JPH0336510B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0336510B2 JPH0336510B2 JP60124554A JP12455485A JPH0336510B2 JP H0336510 B2 JPH0336510 B2 JP H0336510B2 JP 60124554 A JP60124554 A JP 60124554A JP 12455485 A JP12455485 A JP 12455485A JP H0336510 B2 JPH0336510 B2 JP H0336510B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biphenyl
- gene
- strain
- pseudomonas aeruginosa
- pmfb1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(イ) 本発明はビフエニル代謝機能を有する形質転
換微生物に関するものであつて、該微生物を用い
て化合物２−ハイドロキシン−６−オキソ−６
−フエニルヘキサ−２，４−ジエノイツクアシツ
ド及びその誘導体を製造せしめ病原菌として知ら
れている例えばスタフイロコツカス属などのグラ
ム陽性菌及び大腸菌などのグラム陰性菌に対する
殺菌剤や生理活性物質等の中間体として用途が期
待されるものである。 (ロ) 従来の技術 従来、ビフエニルを資化する細菌については自
然界より数種類分離され、その代謝様式も検討さ
れているが、形質転換微生物については全く知ら
れていない。 そこで、本発明者らはビフエニル代謝機構に関
連する遺伝子についてかねてより研究を進めた結
果、シユウドモナス・シユウドアルカリゲネス由
来のビフエニル代謝機能に関与する遺伝子をとり
出すことに成功し、この外来遺伝子bph Ａ−Ｃ
をベクターに組みかえ増殖効率の優れた宿主微生
物にビフエニル代謝機能を持たせた形質転換微生
物、シユウドモナス・エルギノーサを創製するに
至つた。 (ハ) 発明の構成 外来遺伝子bph Ａ−Ｃの給源としては、ビフ
エニル代謝に関与する遺伝子を体内に保有する微
生物で、本発明者が自然界より分離したシユウド
モナス・シユウドアルカリゲネスKF707
（Pseudomonas PseudoalcaligenesKF707）
（FERM Ｐ−8297）を例示できる。 なお、本菌株の菌学的性質は以下のとおりであ
る。 〔菌学的性質〕 グラム 陰性 桿 菌 0.7×1.5〜2.0μ 極鞭毛 １本 色素産生 なし オキシダーゼ 陽性 スターチ加水分解 陰性 41℃での生育 陽性 最適生育温度 35℃ 質化性グルコース、こはく酸、乳酸、ピルビン酸 以上の菌学的性質からバージイーズ マニユア
ル オブ システイ マテイクバクテリオロジ
ー、第９版に基づき検索した結果、シユウドモナ
ス・シユウドアルカリゲネス（Pseudomonas・
Pseudoalcaligenes）と認められた。 次に、本菌株からの該遺伝子の切出しは、前記
菌株を例えばＬ培地（バクトトリプトン10ｇ、イ
ーストエキス５ｇ、食塩５ｇ、蒸溜水１）の一
晩増殖させリゾチーム−SDS法により溶菌し染色
体DNAを調製し次いで、染色体DNA（1μｇ）を
制限酵素Xhoで切断することにより、本遺伝子
を得ることができる。 本遺伝子の各種制限酵素による切断数は第１表
に示すとおりである。
換微生物に関するものであつて、該微生物を用い
て化合物２−ハイドロキシン−６−オキソ−６
−フエニルヘキサ−２，４−ジエノイツクアシツ
ド及びその誘導体を製造せしめ病原菌として知ら
れている例えばスタフイロコツカス属などのグラ
ム陽性菌及び大腸菌などのグラム陰性菌に対する
殺菌剤や生理活性物質等の中間体として用途が期
待されるものである。 (ロ) 従来の技術 従来、ビフエニルを資化する細菌については自
然界より数種類分離され、その代謝様式も検討さ
れているが、形質転換微生物については全く知ら
れていない。 そこで、本発明者らはビフエニル代謝機構に関
連する遺伝子についてかねてより研究を進めた結
果、シユウドモナス・シユウドアルカリゲネス由
来のビフエニル代謝機能に関与する遺伝子をとり
出すことに成功し、この外来遺伝子bph Ａ−Ｃ
をベクターに組みかえ増殖効率の優れた宿主微生
物にビフエニル代謝機能を持たせた形質転換微生
物、シユウドモナス・エルギノーサを創製するに
至つた。 (ハ) 発明の構成 外来遺伝子bph Ａ−Ｃの給源としては、ビフ
エニル代謝に関与する遺伝子を体内に保有する微
生物で、本発明者が自然界より分離したシユウド
モナス・シユウドアルカリゲネスKF707
（Pseudomonas PseudoalcaligenesKF707）
（FERM Ｐ−8297）を例示できる。 なお、本菌株の菌学的性質は以下のとおりであ
る。 〔菌学的性質〕 グラム 陰性 桿 菌 0.7×1.5〜2.0μ 極鞭毛 １本 色素産生 なし オキシダーゼ 陽性 スターチ加水分解 陰性 41℃での生育 陽性 最適生育温度 35℃ 質化性グルコース、こはく酸、乳酸、ピルビン酸 以上の菌学的性質からバージイーズ マニユア
ル オブ システイ マテイクバクテリオロジ
ー、第９版に基づき検索した結果、シユウドモナ
ス・シユウドアルカリゲネス（Pseudomonas・
Pseudoalcaligenes）と認められた。 次に、本菌株からの該遺伝子の切出しは、前記
菌株を例えばＬ培地（バクトトリプトン10ｇ、イ
ーストエキス５ｇ、食塩５ｇ、蒸溜水１）の一
晩増殖させリゾチーム−SDS法により溶菌し染色
体DNAを調製し次いで、染色体DNA（1μｇ）を
制限酵素Xhoで切断することにより、本遺伝子
を得ることができる。 本遺伝子の各種制限酵素による切断数は第１表
に示すとおりである。
【表】
また、本遺伝子の断片の制限酵素地図は第１図
に示されるとおりである。 次に、本遺伝子のビフエニル代謝様式と遺伝子
群との関係は次に示すとおりである。 上記反応式において、Ａ、Ｂ、Ｃは反応を司る
酵素を示し、Ａはビフエニル オキシゲナーゼＢ
はジヒドロキシジオール デヒドロゲナーゼＣは
フエニルカテコール オキシゲナーゼを各々示し
ている。 また、これらの酵素に対応する遺伝子として、
bphA、bphB、bphCが存在しこれらの遺伝子は
オペロンを形成している。またＰはプロモーター
を示す。 本遺伝子の利用にあたつては、例えば、大腸菌
エシエリヒア・コリKF637（Escherichia coli
KF637）（FERM Ｐ−8296）由来のpKF330を常
法により該菌株より取り出した後、制限酵素Xho
で切断後T4リガーゼで結合させ組換えプラス
ミドpMFB1そ構築する（第３図）。 なお、pKF330は第２図に示すようにカナマイ
シン耐性とストレプトマイシン耐性を有する
12.6kbのプラスミドである。カナマイシン耐性遺
伝子部位にはXhoなどの挿入失活部位を有して
おり、またカナマイシンのプロモーターを利用で
きる。 次に宿主株としてシユウドモナス・エルギノー
サKF204（Pseudomonas aeruginosa KF204
（FERM Ｐ−8295）が利用される。形質転換方
法及び形質転換体の選択にあたつては、該菌株の
対数増殖期（５×108細胞／ml）まで培養し、集
菌、洗浄後、冷バツフアー（10ｍＭ MOPS−
10ｍＭ RbCl−100ｍＭ MgCl2、PH7.0）に懸
濁し、次いで遠心後、冷バツフアー（100ｍＭ
MOPS−10ｍＭ RbCl−100ｍＭ CaCl2、PH
6.5）に再懸濁し０℃、30分インキユベートする。
次に遠心後、菌株を1/10量の冷バツフアーに懸
濁する。この0.2mlコンピテントセルに組換えプ
ラスミド（0.5μｇ）に加え０℃にて１時間インキ
ユベート後42℃で２分間ヒートシヨツクする。３
mlのＬ培地を加え、30℃で３時間インキユベート
した後ストレプトマイシン（200μｇ／ml）を含
むＬ−寒天培地上で組換えプラスミドを保有する
形質転換体を一次スクリーニングする。ビフエニ
ル遺伝子を保有する目的とする形質転換体（組換
え微生物）は２，３−ジヒドロキシビフエニル溶
液（１mg／ml）を一次スクリーニングで生じたコ
ロニーに噴霧することにより黄変するコロニーを
選択する。ビフエニル代謝遺伝子を含むクローン
はビフエニル及びビフエニル関連化合物より黄色
物質を蓄積させ確認後、黄色物質を酸性下（PH１
〜２）で酢酸エチルで抽出後、トリメチルシリル
化してGC−MSによる分析を行いこれが化合物
（図４）及びその誘導体であることを確認す
る。 (ニ) 実施例 実施例 １ ビフエニル資化性菌シユウドモナス・シユウド
アルカリゲネスKF707株（FERM Ｐ−8297）を
Ｌ培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、0.1Mトリ
ス（PH7.9）１ｍＭ EDTAバツフアーに懸濁し、
リゾチーム（最終濃度2μｇ／ml）を加え、室温
で５分間インキユベートし、次に10％SDSを50μ
／mlになるように加え溶菌した。次いでプロナ
ーゼ、RNase処理をしたのちフエノール抽出を
行い、エーテルでフエノールを除去した。このよ
うにして調製したDNAは10ｍＭトリス、１ｍＭ
EDTAバツフアーに透析した。 一方、プラスミドpKF330を有するエシエリヒ
ア・コリKF637（FERM Ｐ−8296）をＬ培地で
一晩培養し、アルカリ−SDS法によりpKF330を
調製した。染色体DNA及びプラスミドpKF330
を制限酵素Xhoで切断後、T4−リガーゼで連
結した。次いで組換えプラスミドを宿主株である
シユウドモナス・エルギノーサKF204（FERM
Ｐ−8295）に導入した。すなわち、対数増殖期
（約４×108セル／ml）のKF204株を集菌し、等量
の冷バツフアー（10ｍＭ MOPS、10ｍＭ
RbCl、100ｍＭ MgCl2、PH7.0）で洗浄後、冷
バツフアー（100ｍＭ MOPS、10ｍＭ
RbCl、100ｍＭ CaCl2、PH6.5）に再懸濁し、０
℃にて30分間放置した。次に遠心後、1/10量の冷
バツフアーに再懸濁し、その0.2ml細胞懸濁液
と精製したpMFB1（0.5μｇ）と０℃、１時間イン
キユベートした。42℃で２分間、ヒートシヨツク
した後、３mlのＬ培地を加え30℃で３時間培養し
た。ビフエニル代謝遺伝子群（bph Ａ−Ｃ）の
組込まれたpMFB1を保有する形質転換体はスト
レプトマイシン（200μｇ／ml）を含むＬ−寒天
培地で２，３−ヒドロキシビフエニル溶液（１
mg／ml）を噴霧して黄色となるコロニーとして選
択した。次いで形質転換体ストレプトマイシン
200μｇ／mlを含むＬ培地で一晩培養後、常法に
よりプラスミドを調製した。次いで調製したプラ
スミドpMFB1をXhoIで切断すると7.9kbのbph
Ａ−Ｃ遺伝子が切り出された。本遺伝子は第１図
に示す制限酵素切断点を有していた。 実施例 ２ 実施例１により得られたpMFB1を保有するシ
ユウドモナス・エルギノーサKF257を炭素源とし
てこはく酸（１mg／ml）を含むBSM寒天培地に
塗布（摂種））しビフエニル粉末をペトリ皿のふ
たにおいてビニールテープでシールした。KF257
株の増殖とともにビフエニル蒸気をとり込んだ菌
体は、ビフエニルを化合物に変化せしめ、培地
は鮮やかに黄変した。 上記の反応はpMFB1を保有しない宿主株シユ
ウドモナス・エルギノーサKF204（FERM Ｐ−
8295）では全く認められなかつた。 なお、宿主株及びpMFB1を保有するKF257に
ついて グラム染色 陰性 鞭 毛 １ ピオシアニン 生成 螢光色素 生成 至適生育温度 37℃ オキシダーゼ ＋ GC含量 67％ でんぷん加水分解 − 以上の性質等によりKF257株はシユウドモナ
ス・エルギノーサであることを確認した。 (ホ) 発明の効果 ビフエニル代謝機能を有する外来遺伝子bph
Ａ−Ｃを増殖効率の優れた微生物に組換え、形質
転換微生物を用いて、化合物２−ハイドロキシ
−６−オキソ−６−フエニルヘキサ−２，４−ジ
エノイツクアシツド及びその誘導体を安価に製造
することが可能となる。
に示されるとおりである。 次に、本遺伝子のビフエニル代謝様式と遺伝子
群との関係は次に示すとおりである。 上記反応式において、Ａ、Ｂ、Ｃは反応を司る
酵素を示し、Ａはビフエニル オキシゲナーゼＢ
はジヒドロキシジオール デヒドロゲナーゼＣは
フエニルカテコール オキシゲナーゼを各々示し
ている。 また、これらの酵素に対応する遺伝子として、
bphA、bphB、bphCが存在しこれらの遺伝子は
オペロンを形成している。またＰはプロモーター
を示す。 本遺伝子の利用にあたつては、例えば、大腸菌
エシエリヒア・コリKF637（Escherichia coli
KF637）（FERM Ｐ−8296）由来のpKF330を常
法により該菌株より取り出した後、制限酵素Xho
で切断後T4リガーゼで結合させ組換えプラス
ミドpMFB1そ構築する（第３図）。 なお、pKF330は第２図に示すようにカナマイ
シン耐性とストレプトマイシン耐性を有する
12.6kbのプラスミドである。カナマイシン耐性遺
伝子部位にはXhoなどの挿入失活部位を有して
おり、またカナマイシンのプロモーターを利用で
きる。 次に宿主株としてシユウドモナス・エルギノー
サKF204（Pseudomonas aeruginosa KF204
（FERM Ｐ−8295）が利用される。形質転換方
法及び形質転換体の選択にあたつては、該菌株の
対数増殖期（５×108細胞／ml）まで培養し、集
菌、洗浄後、冷バツフアー（10ｍＭ MOPS−
10ｍＭ RbCl−100ｍＭ MgCl2、PH7.0）に懸
濁し、次いで遠心後、冷バツフアー（100ｍＭ
MOPS−10ｍＭ RbCl−100ｍＭ CaCl2、PH
6.5）に再懸濁し０℃、30分インキユベートする。
次に遠心後、菌株を1/10量の冷バツフアーに懸
濁する。この0.2mlコンピテントセルに組換えプ
ラスミド（0.5μｇ）に加え０℃にて１時間インキ
ユベート後42℃で２分間ヒートシヨツクする。３
mlのＬ培地を加え、30℃で３時間インキユベート
した後ストレプトマイシン（200μｇ／ml）を含
むＬ−寒天培地上で組換えプラスミドを保有する
形質転換体を一次スクリーニングする。ビフエニ
ル遺伝子を保有する目的とする形質転換体（組換
え微生物）は２，３−ジヒドロキシビフエニル溶
液（１mg／ml）を一次スクリーニングで生じたコ
ロニーに噴霧することにより黄変するコロニーを
選択する。ビフエニル代謝遺伝子を含むクローン
はビフエニル及びビフエニル関連化合物より黄色
物質を蓄積させ確認後、黄色物質を酸性下（PH１
〜２）で酢酸エチルで抽出後、トリメチルシリル
化してGC−MSによる分析を行いこれが化合物
（図４）及びその誘導体であることを確認す
る。 (ニ) 実施例 実施例 １ ビフエニル資化性菌シユウドモナス・シユウド
アルカリゲネスKF707株（FERM Ｐ−8297）を
Ｌ培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、0.1Mトリ
ス（PH7.9）１ｍＭ EDTAバツフアーに懸濁し、
リゾチーム（最終濃度2μｇ／ml）を加え、室温
で５分間インキユベートし、次に10％SDSを50μ
／mlになるように加え溶菌した。次いでプロナ
ーゼ、RNase処理をしたのちフエノール抽出を
行い、エーテルでフエノールを除去した。このよ
うにして調製したDNAは10ｍＭトリス、１ｍＭ
EDTAバツフアーに透析した。 一方、プラスミドpKF330を有するエシエリヒ
ア・コリKF637（FERM Ｐ−8296）をＬ培地で
一晩培養し、アルカリ−SDS法によりpKF330を
調製した。染色体DNA及びプラスミドpKF330
を制限酵素Xhoで切断後、T4−リガーゼで連
結した。次いで組換えプラスミドを宿主株である
シユウドモナス・エルギノーサKF204（FERM
Ｐ−8295）に導入した。すなわち、対数増殖期
（約４×108セル／ml）のKF204株を集菌し、等量
の冷バツフアー（10ｍＭ MOPS、10ｍＭ
RbCl、100ｍＭ MgCl2、PH7.0）で洗浄後、冷
バツフアー（100ｍＭ MOPS、10ｍＭ
RbCl、100ｍＭ CaCl2、PH6.5）に再懸濁し、０
℃にて30分間放置した。次に遠心後、1/10量の冷
バツフアーに再懸濁し、その0.2ml細胞懸濁液
と精製したpMFB1（0.5μｇ）と０℃、１時間イン
キユベートした。42℃で２分間、ヒートシヨツク
した後、３mlのＬ培地を加え30℃で３時間培養し
た。ビフエニル代謝遺伝子群（bph Ａ−Ｃ）の
組込まれたpMFB1を保有する形質転換体はスト
レプトマイシン（200μｇ／ml）を含むＬ−寒天
培地で２，３−ヒドロキシビフエニル溶液（１
mg／ml）を噴霧して黄色となるコロニーとして選
択した。次いで形質転換体ストレプトマイシン
200μｇ／mlを含むＬ培地で一晩培養後、常法に
よりプラスミドを調製した。次いで調製したプラ
スミドpMFB1をXhoIで切断すると7.9kbのbph
Ａ−Ｃ遺伝子が切り出された。本遺伝子は第１図
に示す制限酵素切断点を有していた。 実施例 ２ 実施例１により得られたpMFB1を保有するシ
ユウドモナス・エルギノーサKF257を炭素源とし
てこはく酸（１mg／ml）を含むBSM寒天培地に
塗布（摂種））しビフエニル粉末をペトリ皿のふ
たにおいてビニールテープでシールした。KF257
株の増殖とともにビフエニル蒸気をとり込んだ菌
体は、ビフエニルを化合物に変化せしめ、培地
は鮮やかに黄変した。 上記の反応はpMFB1を保有しない宿主株シユ
ウドモナス・エルギノーサKF204（FERM Ｐ−
8295）では全く認められなかつた。 なお、宿主株及びpMFB1を保有するKF257に
ついて グラム染色 陰性 鞭 毛 １ ピオシアニン 生成 螢光色素 生成 至適生育温度 37℃ オキシダーゼ ＋ GC含量 67％ でんぷん加水分解 − 以上の性質等によりKF257株はシユウドモナ
ス・エルギノーサであることを確認した。 (ホ) 発明の効果 ビフエニル代謝機能を有する外来遺伝子bph
Ａ−Ｃを増殖効率の優れた微生物に組換え、形質
転換微生物を用いて、化合物２−ハイドロキシ
−６−オキソ−６−フエニルヘキサ−２，４−ジ
エノイツクアシツド及びその誘導体を安価に製造
することが可能となる。
第１図は外来遺伝子bph Ａ−Ｃの制限酵素切
断地図を示す。第２図はエシエリヒヤ・コリ由来
のプラスミドpKF330の構造を示す。第３図は組
換えプラスミドpMFB1の作製手順とその構造を
示す。
断地図を示す。第２図はエシエリヒヤ・コリ由来
のプラスミドpKF330の構造を示す。第３図は組
換えプラスミドpMFB1の作製手順とその構造を
示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ シユウドモナス・シユウドアルカリゲネス由
来のビフエニル代謝機能を有する外来遺伝子であ
つて、分子量が7.9キロベースであり、次の制限
酵素において塩基の切断数が特徴づけられる外来
遺伝子 を、エシエリヒア・コリ由来のベクターpKF330
に組換え、組換えられたプラスミドpMFB1を宿
主微生物シユウドモナス・エルギノーサに形質転
換したビフエニル代謝機能を備えたことを特徴と
する形質転換微生物シユウドモナス・エルギノー
サKF257株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124554A JPS61282069A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124554A JPS61282069A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282069A JPS61282069A (ja) | 1986-12-12 |
| JPH0336510B2 true JPH0336510B2 (ja) | 1991-05-31 |
Family
ID=14888350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60124554A Granted JPS61282069A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61282069A (ja) |
-
1985
- 1985-06-08 JP JP60124554A patent/JPS61282069A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61282069A (ja) | 1986-12-12 |
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