JPH0342071B2 - - Google Patents
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- JPH0342071B2 JPH0342071B2 JP60124553A JP12455385A JPH0342071B2 JP H0342071 B2 JPH0342071 B2 JP H0342071B2 JP 60124553 A JP60124553 A JP 60124553A JP 12455385 A JP12455385 A JP 12455385A JP H0342071 B2 JPH0342071 B2 JP H0342071B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biphenyl
- strain
- gene
- pseudomonas
- pmfb1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(イ) 本発明はビフエニル代謝機能を有する形質転
換微生物に関するものであつて、該微生物を用
いて化合物２−ハイドロキシン−６−オキソ
−６−フエニルヘキサ−２，４−ジエノイツク
アシツド及びその誘導体を製造せしめ病源菌と
して知られている例えばスタフイロコツカス属
などのグラム陽性菌及び大腸菌などのグラム陰
性菌に対する殺菌剤や生理活性物質等の中間体
として用途が期待されるものである。 (ロ) 従来の技術 従来、ビフエニルを資化する細菌については自
然界より数種類分離され、その代謝様式も検討さ
れているが、形質転換微生物については全く知ら
れていない。 そこで、本発明者らはビフエニル代謝機構に関
連する遺伝子についてかねてより研究を進めた結
果、シユウドモナス・シユウドアルカリゲネス由
来のビフエニル代謝機能に関与する遺伝子をとり
出すことに成功し、この外来遺伝子bphA−Ｃを
ベクターに組みかえ増殖効率の優れた宿主微生物
にビフエニル代謝機能を持たせた形質転換微生
物、シユウドモナス・プチダを創製するに至つ
た。 (ハ) 発明の構成 外来遺伝子bphA−Ｃの給源としては、ビフエ
ニル代謝に関与する遺伝子を体内に保有する微生
物で、本発明者が自然界より分離したシユウドモ
ナス・シユウドアルカリゲネスKF707
（Pseudomonas Pseudoalcaligenes KF707
（FERM Ｐ−8297）を例示できる。 なお、本菌株の菌学的性質は以下のとおりであ
る。 〔菌学的性質〕 グラム 陰性 桿 菌 0.7×1.5〜2.0μ 極鞭毛 １本 色素産性 なし オキシダーゼ 陽性 スターチ加水分解 陰性 41℃での生育 陽性 最適生育温度 35℃ 資化性
グルコース、こはく酸、乳酸、ピルビン酸 以上の菌学的性質からバージイーズ マニユア
ル オブ システイマテイクバクテリオロジー第
９版に基づき検索した結果、シユウドモナス・シ
ユウドアルカリゲネス（Pseudomonas
Pseudoalcaligenes）と認められた。 次に、本菌株からの該遺伝子の切出しは、前記
菌株を例えばＬ培地（バクトトリプトン10ｇ、イ
ーストエキス５ｇ、食塩５ｇ、蒸溜水１）に一
晩増殖させリゾチーム−SDS法により溶菌し染色
体DNAを調製し次いで、染色体DNA（1μｇ）を
制限酵素XhoIで切断することにより、本遺伝子
を得ることができる。 本遺伝子の各種制限酵素による切断数は第１表
に示すとおりである。
換微生物に関するものであつて、該微生物を用
いて化合物２−ハイドロキシン−６−オキソ
−６−フエニルヘキサ−２，４−ジエノイツク
アシツド及びその誘導体を製造せしめ病源菌と
して知られている例えばスタフイロコツカス属
などのグラム陽性菌及び大腸菌などのグラム陰
性菌に対する殺菌剤や生理活性物質等の中間体
として用途が期待されるものである。 (ロ) 従来の技術 従来、ビフエニルを資化する細菌については自
然界より数種類分離され、その代謝様式も検討さ
れているが、形質転換微生物については全く知ら
れていない。 そこで、本発明者らはビフエニル代謝機構に関
連する遺伝子についてかねてより研究を進めた結
果、シユウドモナス・シユウドアルカリゲネス由
来のビフエニル代謝機能に関与する遺伝子をとり
出すことに成功し、この外来遺伝子bphA−Ｃを
ベクターに組みかえ増殖効率の優れた宿主微生物
にビフエニル代謝機能を持たせた形質転換微生
物、シユウドモナス・プチダを創製するに至つ
た。 (ハ) 発明の構成 外来遺伝子bphA−Ｃの給源としては、ビフエ
ニル代謝に関与する遺伝子を体内に保有する微生
物で、本発明者が自然界より分離したシユウドモ
ナス・シユウドアルカリゲネスKF707
（Pseudomonas Pseudoalcaligenes KF707
（FERM Ｐ−8297）を例示できる。 なお、本菌株の菌学的性質は以下のとおりであ
る。 〔菌学的性質〕 グラム 陰性 桿 菌 0.7×1.5〜2.0μ 極鞭毛 １本 色素産性 なし オキシダーゼ 陽性 スターチ加水分解 陰性 41℃での生育 陽性 最適生育温度 35℃ 資化性
グルコース、こはく酸、乳酸、ピルビン酸 以上の菌学的性質からバージイーズ マニユア
ル オブ システイマテイクバクテリオロジー第
９版に基づき検索した結果、シユウドモナス・シ
ユウドアルカリゲネス（Pseudomonas
Pseudoalcaligenes）と認められた。 次に、本菌株からの該遺伝子の切出しは、前記
菌株を例えばＬ培地（バクトトリプトン10ｇ、イ
ーストエキス５ｇ、食塩５ｇ、蒸溜水１）に一
晩増殖させリゾチーム−SDS法により溶菌し染色
体DNAを調製し次いで、染色体DNA（1μｇ）を
制限酵素XhoIで切断することにより、本遺伝子
を得ることができる。 本遺伝子の各種制限酵素による切断数は第１表
に示すとおりである。
【表】
また、本遺伝子の断片の制限酵素地図は第１図
に示されるとおりである。 次に、本遺伝子のビフエル代謝様式と遺伝子群
との関係は次に示すとおりである。 上記反応式において、Ａ，Ｂ，Ｃは反応を司る
酵素を示し、Ａはビフエニル オキシゲナーゼＢ
はジヒドロキシジオール デヒドロゲナーゼＣは
フエニルカテコール オキシゲナーゼを各々示し
ている。 また、これらの酵素に対応する遺伝子として、
bphA，bphB，bphCが存在しこれらの遺伝子は
オペロンを形成している。またＰはプロモーター
を示す。 本遺伝子の利用にあたつては、例えば、大腸菌
エシエリヒア・コリKF637（Escherichia coli
KF637）（FERM Ｐ−8296）由来のpKF330を常
法により該菌株より取り出した後、制限酵素
XhoIで切断後T4リガーゼで結合させ組換えプラ
スミドpMFB1を構築する（第３図）。 なお、pKF330は第２図に示すようにカナマイ
シン耐性とストレプトマイシン耐性を有する
12.6kbのプラスミドである。カナマイシン耐性遺
伝子部位にはXhoIなどの挿入失活部位を有して
おり、またカナマイシンのプロモーターを利用で
きる。 次に宿主株としてシユウドモナス・プチダ
KF107（Pseudomonas putida KF107（FERMP
−8294）が利用される。形質転換方法及び形質転
換体の選択にあたつては、該菌株の対数増殖期
（５×108 細胞／ml）まで倍養し、集菌、洗浄
後、冷バツフアー（10mM MOPS−10mM
RbCl−100mM MgCl−100mM MgCl2，PH7.0）
に懸濁し、次いで遠心後、冷バツフアー
（100mM MOPS−10mM RbCl−100mM
CaCl2，PH6.5）に再懸濁し０℃，30分インキユベ
ートする。次に遠心後、菌株を1/10量の冷バツフ
アーに懸濁する。この0.2mlコンピテントセル
に組換えプラスミド（0.5μｇ）を加え０℃にて１
時間インキユベート後42℃で２分間ヒートシヨツ
クする。３mlのＬ培地を加え、30℃で３時間イン
キユベートした後、ストレプトマイシン（200μ
ｇ／ml）を含むＬ−寒天培地上で組換えプラスミ
ドを保有する形質転換体を一次スクリーニングす
る。ビフエニル遺伝子を保有する目的とする形質
転換体（組換え微生物）は２，３−ジヒドロキシ
ビフエニル溶液（１mg／ml）を一次スクリーニン
グで生じたコロニーに噴霧することにより黄変す
るコロニーを選択する。ビフエニル代謝遺伝子を
含むクローンはビフエニル及びビフエニル関連化
合物より黄色物質を蓄積させ確認後、黄色物質を
酸性下（PH１〜２）で酢酸エチルで抽出後、トリ
メチルシリル化してGC−MSによる分析を行い
これが化合物（第４図）及びその誘導体である
ことを確認する。 (ニ) 実施例 実施例 １ ビフエニル資化性菌シユウドモナス・シユウド
アルカリゲネスKF707株（FERM Ｐ−8297）を
Ｌ培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、0.1Mトリ
ス（PH7.9）、1mM EDTAバツフアーに懸濁し、
リゾチーム（最終濃度2μｇ／ml）を加え、室温
で５分間インキユベートし、次に10％SDSを50μ
／mlになるように加え溶菌した。次いでプロナ
ーゼ、RNase処理をしたのちフエノール抽出を
行い、エーテルでフエノールを除去した。このよ
うにして調製したDNAは10mMトリス、1mM
EDTA バツフアーに透析した。 一方、プラスミドpKF330を有するエシエリヒ
ア・コリKF637（FERM Ｐ−8296）をＬ培地で
一晩培養し、アルカリ−SDS法によりpKF330を
調製した。染色体DNA及びプラスミドpKF330
を制限酵素XhoIで切断後、T4−リガーゼで連結
した。次いで組換えプラスミドを宿主株であるシ
ユウドモナス・エルギノーサKF107（FERM Ｐ
−8294）に導入した。すなわち、対数増殖期（約
４×108セル／ml）のKF107株を集菌し、等量の
冷バツフアー（10mM MOPS，10mM RbCl，
100mM MgCl2，PH7.0）で洗浄後、冷バツフア
ー（100mM MOPS，10mM RbCl，100mM
CaCl2，PH6.5）に再懸濁し、０℃にて30分間放置
した。次に遠心後、1/10量の冷バツフアーに再
懸濁し、その0.2ml細胞懸濁液と精製したpMFB1
（0.5μｇ）と０℃、１時間インキユベートした。
42℃で２分間、ヒートシヨツクした後、３mlのＬ
培地を加え30℃で３時間培養した。ビフエニル代
謝遺伝子群（bphA−Ｃ）の組込まれたpMFB1を
保有する形質転換体はストレプトマイシン
（200μｇ／ml）を含むＬ−寒天培地で２，３−ジ
ヒドロキシビフエニル溶液（１mg／ml）を噴霧し
て黄色となるコロニーとして選択した。次いで形
質転換体ストレプトマイシン200μｇ／mlを含む
Ｌ培地で一晩培養後、常法によりプラスミドを調
製した。次いで調製したプラスミドpMFB1を
XhoIで切断すると7.9kbのbph Ａ−Ｃ遺伝子が切
り出された。本遺伝子は第１図に示す制限酵素切
断点を有していた。 実施例 ２ 実施例１により得られたpMFB1を保有するシ
ユウドモナス・プチダKF138を炭素源としてこは
く酸（１mg／ml）を含むBSM寒天培地に塗布
（摂種）しビフエニル粉末をペトリ皿のふたにお
いてビニールテープでシールした。KF138株の増
殖とともにビフエニル蒸気をとり込んだ菌体は、
ビフエニルを化合物に変化せしめ、培地は鮮や
かに黄変した。 上記の反応はpMFB1を保有しない宿主株シユ
ウドモナス・プチダKF107（FERM Ｐ−8294）
では全く認められなかつた。 なお、宿主株及びpMFB1を保有するKF138に
ついて グラム染色 陰性 鞭 毛 ＞１ ピオシアニン 生成せず 螢光色素 生成 至適生育温度 25−30℃ オキシダーゼ ＋ GC含量 60％ でんぷん加水分解 ＋ 以上の性質等によりKF138株はシユウドモナ
ス・プチダであることを確認した。 (ホ) 発明の効果 ビフエニル代謝機能を有する外来遺伝子bphA
−Ｃを増殖効率の優れた微生物に組換え、形質転
換微生物を用いて、化合物２−ハイドロキシ−
６−オキソ−６−フエニルヘキサ−２，４−ジエ
ノイツクアシツド及びその誘導体を安価に製造す
ることが可能となる。
に示されるとおりである。 次に、本遺伝子のビフエル代謝様式と遺伝子群
との関係は次に示すとおりである。 上記反応式において、Ａ，Ｂ，Ｃは反応を司る
酵素を示し、Ａはビフエニル オキシゲナーゼＢ
はジヒドロキシジオール デヒドロゲナーゼＣは
フエニルカテコール オキシゲナーゼを各々示し
ている。 また、これらの酵素に対応する遺伝子として、
bphA，bphB，bphCが存在しこれらの遺伝子は
オペロンを形成している。またＰはプロモーター
を示す。 本遺伝子の利用にあたつては、例えば、大腸菌
エシエリヒア・コリKF637（Escherichia coli
KF637）（FERM Ｐ−8296）由来のpKF330を常
法により該菌株より取り出した後、制限酵素
XhoIで切断後T4リガーゼで結合させ組換えプラ
スミドpMFB1を構築する（第３図）。 なお、pKF330は第２図に示すようにカナマイ
シン耐性とストレプトマイシン耐性を有する
12.6kbのプラスミドである。カナマイシン耐性遺
伝子部位にはXhoIなどの挿入失活部位を有して
おり、またカナマイシンのプロモーターを利用で
きる。 次に宿主株としてシユウドモナス・プチダ
KF107（Pseudomonas putida KF107（FERMP
−8294）が利用される。形質転換方法及び形質転
換体の選択にあたつては、該菌株の対数増殖期
（５×108 細胞／ml）まで倍養し、集菌、洗浄
後、冷バツフアー（10mM MOPS−10mM
RbCl−100mM MgCl−100mM MgCl2，PH7.0）
に懸濁し、次いで遠心後、冷バツフアー
（100mM MOPS−10mM RbCl−100mM
CaCl2，PH6.5）に再懸濁し０℃，30分インキユベ
ートする。次に遠心後、菌株を1/10量の冷バツフ
アーに懸濁する。この0.2mlコンピテントセル
に組換えプラスミド（0.5μｇ）を加え０℃にて１
時間インキユベート後42℃で２分間ヒートシヨツ
クする。３mlのＬ培地を加え、30℃で３時間イン
キユベートした後、ストレプトマイシン（200μ
ｇ／ml）を含むＬ−寒天培地上で組換えプラスミ
ドを保有する形質転換体を一次スクリーニングす
る。ビフエニル遺伝子を保有する目的とする形質
転換体（組換え微生物）は２，３−ジヒドロキシ
ビフエニル溶液（１mg／ml）を一次スクリーニン
グで生じたコロニーに噴霧することにより黄変す
るコロニーを選択する。ビフエニル代謝遺伝子を
含むクローンはビフエニル及びビフエニル関連化
合物より黄色物質を蓄積させ確認後、黄色物質を
酸性下（PH１〜２）で酢酸エチルで抽出後、トリ
メチルシリル化してGC−MSによる分析を行い
これが化合物（第４図）及びその誘導体である
ことを確認する。 (ニ) 実施例 実施例 １ ビフエニル資化性菌シユウドモナス・シユウド
アルカリゲネスKF707株（FERM Ｐ−8297）を
Ｌ培地で一晩培養し、集菌、洗浄後、0.1Mトリ
ス（PH7.9）、1mM EDTAバツフアーに懸濁し、
リゾチーム（最終濃度2μｇ／ml）を加え、室温
で５分間インキユベートし、次に10％SDSを50μ
／mlになるように加え溶菌した。次いでプロナ
ーゼ、RNase処理をしたのちフエノール抽出を
行い、エーテルでフエノールを除去した。このよ
うにして調製したDNAは10mMトリス、1mM
EDTA バツフアーに透析した。 一方、プラスミドpKF330を有するエシエリヒ
ア・コリKF637（FERM Ｐ−8296）をＬ培地で
一晩培養し、アルカリ−SDS法によりpKF330を
調製した。染色体DNA及びプラスミドpKF330
を制限酵素XhoIで切断後、T4−リガーゼで連結
した。次いで組換えプラスミドを宿主株であるシ
ユウドモナス・エルギノーサKF107（FERM Ｐ
−8294）に導入した。すなわち、対数増殖期（約
４×108セル／ml）のKF107株を集菌し、等量の
冷バツフアー（10mM MOPS，10mM RbCl，
100mM MgCl2，PH7.0）で洗浄後、冷バツフア
ー（100mM MOPS，10mM RbCl，100mM
CaCl2，PH6.5）に再懸濁し、０℃にて30分間放置
した。次に遠心後、1/10量の冷バツフアーに再
懸濁し、その0.2ml細胞懸濁液と精製したpMFB1
（0.5μｇ）と０℃、１時間インキユベートした。
42℃で２分間、ヒートシヨツクした後、３mlのＬ
培地を加え30℃で３時間培養した。ビフエニル代
謝遺伝子群（bphA−Ｃ）の組込まれたpMFB1を
保有する形質転換体はストレプトマイシン
（200μｇ／ml）を含むＬ−寒天培地で２，３−ジ
ヒドロキシビフエニル溶液（１mg／ml）を噴霧し
て黄色となるコロニーとして選択した。次いで形
質転換体ストレプトマイシン200μｇ／mlを含む
Ｌ培地で一晩培養後、常法によりプラスミドを調
製した。次いで調製したプラスミドpMFB1を
XhoIで切断すると7.9kbのbph Ａ−Ｃ遺伝子が切
り出された。本遺伝子は第１図に示す制限酵素切
断点を有していた。 実施例 ２ 実施例１により得られたpMFB1を保有するシ
ユウドモナス・プチダKF138を炭素源としてこは
く酸（１mg／ml）を含むBSM寒天培地に塗布
（摂種）しビフエニル粉末をペトリ皿のふたにお
いてビニールテープでシールした。KF138株の増
殖とともにビフエニル蒸気をとり込んだ菌体は、
ビフエニルを化合物に変化せしめ、培地は鮮や
かに黄変した。 上記の反応はpMFB1を保有しない宿主株シユ
ウドモナス・プチダKF107（FERM Ｐ−8294）
では全く認められなかつた。 なお、宿主株及びpMFB1を保有するKF138に
ついて グラム染色 陰性 鞭 毛 ＞１ ピオシアニン 生成せず 螢光色素 生成 至適生育温度 25−30℃ オキシダーゼ ＋ GC含量 60％ でんぷん加水分解 ＋ 以上の性質等によりKF138株はシユウドモナ
ス・プチダであることを確認した。 (ホ) 発明の効果 ビフエニル代謝機能を有する外来遺伝子bphA
−Ｃを増殖効率の優れた微生物に組換え、形質転
換微生物を用いて、化合物２−ハイドロキシ−
６−オキソ−６−フエニルヘキサ−２，４−ジエ
ノイツクアシツド及びその誘導体を安価に製造す
ることが可能となる。
第１図は外来遺伝子bphA−Ｃの制限酵素切断
地図を示す。第２図はエシエリヒヤ・コリ由来の
プラスミドpKF330の構造を示す。第３図は組換
えプラスミドpMFB1の作製手順とその構造を示
す。
地図を示す。第２図はエシエリヒヤ・コリ由来の
プラスミドpKF330の構造を示す。第３図は組換
えプラスミドpMFB1の作製手順とその構造を示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ シユウドモナス・シユウドアルカリゲネス由
来のビフエニル代謝機能を有する外来遺伝子であ
つて、分子量が7.9キロベースであり、次の制限
酵素において塩基の切断数が特徴づけられる外来
遺伝子 を、エシエリヒア・コリ由来のベクタ−pKF330
に組換え、組換えられたプラスミドpMFB1を宿
主微生物シユウドモナス・プチダに形質転換した
ビフエニル代謝機能を備えたことを特徴とする形
質転換微生物シユウドモナス・プチダKF138株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124553A JPS61282068A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフエニル代謝機能を備えた形質転換微生物シユウドモナス・プチダｋｆ１３８株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60124553A JPS61282068A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフエニル代謝機能を備えた形質転換微生物シユウドモナス・プチダｋｆ１３８株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61282068A JPS61282068A (ja) | 1986-12-12 |
| JPH0342071B2 true JPH0342071B2 (ja) | 1991-06-26 |
Family
ID=14888325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60124553A Granted JPS61282068A (ja) | 1985-06-08 | 1985-06-08 | ビフエニル代謝機能を備えた形質転換微生物シユウドモナス・プチダｋｆ１３８株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61282068A (ja) |
-
1985
- 1985-06-08 JP JP60124553A patent/JPS61282068A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61282068A (ja) | 1986-12-12 |
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