツフアー化塩水中でセフアデツクスＧ
−25（交叉結合ビーズデキストラン、5000ドル
トンの排除限界を有する）のカラム（1.5×40
cm）上で脱塩させた。ボイド容量中に溶出され
る誘導体化されたFab′フラグメントをプール
し、そして４℃の燐酸バツフアー化塩水中12
mg／mlのβ−ガラクトシダーゼ２mlと合した。
16時間後この溶液をアミコンPM−30加圧過
撹拌セル中で２mlに濃縮させ、次いでセフアロ
ース4B−CL（1.5×90cmカラム中１〜５×10⁶ド
ルトン排除限界を有するビーズ形交叉結合マク
ロ細孔性アガロース）のカラムクロマトグラフ
イーに付した。Fab′−β−ガラクトシダーゼ
コンジユゲートは遊離β−ガラクトシダーゼと
共に溶出された。酵素活性の全ピークをプール
し、次いでウアバインアフイニテイーカラム上
で免疫学的に精製させた。免疫学的精製法は以
下の通りであつた。セフアロース4B−CLカラ
ムからのプールしたカラム分画をウアバインア
フイニテアーカラム（1.0×7.0cm）を通して溶
出させ、次いで100mlの燐酸バツフアー化塩水
で溶出させた。このFab′−β−ガラクトシダ
ーゼコンジユゲートを次いで燐酸バツフアー化
塩水中の23ミリモルウアバイン50mlで溶出させ
た。この溶出液は最終試薬に相当し、これを４
℃の４の燐酸バツフアー化塩水で６回透析し
た。 Ｂ ウアバインとジゴキシン樹脂の合成 ウアバインおよびジゴキシンをそれぞれ別々
に種々の比率で有機スペーサー成分トリエチレ
ンテトラアミン（TETA）を介してセフアデ
ツクスＧ−10（フアルマシア・フアイン・ケミ
カルズ社より入手可能なビーズ型デキストラ
ン）にカツプリングさせた。 ウアバイン（20〜325mg）を蒸留水に溶解さ
せ、そして５倍のモル過剰のメタ過沃素酸ナト
リウムを添加することによつて25℃で２時間酸
化させた。この時間の終りに過剰の過沃素酸塩
を除去させるダウエツクスＩ−X8（Cl^-イオン
交換樹脂）の５mlのカラムに各溶液を通すこと
によつて反応を停止させた。溶出液を集めそし
て濃縮ストツク溶液の添加によつて0.1モル燐
酸ナトリウム（PH7.0）の最終濃度とした。
TETA（50〜125mg）を各溶液に加え（表1A参
照）そして最終溶液のPHをPH7.0に調整した。
この溶液を25℃で１時間培養し、この時間の終
りに30mgのナトリウムシアノボロハイドライド
を加えた。得られた溶液を25℃で48時間撹拌し
た。 ウアバインについて前記した同一の方法を、
但しジゴキシンを30％エタノールに溶解させて
ジゴキシンに対して実施した。実験の詳細は表
1Bに示されている。 各コンジユゲート（ウアバイン−TETA9ロ
ツトおよびジゴキシン−TETA9ロツト）を次
いで次の方法によつてセフアデツクスＧ−10に
カツプリングさせた。210ｇのセフアデツクス
Ｇ−10を１蒸留水中で膨潤させた。樹脂を次
いで一回１の水で３回洗つた。最後に樹脂を
１のメタ過沃素酸ナトリウム（10ｇ／）に
懸濁させることにより酸化させた。１時間25℃
に置いた後、樹脂を沈降させ、上澄流体を除去
し、そして樹脂を約３の0.25モル燐酸ナトリ
ウム（PH7.0）を使用して焼結ガラスロート上
で洗つた。得られた樹脂を25ml区分に分け、そ
して前記合成コンジユゲート各ロツトにその一
区分を混合させた。１時間混合後、ナトリウム
シアノボロハイドライド（30mg）をコンジユゲ
ートを加えた樹脂の各区分量に加えた。得られ
た懸濁液を25℃で64時間混合させるがこの時樹
脂を沈降させ、上澄流体を除去し、そして樹脂
（各区分別々に）を300mlの水、300mlの0.5モル
NaClおよび500mlの0.15モル燐酸ナトリウム
（PH7.1）で洗つた。各樹脂区分をaca 独立臨
床アナライザー分析カラム（0.5×８cm、カラ
ム１本当り1.8ml）に充填させた。そのカラム
を次いで７mgのｏ−ニトロフエニル−β−Ｄガ
ラクトピラノシド（ONPG）を含有するaca
独立臨床アナライザー分析テストパツクの通水
管中にくぼみ（dimple）６で位置させた。 Ｃ ウアバイン−TETA−セフアデツクスとジ
ゴキシン−TETA−セフアデツクスの比較 前記(B)で合成された各樹脂ロツトを次のプロ
トコールに従つてaca 独立臨床アナライザー
で評価した。10ピコモルの前記(A)で合成された
β−ガラクトシダーゼ標識抗ジゴキシン
Fab′を100μの０または5nｇ／mlのジゴキシ
ンを含有する人プール血清試料に加えた。10分
間25℃で培養後、抗体−試料混合物を自動的に
前記のaca 独立臨床アナライザー分析テスト
パツク中に注入させそしてパツク通水管中のカ
ラムを通して溶出させた。試料に続けて２mlの
0.15モル燐酸ナトリウム（PH7.8）を流した。
カラム流速は34μ／秒であつた。このパツク
に次いで針位置２（カラムバイパス）において
更に2.9mlの水を充填した。ONPGを約３ 1/2
分後にブレーカー／ミキサーから放出させ
た。酵素活性は基質添加後405nｍで、29秒お
よび46秒で測定された。 表によりすべての18の樹脂ロツトの性能を
バツクグラウンド（表Ａ）および感度（表
Ｂ）について比較する。バツクグラウンドは試
料が0nｇ／mlのジゴキシンを含有する場合の
405nｍの吸収変化として定義された。これら
条件下ではすべての標識抗体はカラムに結合残
存する筈である。感度は分離として、すなわち
0nｇ／mlジゴキシンと5nｇ／mlジゴキシンと
の間における405nｍの吸収における変化とし
て定義される。 バツクグラウンドは一般にカラムがジゴキシ
ン−TETA−セフアデツクスよりなつている
場合により低かつたが、感度はカラムがウアバ
イン−TETA−セフアデツクスよりなつてい
る場合に常により良好であつた。最良のウアバ
イン樹脂は0.158吸収単位／分の感度を有して
おり、一方最良のジゴキシン樹脂は0.110吸収
単位／分しか示さなかつた。表Ｂにおいて星
印を付したこれらの樹脂は以後の研究用に選ば
れたものであつた。 Ｄ 精度 表において星印を付された樹脂、すなわち
ウアバイン−TETA−セフアデツクスよりな
る一つのものとジゴキシン−TETA−セフア
デツクスよりなるその他のものを更にジゴキシ
ンに対する検定精度に関して評価した。０、１
または3.4nｇ／mlジゴキシンを含有する試料を
使用して前記と全く同じようにパツクを操作し
た。少くとも13のパツクが各薬剤濃度において
操作された。そして平均値（Ｘ）、標準偏差
（S.D.）および変動係数％（C.V.）が決定され
た。これらは表に示されている。 この薬物に対する医学的決定濃度である1n
ｇ／mlジゴキシンにおいて測定の精度はジゴキ
シンカラムに比較してウアバインカラムに対し
て有意に改善された。ジゴキシンカラムを使用
する場合には、1nｇ／mlジゴキシンの血清濃
度を有する人は誤認され易い。そして場合によ
り薬剤の過剰投与（または不充分投与）を導き
うる。ジゴキシンは1nｇ／ml以下の濃度では
有効性はなく、そしてそれより大きく上回る濃
度では有毒なので、そのような測定誤差の結果
は重大なものでありうる。この理由からジゴキ
シンカラムの代りにウアバインカラムを使用す
ることが本発明の基本を形成する。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 例 ２ Ａ 二価（Ｆ（ab′）₂）抗体酵素コンジユゲートの
合成１mlのアフイニテイー精製抗ジゴキシンＦ
（ab′）₂フラグメント（例１に記載のようにして
調製）〔2.85mg／mlの蛋白質−0.015モル燐酸ナ
トリウム、0.15モルNaCl、１ミリモルEDTA
（PH7.0）中〕を23〜25℃で9.1μの、ジメチル
ホルムアミド中に溶解させた60ミリモルサクシ
ンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレート
（SMCC）溶液と混合させた。60分後、同一の
燐酸ナトリウム−NaCl−EDTA溶液で平衡化
させたセフアデツクスＧ−25カラム（1.5×30
cm）上でこの溶液を脱塩させることによつてこ
の反応を停止させた。ボイド容積で溶出した蛋
白質を集め、そしてアミコン撹拌セル濃縮装置
（PM−30膜）を使用して１mlまで濃縮した。
１mlの0.05モルトリスHCl、0.15モルNaCl、１
ミリモルMgCl₂（PH7.5）中に溶解させたβ−ガ
ラクトシダーゼ24mgをこのＦ（ab′）₂−SMCCア
ダクトに加えそして４℃で20時間反応させた。
４℃で１時間、0.1モルの２−メルカプトエタ
ノール10μの添加によつてこの反応を急冷さ
せた。Ｆ（ab′）₂−β−ガラクトシダーゼコンジ
ユゲートを0.05モルトリスHCl、0.15モル
NaCl、１ミリモルMgCl₂（PH7.5）で４℃で平
衡化させたセフアローズ4Bカラム（1.5×90
cm）上でのクロマトグラフイーによつてこのＦ
（ab′）₂−β−ガラクトシダーゼコンジユゲート
を未反応β−ガラクトシダーゼから分離させ
た。 Ｂ ウアバイン樹脂とジゴキシン樹脂の合成 ウアバインおよびジゴキシンをそれぞれ牛血
清アルブミン（BSA）を介して至適比率でセ
フアデツクスＧ−10に別々にカツプリングさせ
た。 (1) ウアバイン−BSAは500mlの熱蒸留水（70
℃）に５ｇのウアバイン８水和物を溶解させ
ることにより調製された。溶液を25℃まで冷
却させた後、7.3ｇのメタ過沃素酸ナトリウ
ムを加え、次いで暗所で25℃で２時間連続混
合させた。次いでこの混合物を250mlのダウ
エツクス（１−X8）陰イオン交換樹脂床に
通すことによつて酸化を停止させた。溶出液
を集め、そして１モル燐酸ナトリウムバツフ
アー（PH7.0）に溶解させた牛血清アルブミ
ン溶液（10ｇ／500ml）と合した。25℃で１
時間置いた後、0.64ｇのナトリウムシアノボ
ロハイドライドを撹拌しつつ加えそしてこの
混合物を25℃で72時間培養させた。カツプリ
ングしなかつたウアバインを、ウアバイン−
BSAコンジユゲート溶液を24時間蒸留水流
水で次いで20容量の0.015モル燐酸ナトリウ
ムバツフアー（PH7.0）で４℃で透析させる
ことによつてこの混合物から除去した。セフ
アデツクス樹脂にカツプリングする前に
NaCl14.6ｇを加えることによつて、このコ
ンジユゲート溶液の最終イオン強度を0.25モ
ルに調整した。 (2) ウアバイン−BSAのセフアデツクスＧ−
10へのカツプリング セフアデツクスＧ−10（420ｇ）（フアルマ
シア・フアイン・ケミカルズ社製）を１時間
以上、2000mlの蒸留水中で膨潤させた。樹脂
微粒子をデカントおよび３×2000mlの水によ
る再懸濁により除去させた。次いで樹脂を20
ｇの溶解メタ過沃素酸ナトリウムを含有する
水1000mlに再懸濁させることにより酸化させ
た。10分後、樹脂を５×2000mlの水、次いで
4000mlの0.25モル燐酸ナトリウムバツフアー
（PH7.0）で洗つた。デカントさせた樹脂を
1000mlのウアバイン−BSA溶液（前記より
のもの）に再懸濁させ、25℃で１時間混合さ
せ、次いで0.66ｇのナトリウムシアノボロハ
イドライドと混合させた。72時間後、水中の
0.1％ナトリウムドデシルサルフエート4000
ml、12の蒸留水、次いで4000mlの0.15モル
燐酸ナトリウムバツフアー（PH7.1）で完全
に洗つた。最終樹脂をデユポンaca 独立臨
床アナライザー中での自動分析に使用するた
めの小形カラム（0.5cm×７cm）中にスラリ
ー状態で充填させた。 (3) ジゴキシン−BSAは75mlのエタノールに
1.25ｇのジゴキシンを溶解させ、ついでこの
溶液を1.83ｇのメタ過沃素酸ナトリウムを含
有する水150mlと合することにより調製され
た。25℃で２時間撹拌した後、この混合物を
ダウエツクス（１−X8）陰イオン交換樹脂
床（100ml）に通すことによつて酸化を停止
させた。溶出液を0.1モル燐酸ナトリウム
（PH8.5）に溶解させた牛血清アルブミン
（2.5ｇ）の溶液と合した。ナトリウムシアノ
ボロハイドライド（0.24ｇ）に次いで加え、
そしてこの混合物を25℃で48時間混合させ
た。遊離のコンジユゲートしていないジゴキ
シンを２日間蒸留水流水で、次いで20容量の
0.015モル燐酸ナトリウムバツフアー（PH
7.0）で４℃で透析させることによつて除去
した。 (4) ジゴキシン−BSAのセフアデツクスＧ−
10へのカツプリング セフアデツクスＧ−10（50ｇ）を１時間以
上、250mlの蒸留水中で膨潤させた。樹脂微
粒子をデカントおよび再懸濁により除去させ
た。次いで樹脂を５ｇの溶解メタ過沃素酸ナ
トリウムを含有する水250mlに再懸濁させる
ことにより酸化させた。10分後樹脂を５×
250mlの水、次いで0.1モル燐酸ナトリウムバ
ツフアー（PH8.5）1000mlで洗つた。デカン
トさせた樹脂（〜250mlの沈降床容積）を次
いで125mgのナトリウムシアノボロハイドラ
イドを含有する125mlの0.1モル燐酸ナトリウ
ムバツフアー（PH8.5）でスラリー化させた。
24時間絶えず混合した後樹脂を３×500mlの
水、500mlの0.15モル燐酸ナトリウム（PH
7.8）で洗い、そして125mlの0.15モル燐酸ナ
トリウム（PH8.5）に４℃で再懸濁させた。
無水下酸（1.25ml）をスラリーに加えそして
30分間混合しつつ４℃で反応させた。樹脂を
１の0.5モルNaCl、４の蒸留水および２
の0.15モル燐酸ナトリウム（PH7.1）で完
全に洗つた。最終樹脂をaca 独立臨床アナ
ライザーテストパツクの通水管中に位置させ
るように設計されている小形カラム（0.5cm
×８cm）中にスラリー状で充填させた。 Ｃ 二価抗体酵素コンジユゲートを使用するジゴ
キシン−BSA−セフアデツクス樹脂とウアバ
イン−BSA−セフアデツクス樹脂の比較 同一条件下に両樹脂ロツトを比較した。前記
(A)で合成されたＦ（ab′）₂−β−ガラクトシダー
ゼ（200μのバツフアー中2.6ピコモル）を
種々の量のジゴキシン（０、0.5、1.5、3.5およ
び5.0nｇ／ml）を含有する正常人血清標準液
200μに加えた。10分間の25℃における培養
時間の後、全抵抗−試料混合物を自動的にaca
独立臨床アナライザーテストパツクに注入
し、そしてパツク通水管中のカラムを通して溶
出させた。試料につづいて２mlの0.15モル燐酸
ナトリウムPH7.8を流した。カラム流速は34μ
／秒であつた。次いで針位置２（カラムバイ
パス）においてパツクに更に2.6mlの水を充填
した。ONPGは約3.5分後にブレーカー／ミキ
サーから放出された。酵素活性は405nｍで、
基質添加後29および46秒で測定された。 第１図および表によりバツクグラウンドおよ
び傾斜感度（第１図）および精度（表）に関し
て２つの至適化させたジゴキシン−BSA−セフ
アデツクスおよびウアバイン−BSA−セフアデ
ツクス樹脂の性能を比較する。 両樹脂ロツトはＦ（ab′）₂−β−ガラクトシダー
ゼコンジユゲートに関して直線状薬量感応を可能
にするが、ウアバイン−樹脂はより低いバツクグ
ラウンド（32％低い）およびより大きな傾斜感度
（47％大きい）の両方を示した。より低いバツク
グラウンドおよびより高い傾斜感度はより良好な
検定性能および精度にとつて好ましいものであ
る。更に検定精度はジゴキシン樹脂に対するより
もウアバイン樹脂に対して顕著でより良好であつ
た（表）。個々のパツク検定は前記と全く同様
にして２つのジゴキシン濃度、0.5nｇ／mlおよび
1.5nｇ／mlで実施された。各薬剤濃度に対して少
くとも12パツクが操作された。そして平均値
（Ｘ）、標準偏差（S.D.）および変動係数（％）
（C.V.）が測定された。

【表】 【図面の簡単な説明】

添付図面はジゴキシンカラムとウアバインカラ
ムを用いた場合の傾斜感度を表わすグラフであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 標識された一価または二価の抗ジゴキシン抗
   体と、不動化されたウアバインを有する固体相と
   からなる、液体試料中のジゴキシン量を測定する
   ための不均質系ジゴキシン免疫定量用テストキツ
   ト。