JPS61282069A - ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株 - Google Patents
ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株Info
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- JPS61282069A JPS61282069A JP60124554A JP12455485A JPS61282069A JP S61282069 A JPS61282069 A JP S61282069A JP 60124554 A JP60124554 A JP 60124554A JP 12455485 A JP12455485 A JP 12455485A JP S61282069 A JPS61282069 A JP S61282069A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）本発明はビフェニル代謝機能を有する形質転換微
生物に関するものであって、該微生物を用いて化合物■
２−ハイドロキシン−６−オキソ−６−フェニルヘキサ
−２，４−ジェノインクアシッド及びその誘導体を製造
せしめ病源菌として知られている例えばスタフィロコッ
カス属などのダラム陽性菌及び大腸菌などのダラム陰性
菌に対する殺菌剤や生理活性物質等の中間体として用途
が期待されるものである。
生物に関するものであって、該微生物を用いて化合物■
２−ハイドロキシン−６−オキソ−６−フェニルヘキサ
−２，４−ジェノインクアシッド及びその誘導体を製造
せしめ病源菌として知られている例えばスタフィロコッ
カス属などのダラム陽性菌及び大腸菌などのダラム陰性
菌に対する殺菌剤や生理活性物質等の中間体として用途
が期待されるものである。
（ロ）従来の技術
：従来、ビフェニルを資化する細菌については自然界よ
り数種類分離され、その代謝様式も検討されているが、
形質転換微生物については： 。
り数種類分離され、その代謝様式も検討されているが、
形質転換微生物については： 。
全く知られていない。
成功し、この外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃをベクターに
組みかえ増殖効率の優れた宿主微生物にビフェニル代謝
機能を持たせた形質転換微生物、シュウトモナス・エル
ギノーザを創製するに至った。
組みかえ増殖効率の優れた宿主微生物にビフェニル代謝
機能を持たせた形質転換微生物、シュウトモナス・エル
ギノーザを創製するに至った。
（ハ）発明の構成
外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃの給源としては、ビフェニ
ル代謝に関与する遺伝子を体内に保有する微生物で、本
発明者が自然界より分離したシュウドモナス・シュウド
アルカリゲネスＫＦ７０７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｔｇｅｎｅｓＫＦ７０７）
（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９７）を例示できる。
ル代謝に関与する遺伝子を体内に保有する微生物で、本
発明者が自然界より分離したシュウドモナス・シュウド
アルカリゲネスＫＦ７０７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ＰｓｅｕｄｏａｌｃａｌｔｇｅｎｅｓＫＦ７０７）
（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９７）を例示できる。
なお、本菌株の菌学的性質は以下のとおりである。
ダラム 陰性
桿菌 ０．７Ｘ１．５〜２．０μ極鞭毛
１本 色素産生 なし 、オキシダーゼ 陽性 βタニチ加水分解 陰性 ４１℃での生育 陽性 最適生育温度 ３５℃ 資化性 グルコース、こはく酸、乳酸、
ピルビン酸以上の菌学的性質からバージイーズ マニュ
アル オプ システィマティクバクテリオロジー 第９
版に基づき検索した結果、シュウドモナス・シュウドア
ルカリゲネス（Ｐｓ−ｅｕｄｏｍｏｎａｓ−Ｐｓｅｕｄ
ｏａ ｌｃａ １ ｉｇｅｎｅｓ）と認められた。
１本 色素産生 なし 、オキシダーゼ 陽性 βタニチ加水分解 陰性 ４１℃での生育 陽性 最適生育温度 ３５℃ 資化性 グルコース、こはく酸、乳酸、
ピルビン酸以上の菌学的性質からバージイーズ マニュ
アル オプ システィマティクバクテリオロジー 第９
版に基づき検索した結果、シュウドモナス・シュウドア
ルカリゲネス（Ｐｓ−ｅｕｄｏｍｏｎａｓ−Ｐｓｅｕｄ
ｏａ ｌｃａ １ ｉｇｅｎｅｓ）と認められた。
次に、本菌株からの該遺伝子の切出しは、前記菌株を例
えばＬ培地（バタトトリブトン１０ｇ、イーストエキス
５ｇ１食塩５ｇ、蒸溜水ＩＪ）に−晩増殖させリゾチー
ム−３ＤＳ法により溶菌し染色体ＤＮＡを調製し次いで
、染色体ＤＮＡ （１μｇ）を制限酵素Ｘｈｏｌ”９切
断することにより、本遺伝子を得ることができる。
えばＬ培地（バタトトリブトン１０ｇ、イーストエキス
５ｇ１食塩５ｇ、蒸溜水ＩＪ）に−晩増殖させリゾチー
ム−３ＤＳ法により溶菌し染色体ＤＮＡを調製し次いで
、染色体ＤＮＡ （１μｇ）を制限酵素Ｘｈｏｌ”９切
断することにより、本遺伝子を得ることができる。
本遺伝子の各種制限酵素による切断数は第１表に示すと
おりである。
おりである。
第１表
また、本遺伝子の断片の制限酵素地図は第１図に示され
るとおりである。
るとおりである。
次に、本遺伝子のビフェニル代謝様式と遺伝子群との関
係は次に示すとおりである。
係は次に示すとおりである。
Ｉ ＩＩ ＩＩＩ
ＩＶ−１＋１ 上記反応式において、Ａ、Ｂ、Ｃは反応を司る酵素を示
し、Ａはビフェニル オキシゲナーゼＢはジヒドロキシ
ジオール デヒドロゲナーゼＣはフェニルカテコール
オキシゲナーゼを各々示している。
ＩＶ−１＋１ 上記反応式において、Ａ、Ｂ、Ｃは反応を司る酵素を示
し、Ａはビフェニル オキシゲナーゼＢはジヒドロキシ
ジオール デヒドロゲナーゼＣはフェニルカテコール
オキシゲナーゼを各々示している。
また、これらの酵素に対応する遺伝子として、ｂｐｈＡ
、ｂｐｈＢ。
、ｂｐｈＢ。
ｂｐｈＣが存在しこれらの遺伝子はオペロンを形成して
いる。またＰはプロモーターを示す。
いる。またＰはプロモーターを示す。
本遺伝子の利用にあたっては、例えば、大腸菌エシェリ
ヒア・コリＫＦ６３７ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｔ ＫＦ６３７）（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９６
）由来のｐＫＦ３３０を常法により該菌株より取り出し
た後、制限酵素Ｘｈｏｌで切断後Ｔ４リガーゼで結合さ
せ組換えプラスミドｐＭＦＢ１を構築する（第３図）。
ヒア・コリＫＦ６３７ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｔ ＫＦ６３７）（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９６
）由来のｐＫＦ３３０を常法により該菌株より取り出し
た後、制限酵素Ｘｈｏｌで切断後Ｔ４リガーゼで結合さ
せ組換えプラスミドｐＭＦＢ１を構築する（第３図）。
なお、ｐＫＦ３３０は第２図に示すようにカナマイシン
耐性とストＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ ＫＦ２０４（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９５）が
利用される。形質転換方法及び形質転換体の選択にあた
っては、該菌株の対数増殖期（５ｘＨｓ細胞／ｍ１）ま
で培養し、集菌、洗浄後、冷バッファー（１０ｍＭ
ＭＯＰＳ−１’ＯｍＭ ＲｂＣｊ！−１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｔ、 ｐＨ７，０）に懸濁し、次いで遠心後、冷バ
ッファー■（，１００ｍＭ ＭＯＰＳ−１０ｍＭ
ＲｂＣ１−１００ｍＭ ＣａＣｌ１ｔ、ｐＨ６，５）
に再懸濁しθ℃、３０分インキエベートする０次に遠心
後、菌株を１７１０量の冷バフファー■に懸濁する。こ
の０．２ｍｆｆ１コンピテントセルに組換えプラスミド
（０，５μｇ）を加え０℃にて１時間インキエベートａ
で２分間ヒートショックする。３ｍｊ！のし培地を加え
、３０℃で３時間インキュベートした後ストレプトマイ
シン（２００μｇ／ｍｌ）を含むし一寒天培地上で組換
えプラスミドを保有する形質転換体を一次スクリーニン
グする。ビフェニル遺伝子を保有する目的とする形質転
換体（組換え微生物）は２，３−ジヒドロキシビフェニ
ル溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を−次スクリーニングで生じた
コロニーに噴霧することにより黄変するコロニーを選択
する。ビフェニル代謝遺伝子を含むクローンはビフェニ
ル及びビフェニル関連化合物より黄色物質を蓄積させ確
認後、黄色物質を酸性下（ｐＨ１〜２）で酢酸エチルで
抽出後、トリメチルシリル化してＧＣ−ＭＳによる分析
を行いこれが化合物■（図４）及びその誘導体であるこ
とを確認する。
耐性とストＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａ ＫＦ２０４（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９５）が
利用される。形質転換方法及び形質転換体の選択にあた
っては、該菌株の対数増殖期（５ｘＨｓ細胞／ｍ１）ま
で培養し、集菌、洗浄後、冷バッファー（１０ｍＭ
ＭＯＰＳ−１’ＯｍＭ ＲｂＣｊ！−１００ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｔ、 ｐＨ７，０）に懸濁し、次いで遠心後、冷バ
ッファー■（，１００ｍＭ ＭＯＰＳ−１０ｍＭ
ＲｂＣ１−１００ｍＭ ＣａＣｌ１ｔ、ｐＨ６，５）
に再懸濁しθ℃、３０分インキエベートする０次に遠心
後、菌株を１７１０量の冷バフファー■に懸濁する。こ
の０．２ｍｆｆ１コンピテントセルに組換えプラスミド
（０，５μｇ）を加え０℃にて１時間インキエベートａ
で２分間ヒートショックする。３ｍｊ！のし培地を加え
、３０℃で３時間インキュベートした後ストレプトマイ
シン（２００μｇ／ｍｌ）を含むし一寒天培地上で組換
えプラスミドを保有する形質転換体を一次スクリーニン
グする。ビフェニル遺伝子を保有する目的とする形質転
換体（組換え微生物）は２，３−ジヒドロキシビフェニ
ル溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を−次スクリーニングで生じた
コロニーに噴霧することにより黄変するコロニーを選択
する。ビフェニル代謝遺伝子を含むクローンはビフェニ
ル及びビフェニル関連化合物より黄色物質を蓄積させ確
認後、黄色物質を酸性下（ｐＨ１〜２）で酢酸エチルで
抽出後、トリメチルシリル化してＧＣ−ＭＳによる分析
を行いこれが化合物■（図４）及びその誘導体であるこ
とを確認する。
（ニ）実施例
実施例」
ビフェニル資化性菌シュウドモナス・シュウドアルカリ
ゲネスＫＦ７０７株（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９７）をＬ
培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、Ｏ，ＬＭ）リスＣｐ
Ｈ１，９）１ｍＭ ＥＤＴＡバッファーに懸濁し、リ
ゾチーム（最終濃度２μｇ／ｍｌを加え、室温で５分間
インキエベートし、次に１０％ＳＤＳを５０μｊｌ ／
ｍ Ｊになるように加え溶菌した０次いでプロナーゼ
、ＲＮａｓ ｅ処理をしたのちフェノール抽出を行い、
エーテルでフェノールを除去した。このようにし一方、
プラスミドｐＫＦ３３０を有するエシェリヒア・コリＫ
Ｆ６３７（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９６）をＬ培地で一晩
培養し、アルカリ−３ＤＳ法によりｐＫＦ３３０を調製
した。染色体ＤＮＡ及びプラスミドｐＫＦ３３０を制限
酵素Ｘｈｏｌで切断後、Ｔ４−リガーゼで連結した０次
いで組換えプラスミドを宿主株であるシェウドモナス・
エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥＲＭ Ｐ−８２９５
）に導入した。すなわち、対数増殖期（約４Ｘ１０”セ
ル／ ｍ ｌ ）のＫＦ２０４株を集菌し、等量の冷バ
ッフｙ−（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＲｂＣ
ｊ！。
ゲネスＫＦ７０７株（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９７）をＬ
培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、Ｏ，ＬＭ）リスＣｐ
Ｈ１，９）１ｍＭ ＥＤＴＡバッファーに懸濁し、リ
ゾチーム（最終濃度２μｇ／ｍｌを加え、室温で５分間
インキエベートし、次に１０％ＳＤＳを５０μｊｌ ／
ｍ Ｊになるように加え溶菌した０次いでプロナーゼ
、ＲＮａｓ ｅ処理をしたのちフェノール抽出を行い、
エーテルでフェノールを除去した。このようにし一方、
プラスミドｐＫＦ３３０を有するエシェリヒア・コリＫ
Ｆ６３７（ＦＥＲＭ Ｐ−８２９６）をＬ培地で一晩
培養し、アルカリ−３ＤＳ法によりｐＫＦ３３０を調製
した。染色体ＤＮＡ及びプラスミドｐＫＦ３３０を制限
酵素Ｘｈｏｌで切断後、Ｔ４−リガーゼで連結した０次
いで組換えプラスミドを宿主株であるシェウドモナス・
エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥＲＭ Ｐ−８２９５
）に導入した。すなわち、対数増殖期（約４Ｘ１０”セ
ル／ ｍ ｌ ）のＫＦ２０４株を集菌し、等量の冷バ
ッフｙ−（１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＲｂＣ
ｊ！。
１００ｍＭ ＭｇＣｌ１ｚ、ｐＨ１，０）で洗浄後、
冷バッフｙ−ｎ（１００ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ
ＲｂＣｊ！、１００ｍＭ ＣａＣＪｔ。
冷バッフｙ−ｎ（１００ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ
ＲｂＣｊ！、１００ｍＭ ＣａＣＪｔ。
ｐＨ６，５）に再懸濁し、０℃にて３０分間放置した０
次に遠心後、１／１０量の冷バッファーＨに再Ｑｉし、
その９． ２ｍｌ！細胞懸濁液゛と精製したｐＭＦＢｌ
（０，５μｇ）と０℃、１時間インキュベートした。４
２℃で２分間、ヒートシラツクした後、３ｍｊ！のし培
地を加え３０℃で３時間培養した。ビフェニル代謝遺伝
子群（ｂｐｈＡ−Ｃ）の組込まれたｐＭＦＢｌを保有す
る形質転換体はストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ
）を含むし一寒天培地で２．３−ヒドロキシビフェニ
ル溶液（１ｍｇ／ｍｌ ）を噴霧して黄色となるコロニ
ーとしで調製したプラスミドｐＭＦＢ１をＸｈｏｌで切
断すると７．９ｋｂ炭素源としてこはく酸（１ｍｇ／ｍ
Ａ ）を含む８３Ｍ寒天培地に塗布（摂種）しビフェニ
ル粉末をベトリ皿のふたにおいてビニールテープでシー
ルした。ＫＦ２５７株の増殖とともにビフェニル蒸気を
とり込んだ菌体は、ビフェニルを化合物■に変化せしめ
、培地は鮮やかに黄変した。
次に遠心後、１／１０量の冷バッファーＨに再Ｑｉし、
その９． ２ｍｌ！細胞懸濁液゛と精製したｐＭＦＢｌ
（０，５μｇ）と０℃、１時間インキュベートした。４
２℃で２分間、ヒートシラツクした後、３ｍｊ！のし培
地を加え３０℃で３時間培養した。ビフェニル代謝遺伝
子群（ｂｐｈＡ−Ｃ）の組込まれたｐＭＦＢｌを保有す
る形質転換体はストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ
）を含むし一寒天培地で２．３−ヒドロキシビフェニ
ル溶液（１ｍｇ／ｍｌ ）を噴霧して黄色となるコロニ
ーとしで調製したプラスミドｐＭＦＢ１をＸｈｏｌで切
断すると７．９ｋｂ炭素源としてこはく酸（１ｍｇ／ｍ
Ａ ）を含む８３Ｍ寒天培地に塗布（摂種）しビフェニ
ル粉末をベトリ皿のふたにおいてビニールテープでシー
ルした。ＫＦ２５７株の増殖とともにビフェニル蒸気を
とり込んだ菌体は、ビフェニルを化合物■に変化せしめ
、培地は鮮やかに黄変した。
上記の反応はｐＭＦＢｌを保有しない宿主株シュウトモ
ナス・エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥＲＭ Ｐ−８
２９５）では全く認められなグラム染色 陰
性 鞭毛 １ ビオシアニン 生成 螢光色素 生成 至適生育温度 ３７℃ オキシダーゼ ＋ ＧＣ含量 ６７％ でんぷん加水分解 − 以上の性質等によりＫＦ２５Ｔ株はシェウドモナス・エ
ルギノーザであることを確認した。
ナス・エルギノーザＫＦ２０４ （ＦＥＲＭ Ｐ−８
２９５）では全く認められなグラム染色 陰
性 鞭毛 １ ビオシアニン 生成 螢光色素 生成 至適生育温度 ３７℃ オキシダーゼ ＋ ＧＣ含量 ６７％ でんぷん加水分解 − 以上の性質等によりＫＦ２５Ｔ株はシェウドモナス・エ
ルギノーザであることを確認した。
（ホ）発明の効果
ビフェニル代謝機能を存する外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−
Ｃを増殖効率の優れた微生物に組換え、形質転換微生物
を用いて、化合物■２−ハイドロキシ−６−オキソ−６
−フェニルヘキサ−２，４−ジエノイックアシンド及び
その誘導体を安価に製造することが可能となる。
Ｃを増殖効率の優れた微生物に組換え、形質転換微生物
を用いて、化合物■２−ハイドロキシ−６−オキソ−６
−フェニルヘキサ−２，４−ジエノイックアシンド及び
その誘導体を安価に製造することが可能となる。
第１図は外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃの制限酵素切断地
図を示す。 第２図はエシェリヒア・コリ由来のプラスミドｐＫＦ３
３０の構造を示す。 第３図は組換えプラスミドｐＭＦＢ１の作製手順とその
構造を示す。
図を示す。 第２図はエシェリヒア・コリ由来のプラスミドｐＫＦ３
３０の構造を示す。 第３図は組換えプラスミドｐＭＦＢ１の作製手順とその
構造を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 シュウドモナス・シュウドアルカリゲネス由来のビフェ
ニル代謝機能を有する外来遺伝子であって、分子量が７
．９キロベースであり、次の制限酵素において塩基の切
断数が特徴づけられる外来遺伝子ｂｐｈ Ａ−Ｃ Ｐｓｔ I ，６個 ＢｇｌII，１ Ｘｈｏ I １ Ｅｃｏ I ，２ ＢａｍＨ I ，１ Ｘｂａ I ０ Ｓｍａ I ，１ Ｓａｃ I ，１ ＨｉｎｄIII ０ Ｓａｌ I ，０ Ｈｐａ I ，０ を、エシェリヒア・コリ由来のベクターｐＫＦ３３０に
組換え、組換えられたプラスミドｐＭＦＢ１を宿主微生
物シュウドモナス・エルギノーサに形質転換しビフェニ
ル代謝機能を備えたことを特徴とする形質転換微生物シ
ュウドモナス・エルギノーサＫＦ２５７株
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124554A JPS61282069A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124554A JPS61282069A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282069A true JPS61282069A (ja) | 1986-12-12 |
| JPH0336510B2 JPH0336510B2 (ja) | 1991-05-31 |
Family
ID=14888350
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60124554A Granted JPS61282069A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフェニル代謝機能を備えた形質転換微生物シュウドモナス・エルギノ−サｋｆ２５７株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61282069A (ja) |
-
1985
- 1985-06-08 JP JP60124554A patent/JPS61282069A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0336510B2 (ja) | 1991-05-31 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |