JPS60105965A - 不均質系ジゴキシン免疫定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改善されノζジゴヤシン免役定量法、そして詳
細にはインディケータ−試楽として標識−価または二価
抗ジゴキシン抗体および分離を行う手板として不動化ウ
アバインカラムを用いる非拮抗的不均質系免疫定量法に
関する。

迅速にそして正確に生物流体中に存在するジゴキシンの
改変を測定しうる臨床検を室診断テストに対する大きく
そして広い市場がある。ジゴキシンは往々にしてナノモ
ルまたはそれ以下の濃度で存在している。

近年、臨床的に重要なリガンドの測定のための多くの免
疫足置技術が開発された。代表的には、拮抗的結合免疫
定量法は結合反応に関与する結合成分に結合した標識物
質のコンジュゲートよりなっていて、結合したものおよ
び遊離したものの二柚の標識コンジュゲートを生成させ
る。結合したものおよび遊離したものを与える標識コン
ジュゲートの相対量はテスト試料中の検出させるべきリ
ガンド濃度の函数である。

結合したものにおける標識コンジュゲートと遊離したも
のの標識コンジュゲートが標識物質測定に使用される手
段によって本質的に識別可能でない場合には、その結合
したものと遊離したものを物理的に分離させなくてはな
らない。

このタイプの検定は不均質系と呼ばれる。

２つの最も広く使用されている不均質系免疫定量法は放
射免疫定量法（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着検定（
ＩＣＬ工Ｅ３Ａ）である。ＲＩＡにおいては未知量の抗
原を含有する試料を既知量の放射標識抗原および抗体と
混合させる。系を平衡に近い点まで反応せしめ、次いで
抗体結合抗原を非結合抗原から分離させる。試料抗原は
限定された数の抗体結合部位に対して標識抗原と拮抗す
るので、試料中の抗原が多くなればなる程、結合分画中
の標識抗原はますます少なくなる（または非結合分画中
ではますます多くなる）。この方法は一般に時間がかか
り（１〜３時間）そして労力を要するものである。

極く最近になって、多孔性担体上での抗体の不動化によ
ってＲ１は自動化された。抗原を含有すると疑われる試
料を既知量の標識抗原と混合させた後、限定された数の
不動化抗体結合部位を有するカラムにこの試料を通す。

遊離または結合された標識を定量化させることができる
。

迅速ではあるけれどもこの検定法はそれを再現性のある
ものとするためには抗体の厳密なｆｌ！！Ｉ量を必要と
する。

ＲＩＡは２つの主なる不利点を有している。第一に使用
される標識物質はその取扱い、保存および投棄に関して
多くの問題を有する放射性同位元素である。第二にＲＩ
Ａは拮抗様式で実施され、（（すなわちアナライトと標
識アナライトは抗体上の限定された数の結合部位に対し
て拮抗する）、従って、抗体親和性定数が検定法の感度
を代表的には１０−８Ｍ１〜１０−”Ｍｌの範囲に限定
する。

ＥＬ工ＳＡはその標識物質が放射性同位元素よりはむし
ろ酵素であるという以外は原則においてＲＩＡと同様で
ある。それも感度がなお抗体親和性定数の厳密な函数で
あるとｂう制限を受ける。

同位元素および酵素に加えてその他の標識物質が記載さ
れている。これらとしては螢光発生口、補酵素、生物発
光物質、酵素抑制剤があげられる。

不均質系免疫定量法における分離段階の種々の実施法が
知られている。これらとしては濾過、遠心分離、クロマ
トグラフィーその他があげしれる。

分離段階を実施するためのアフィニティーカラムの使用
はフランス特許出願第７９１５９９２号明細書に記載さ
れている。それは標識物質に対して親和性を有し、そし
て更に分子ふるい性を有しているりガントをそれにカッ
プリングさせたゲルの使用を記載している。標識物質よ
りはむしろ関心のあるリガンドに対して親和性を有し、
そして分子ふるい性を有するゲルの使用もまた開示され
ている。記載されている検定法は拮抗的または非拮抗的
様式で実施することができる。

米国特許第４，２９８，６８７号明細書は不均質系免疫
定量法を開示しているが、この場合測定すべき物質を標
識−次結合対応成分と反応させ、そして未反応結合対応
成分の量をその一次結合対応成分に対する特異的結合性
を与えた固体用土への吸収によって測定する。この−次
結合対応成分は限定された量で存在させる。

米国特許第３，６５４，０９０号明細書は人絨毛膜ゴナ
ドトロピン（ＨＯＧ）に対する非拮抗的不均質系免疫定
量法を開示しているがこれはその分離段階を実施するた
めに過剰の酵素標識二価抗体と不動化ＨＯＧカラムを使
用している。この検定法は１モルＨＣＧ結合抗体とＨＯ
Ｇ結合のない抗体とを区別できないという事実によりそ
の感度において限定されている。両種のものがアフィニ
ティーカラムにより保持される。

米国特許第４，１３４，７９２号明細書は関心あるリガ
ンドに対する標識特異的結合対応成分を過剰に存在させ
る不均質系免疫定量法を開示している。標識特異結合対
応成分は二価抗体であり、そしてこれは前記と同一の不
利点を有している。

ｒＢｒｌｔｔｓｈ　：ｒ、　ＨａｅｍａｔＯｌ、　」第
４７巻第２６９頁（１９８１）は凝固因子■に対する二
部位免疫放射能測定検定法（工ＲＭＡ　）を開示してい
るがことでは一価Ｆａｂ抗体フラグメントが使用されて
いる。それらの結果は二価抗体よシはむしろ一価抗体を
使用する場合に１０倍のより高い感度が得られることを
示している。

（ 米国特許第４，２００，４３６号明細書は標識−価抗体
を使用する免疫定量法を開示しているが、との場合不動
化抗原（測定すべきものと同一の抗原）を使用して結合
分画および遊離分画を分画させる。測定されるのは第−
義的には結合分画なのでこの検定は拮抗様式で通常実施
される。

従って感度は検定が好ましい様式で実施される場合には
抗体の親和性定数によって限定石れる。

ある場合には免疫定量におけるアナライトをアナライト
同族体に代えることができる。一般に性能はアナ２イト
の使用とアナライト同族体の使用との間に差はなく等し
いものと予想される。意外なことに本発明のジゴキシン
検定においては、不動化抗原としてのジゴキシンをウア
バインに代えることによって検定の感度および精度を顕
著に改善することが発見された。本改善をもたらす正確
な機構はわかっていないが、それは抗原−抗体反応の性
質にあるものと考えられる。

当該技術においてはその感度および精度が抗体の親和性
定数によって限定されないジゴキシンの不均質系免疫定
量法に対する要求がある。

本発明の非拮抗的不均質系免疫定量法は次の段階すなわ
ち、 （ａ）　モル過剰の標識−価または二価抗ジゴキシン抗
体をジゴキシンを含有する疑いのあるテスト試料に接触
させることによって反応混合物を生成させ、それによっ
て前記抗体の一方面がジゴキシンとコンプレックスを形
成し、ソシて一方面が遊離状態に留まシ、 （ｂ）　この反応混合物ｒ遊離抗体の全部を結合させう
る量で存在する、固体担体上で不動化させたウアバイン
を有する固体相と接触させて遊離抗体ケこの反応混合物
から分離し、そして（０）　標識を測定することによっ
て固体相から溶出したコンプレックスの量を抑１定する
こと、を包含する。次いで試料中のジゴキシン量を標準
曲線を比較することにより決定することができる。

その他の態様においては、拮抗的不均質系免疫定量法が
提供されるが、これは次の一連の段階、すなわち （＝）　ジゴキシンを含有する疑いのある試料を固体用
土に不動化させたモル過剰のウアバインと接触させるこ
とによシ反応混合物を生成させ、（ｂ）　この反応混合
物をジゴキシンに対してモル過剰の、但しウアバインに
対してはモル以下の標識−価または二価抗ジゴキシン抗
体と接触させ。

（ｃ）　反応を行わせ、それによって抗体の一方面がジ
ゴキシンと第一コンプレックスを形成しそして第二の分
画が不動化ウアバインとコンプレックスを形成するよう
にし、 （ロ））第二分画から第一分画を分離し、そして＜）　
第一分画または第二分画のいずれか一つに存在する標識
量を測定すること を包含している。

一般に抗体を免疫定量法で使用する前に抗体を免疫学的
に精製することが望ましい。動物血清、腹水または組織
培養媒体からの工ｇＧ単離法およびアフィニティークロ
マトグラフィーによるその免疫学的精製法もまた当該技
術では知らレテイる。簡単にＩｇＧ分画を硫酸アンモニ
ウム沈殿により調製する。■ｇＧ分画を次いでイオン交
換、ゲル濾過または蛋白質入クロマトグラフィーによシ
調製する。アフィニティー精製は抗原カラムからの溶出
により実施される。

抗体は多クローン性または単一クローン性のいずれであ
ってもよい。−価抗体は当該技術において既知の方法で
調製することができる。例えばＦａｂフラグメントは工
ｇＧのパパイン消化により得られ、′Ｆａｂ’フラグメ
ントは工ｇ（）のペゾシン消化により得られたＦ（ａｂ
’）２７ラグメントのジサルファイド還元によシ得られ
る。

抗体への標識物質のカップリングに対しては任意の多数
の方法を使用しうる。標識物質は酵素、放射性同位元素
、発色団、螢光発生団、または単独でまたはその他の試
薬と組合せた場合に検出可能なシグナルを発生しうる任
意のその他の物質でありうる。一般に各抗体に対して少
くとも一つの標識を好ましくは共有結合的に、そして抗
体の免疫反応性および標識物質の活性を保存するような
方法でカップリングさせるべきである。Ｆ’ａｂ’７ラ
グメント中に存在する遊離のスルフヒドリル基は標識の
共有結合的結合に対して特異的な反応性の基を与える。

マレイミドまたはチオピリジル基を有する複素三官能交
叉結合試薬がこの目的には有用である。一般に免疫学的
活性の保持を確実にするために、標識抗体の合成の最終
段階は免疫学的精製段階であるのが望ましい。

ウアバインまたはそのコンジュゲートは例えばｒＢｉｏ
ｈｅｍｉｅｔｒｙ［第９巻第３３１頁（１９７０）によ
る当該技術に既知の方法によって適当な担体上に不動化
させることができる。一般に、担体はその流れ特性で選
ばれ、そしてその例としてはビーズ化アガロース、ビー
ズ化デキストジン、ポリアクリルアミドまたはガラスを
めげることができる。ウアバインは直接にまたは蛋白質
、ポリアミノ酸または合成結合成分でありうるスペーサ
ーアームを介してこの担体に共有結合的に結合させるこ
とができる。通常、アフィニティーカラム物質は一回使
用すると捨てられるがしかし所望によりそれを再循環さ
せることはできる。担体が分子ふるい特性を有してＣる
ことは一般に望ましくない。それはもし徐脈抗体が試料
アナライトから解離した場合、分子ふるいはそれらが相
互に再び出会う可能性を減じさせる傾向があるからであ
る。

非拮抗性様式においては、本発明の検定は次のように［
７て実施することができる。未知量の）ｄキシンを含有
する通常は５μａ〜５００　Ａｎの血清である患者試料
の既知の容量をジゴキシンに対して明らかに過剰な量の
標識付けした一価または二価の抗体を含有する溶液と混
合させる。

通常標識付けした抗体はジゴキシンに比べて約１０〜１
００モル過剰で存在させる。ジゴキシンおよび抗体を通
常は少くとも５分、そして６０分未満のある特定の時間
の長さの間、４℃〜４５℃の間の一定の温度、通常は３
７℃で前培養（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　）させる
。ジゴキシン結合抗体と非結合抗体を含有するこの溶液
の既知の容量（通常５薦〜５００μｆ１．）を好ましく
は２ａＸ　１０璽の寸法を有する、多孔性担体上に不動
化させたウアバインよりなるカラムに通過させる。すべ
ての遊離の標識付き抗体を結合させるに充分なウアバイ
ン−カップリング担体が使用される。

カラムを０．２〜５．０ｍ１１分の流速で、通常は１〜
５−全量の適当なバラ・７１！−で溶出させる。カラム
から溶出する分画は患者血清からのジゴキシンでコンプ
レックス化された標識付き抗体を含有している。この分
画中の標識活性を次いで測定する。或いはまたこの分画
を捨て、そしてグイオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉ
ｃ）剤または極端な値のｐＨによってカラムから保持さ
れている抗体を溶出させることができる。第一の場合に
は標識の量は試料中のジゴキシン旋度に直接比例する。

第二の場合はそれは逆比例する。

本発明の検定法は手動的に実施しうるしまたはそれは種
々の自動式または半自動式装置例えばａｃａ［Ｆ］独立
臨床アナライザー（デュポン社製）に適応することがで
きる。この場合には患者試料および過剰の標識−価また
は二価抗体を装置の外で前培養させる。既知の６１にの
この混合物を分析テストパック（ここに参考として包含
さ・れているＲｅ　２９．７２５に記載されている）中
に、この装置の充填ステーションにおいて自動的に注入
し、次いで最終パック内容量を５−とするに充分な蓋の
バッファーを注入する。この試料混合物をパック通水管
（ｈｅａｄｅｒ　）に置いた多孔性担体上で不動化させ
たウアバインのカラムに通しそして直接パック中に溶出
させる。この溶出された分画は患者血清中のアナライト
でコンプレックス化された標識抗体を含有している。こ
のパンクは自動的に６７℃でブレーカ−／ミキサーＩま
たはブレーカ−／ミキサー■のいずれかでシグナル発生
反応に必要な試薬を添加し、そして、そのシグナルの光
度計による読出しを行なう。

本発明の検定法はまた、拮抗様式でも実施させうるが、
これは抗体を試料ジゴキシンとウアイくインに、連続的
というよシはむしろ同時に露出させることを意味してい
る。

拮抗様式においては検定法は以下のように実施される。

ジゴキシンを含有する疑いのある試料の一区分量、通常
は１０〜１００μλを固体組上に不動化させたモル過剰
のウアバインを含有する試販管に加える（一般にはアフ
ィニティーカラム樹脂例えば交叉結合アガロースまたは
デキストランの１００〜１０００μλ充填容量）。次い
で一価または二価標識抗ジゴキシン抗体溶液を試料中に
予想されるジゴキシンの最大値よ９モル過剰の、但しウ
アバインに対してはモル以下の量で加える。この抗体溶
液の量は一般には５〜５０μλである。このようにして
生成された反応混合物を２６℃〜４５℃、好ましくは６
７℃の温度で、１５〜６０分、好ましくは１５分間、静
かに攪拌しつつ培養する。抗体−ジゴキシンコンプレッ
クスを次いで抗体／不動化ウアバインコンプレックスか
ら分離させる。親和性樹脂が使用される場合には約６分
間の２０００　Ｘｆの遠心が好ましい。次いで上澄流体
を吸引する。固体組上に吸着された標識の量または上澄
流体中の標識の量のどちらかを測定してテスト試料中に
最初に存在したジゴキシンの量を決定することができる
。標識が酵素である場合には酵素をその基質と反応させ
て検出可能な生成物を生成させることによって測定を実
施することができる。

非酵素標識例えば螢光発生口、発色団、および放射性同
位元素は当該技術でよく知られた技術によシ測定するこ
とができる。

固体組上でジゴキシンよシはむしろウアバインを使用す
ることの利点は次の実施例によって説明されている。こ
れら実施例中では種々の実験条件下にジゴキシン（アナ
ライト）およびウアバイン（アナライト同族体）カラム
の両方が調製され、そしてそれらのジゴキシンアフィニ
ティーカラムを使用する免疫学的検定における性能がパ
ックグラウンド、感度および精度に関して評価された。

各樹脂の合成に対する至適条件は異っているけれども、
最良のウアバイン樹脂は一貫して最良のジゴキシン樹脂
よりも秀れた性能を示した。

本明細書中ではウアバインのみが特定的に例示されてい
るけれども、均等物としてジギトキシン、デスラノンド
、ジゴキシゲニン、およびストロファンチンが予想され
る。

例　１ Ａ　−価抗体一酵素コンジュゲートの合成ウアバイン−
ＩＳＡ免疫免疫吸着剤用使用先金血清から直接ジゴキシ
ン特異抗体を免疫精製した。

ウアバインは蛋白質（ＩＳＡ１人血清アルブミン）スは
−サーアームを介してデガロースマトリックスに結合さ
せた。第一の段階はウアバイン−アルブミンコンジュゲ
ートの合成を包含する。ウアバイン（ｌ）、　５６ミリ
モルを２０−の水に溶解）を暗所で室温で一時間、メタ
過沃素酸ナトリウム（１，０２ミリモル）で酸化した。

定量酸化は酢酸エチル：メタノール：　Ｈ２Ｏ（７５：
２５：１）で展開させたシリカゲルＧプレート上での薄
層クロマトグラフィーによって証明された。ダウエック
スＡＧ−Ｉ　Ｘ８イオン交換樹脂の３−のカラム上にこ
の水性混合物を通すことＫよって過剰の過沃素酸塩を除
去した。ウアバインの定量的回収は放射能標識（トリチ
ウム化）ウアバインを追跡することにより証明された。

０．４−の５　％　ＮａｚＯＯｓを添加することによっ
て酸化ウアバインの溶液をｐＨ９，５にバッファー化さ
せ、そして２０ｔｎｌのＨ８Ａ　ｉ液（２８ｎｑ／ｒｎ
１．）と合した。４５分後、このコンジュゲートを２０
艷の水に新たに溶解させた０、６１のすトリウムボロハ
イドライドを添加することによって還元させた。３時間
後８−の１モル蟻酸を加えてそのｐＨを６．５に下げた
。ｐＨ６，５で１時間置いた後、１モル、　ＮＨ４ＯＨ
でそのｐＨを７．５に上昇させた。

全反応混合物ｒ蒸留水で完全に透析させ次いで最後に０
．０１５モル燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，８）
、０．１５　モルＮａ０ｊ２　テ透析した。コノコンジ
ュゲートをアミコンＰＭ−３０膜で濃縮させ°Ｃ１４，
２η／−とした。蛋白質濃度は当該技術では既知のロー
９−法により測定された。

ウアバイン−Ｈ８Ａコンジュゲート’ｊｉ−ｒＢｉｏ−
ＲａｄｍａｎｕａｌＪに記載の方法を使用してアフィゲ
ル［有］１０（ビオ−ラド・ラボラトリーズ社製）上で
不動化させた。２５−のアフィゲノＬ／＠）１０を７５
−の氷冷水で洗った。このゲルを透析ウアバイン−Ｈ８
Ａコンジュゲートに加えそして４℃でロッカー上で一晩
混合せしめた。過剰の活性エステル基を０．１コの１モ
ルエタノール７ミン（ｐＨａＯ）を室温で一時間加える
ことにより急冷させた。

最後に、このゲルを蒸留水で完全に、次いで順に５００
−の０．５　モルＮａ０ｆｆｉ、４００ｍ６００．１−
ｅｋグリシン（ｐＨ２，５）、３００ｒｎｌの２５モル
ＮＨ４５ｃＮ　。

１０００ｍｇのホス７エートバツフアー化塩水で洗った
。ウアバイン親水性樹脂を６−のベッド容積になるよう
にカラム（０，７Ｘ　１５ｃｒｎ）中に充填して、そし
て燐酸バッファー化塩水で平衡化した。

抗血清（４，５η／ｍｅモノ特異性抗体のカベル抗ジゴ
キシン血清１０ｍ１）を１ｍｅ１分以下の流速で適用し
た。カラムをその２８０　ｎｍの吸光度がベースライン
（＜０．０１）に達するまで燐酸バッファー化塩水で洗
った。次いで６０ｍｅの３モルＮＨ４５ＯＮ　（ｐＨ７
，５）でこの力２ムから抗体を溶出させ、そして直ちに
４℃で２２燐酸バツフアー化塩水で４回透析した。

アミコン攪拌セル装置（ＰＭ−３０膜）上でこの２７−
のアフィニティー精製抗ジゴΦシン抗体を２７艷に濃縮
した。最終蛋白質濃度は１０η／−であった。試料を０
．１モル酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）１０００−で４
℃で４時間透析した。透析後、同一酢酸ナトリウムバッ
ファーに溶解させた１ｏｍｙ／ｌｎｔ、のペプシン溶液
２０μλを加え、そして温度を３７℃に加温して２０時
間保った。

この消化時間の後、短時間遠心分離させることにより試
料を清澄化させ、次いで［１０１５モル燐酸ナトリウム
（ｐＨ７，４）、０．１５モルＮａ０１（燐酸バッファ
ー化塩水）中で平衡化させたセファデックスＧ−１５０
カラム（１，５Ｘ９０ｃｒｎ）上でりＯマドグラフィー
に付した。ゲル電気泳動により同定された（Ｆａｂ’　
）２７ラグメントを含有するカラム分画をプールしく１
９．２ｍ）％次いで加圧濾過（ＰＭ−３Ｑアミコン膜）
で２．７１ｒＬｔに濃縮した。濃縮後この（Ｆａｂつ２
ノラグノントを５５．ｄの１モルジチオスレイトール溶
液を加えることにょシ還元させて相当するＦａｂ’）２
グメントとした。還元は２５℃で９０分間実施された。

次いで４℃で０．１５　モｋ　ＮａＣ！Ｉ１．．０．０
１５　モ／ｌ／燐酸ナトリウム、ｐＨ５，６（２Ｘ　１
０００−）で透析を実施した。

このようにして調製されたＦａｂ’　７ラグメントを次
いで２０倍モル過剰のｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒド
ロキシサク７ンイミドエステル（ＭＢＳ）と反応させた
。テトラヒドロンラン中の７９ミリモルのＭＢＳ　溶液
８５　ｐｉ、を２−〇Ｆａｂ’７ラグメントの溶液に加
え、そして２５℃でアルゴン下に１時間反応させた。こ
の混合物を燐酸バッファー化塩水中でセファデックスＧ
−２５（交叉結合ビーズデキストラン、５０００ドルト
ンの排除限界を有する）のカラム（１，５Ｘ４Ｄｏｎ）
上で脱塩させた。ボイド容量中に溶出される誘導体化さ
れたＰａ　ｂ’フラグメントをプールし、そして４℃の
燐酸バッファー化塩水中１２ｍｙ／−のβ−ガラクト７
ダーゼ２ｒｎｔと合した。１６時間後この溶液をアミコ
ンＰＭ−３０加圧ｐ過攪拌セル中で２−に濃縮させ、次
いでセファロース４Ｂ−ＯＬ（１，５Ｘ９０ロカジム中
１〜５Ｘ１０”ドルトン排除限界を有するビーズ形交叉
結合マクロ細孔性アガロース）のカラムクロマトグラフ
ィーに付した。Ｆａ　ｂ’−β−ガラクト７ダーゼコン
ジユゲートは遊離ｉ−ガラクトシダーゼと共に溶出され
た。酵素活性の全ピークｒプールし、次いでウアバイン
アフィニティーカラム上で免疫学的に精製させた。免疫
学的精製法は以下の通υであった。セファロース４Ｂ−
ＯＬカラムからのプールしたカラム分画をウアバインア
フィニティーカラム（１，ＯＸ　７．　Ｄｃｍ）を通し
て溶出させ１次いで１００−の燐酸バッファー化塩水で
溶出させた。

このＦａ　ｂ’−β−ガラクト７ダーゼコンジユゲート
を次いで燐酸バッファー化塩水中の２３ミリモルウアバ
イン５０−で溶出させた。この溶出液は最終試薬に相当
し、これを４℃の４Ｌの燐酸バッファー化塩水で６回透
析した。

Ｂ、ウアバインとジゴキシン樹脂の合成ウアバインおよ
びジゴキシンをそれぞれ別々に種々の比率で有機スペー
サー成分トリエチレンテト２アミン（ＴＪｌｌＴＡ　）
を介してセファデックス（）−１０（７アルマ７ア・フ
ァイン・ケミカルズ社より入手可能なビーズ壓デキスト
ラン）にカップリングさせた。

ウアバイン（２０〜３２５ｎｖ）を蒸留水に溶解させ、
そして５倍のモル過剰のメタ過沃素酸ナトリウムを添加
することによって２５℃で２時間酸化させた。この時間
の終りに過剰の過沃素酸塩を除去させるダウエックスニ
ーＸ８　（０Ｊ２−イオン交換樹脂）の５−〇カラムに
各溶液を通すこと　□によって反応を停止させた。溶出
液を集めそして漉縮ストック溶液の添加によって０．１
モル燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）の最終濃度とした。

Ｔｌ！１ＴＡ（５０〜１２５巧）を各溶液に加え（表１
Ａ参照）そして最終溶液のｐＨをｐＨ７，［＋に調整し
た。この溶液を２５℃で１時間培養し、この時間の終り
に６０〜のナトリウムシアノボロハイドライドを加えた
。得られた溶液を２５℃で４８時間攪拌した。

ウアバインについて前記した同一の方法を、但しジゴキ
シンを３０％エタノールに溶解させてジゴキシンに対し
て実施した。実験の詳細は表１Ｂに示されている。

各コンジュゲート（ウアバイン−ＴＦｌｉＴＡ　９０ツ
トおよびジゴキシン−ＴＥＴＡ　９０ツト）ヲ次いで次
の方法によってセファデックスＧ−１０にカップリング
させた。２１０ＦのセファデックスＧ−１０を１℃蒸留
水中で膨潤させた。樹脂を次いで一回１にの水で６回洗
った。最後に樹脂を１１！、のメタ過沃暑、酸ナトリウ
ム（ＩＣ１／λ）に感濁させることにより酸化させた。

１時間２５℃に置いた後、樹脂を沈降させ、上澄流体を
除去し、そして樹脂を約３βの０．２５モル燐酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，Ｄ）を使用して焼結ガラスロート上で洗
った。得られた（り１脂を２５ｍ１区分に分け、そ　・
して前記合成コンジュゲート各ロットにその一区分を混
合させた。１時間混合後、ナトリウムシアノボロハイド
ライド（３０ｎｉ）をコンジュゲートを加えた樹脂の各
区分量に加えた。得られた懸濁液を２５℃で６４４時間
混させるがこの時樹脂を沈降させ、上澄流体を除去し、
そして樹脂（各区分別々に）を３００−の水ｂ　３００
ｍの０．５モルＮａａｊ２および５００ｍ１の０，１５
モル燐酸ナトリウム（ｐＨ７，１）で洗った。各樹脂区
分をａｃａ■独立臨床アナライザー分析カラム（０，５
Ｘ８ｃｒｎ１　カラム１本当り１．８　ｒｎｌ）に充填
させた。

そのカラムを次いで７■の０−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（０ＮＩ）Ｇ　）を含有するａｃ
ａ［Ｆ］独立臨床アナライザー分析テストパックの通水
管中にくほみ（ｄｉｍｐｌｅ　）　６で位置させた。

Ｃ，ウアバイン−ＴＦｔＴＡ−セファデックスとジゴキ
シン−ＴＦｌｉＴ　Ａ−セファデックスの比較前記の）
で合成された各樹脂ロットを次のプロトコールに従って
ａｃａ■独立臨床アナライザーで評価した。１０ピコモ
ルの前記（Ａ）で合成されたβ−ガラクトシダーゼ標標
識ジゴキシンＦａ　ｂ’を１００μ℃の０または５ｎｒ
／−のジゴキシンを含有する人プール血清試料に加えた
。１０分間２５℃で培養後、抗体−試料混合物を自動的
に前記のａｃａ■独立臨床アナライザー分析テストパッ
ク中に注入させそしてパック通水管中のカラムを通して
溶出させた。試料に続けて２−の０．１５モル燐酸ナト
リウム（ｐＨ７，８）ヲ流した。カラム流速は３４μ２
／秒であった。このパックに次いで針位置２（力２ムバ
イパス）において更に２．９−の水を充填した。０ＮＰ
Ｇを約３％分後にブレーカ−／ミキサー■から放出させ
た。酵素活性は基質添加後４０５ｎｍで、２９秒および
４６秒で測定された。

表■によりすべての１８の樹脂ロットの性能をパックグ
ラウンド（表１１Ａ）および感度（表ＪＩＢ）について
比較する。パックグラウンドは試料がＱｎｔ／ｍｌのジ
ゴキシンを含有する場合の４０５μｍの吸収変化として
定義された。これら条件下ではすべての標識抗体はカラ
ムに結合残存する筈である。感度は分離として、すなわ
ちＱｎＰ／ｒｎ１．ジゴキシンと５ｎｒ／ｍｌ：）ゴキ
シンとの間における４０５μｍの吸収における変化とし
て定義される。

パックグラウンドは一般にカラムがジゴキシン−ＴＥＴ
Ａ−セファデックスよすなっている場合により低かった
が、感度はカラムがウアバイン−ＴＦｉＴＡ−セファデ
ックスよりなっている場合に常により良好でめった。最
良のウアバイン樹脂は０．１５８吸収率位／分の感度を
有しており、一方最良のジゴキシン樹脂は０．１１０吸
収率位／分しか示さなかった。表１１Ｂにおいて星印を
付したこれらの樹脂は以後の研究用に選ばれたものであ
った。

Ｄ、精　度 表■において星印を付された樹脂、すなわちウアバイン
−ＴＩＩｉＴＡ−セファデックスよりなる一つのものと
ジゴキ７ンーＴＥＴＡ−セファデックスよシなるその他
のものを更にジゴキシンに対する検廻精度に関して評価
した。０．１または１４ｎｔ／−ジゴキシンを含有する
試料を使用して前記と全く同じようにパックを操作した
。少くとも１３のパックが各系剤濃度に２いて操作され
た。そして平均１１α蛯）、標準偏Ｍ　（Ｓ、Ｄ、）お
よび変動係ｅ％　Ｃ０−Ｖ、）が決定された。これらは
表■に示されている。

この薬物に対する医学的決定濃度である１ｎｒ／　ｍｌ
　：）ゴキ７ンに於いて測定の精度はジゴキシンカラム
に比較してウアバインカラムに対して有意に改吾され／
ζ。ジゴキシンカラムを使用する場合には、１１／−ジ
ゴキシンの血清濃度を有する人は誤認され易い。そして
場合によシ薬剤の過剰投与（または不充分投与）を導き
うる。

ジゴキシンはＩｎｔ／−以下の濃度では有効性はなく、
そしてそれよシ大きく上回る濃度では有毒なので、その
ような測定誤差の結果は重大なものでありうる。この理
由からジゴキシンカラムの代りにウアバインカラムを使
用することが本発明の基本を形成する。

表１人 ０Ｕ−Ａ　３２５　１２５ ０［ＩＴ−Ｂ　１９５　７５ ０Ｕ−０１３０５０ ０Ｕ−Ｄ　１２５　１２５ ０Ｕ−１ｉｉ　７５　７５ ０Ｕ−Ｆ　５０　５０ ０Ｕ−Ｇ　５０　１２５ ０Ｕ−Ｈ３０７５ ０Ｕ−工　２０　５０ 表１Ｂ ＤＧ−Ａ　５２５　１２５ ＤＧ−Ｂ　１９５　７５ ＤＧ−０１３０５０ ＤＧ−Ｄ　Ｉ２５　１２５ ＤＧ−Ｅ　７５　７５ ＤＧ−Ｆ　５０　５０ ＤＧ−［）　５０　１２５ ＤＧ−Ｈ３０７５ ＤＧ−工　２０　５０ 表１１ａ Ａ　Ｏ，２３４０，０４２ Ｂ　Ｏ，２５４０，１０８ ＣＤ、２６１　０．３１８ Ｄ　Ｏ，１１１０，０４４ ｎ　Ｏ，１２１０，２０６ ｙ　Ｏ，１２４０，３１１ ｅ　Ｏ，１６４０，１３７ ＨＯ，１６６０，２２４ 工　０．１５９　０．２６８ 表■Ｂ Ａ　Ｏ，０３００，００８ Ｂ　０．０１９ ａ　Ｏ，０１５０，０１３ Ｄ　Ｏ，１５８＊　０．０１２ Ｅ　Ｏ，１４８０，０１１ Ｆ’　０．１４８　０．０４７ （）　０．１０６　０．０３３ ＨＤ、　１０８　０．０８７ エ　０．１１２　０．１１０＊ 表■ 樹脂０Ｕ−ＤとＤＧ−工の比較：精度 ｉ　Ｃｎｒ／ｄ）　０．８３　０．９６Ｓ　、　Ｄ、　
（１’、ｚＱ）　０．１４　０．５３０、ｖ、（％）（
ｎな−）　１７　５５−／Ｘ（ｎｒ／ｒｎ＋り　３．４
　３．４ Ｅ１．Ｄ、　（ｎｒ／ｍｇ）　ｏ、　０９　０．３７ａ
、ｖ、（ｘ）　（ｎｆ％／）　２．５　１１列　２ Ａ、、二価（Ｆ（ａｂつ２）抗体酵素コンジュゲートの
合成１ｒｎｌのアフィニティーＮ製抗ジゴキシンＦ（ａ
ｔ／　）２７ラグメント（例１に記載のようにして調製
）［２，８５ｍｒ／−の蛋白質−０，０１５モル燐酸ナ
トリウム、０．１５モルＮａ０Ａ、１ミリモルＦｉＤＴ
Ａ　（ｐＨ１Ｑ　）アミド中に溶解させた６０ミリモル
サクシンイミジ＃４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート（５Ｍ０Ｏ）　ｍ　
液と混合させた。６０分後、同一の燐酸ナトリウム−’
ＮａＯβ−ＥＤＴＡ溶液で平衡化させたセファデックス
Ｇ−２５力２人（１，５ｘ３［］６ｎ）上でこの溶液を
脱塩させることによってこの反応を停止させた。ボイド
容積で溶出した蛋白質を集め、そしてアミコン攪拌セル
濃縮装置（ＰＭ−３０１換）を使用して１−まで濃縮し
た。１−の０．０５モルトリスＨＯＡ、０．１５モルＮ
ａＯＲ，１ミリモルＭｇ０ｆ１２（ｐＨ７，５）中に溶
解させたβ−ガラクトシダーゼ２４ηをこのＦ（ａｂす
２−８Ｍ０Ｏアダクトに加えそして４℃で２０時間反応
させた。４℃で１時間、０．１モルの２−メルカプトエ
タノール１０μ必の添加によってこの反応を急冷させた
。Ｆ（ａｂ’）２−β−ガラクトシダーゼコンジュゲー
トを０．０５モルトリス１ｘｃＡ　、α１ｓ　モルｍａ
ｎ、１゛ミリモ／Ｌ／ｇＯβ２（ｐＨ７，５）で４℃で
平衡化させたセファ　′ローズ４Ｂカラム（ｔ５Ｘ９ｃ
１６ｎ）上でのクロマトグラフィーによってこのＦ（ａ
ｂり２−ρ−ガ２クトシダーゼコンジュゲートを未反応
β−ガジクト７ダーゼから分離させた。

Ｂ。ウアバイン樹脂とジゴキシン樹脂の合成ウアバイン
およびジゴキシンをそれぞれ牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）を介して至適比率でセファデックスＧ−１０に別々に
カップリングさせた。

１）ウアバイン−ＢＥＩＡは５００−の熱蒸留水（７０
℃）に５２のウアバイン８水和物を溶解させるととＫよ
！２調製された。溶液を２５℃まで冷却させた後、Ｚ６
りのメク過沃素酸ナトリウムを加え、次いで暗所で２５
℃で２時間連続混合させた。次いでこの混合物を２５０
１ｙ１ｇのダウエックス（１−Ｘ８）陰イオン交換樹脂
床に通すこと罠よって酸化′ｆｔ停止させた。溶出液を
集め、そして１モル燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７
，０）に溶解させた牛血清アルブミン溶液（１ｏｇ１５
００−ンと合した。２５℃で１時装置いた後、　０．６
４ｒのナトリウム７１ノボロバイド２イドを攪拌しつつ
加えそしてこの混合物を２５℃で７２時間培養させた。

カップリングしなかったウアバインを、ウアバイン−Ｂ
ＳＡコンジュゲート醍液を２４時間蒸留水流水で次いで
２ｏ容量の０．０１５モル燐酸燐酸ナトリウムバラノア
−Ｈ７，０）で４℃で透析させることによってこの混合
物から除去した。セファデックス樹脂にカップリングす
るＭｆＪにＮａＣＲ１４，６ｆ　ｔｌ−加えることによ
って、このコンジュゲート溶液の最終イオン強度を０．
２５モルに調整した。

２）ウアバイン−ＢＳＡのセファデックスＧ−１０への
六ツぜＩＩ　ｙＪ’ セファデックスＧ−１０（４２０Ｆ）（ファルマシア・
ファイン・ケばカルズ社製）を１時間以上、２０００ｍ
１の蒸留水中で膨潤させた。樹脂微粒子をデカントおよ
び５ｘ２ｏｏｏｙの水による再懸濁によシ除去させた。

次いで樹月旨を２Ｏｆの溶解メタ過沃素酸ナトリウムケ
含有する水’＋ａａａｍｌに再懸濁させることにより酸
化させた。１０分後、樹脂を５ｘ２０００艷の水、次い
で４０００−の０．２５モル燐酸ナトリウムバッファ＝
（ｐＨ７，０）で洗った。デカントさせた樹脂を１０１
００Ｏのウアノ２インーＢＳＡ溶液（前記よりのもの）
に再懸濁させ、２５℃で１時間混合させ、次いで０．６
６ｆのナトリウムシアツボＩ：ｆ／％イドンイドと混合
させた。７２時間後、水中００，１％ナトリウムドデシ
ルサルフェート４０００ｔｎｌ、１２　Ａの蒸留水、次
いで４０００−の０．１５モル燐酸ナトリウム、Ｓツフ
ァ−（ｐＨ７，１）で完全に洗った。最終樹脂をデュポ
ンａｃａ■独立臨床アナライザー中での自動分析に使用
するだめの小形カラム（０，５ｍｘ７　ｔ：ｍ　）中に
スラリー状態で充填させた。

６）ジゴキシン−ＢＳＡは７５ゴのエタノールに１．２
５　ｔのジゴキシンを溶解させ、ついでこの溶液を１．
８３Ｆのメタ過沃素酸ナトリウムを含有する水１５０−
と合することにより調製された。

２５℃で２時間攪拌した後、この混合物をダウエックス
（１−Ｘ８）陰イオン交換樹脂床（１ｏ　ＯＪに通すこ
とによって酸化を停止させた。溶出液を０．１モル燐酸
ナトリウム（ｐＨａ５）に溶解させた牛血清アルブミン
（２，５Ｆ）の溶液と合した。

ナトリウムシアノボロハイドライド（０，２４１）を次
いで加え、そしてこの混合物を２５℃で４８時間混合さ
せた。遊離のコンジュゲートしていないジゴキシンを２
日間蒸留水流水で、次いで２０谷量の０．０１５モル燐
酸ナトリウムパンファー（ｐＨ７，０）で４℃で透析さ
せることによって除去した。

４）：）ゴキシン−ＢＳＡのセファデックスＧ−１０へ
のカップリング セファデックスＧ−１０（５Ｂ）を１時間以上、２５０
−の蒸留水中で膨潤させた。樹脂微粒子をデカントおよ
び再懸濁によシ除去させた。次いで樹脂を５２の溶解メ
タ過沃素酸ナトリウムを含有する水２５０−に再懸濁さ
せることによシ酸化させた。１０分後横脂を５Ｘ２５０
−の水、次いで０．１モル燐酸ナトリウムバッファー（
ｐＨ８，５）１０００−で洗った。デカントさせた樹脂
（〜２５〇−の沈降法容積）を次いで１２５ηのナトリ
ウムシアノボロハイドライドを含有する１２５−の０．
１モル燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨａ５）でスラリ
ー化させた。２４時間絶えず混合した後樹脂を３Ｘ５０
０−の水、５００−の０．１５モル燐酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，８）で洗い、そして１２５−００．１５モル燐酸
ナトリウム（ｐＨａ５）Ｋ４℃で再懸濁させた。無水酢
酸（１，２５ｍ）をスラリーに加えそして６０分間混合
しつつ４℃で反応させた。樹脂を１にの０．５モルＮａ
０Ｉｔ、　４ｉ、＋７）蒸留水および２βの０．１５モ
ル燐酸ナトリウム（ｐＨ７，１）で完全に洗った。最終
樹脂をａｃａＩ３独立臨床アナライザーテストｌξツク
の通水管中に位置させるように設計されている小形カラ
ム（０，５ｃｍＸ　８　ｃｍ　）　中にスラリー状で充
填させた。

Ｃ１二価抗体酵素コンジュゲートを使用するジゴキシン
−ＢＳＡ−セファデックス樹脂とウアバイン−ＢＳＡ−
セファデックス樹脂の比較 同一条件下に両樹脂ロットを比較した。前記（Ａ）で合
成されたＦ（ａｂ’１２−β−ガラクトンダーゼ（２０
０μλのバッファー中２．６ピコモル）全種々の量のジ
ゴキシン（０，０，５，１，５，５，５および５、０　
ｎｒ　／ｍｌ　）を含有する正常人血清標準液２００μ
℃に加えた。１０分間の２５℃における培養時間の後、
全抗体−試料混合物を自動的にａｃａＩ３１独立臨床ア
ナライザーテストパックに注入し、そしてパック通水管
中のカラムを通して溶出させた。試料につづいて２ｒｎ
ｌの０．１５モル燐酸ナトリウムｐＨ７，８ｋ流した。

カラム流速は６４μし秒であった。次いで針位置２（力
２ムバイパス）においてパックに史に２．６　ｍ／！の
水を充填した。

０ＮＰＧは約３．５分後にブレーカ−／ミキサー■から
放出された。酵素活性は４０５　ｎｍで、基質添加後２
９および４６秒で測定された。

第１図および表■によりパックグラウンドおよび傾斜感
度（第１図）および精度（表■）に関して２つの至適化
させたジゴキシン−ＢｓＡ　−セファデックスおよびウ
アバイン−ＢＳＡ−セ７アデツクス樹脂の性能を比較す
る。

両樹脂ロットはＦ（ａｂ’）　２−β−ガラクトシダー
ゼコンジュケ゛−トに関して直線状薬量感応を可能にす
るが、ウアバイン−樹脂はよ−り低いパックグラウンド
（３２チ低い）およびより大きな傾斜感度（４７％大き
い）の両方を示した。より低いパックグラウンドおよび
よシ高い傾斜感度はより良好な検定性能および精度にと
って好ましいものである。更に検定精度はジゴキシン樹
脂に対するよりもウアバイン樹脂に対して顕著でより良
好であった（表■）。個々のパック検定は前記と全く同
様にして２つのジゴキシン樹脂％　Ｄ、５ｎｒ／ゴおよ
び１．５ｎｆ／−で実施された。

各薬剤濃度に対して少くとも１２のパックが我作された
。そして平均値（Ｘ）　％標準偏差（Ｅｌ、Ｄ、）およ
び変動係数（支））（０，Ｖ、）が測、定された。

表■ 精度に対する、ウアバイン樹脂とジゴキシン樹脂の比較
Ｘ（ｎｆ／ｍｔ）　［１，４７０，４３ｓｅＤ、（ｎｒ
７Ｑり　Ｄ、［１４０，０７Ｃ、Ｖ、（％）（ｎｌ／１
ｔｔｉ）　８．　’Ｉ　１４．２Ｘ（ｎｒ／ｄ）　１．
５２　１．５４ Ｓ、Ｄ、　（ｎ７／＋り　α０５　０．２００　、ｖ、
ｆ％）（ｎｒ／ｍ／）　３．０　１５．１

【図面の簡単な説明】

添付図面はジゴキ７ンカ２ムとウアバインカラムを用い
た場合の傾斜感度を表わすグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｉ　Ｘａ）　モル過剰の標識−価または二価抗ジゴキシ
   ン抗体をテスト試料に接触させることによって反応混合
   物を生成させ、それによって前記抗体の一分画がジゴキ
   シンとコンプレックスを形成しそして一分画が遊離状態
   に留まり、 （１））　この反応混合物を遊離抗体の全部を結合しう
   る量で存在する、その上で不動化させたウアバインを有
   する固体相と接触させ、それにより遊離抗体をこの固体
   相上に結合させ、そして （Ｃ）　、−標識活性を測定することによって固体相か
   ら溶出したコンプレックスの量を測定ことからなるテス
   ト試料中のジゴキシンを測定するための非拮抗的免疫定
   量法。 ２）標識が酵素、放射性同位元素、発色団また゛は螢光
   発生団である前記特許請求の範囲第１項記載の免疫定量
   法。 ３）−価抗体がＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フ２
   グメントである前記特許請求の範囲第１項記載の免疫定
   量法。 ４）二価抗体がＦ（ａｂ’）２７ラグメントである前記
   特許請求の範囲第１項記載の免疫定量法。 ５）固体相がビーズ化アガロース、ビーズ化デキストラ
   ン、ポリアクリルアミドまたはガラスである前記特許請
   求の範囲第１項記載の免疫定量法。 ６）固体相をカラ人中に充填させる、前記特許請求の範
   囲第５項記載の免疫定量法。 価抗体がＦａｂ’７ラグメントでアリ、そして標識がＩ
   −ガラクト７ダーゼである前記特許請求の範囲第１項記
   載の免疫定量法。 ８）固体用がビーズ化デキストフンであり、二価抗体が
   Ｆ（ａｂ’）２フラグメントでありそして標識がβ−ガ
   ラクト７ダーゼである前記特許請求の範囲第１項記載の
   免疫定量法。 ９）　（０）の測定段階が溶出β−ガラクトシダーゼ標
   識Ｆａ　ｂ’抗ジゴキシン抗体／ジゴキシンコンプレッ
   クスを０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ２クトビラノシ
   ドと接触させることによシ実施される、前記特許請求の
   範囲第７項記載の免疫定量法。 １０）　（０）の測定段階が溶出β−ガラクトシダーゼ
   標ｍＦ（ａｂ’）ｚ抗ジゴキシン抗体／ジゴキシンコン
   プレックスｆｏ−二トロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトピ
   ンノシドと接触させることにより実施される、前記特許
   請求の範囲第８項記載の免疫定量法。 １１％ａ）　ジゴキシンを含有する疑いのある試料を固
   体用土に不動化させたモル過剰のウアバインと接触させ
   ることにより反応混合物を生成させ、 （１））　この反応混合物をジゴキシンに対して免疫化
   学的に過剰の、但しウアバインに対しては免疫化学的に
   不足の標識−価または二価抗ジゴキシン抗体と接触させ
   、 （Ｃ）　反応を行わせて抗体の一分画がジゴキシンと第
   一コンプレックスを形成し、そして第二の分画が不動化
   ウアバインとコンプレックスを形成するようにすること
   、 （ｄ）　第二分画から第一分画を分離し、そして（ｅ）
   　第一分画または第二分画のいずれか一つに存在する標
   識量を測定する ことからなる一連の段階を包含するテスト試料中のジゴ
   キシンを測定するための、拮抗的免疫定量法。 １２）標識が酵素、放射性同位元素、発色団また−　は
   螢光発生口である前記特許請求の範囲第１１項記載の免
   疫定量法。 １６）−価抗体がＦａｂフラグメントまｆｃはＦａｂ’
   ７ラグメントである前記特許請求の範囲第１１項記載の
   免疫定量法。 １４）二価抗体がＦ（ａｂ’）２ノラグメントである前
   記特許請求の範囲第１１項記載の免疫定量法。 １５）固体用がビーズ化アガロース、ビ−ズ化デキスト
   フン、ポリアクリルアミドまたはガラスである前記特許
   請求の範囲第１１項記載の免役定量法。 １６）固体用がビーズ化デキストランであり、−価抗体
   がＦａ　ｂ’フラグメントであり、そして標識がβ−ガ
   ラクト７ダーゼである前記特許請求の範囲第１１項記載
   の免疫定量法。 １７）固体用がビーズ化デキストランであり、−価抗体
   がＩｌ′（ａｂす２フラグメントでありそして標識がβ
   −ガラクトシダーゼである前記特許請求の範囲第１１項
   記載の免疫定量法。 １８）　（ｅ）の測定段階が測定すべき分画をｏ　−二
   ）ロフェニルーβ−Ｄ−ガ２クトピラノシドと接触させ
   ることにより実施される、前記特許請求の範囲第１６項
   記載の免疫定量法。 １９）　（ｅ）の測定段階が測定すべき分画を０−ニト
   ロフェニル−β−Ｄ−ガ之クトりラノシドと接触させる
   ことにより実施される、前記特許請求の範囲第１７項記
   載の免疫定量法。 ２０）（ａ）　標識量ジゴキシン抗体 （ｂ）　それに結合させたウアバインを有する固体用お
   、よび （Ｃ）　前記キットの使用指示 からなる液体試料中のジゴキ７ン量を測定するためのテ
   ストキット。