PL162290B1

PL162290B1 - Sposób wytwarzania bialka wiazacego czynniki wzrostu podobne do insuliny PL PL

Info

Publication number: PL162290B1
Application number: PL89282257A
Authority: PL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1988-11-11
Filing date: 1989-11-10
Publication date: 1993-09-30
Also published as: HU895836D0; IL92257A0; PT92278A; PT92278B; NZ231333A; EP0369943B1; DK564989A; FI895346A7; AU623447B2; DE68918556D1; ZA898610B; EP0369943A1; HU895607D0; CA2002609A1; AU4453689A; DK564989D0; MY104673A; JPH0341096A; GB8826451D0; ATE112311T1

Abstract

1. Sposób wytwarzania bialka wiazacego czynniki wzrostu podobne do insuliny (IGF-BP), obejmujacego sekwencje aminokwasów, która wykazuje co najmniej 85% homologii z sek- wencja aminokwasów przedstawiona na fig. 2, i która zaczyna sie w pozycji 1 i konczy sie w pozycji 289, lub dowolny jej fragment zwiera- jacy wiecej niz 20 reszt aminokwasów, zna mienny tym, ze prowadzi sie hodowle linii komórkowej stransformowanej zrekombino- wanym fragmentem DNA zawierajacym sek- wencje nukleotydów kodujaca wymienione bialko IGF-BP. Figura 2 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka wiążącego czynniki wzrostu podobne do insuliny (IGF), znane także jako somatomedyny, które nadają się do użycia w różnych zastosowaniach terapeutycznych.

Czynniki IGF są hormonami polipeptydowymi o niskim ciężarze cząsteczkowym, które wykazują podobieństwo strukturalne do proinsuliny. Znane są dwa różne IGF, mianowicie IGF-I i IGF-II, które są mitogenne in vitro dla różnorodnych komórek w hodowli tkankowej. Obydwa IGF stymulują in vivo wzrost różnych tkanek, a zwłaszcza indukują syntezę kolagenu. IGF-I pośredniczy w działaniu promującym wzrost hormonu wzrostu w chondrogenezie i w tworzeniu się kości, ma zatem podstawowe znaczenie dla normalnego wzrostu osobnika. Dowodem tego jest fakt, że pigmeje i pudle miniaturowe wykazują niedobór IGF-I, ale mają normalny poziom hormonu wzrostu w surowicy. Natomiast uważa się, że IGF-II odgrywa kluczową rolę w rozwoju płodu i we wzroście nerwów.

Przypuszcza się, że obok głównego oddziaływania na tkankę kostną, IGF wykazują też działanie stymulujące wzrost innych tkanek. Wiadomo, że uszkodzone fibroblasty wytwarzają IGF, które skutecznie stymulują wzrost fibroblastów i syntezę kolagenu, białka strukturalnego, które zwykle jest potrzebne do gojenia się ran. Wskazane jest także unaczynienie zranionej tkanki. Dalej stwierdzono także, że IGF wykazują aktywność podobną do erytropoetyny w zakresie indukowania hematopoezy.

Ostatnie badania udowodniły także, że IGF wytworzone przez pewne komórki rakowe, np. komórki raka sutka i nerki autostymulują proliferację komórek rakowych i tkanek naczyniowych i włóknistych potrzebnych do podtrzymania wzrostu tkanek rakowych.

Ponadto, obydwa IGF wykazują zakres aktywności metabolicznych podobnych do aktywności insuliny, mianowicie, stymulują, zwłaszcza transport i metabolizm glikozy. Biologiczne działanie IGF i insuliny zachodzi poprzez ich wiązanie ze specyficznymi receptorami. Zwłaszcza, obydwa IGF mają zdolność do wiązania się z receptorem insuliny z powinowactwem w przybliżeniu 100 razy niższym niż insulina.

Stężenie obydwu IGF we krwi jest w przybliżeniu 100 razy wyższe niz insuliny. Ponieważ IGF wykazują aktywność podobną do insuliny, powinno to prowadzić zatem do hipoglikemii. Zapobiega temu mechanizm regulacyjny, który jest związany z występującym we krwi białkiem nośnikiem i umożliwia powstawanie kompleksu, który nie wykazuje aktywności insuliny. Przez połączenie ich z nośnikiem białkowym (określonym w opisie jako białka wiążące IGF lub IGF-BPs), zahamowane jest wiązanie się z ich komórkowymi powierzchniowymi receptorami.

162 290 3

Udowodniono także, że białka wiążące IGF zwiększają też krótki półokres życia IGF, które ulegają szybkiej proteolitycznej degradacji, gdy znajdują się we krwi w wolnej postaci.

Zgodnie z powyższym IGF mogą być użyteczne in vivo w celu stymulowania a/ wzrostu zwierząt i ludzi z niedoborem hormonu wzrostu, b/ regeneracji tkanki, takiej jak erytropoeza i chondrogeneza, c/ gojenie się ran i d/ działanie różnych organów, np. wątroby lub nerek. W związku z aktywnością pobudzającą chondrogenezę IGF są szczególnie odpowiednie do użycia w przypadkach tworzenia się kości, np. w leczeniu zrzeszotowienia kości. W tym przypadku IGF korzystnie podaje się pacjentowi w połączeniu z co najmniej jednym białkiem wiążącym IGF. Podawanie takiej kombinacji, a nie samych IGF, daje korzystny efekt, który polega na zapobieżeniu hipoglikemii, umożliwieniu mitogennego działania w miejscach iniekcji oraz przedłużeniu półokresu życia IGF. Dalej stwierdzono, że białka wiążące są także użyteczne w związku z potencjalnym działaniem IGF-I podobnym do działania erytropoetyny.

Gdy białka wiążące podawane są same, tzn, bez IGF, mogą być także terapeutycznie użyteczne w celu blokowania niekorzystnego działania IGF, takiego jak to, które występuje, gdy IGF są produkowane w nadmiarze, np. w przypadku, gdy wolne IGF są wydzielane przez pewne komórki rakowe, np. komórki raka wytwarzające hormony, takie jak komórki raka sutka lub nerki. Terapia polegająca na wiązaniu IGF może także zapobiegać ślepocie, która jest objawem wtórnym retinopatii cukrzycowej. Rzeczywiście wykazano, że IGF mogą być jednym z czynników stymulujących przerost śródbłonka i fibroblastów w retinopatii cukrzycowej.

Inne zastosowanie lecznicze polega na kontrolowaniu nadmiernego wzrostu u pacjentów z niedoborem białka wiążącego IGF, ponieważjest to bardzo prawdopodobne, że wysokie poziomy IGF w kombinacji z nienormalnie niskimi poziomami białka wiążącego są odpowiedzialne za nadmierny wzrost.

W ostatnich latach w surowicy gryzoni i ludzi wykryto co najmniej dwa główne gatunki białek wiążących IGF.

Duże białko wiążące jest glikoproteiną o wielkości około 150 kd i jest złożone z kilku podjednostek. Jego wytwarzanie, w przeciwieństwie do wytwarzania małego białka wiążącego, jest zależne od hormonu wzrostu.

Małe białko wiążące ma ciężar cząsteczkowy około 30-40 kd u ludzi i szczura. Ludzkie małe białko wiążące zostało już wydzielone i oczyszczone z różnych źródeł, obejmujących płyn owodniowy (G. Povoa i in., Eur. J. Biochem. (1984) 144:199 (nazwane także białkiem wiążącym płynu owodniowego)), łożysko (R. Koistenen i in. Endocrinology (1986) 118:1375) i kondycjonowana pożywka dla komórek hepatoma G2 (nowotworu wątroby G2) (D. R. Powell i in., J. Chromatogr. (1987) 420:163). Białka wiążące scharakteryzowano zawartością aminokwasów i N-końcową sekwencją aminokwasów i stwierdzono, że są one identyczne lub co najmniej bardzo podobne. Porównanie sekwencji aminokwasów białka wiążącego IGF, wydzielonego z komórek nowotworu wątroby G2 (Lee Y. L. i in., Mol. Endocrinol. (1988) 2 (5):404) i białka wiążącego IGF sklonowanego z wykorzystaniem biblioteki wykonanej na cDNA z łożyska (A. Brinkman i in., The EMBO Jurnal (1988)7 (8):2417) wykazuje 99% homologię. Ponadto, te dwie sekwencje aminokwasów w porównaniu z białkiem wiążącym IGF, kodowanym przez sekwencję cDN A sklonowaną z użyciem biblioteki wykonanej na cDNA z ludzkiej macicy, wykazują homologię 94% (Μ. T. Brewer i in., Bioch. Biophys. Res. Com. (1988) 152 (3):1289).

Oprócz tych dwóch głównych postaci białek wiążących IGF występujących w surowicy, zidentyfikowano kilka innych białek wiążących IGF w różnych ludzkich ekstraktach tkankowych i środowiskach hodowlanych komórek, stosując techniki plamkowe Westerna i znakowanie powinowactwa z użyciem [J¹²⁵]IGF. Ich ciężary cząsteczkowe są w zakresie od 15 do 150 kd i niektóre z tych białek powstają na drodze proteolitycznej degradacji większych białek wiążących IGF. Zwłaszcza białko wiążące IGF o wielkości 53 kd, które wydzielono z ludziej surowicy, stanowi podjednostkę białka wiążącego IGF o 150 kd (R. C. Baxter, Biochem, Biophys. Res. Com. (1986) 139 (3):1256).

Inną postać białka wiążącego IGF znaleziono także w kondycjonowanym podłożu z komórek szczura BRL-3A; białko to ma ciężar cząsteczkowy około 33-36 kd. Określono częściową sekwencję białka wiążącego szczura BRL-3A od końca aminowego (C. Mottola i in., J. of Biol. Chem. (1986) 261:11180; R. M. Lyons, G. L. Smith, Mol. Celi, Endrocrinol. (1986)45:263) i przedstawiono

162 290 ją na figurze 1 razem z N-końcową sekwencją aminokwasów ludzkiego małego białka wiążącego (G. Povoa i in. oraz X. L. Lee i in.). 33% stopień homologii, jaki wykazują sekwencje końcowe szczurza i ludzka, nie jest na tyle wysokie, by odpowiednie białko wiążące uważać za równoważne.

Teraz znaleźliśmy ludzkie białko wiążące równoważne z białkiem z komórek szczura BRL-3A i ustaliliśmy jego pełną sekwencję aminokwasów. Porównanie z sekwencją innych małych ludzkich białek wiążących wyraźnie wskazuje, że to nowe ludzkie białko wiążące stanowi charakterystyczną postać.

Nowe białko wiążące IGF, wytworzone sposobem według wynalazku, obejmuje sekwencję 289 aminokwasów, przedstawioną na figurze 2 zaczynającą się kwasem glutaminowym w pozycji 1 (reszta N-końcowa) i kończącą się glutaminą w pozycji 289 (reszta C-końcowa) i nazwanejest także dojrzałym IGF-BP. Korzystnie białko to składa się z sekwencji 289 aminokwasów. Białko może także obejmować sekwencję 327 lub 328 aminokwasów, zaczynającą się leucyną w pozycji -38 lub metioniną w pozycji -39 i kończącą się glutaminą w pozacji 289, co odpowiada formie prekursorowej dojrzałego białka o 289 aminokwasach, ponieważ zawiera sekwencję sygnalną wraz z całkowitą sekwencją dojrzałego białka. Sposób według wynalazku obejmuje także alleliczną postać prekursora lub dojrzałego białka, których sekwencja aminokwasów odbiega od sekwencji przedstawionej na fig. 2 przez delecję, addycję lub podstawienie co najmniej jednego aminokwasu, w takim zakresie, aby zachowała się co najmniej jedna jego funkcja. Np. takie zmiany mogą zwiększać lub zmniejszać powinowactwo białka do wiązania IGF. Delecje polegają na wyeliminowaniu reszt aminokwasów bez wstawienia reszty zastępczej. Mutanty uzyskane przez podstawienie mają jedną resztę aminokwasową zastąpioną inną, natomiast mutanty związane z insertami mają jedną lub więcej reszt wstawionych do sekwencji lub na dowolnym końcu sekwencji aminokwasów oryginalnego białka. Typowe fuzje stanowią takie mutanty insercyjne, w których insercja nastąpiła przy karboksylowej lub aminowej reszcie końcowej.

Ponieważ porównanie pomiędzy peptydami można dogodnie przeprowadzić w oparciu o stopień homologii ich sekwencji aminokwasów, uważa się zatem, że zakres wynalazku obejmuje dowolne białko, które jest zasadniczo homologiczne, np. wykazuje około 85%, korzystnie od 95% do 100% homologii z prekursorem IGF-BP (pre-IGF-BP) lub z IGF-BP, korzystnie z IGF-BP, jak przedstawiono na fig. 2 lub dowolny jego fragment zawierający więcej niż 20 reszt.

Zdolność wiązania czynnika wzrostu podobnego do insuliny jest jedną z biologicznych aktywności białek wytwarzanych sposobem według wynalazku. Białka te można dogodnie testować w próbie wiązania z użyciem IGF-I (E. Rinderknecht i R. E. Humbel, J. Biol. Chem. (1978) 253:2769) lub IGF-II (E. Rinderknecht i R. E. Humbel, FEBS (1978) 89:283), korzystnie IGF-II, w znakowanej, np. jodem, postaci. Np. taka próba może korzystnie obejmować elektroforezę żelową (SDS-PAGE) białka wytwarzanego sposobem według wynalazku, następnie analizę plamkową Westerna żelu, inkubację plamek w obecności [¹²5j]IGF-I lub -II, przemycie plamek w celu usunięcia wolnego IGF-I lub -II i wykrycie radioaktywności na plamce.

Podczas gdy początkowo IGF-BPs według wynalazku oznaczały ludzkie IGF-BPs, to jednak w zakres definicji IGF-BPs wchodzą białka z innych źródeł, takich jak ssaki, np. myszy, świnie, konie lub bydło, dopóki odpowiadają żądanemu stopniowi homologii.

IGF-BPs według wynalazku obejmują oczyszczone białka z ekstraktu tkankowego lub z kondycjonowanego podłoża hodowlanego, jak również białka otrzymane na drodze rekombinacji.

W zakresie wynalazku wchodzą także pochodne IGF-BPs, które obejmują formy glikozylowane, zespoły sprzężone z innymi cząsteczkami IGF-BP i kowalencyjne sprzężenia z niespokrewnionymi grupami chemicznymi. Kowalencyjne pochodne wytwarza się przez wiązanie grup funkcyjnych z grupami, które znajdują się w łańcuchu aminokwasu IGF-BP lub przy N- lub C-końcowej reszcie, znanymi sposobami.

Wynalazek dostarcza także zrekombinowanych sekwencji kwasów nukleinowych, kodujących IGF-BPs, np. białko obejmujące sekwencje 289 aminokwasów przedstawioną na fig. 2, zaczynającą się kwasem glutaminowym w pozycji 1 i kończącą się glutaminą w pozacji 289. Sekwencja kwasów nukleinowych może kodować białko prekursorowe przedstawione na fig. 2, zaczynające się leucyną w pozycji -38 lub metioniną w pozycji -39 i kończące się glutaminą w pozycji 289. '

162 290

W zakres wynalazku wchodzi także sekwencja kwasów nukleinowych kodująca postacie alleliczne prekursora lub dojrzałego IGF-BP, jak przedstawiono na fig. 2. Przez termin „zrekombinowana sekwencja kwasów nukleinowych rozumie się dowolną sekwencję kwasów nukleinowych wytworzoną przez połączenie kilku sekwencji kwasów nukleinowych z różnych źródeł. W szerokim rozumieniu, termin ten obejmuje też sekwencję wydzieloną ze źródła naturalnego. Takie zrekombinowane sekwencje kwasów nukleinowych mogą stanowić mRNA lub rDNA, w tym cDNA i genomowy rDNA. Korzystnie są to cDNA, a najkorzystniej sekwencja cDNA przedstawiona na fig. 2, zaczynająca się w pozycji 120, 123 albo 237 i kończąca się w pozycji 1103.

Ogólnie uważa się, że w zakres wynalazku wchodzi dowolna sekwencja kwasów nukleinowych, która hybrydyzuje z DNA kodującym pre-IGF-BP lub dojrzałe IGF-BP przedstawione na fig. 2, w ostrych warunkach hybrydyzacji, np. w 65°C w buforze 4X solankowo-cytrynianowym nie dłużej niż przez 16 godzin.

Przykładowe sekwencje kodujące IGF-BP były uzyskane następująco:

Do skonstruowania dwóch sond oligonukleotydowych z 92 zasad, zwanych BPS 1 i BPS 2, które są przedstawione na fig. 4, użyto znaną N-końcową sekwencję IGF-BP z komórek szczura BRL-3A, jak przedstawiono na fig. 1. Po radioaktywnym znakowaniu sond tych użyto do screeningu biblioteki na szczurzym cDNA. Z 10⁶ klonów wybrano 34 niezależne krzyżowo hybrydyzujące klony i poddano je analizie stosując enzym restrykcyjny i analizę plamkową Southerna. Te 34 klony zaklasyfikowano do 12 różnych grup klonów, według wielkości fragmentu cDNA. Fragmenty cDNA reprezentatywne dla każdej grupy klonowano w wektorze M13mp8 (J. Vieira i J. Messing, J. Gene(1982) 19:259) i sekwencjonowano. W rezultacie określono kompletną sekwencję nukleotydów dla IGF-BP szczura BRL-3A z jednej z grup, jak przedstawiono na fig. 3. Zawiera ona otwarty układ czytający kodujący 299 aminokwasów. Jeżeli N-koniec dojrzałego białka odpowiada sekwencji określonej przez R. M. Lyonsa i G. L. Smitha, wówczas białko wiążące i sygnalny peptyd składają się odpowiednio z 270 i 29 aminokwasów. Białko nie zawiera miejsc N-glikozylowania i zawiera o 19 reszt cysteiny więcej niż zebrane w pobliżu jego NH2-końca.

Trzy biblioteki ludzkiego cDNA poddano screeningowi stosując szczurzą sekwencję cDNA jako sondę: bibliotekę wykonaną na cDNA dorosłej wątroby (dostępną handlowo f-my Clontech pod numerem katalogowym HL 10013), bibliotekę na cDNA z wątroby płodowej (Clontech, HL 1005) i bibliotekę cDNA pochodzącego z linii komórkowej HEP G2 (Clontech, HL 1015). Chociaż screeningowi poddano 5 X 10⁵ niezależnych klonów fagowych z biblioteki na cDNA z dorosłej wątroby, nie wykryto żadnego klonu, który miałby zdolność do hybrydyzacji. Z 2,5 X 10⁵klonów (z biblioteki na cDNA z ludzkiej płodowej wątroby) i 1,5 X 10⁵ klonów (z biblioteki HEP G2), wydzielono i zanalizowano 14 i 3, odpowiednio, klony hybrydyzujące krzyżowo. Stwierdzono, że cDNA stanowiące inserty w 3 klonach HEP G2, są identyczne i w przybliżeniu mają długość 800 bp. Ta sekwencja nukleotydowa była także zakodowana na klonie cDNA o długości

1,4 kb, wydzielonym z biblioteki na cDNA z płodowej wątroby, przy czym określono ją jeszcze, jak to przedstawiono na fig. 2. Ten cDNA ma otwarty układ czytający kodujący 289 aminokwasów, zaczynający się kodonem translacyjnym ATG. Porównanie aminokwasów z białkiem wiążącym szczura BRL 3A wykazuje 81% homologię.

Dojrzałe ludzkie białko wiążące kodowane przez tę sekwencję DNA jest o 19 aminokwasów dłuzsze niz jego szczurzy odpowiednik, jeżeli sygnalny peptyd jest rozszczepialny w tej samej pozycji jak w białku wiążącym szczura BRL-3A. To ludzkie białko wiążące i inne ludzkie białko wiążące o wielkości 30 kd (Y. L. Lee i in., A. Brinkman i Μ. T. Brewer i in.) mają około 37% aminokwasów wspólnych. Ten niski stopień homologii wyraźnie wykazuje, że są to różne białka wiążące. Dwie struktury w sekwencji są takie same jak w znanych już białkach wiążących, tj. rejon bogaty w cysteinę przy NH2-końcu białka i sekwencja Arg-Gly-Asp w pozycjach 262-264. Ta sekwencja odróżnia to białko wiążące od innych ludzkich białek wiążących hormon i może mieć znaczenie z uwagi na jego własności, np. wiązanie się ze specyficznym komórkowym receptorem powierzchniowym.

Stosowane w sposobie według wynalazku wektory ekspresji zawierają sekwencję DNA kodującą IGF-BP, która jest skutecznie związana z odpowiednimi sekwencjami kontrolnymi, co poz6

162 290 wala na ekspresję IGF-BP w odpowiednim eukariotycznym lub prokariotycznym gospodarzu. Takie sekwencje kontrolne obejmują promotor transkrypcji, ewentualny operator kontrolujący transkrypcję, sekwencję kodującą odpowiednie miejsce wiązania rybosomalnego mRNA i sekwencje kontrolujące zakończenie transkrypcji i translacji. Wektory obejmują plazmidy, wirusy i zdolne do łączenia się w całość fragmenty DNA, tj. fragmenty, które łączą się w całość w genomie gospodarza przez rekombinację. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się plazmidy, które nadają się do ekspresji w gospodarzu prokariotycznym lub eukariotycznym, korzystnie w eukariotycznym.

W korzystnym sposobie realizacji wynalazku fragment cDNA EcoRI-EcoRI kodujący prekursorowe białko wiążące, przedstawione na fig. 2, jest klonowany w plazmidzie pXMT uprzednio trawionym za pomocą EcoRI. Plazmid pXMT jest przedstawiony na fig. 5 i utworzony został z p91023(B) (G. G. Wong i in., Science 228:810) przez standardowe manipulacje z DNA. pXMT ma odcinek startu replikacji pBR322 i gen oporności na amplicylinę do namnażania w E. coli, nie ma natomiast sekwencji bakteryjnych, które hamują replikację DNA w komórkach małpy COS. Zawiera ponadto eukariotyczne elementy regulatorowe z kilku różnych źródeł: (i) odcinek startu SV40 i odcinek wzmacniający, które razem umożliwiają replikację plazmidu w bardzo dużej liczbie kopii w komórkach COS i skuteczną transkrypcję wstawionych genów cDNA, (ii) główny późny promotor adenowirusa sprzężony z kopią cDNA trójdzielnego lidera adenowirusa, (iii) hybrydowy intron składający się z 5' miejsca połączenia z pierwszego egzonu trójdzielnego lidera i 3' miejsca połączenia z genu immonoglobuliny myszy, (iv) wczesny sygnał poliadenylacji SV40 i (v) rejon genu adenowirusa VAI. Plazmid pXMT zawiera także sekwencję kodującą mysią reduktazę dihydrofolianową (DHFR) przed unikalnym miejscem klonującym EcoRI, które znajduje się w pozycji bezpośrednio po 3' miejscu łączenia się.

Linie komórkowe użyte w sposobie według wynalazku są stransformowane sekwencjami DNA lub wektorem. Wybór odpowiednich komórek gospodarza jak również metody transformowania i hodowania są znane w technice. Można stosować prokariotyczne i eukariotyczne linie komórkowe, korzystnie eukariotyczne. Eukariotyczne komórki obejmują np. komórki drożdży lub komórki pochodzące z organizmu wielokomórkowego, np. komórki ssaków. Jedną ze szczególnie odpowiednich linii komórkowych jest linia komórkowa z jajnika świnki morskiej (CHO). Inną odpowiednią linią komórkową ssaków jest linia komórkowa małpy COS-1 lub CV-1.

Sposób wytwarzania IGF-BP według wynalazku polega na prowadzeniu hodowli linii komórkowej stransformowanej zrekombinowanym fragmentem DNA zawierającym sekwencję nukleotydów kodującą IGF-BP.

Krótki opis rysunków:

Na fig. 1 porównano N-końcową sekwencję białka wiążącego szczura BRL-3A, oznaczoną przez (a) R. M. Lyonsai G. L. Smitha, Mol. Celi. Endocrinol. (1986)45:263 lub(b)C. Mottola iin., J. of Biol. Chem. (1986) 261:11180 i N-końcową sekwencję ludzkiego małego białka wiążącego (c) określoną przez Y. L. Lee i in., Mol. Endocrinol. (1988) 2 (5) 404; A. Brinkmana i in.The EMBO Journal (1988) 7 (8): 2417 lub G. Povoa i in., Eur. J. Biochem. (1984) 144:119. Odstęp wprowadzono by zmaksymalizować homologię sekwencji pomiędzy tymi dwoma białkami.

Figura 2 przedstawia sekwencję fragmentu cDNA EcoRI-EcoRI sklonowanego z biblioteki wykonanej na cDNA z płodowej wątroby (Clontech, HL 1005) i odpowiednią sekwencję aminokwasów prekursorowej postaci ludzkiego białka wiążącego równoważnego z białkiem z komórek szczura BRL-3A, zaczynającą się w pozycji -39 i kończącą się w pozycji 289. Dojrzałe białko zaczyna się w pozycji 1. Sekwencja sygnalna jest podkreślona.

Figura 3 przedstawia kompletną sekwencję cDNA szczura BRL-3A kodującą prekursorową postać białka wiążącego zaczynającą się w pozycji -29 i dojrzałe białko zaczynające się w pozycji 1. Sekwencja sygnalna jest podkreślona

Figura 4 przedstawia sekwencje DNA sond BPS-1 i BPS-2, skonstruowanych według N-końcowej sekwencji białka wiążącego szczura BRL-3A, jak donosił Mottola i in. i użytych do screeningu bibliotek na szczurzym cDNA.

Figura 5 przedstawia plazmid pXMT i jego pochodne otrzymane po insercji fragmentu cDNA w miejscu rozpoznawanym przez EcoRI.

162 290

Ί

Na fig. 6 przedstawiono wyniki analizy plamkowej Westerna otrzymane w następujący sposób: 50 μΐ pożywki kondycjonowanej za pomocą nietransfekowanych komórek CHO (ścieżka 4), transfekowanych pXMT + (ścieżka 1) lub transfekowanych pXMT- (ścieżka 2) naniesiono na żel poliakryloamidowy do elektroforezy w warunkach nieredukujących. Na ścieżkę 3 naniesiono 50μ1 ludzkiej surowicy z pępowiny. Po migracji białka przeniesiono na nitrocelulozowe błony i poddano ekspozycji na [¹²5J]-IGF-I.

Na fig. 7 przedstawiono wyniki analizy Westerna pożywki kondycjonowanej za pomocą komórek CHO transfekowanych pXMT+. Obok wiązania Ing [¹²5J]-IGF-II przedstawiono wiązanie 0 ng (ścieżka A), 5 ng (ścieżka B), 25 ng (ścieżka C) nieznakowanego IGF-II, 5 ng lub 25 ng (ścieżka D i E) zimnego IGF-I lub 100 ng (ścieżka F) nieznakowanej insuliny. Analizę przeprowadzono jak w przypadku figury 6.

Przykład I. Odzyskiwanie cDNA kodującego szczurze białko wiążące.

Zsyntetyzowano dwie sondy oligonukleotydowe 92-zasadowe BPS-1 i BPS-2, które odpowiadają N-końcowej sekwencji białka wiążącego BRL-3A, określonej przez Mottola i in., stosując syntetyzator oligonukleotydów Applied Biosystems 380 A. Sondy te są przedstawione na fig. 4. Skonstruowano je dobierając kodony dla odpowiednich aminokwasów, które najczęściej występują u szczura. Sondy oznakowano za pomocą y[³²P] przy użyciu kinazy polinukleotydowej.

¹⁰⁶ zrekombinowanych klonów faga -gtl 1 z biblioteki wykonanej na cDNA z wątroby nowourodzonego szczura (skoder Biozentrum) lub z biblioteki na cDNA z wątroby dorosłego szczura (Clontech, RL 1001) poddano screeningowi stosując obie sondy w następujący sposób:

5Χ10⁴ zrekombinowanych fagów Agtll z każdej biblioteki użyto do transfekcji 4Χ109 kompetentnych komórek E. coli K803 w 2 ml 10 mM CaCkUOmM MgCb. Po 15 minutach inkubacji w 37°C w łaźni wodnej do komórek dodano 30 ml pożywki Luria Broth (LB) 1% miękkiego agaru i umieszczono na szalkach Petriego 23X23 cm Nunclon, zawierających 400 ml 1,5% miękkiego agaru pożywki LB. Płytki inkubowano przez 12 godzin w 37°C, po czym przeniesiono do 4°C na co najmniej 1 godzinę.

Na klonach każdej szalki położono nitrocelulozowy filtr 21,5X22 cm (Schleier i Schuell BA 85) i wprowadzono do 0,:5 M NaOH, 1,5 M NaCl na 5 minut w celu zdenaturowania DNA na fiitrach i przemyto dwukrotnie roztworem zobojętniającym (0,2 M Tris, 2,5 M NaCl, 0,015 M cytrynianu sodu, 0,015 Μ KH2PO4 i 0,001 MEDTA(Na)2, pH Ί). W końcu filtry suszono w powietrzu w ciągu 1 godziny przed przeniesieniem ich do pieca próżniowego na 2 godziny w 80°C.

Następnie filtry były wstępnie zamoczone w buforze 6XSSC, 1 XDenhardt, 50 mM Pipes i 0,1 Μ KPO4, pH Ί, w temperaturze 50°C na okres 6 godzin. (20XSSC:0,15M NaCl i 0,015 M cytrynianu sodu; 20 X Denhardt: 0,4% albuminy z surowicy bydlęcej, 0,4% ficollu i 0,4% poliwinylopirolidonu MW 360 kd).

Hybrydyzację przeprowadzono w 50°C w ciągu 36 godzin w 6XSSC, 1 X Denhardt, 1 mM Tris-HCl pH Ί,0,2 mM EDTA pH 8,0,9 Μ KPO4 pH Ί,0,5% SDS uzupełnionych DNA ze spermy łososia zdenaturowanej pod wpływem ciepła w ilości lOmg/ml, stosując mieszaninę 10^ecpm/ml sondy BPS-1 i ^cpm/mI BPS-2. W końcu filtry przemyto 3-krotnie w ciągu 30 minut każdy, za pomocą 4XSSC, 0,5% SDS w 50°C i poddano ekspozycji z filmem Kodak Χ-ΟΜΑΤ XAR. Powierzchnie odpowiadające radioaktywnym plamkom na filmie rozpoznano na płytkach i wycięto je. Po rescreeningu wyizolowano z biblioteki na cDNA z wątroby 34 niezależne klony zdolne do hybrydyzacji krzyżowej. Klony te poddano analizie przeprowadzając restrykcję enzymatyczną i analizę Southerna i zaklasyfikowano je do 12 grup. Inserty cDNA reprezentatywne dla każdej grupy klonowano w M13 mp8 (J. Vieira i J, Messing, J. Gene (1982) 19:259) i sekwencjonowano zgodnie z metodą Sangera. Sekwencje nukleotydów 4 klonów wydzielonych z biblioteki wykonanej na cDNA z wątroby nowourodzonego osobnika i także sekwencjonowanych były identyczne i odpowiadały częściowej sekwencji białka wiążącego szczura BRL-3A. Kompletna sekwencja DNA na fig. 3 była oznaczona przez połączenie sekwencji zachodzących na siebie subfragmentów cDNA. Te subfragmenty klonowano i sekwencjonowano po losowym rozerwaniu początkowego cDNA przez działanie ultradźwiękami.

162 290

Przykład II. Odzyskiwanie cDNA kodującego ludzkie białko wiążące.

Kompletny fragment cDNA na fig. 3 kodujący białko wiążące szczura BRL-3A oznakowano stosując procedurę losowego startera (Boehringer Kit) i użyto do screeningu biblioteki wykonanej na cDNA z dorosłej ludzkiej wątroby (Clontech, HL 1005) i z komórek HEP G2 (Clontech HL 1015). Procedura screeningu była identyczna jak opisana w przykładzie I, z tą różnicą, że hybrydyzację prowadzono w 65°C. Chociaż poddano screeningowi 5 X 10⁵ niezależnych klonów fagowych z biblioteki na cDNA z dorosłej wątroby, nie wykryto żadnego klonu fagowego zdolnego do hybrydyzacji krzyżowej. Z 2,5 X 1)5 (biblioteka na cDNA z ludzkiej płodowej wątroby) i 1,5 X 10⁵klonów fagowych (HEP G2) wydzielono 14 i 3, odpowiednio, klonów hybrydyzujących krzyżowo. Długość insertów we wszystkich klonach specyficznego cDNA z HEP G2 wynosiła około 800 bp. Sekwencje nukleotydów tych trzech klonów cDNA były identyczne i były także kodowane przez klon cDNA o długości 1,3 kb wyizolowany z biblioteki na cDNA z wątroby płodowej. Ten 1,3 kb fragment cDNA sekwencjonowano zgodnie z metodą Sangera stosując startery oligonukleotydowe, jak widać na fig. 2.

Przykład III. Ekspresja ludzkiego białka wiążącego IGF.

Fragment EcoRI-EcoRI zawierający sekwencję cDNA kodującą prekursorowe białko wiążące, jak przedstawiono na fig. 2, klonowano w pXMT, uprzednio trawionym EcoRI. Po ligacji zidentyfikowano zrekombinowany plazmid z fragmentem EcoRI-EcoRI we właściwej orientacji i dalej trawiono za pomocą SsPI w celu otrzymania liniowego wektora.

10pg tak wytworzonego preparatu plazmidowego użyto do wspólnej z 1 pg kolistego plazmidu pSV2-neo(P. J. Southern i P. Berg, J. Mol. Applied Gen. (1982) 1:327) transfekcji do 10®komórek CHO, uprzednio wyhodowanych do 70% stopnia zlewania się (70% cenfluency) w pożywce alfa+ MEM (firmy Gibco, nr katalogowy 041-02571 M), wzbogaconej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS). Transfekcję przeprowadzono zgodnie z metodą „scrape loading M. Fechheimera i in. PNAS (1987) 84:8453. Po transfekcji komórki wysiano w 75 ml kolbach do hodowli w pożywce alfa+ MEM, wzbogaconej 10% FCS. Po 48 godzinach do pożywki dodano 1 mg/ml leku G418. W 18 dni później rosnące (oporne na lek) kolonie przeniesiono do pożywki alfa” MEM (Gibco, 041-02561 H) wzbogaconej 10% dializowaną FCS.

Kolonie oporne na lek jak również nietransfekowane komórki CHQ jako kontrolne, były następnie badane pod względem zachodzenia w nich ekspresji IGF-BP, w następujący sposób: wytworzono preparat mRNA i przeprowadzono analizę Northerna stosując sekwencję DNA kodującą NH2-końcową sekwencję białka wiążącego szczura BRL-3A, jako sondę. Zaobserwowano hybrydyzację. W komórkach CHO transfekowanych pXMT zawierających insert cDNA w prawidłowej orientacji (pXMT +) i w komórkach 20-dniowego embrionu szczurzego jest transkrybowany specyficzny cDNA białka wiążącego, podczas gdy w komórkach CHO nietransfekowanych lub transfekowanych pXMT zawierającym insert cDNA w niewłaściwej orientacji (pXMT) transkrypcja nie zachodzi.

Supernatanty z hodowli transfekowanych i nietransfekowanych komórek CHO (pXMT-) zatężono jeszcze 20-krotnie, po czym rozdzielono na SDS-PAGE. Następnie przeprowadzono analizę Westerna. W końcu zhybrydyzowano z [”¹²⁵J]-IGF-I jak przedstawiono na fig. 6. W pożywce kondycjonowanej z komórkami CHO transfekowanymi pXMT + (ścieżka 1) i w ludzkiej surowicy (ścieżka 3) wystąpiło pasmo o ciężarze cząsteczkowym 36 Kd. Nie wykryto żadnego sygnału w pożywce kondycjonowanej z nietransfekowanymi komórkami CHO (ścieżka 4) ani z komórkami transfekowanymi pXMT- (ścieżka 2). To dodatkowo dowodzi, że tylko w komórkach CHO transfekowanych cDNA we właściwej orientacji zachodzi ekspresja białka wiążącego.

Przeprowadzono też badania konkurencyjne w celu określenia zdolności IBP-2 wyrażonej przez zdolność komórek CHO do wiązania IGF-II i ich względnego powinowactwa do IGF-I, IGF-II i insuliny. 50/1 próbki kondycjonowanej pożywki z komórek CHO transfekowanych pXMT + poddane SDS-PAGE w warunkach nieredukujących i przeniesiono na nitrocelulozę. Filtr pocięto pionowo na paski i każdy pasek potraktowano inaczej w konkurencyjnej próbie wiązania (figura 7). Każdy filtr hybrydyzowano z Ing ['¹²⁵JJ-IGF-I1 (10^ecpm/5/rg białka). Następnie, dodano dodatkowo na ścieżkę A nieznakowany IGF-II, na ścieżkę B 5 ng a na ścieżkę C 25 ng nieznakowanego IGF-II. Gdy jako konkurenta użyto IGF-I, do roztworu hybrydyzacyjnego

162 290 dodano 5 ng (ścieżka D) i 25 ng (ścieżka E). W doświadczeniu F użyto 100 ng insuliny. Wyniki tych doświadczeń zilustrowano na fig. 7. Wykazują one, że IGF-BP wytworzone sposobem według wynalazku, specyficznie wiąże IGF-II, ponieważ wiązanie można zahamować tylko przez 5-krotny nadmiar nieznakowanego IGF-II. Wiązanie można także zahamować przez nadmiar nieznakowanego IGF-I, lecz IGF-I ma mniejsze powinowactwo niż IGF-II. Przy 100-krotnym nadmiarze zimnej insuliny nie stwierdzono zahamowania wiązania [^_125J]-IGF-II. Dowodzi to, że ludzkie IGF-BP, wytworzone sposobem według wynalazku, ma większe powinowactwo do IGF-II niż do IGF-I i nie wiąże insuliny. Także pod tym względem IGF-BP, wytworzone sposobem według wynalazku, jest inne niż IGF-BP wyizolowane z ludzkiego płynu owodniowego, które ma większe lub zbliżone powinowactwo do IGF-I.

Przykład IV. Oczyszczanie ludzkiego białka wiążącego IGF.

Procedura 4A/.

Klon CHO, w którym zachodzi ekspresja białka wiążącego, wysiano przy gęstości komórek 2 do 4X 10^e komórek/75 ml kolbę i hodowano do 90% stopnia zlewania się ' w pożywce alfaMEM. Komórki oddzielono od pożywki przez odsączenie i supernatantu nie zawierającego komórek użyto do oczyszczania białka wiążącego IGF.

200 ml supernatantu rozcieńczono równą objętością 50 mM fosforanu sodu stanowiącego bufor, pH 6,0, i za pomocą kwasu fosforowego doprowadzono pH końcowego roztworu do 6,0. Następnie roztwór naniesiono na kolumnę jonowymienną (10Χ 120mm) Q-Sepharose FF (Pharmacia) uprzednio zrównoważoną 50 mM fosforanem sodu - buforem, pH 6,0. Kolumna pracowała przy prędkości przepływu 1,3 ml/min. Zbierano ciecz przepływającą przez kolumnę zawierającą białko wiążące IGF. Na drodze analizy Westerna wykryto aktywność wiążącą, tj. frakcje poddano elektroforezie SDS-PAGE, przeniesiono na arkusze nitrocelulozowe i wywołano białko wiążące w oparciu o jego właściwość reagowania z radioaktywnie wyznakowanym IGF.

Do przepływającej przez kolumnę Q-Sepharose cieczy wykazującej aktywność wiązania IGF dodano kwasu trifluorooctowego (TFA) do końcowego stężenia 0,1%. Ten zakwaszony roztwór dalej oczyszczano na drodze chromatografii z odwróconymi fazami w kolumnie Vydac C4 (4,6 X 250 mm) zrównoważonej 0,1% TFA w wodzie, po czym białka eluowano gradientem 0,1% TFA w wodzie do 0,1% TFA w acetonitrylu. Frakcje zawierające białko wiążące IGF były wyeliminowane przy około 30% acetonitrylu, jak wykryto na drodze analizy Westerna.

Procedura 4B/.

Supematant z hodowli komórek zawierający IGF-BP rozcieńcza się w stosunku 1:1 20 mM Tris-octanem sodu, pH 5,5. Po rozcieńczeniu kontroluje się pH roztworu i, w razie potrzeby, doprowadza się do wartości 5,5 za pomocą kwasu solnego.

Roztwór ten nanosi się na kolumnę S-Sepharose (Pharmacia) zrównoważoną 20 mM Tris-octanem sodu, pH 5,5. Kolumnę przemywa się 20 mM Tris-octanem sodu, pH 5,5, aż absorbancja powróci do poziomu podstawowego. IGF-BP eluuje się stopniowo chlorkiem sodu w Tris-octanie sodu, pH 5,5, w stężeniu zmieniającym się od 100 mM do 20 mM. IGF-BP eluuje się przy stężeniu chlorku sodu pomiędzy 0,1 i 0,3 M, jak wykryto na drodze analizy Westerna wyeluowanych frakcji.

Frakcje z aktywnością wiązania IGF łączy się i zatęża w aparacie do zatężania Amicon, wyposażonym w membrany YM10. Koncentrat poddano chromatografii żelowej w kolumnie Superose 12 (Pharmacia) zrównoważonej 20 mM Tris-octanem sodu, pH 5,5. Aktywne frakcje połączono.

Połączone frakcje zawierające IGF-BP z chromatografii żelowej poddaje się chromatografii z odwróconymi fazami w kolumnie Vydac C4 uprzednio zrównoważonej 0,1% kwasem trifluorooctowym. Nanosi się połączone eluaty z Superose 12 i kolumnę przemywa się do poziomu podstawowego kwasem trifluorooctowym. Następnie z kolumny odzyskuje się IGF-BP na drodze elucji gradientem acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu trifluorooctowego.

Terapeutyczne zastosowania białek wiążących, wytwarzanych sposobem według wynalazku, obejmują użycie ich jako samodzielnych środków leczniczych oraz w kombinacji z IGF, korzystnie właśnie w kombinacji z IGF.

W kombinacji z IGF białko wiążące nadaje się do stosowania w wyżej wymienionych wskazaniach, głównie jako środek indukujący wzrost, regenerujący tkanki i ułatwiający gojenie się ran.

162 290

Wynalazek zatem obejmuje: i/ użycie białka wiążącego, wytworzonego sposobem według wynalazku, wraz z IGF w postaci wolnej lub w postaci trwałego połączenia do stymulowania wzrostu pacjenta, regeneracji tkanek lub organów i gojenia się ran lub ii/ sposób stymulowania wzrostu pacjenta, regeneracji tkanek lub organów lub gojenia się ran, który polega na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości białka wiążącego, wytworzonego sposobem według wynalazku, wraz z terapeutycznie skuteczną ilością IGF, pacjentowi który wymaga takiego leczenia lub iii/ środek farmaceutyczny do stymulowania wzrostu pacjenta, regeneracji tkanek lub organów, lub gojenia się ran, który zawiera białko wiążące, wytworzone sposobem według wynalazku, wraz z IGF i farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem lub iv/ zestaw składający się z dwóch oddzielnych opakowań zawierających jednostki dawkowe białka wiążącego, wytworzonego sposobem według wynalazku, i IGF, wraz z instrukcją mieszania i podawania.

W połączeniu z IGF, białko wiążące, wytworzone sposobem według wynalazku, jest szczególnie interesujące w przypadku chondrogenezy lub hematopoezy. Można to wykazać za pomocą następujących testów A do C:

A/ IGF poprawia formowanie się kości, na co wskazuje np. zwiększona ilość [3H]proliny w kolagenowych i niekolagenowych białkach w sklepieniu czaszki płodu szczura. Nieoczekiwanie, uzyskuje się synergiczny efekt, gdy IGF stosuje się w obecności białka wiążącego, wytwarzanego sposobem według wynalazku. Hodowle narządów ze sklepienia czaszki szczura przygotowuje się przez wypreparowanie czołowych i ciemieniowych kości z 21-dniowych płodów szczura, rozcięcie wzdłuż szwu strzałkowego i prowadzenie hodowli metodą Kreama i in. (Endocrinology, (1985) 116, 296). Białko wiążące lub IGF dodaje się w dawkach od 10 do 200 ng/ml hodowli. Jeżeli dodajesięje razem, stosunek molowy wynosi 1:1. Hodowlę prowadzi się przez 24 do 48 godzin. Homogenaty kości poddaje się trawieniu bakteryjną kolagenazą zgodnie z metodą Diegelmana i Peterkofsky'ego (Dev. Biol. (1972) 28:443) zmodyfikowaną przez Kreama i in. (Endocrinology (1985) 116:296), w celu ilościowego włączenia [3H]proliny do białka ulegającego trawieniu kolagenazą i białka niekolagenowego.

B/ IGF zmniejsza resorpcję kości, na co wskazuje zmniejszone uwalnianie z kości [45]Ca. Nieoczekiwanie, uzyskuje się synergistyczny efekt, gdy IGF stosuje się w obecności białka wiążącego, wytwarzanego sposobem według wynalazku. Test przeprowadza się według zasad Raisza (J, Clin. Invest. (1965)44,103). Ciężarnym szczurom wstrzykuje się s. c. [45]Ca 18-tego dnia ciąży. IGF, sam lub w obecności białka wiążącego, wytworzonego sposobem według wynalazku, wstrzykuje się w dawce 10 ng do 200 ng na zwierzę. Białko wiążące dodaje się w takiej ilości, że stosunek molowy do IGF wynosi 1:1. 19-go dnia zwierzęta zabija się, usuwa się płody. Wycina się trzony kości promieniowych i łokciowych i umieszcza się w hodowli. Resorpcję określa się ilościowo na podstawie uwalniania [45]Ca z eksplantantów kości.

C/ Stwierdzono także, że białka wiążące IGF, wytwarzane sposobem według wynalazku, jak również inne białka wiążące IGF wzmagają aktywność IGF-I podobną do erytropoetyny. Można to wykazać, zwłaszcza, testując IGF-I, np. 10 ng/ml IGF-I, samego i w kombinacji z dojrzałym białkiem wiązącym IGF, przedstawionym na fig. 2, np. 50pi próbki supernatantu z hodowli linii komórkowej CHO, w której zachodzi ekspresja dojrzałego białka wiążącego IGF według fig. 2, w próbie CFU-E, opisanej przez B. Fagg, C. A. Roitsch, Celi, Physiol. (1986) 126:1. Podczas gdy wyniki uzyskane z samym białkiem wiązącym IGF nie różnią się znacznie od próby kontrolnej, efekt synergistyczny kombinacji jest wyraźnie widoczny w porównaniu z samym IGF-I.

Mitogenną aktywność IGF w połączeniu z białkiem wiążącym wytwarzanym sposobem według wynalazku, można badać następującym sposobem. Metodą opisaną przez Plouet i in., Celi. Mol. Biol. (1984) 30:105, mierzy się ilość [³H]metylo-tymidyny włączonej do komórek CCL 39 (fibroblasty z płuc świnki morskiej) w hodowli. W próbie tej linię komórkową CCI 39 wysiewa się na płytce przy gęstości 40 000 komórek na wgłębienie, w 0,5 ml pożywki MEM (Gibco), zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą, 0,1% penicyliny, 0,4% streptomycyny i 0,5% fungizonu. Po 72 godzinach inkubacji w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2, komórki przemywa się pożywką MEM nie zawierającą płodowej surowicy cielęcej, następnie prowadzi się hodowlę w tej pożywce przez 20 godzin. Na tym etapie hodowla komórkowa zlewa się i szczepi się nią IGF lub białko

162 290 wiążące lub obydwa razem, każde w dawce 10 ng do 200 ng pożywki hodowlanej. Jeżeli stosuje się je razem, wówczas musi być zachowany stosunek molowy 1:1. Badaną próbkę inkubuje się w 37°C przez 24 godziny, po czym dodaje się 1p Ci [³H]metylotymidyny w 10p1 PBS. Po 4 godzinach inkubacji włączanie metylotymidyny zatrzymuje się przez przemycie komórek PBS. Komórki utrwala się 0,5 ml kwasu trichlorooctowego w ciągu 30 minut, przemywa się wodą i w końcu poddaje się lizie 0,5 ml 0,1 M NaOH w ciągu 2 godzin w 37°C. 0,5 ml lizatu przenosi się do kolby scyntylacyjnej i miesza się z 3 ml cieczy scyntylacyjnej w celu zmierzenia J-radioaktywności. Białko wiążące wzmaga mitogenną aktywność IGF chociaż poziom radioaktywności, zmierzony przy stosowaniu samego białka wiążącego zasadniczo nie różni się od próbki kontrolnej.

Białko wiążące, wytwarzane sposobem według wynalazku, w kombinacji z IGF, jest zatem użyteczne a/ do leczenia niedoczynności przysadki mózgowej, karłowatości typu Laron, zrzeszotowienia kości, anemii, zwłaszcza powikłań występujących po przewlekłej niewydolności nerek i niewydolności wątroby lub nerek i b/ do ułatwiania gojenia się ran, takich jak wrzody i oparzenia, ewentualnie rany powypadkowe lub występujące w wyniku operacji.

IGF stosowane z białkiem wiążącym, wytwarzanym sposobem według wynalazku, korzystnie wybiera się spośród IGF-I, opisanego przez E. Rinderknechta i R. E. Humbela, J. Biol. Chem. 1 (1978) 258:2769, IGF-II, opisanego przez E. Rinderknechta i R. E. Humbela, FEBS (1978) 89:283 i dowolnej pochodnej lub fragmentu IGF-I i IGF-II wykazującego aktywność czynnika wzrostu podobnego do insuliny. Najkorzystniej jest to IGF-II.

W celu połączenia z IGF korzystnym białkiem wytwarzanym według wynalazku jest białko wiążące, które wykazuje 85% do 100% homologii z pre-IGF-BP lub IGF-BP, przedstawionymi na fig. 2.

Białka wiążące, wytwarzane sposobem według wynalazku, nie związane z IGF, mają też terapeutyczne zastosowanie w zaburzeniach fizjologicznych wynikających z nadmiernej produkcji wolnych IGF, np. w przypadku wytwarzania IGF przez komórki rakowe takie jak rak sutka lub nerki, przy cukrzycowej retinopatii lub nienormalnym wzroście wysokich dzieci, które mają w surowicy wysoki poziom wolnego IGF.

Białko wiążące wytwarzane sposobem według wynalazku może być zatem stosowane do leczenia zaburzeń fizjologicznych wynikających z nadmiernej produkcji wolnego IGF u ssaków, np. w organizmie ludzkim, np. w przypadku raków wytwarzających IGF, retinopatii cukrzycowej lub nienormalnego wzrostu wysokich osobników.

Sposób leczenia takich zaburzeń fizjologicznych polega na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości białka wiążącego, wytwarzanego sposobem według wynalazku, pacjentowi, który wymaga takiego leczenia.

Środek farmaceutyczny do leczenia zaburzeń fizjologicznych wynikających z nadmiernej produkcji wolnego IGF składa się z białka wiążącego wytwarzanego sposobem według wynalazku, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Fragmenty lub zmutowane postacie białka pre-IGF-BP lub IGF-BP, przedstawione na fig. 2, są szczególnie cenne do leczenia fizjologicznych zaburzeń wynikających z nadmiernej produkcji wolnego IGF w organizmie ludzkim.

Białko wiążące, wytworzone sposobem według wynalazku, samo lub w kombinacji z IGF, można podawać konwencjonalnym sposobem, odpowiednim dla peptydów, zwłaszcza dojelitowo, np. w postaci tabletek lub kapsułek lub korzystnie pozajelitowo, np. podskórnie lub dożylnie w postaci iniekcji lub infuzji. Ponadto, można je także stosować domiejscowo, np. w postaci maści lub zawiesin, wówczas gdy stosuje się je jako środek do gojenia się ran.

We wszystkich powyższych wskazaniach odpowiednia dawka będzie, oczywiście, zmieniać się w zależności od np. charakteru i stopnia zaburzeń, które mają być leczone oraz od sposobu podawania. Np. zadowalające wyniki można uzyskać w leczeniu zrzeszotownienia kości lub niedokrwistości, stosując dawkę dzienną od około 0,1 pg/kg wagi ciała do 40pg/kg, korzystnie od około 0,5pg/kg do około 20 pg/kg białka wiążącego. Dla dużych ssaków, np. człowieka wskazana jest dawka dzienna od około 5 pg do około 500pg, koizystme od 10 do lOOpp, dogodnie podana pozajelitowo, np. raz dziennie. Do leczenia ran dla dużych ssaków, np. ludzi wskazane jest

162 290 stosowanie dawki dziennej od 0,1 do lOyug białka wytwarzanego sposobem według wynalazku, na cm² zranionej powierzchni. Dogodnie stosuje się je raz dziennie. Gdy białko wiążące stosowane jest w kombinacji z IGF, stosunek molowy białka wiążącego do IGF korzystnie wynosi od 0,1:1 do 5:1, bardziej korzystnie od 0,5:1 do 2:1, a najbardziej korzystnie 1:1.

Środki farmaceutyczne zawierające białko wytwarzane sposobem według wynalazku, można wytwarzać konwencjonalnym sposobem.

fiqur* 7

fiqure 6

Mr 1234

ATG

CD NA ludzkiego białka wiążącego

TGA

162 290

FIG. 5

SV 40 ori \

\ \

/ /

/

VA1

r

Figura 4

BPS I:»' TTC

AGA

TGC

CCA

CCC

TGC

ACA

CCC

GAG

AGA

CTG

GCC

CCC TGC

GGC

CCA

CCC

CCA

CAC

CCC

CCA

TGC

CCC

GAC

CTC

GTC

AGA

GAG

CCC

GGC

TGC

i

BPS 2:’’ TTC

AGA

TGT

CCT

CCA

TCT

ACC

CCA

GAG

AGA

CTC

GCC

GCC TCT

GGC

CCC

CCA

CCC

CAC GCC

CAC TCT CCC GAC CTC GTC AGA GAG CCA GGC TCT >'

Figura 3

GAATT CCO GGC CCC GCO CTO CCO Pro Oly Pro Ala Pro

CTO CTC CTO CCO TCG CTO CTC TTO Lau Lau L»u Pro Sar Lau Lau Lau

CTO CTO CTO TTO GOC ^L«U L.m Cu UuGIy «0 95 Ud

GCO GGC GGT Ala Gly Gly

TCC cyt

GGT Gly

CCT GGG GTG Pro Gly Val

CCC CCC GAC CTC CTC TTC CCC TCC CCA CCC TCC ACC

Arg Ala

Glu Val ♦ 4 155

Lau Pha Arg Cyt 170 GCG CCC TGC CCC

Pro Pro cy· Thr

125 CCC GAG CGT Pro Olu Arg

CTG Lau

CCC Ala

140 CCC Ala

TGC Cy·

GCA Gly

CCC Pro

-4 CCA Pro

CCC Pro

GAC Atp

GAO CTG GTG

CGA Arg

Ala

Pro

cy·

Ala

Glu

Lau

Val

105

200

215

230

GAG CCC GGC

TGC

GGT

TGC

TCC

GTG

TGC

GCA

CGA

CAG

GAG

GGC

GAA GCT

TOC

COC

GTC

Glu Pro Gly

cy·

Gly

cy,

cy·

Sar

Val

cy·

Ala

Arg

Gin

Glu

Gly

Olu

Ala

cy·

Gly

Vai

215

260

275

290

TAC ATC CCO

CCC

TGC

GCC

CAG

ACO

TTA

CGC

TCT

TAC

CCC

AAC

CCO

GGC

TCC

GAG

CTO

CCC

Tyr lla Pro

Arg

C·»

Ala

Gin

Thr

Lau

Arg

cy»

Tyr

Pro

Atn

Pro

Cly

Sar

Glu

Lau

Pro

305

320

335

350

CTG AAO GCA

CTG

GTC

ACC

GGC

GCG

GGT

ACC

TGT

GAA

AAO

AGA CGC

GTO

GGC

GCC

ACC

CCA

Lau Lyt Ala

Lau

Val

Thr

Gly

Ala

Gly

Thr

cy·

Glu

Lya

Arg Arg

Val

Gly

Ala

Thr

Pro

365

300

395

410

GAG CAG GTT

GCA

GAC

AGT

GAG

CAT

GAC

CAC

TCG

GAG

GGA GGC

CTG

GTC

GAG

AAC

CAT

GTO

Gin Gin Val

Ala

Atp

Sar

Glu

Atp

Hit

Sar

Glu

Gly Gly

Lau

val

Olu

Asn

ula

Val

425

440

455

470

GAC GCA ACC

ATG

AAC

ATG

TTC

GCA

GGC

AGC

AGT

GCT GGC

CGG

AAG

CCC

CCT

AAG

TCA

GOC

Atp Gly Thr

MCT

Aan

MTT

Lau

Gly

Sar

Ala

Gly

Arg

Lyt

Pro

Ly»

Sar

Oly

485

500

515

5)0

ATG AAG GAA

CTG

CCT

GTO

TTC

CGG

GAG

AAG

GTC

AAC

GAG

CAC

CCO

CAG

ATO

GGC

AAA

MET Lya Glu

Lau

Ala

Val

Pha

Arg

Glu

Lya

V<1

Atn

Glu

Gin

Hia

Arg

Gin

MET

ciy

Ly·

545

560

575

590

GGT CCC AAA

CAC

CTC

ACC

CTG

GAG

CCC

AAG

CTG

CGC

CCA

CCT

GCC

ACO

ACC

Gly Ala Lya

Hit

Lau

Sar

Lau

Glu

Pro

Ly·

Lau

Arg

Pro

Ala

Arg

Thr

605

620

635

650

CCT TCC CM

CAG

GAG

CTO

OAC

CAG

GTC CTG

GAG

CGC

ATC

TCC

ACC

ATC

CGC

CTT

CCC

GAT

Pro cyt Gin

Gin

Glu

Lau

Atp

Gin

Val

Lau

Glu

Arg

Ila

Sar

Thr

MET

Arg

Lau

Pro

Atp

665

600

695

710

GAT CGG GGT

CCT

CTO

GAA

CAT

CTC TAC

TCC

crc

CAT

ATC

CCC

AAC

TGT

GAC

AAG

CAT

GGC

Atp Arg Gly

Pro

Lau

Glu

HI·

Lau Tyr

Sar

Lau

Hit

l^a

Pro

Atn

Cy.

Atp

Ly·

Ilia

Oly

725

740

755

770

CTG TAC AAC

CTC

AAA

CAG

TGC AAG

ATC

TCT

CTG

AAT

GGA

CAG

CGT

GGG

GAG

TGC

TGO

TGT

Lau Tyr Atn

Lau

Ly»

Gin

Cy· Ly·

IlET

Sar

Lou

Atn

Gly

Gin

Arg

Gly

Glu

cy»

Trp

cy·

705

000

015

830

GTO AAC CCC

ΑΛΤ

ACT

GGG AAG

CCA

ATC

CAG

GCA

GCT

CCC

ACC

ATC

CGG

GCA

GAC

CCC

GAC

Val Atn Pro

Atn

Thr

Gly Lya

Pro

Ila

Gin

Ciy

Ala

Pro

Thr

lla

Arg

Gly

A»p

Pro

Glu

HS

060

875

890

T$C CAT CTC

7—r

TAC

AAC

GAG

CAG

CAC

rac

•w.r

GAT

GGG

GCT

CAC

CCC

CAA

AGC

GTG

CAG

C* s His Lau

Tha

Tyr

Aan

Glu

Gin

Glu

Asn

Asp

Cly

Al·

Hit

Ala

Gin

z.rq

val

Gin

405

916

925

9 )

5

9 15

955

□ 6«·

97

TAA ACCACAGCCA GTCCGTCCCT CCCYICCCCA CCCCAAACAC CAC CAG AAAT GGAClcCTCTC ACCCTCATCG

985	995	1005	1015	1025	1035	1045
GIGTGGAGGA	TT^CCCAGrr	TTGACACATC	ΤΑ1ΤΓΆΤΛ1Τ	TGCAAAGAGA	CCAAOACrGA	GL iCAGAAGC
1055	1065	1075	.085	1095	1105	1115
CCCCCTCCCC	CCCCCAGTCG	CAGTTAACCT	GTACCrCCGT	TCC7GC1TCT	AATAGAGAGG	GTGGTGGCAC
1 1 25	l P5	1 1 15	115»	1165	1175	1 185
TCCGGATACT	CCCTACAGGC	TTCGGAATGC	GGAAAGAAAT	τπταγγπτ	GAACCCCfGT	GTCTCITrrA

1195 1205

CTTAAGATTA AACGAAGGAA ACCGAATTC

162 290

Figura 2

20 )0 40 50 60 ΊΟ 80 90

GAATTCGGGG CCACGGAGCA GGGACMGCfi OJAGMKSCCKt CTCCCGCTCG CAGGGCCGTG OkCCTGCCG CCCGCCCGCT CCCTCCCTCC

100	110	1)4	149	164
CCCCCCCCCC CCCCCTCCCC ACCCCCACC	ATG CTO CCC AGA GTG GGC TGC CCC GCO CTO CCC CTO	cco cco cco ccg cto
		HET Lau Pro Arg Val Oly Cya Pro Ala Lau Pro Lau	Pro Pro Pro Pro Lau
		-S9 -5β
!>«	194	209	224	2)9
ero cco cto cto	cco ero cto cto ctc cta ctg ccc ccg agt	CCC CCC GCC GCC GGC CCG	CGC GCO CAG CTG CTC
La u Pro Lau La u	Pro Lau Lau Lau Lau Lau Lau Gly Ala Sar	Cly Cly Cly Cly Cly Al·	Arg Ala Glu Val Lau
				-1 ♦!
254	269	284	299	)14
TTC COC TCC CCO	CCC TGC ACA CCC	GAC CGC CTC UCC CCC TCC	CGG CCC CCO CCO GTT GCC	CCO CCC GCC CCC CTG
Pha Aro cye Pro	Pro Cys Thr Pro	Clu Arg Lau Ala Ala Cya	Cly Pio Pro Pro Val Ala	Pro Pio Al· Al· Val
329	344	)59	)74	389
GCC GCA GTG GCC	GGA GGC GCC CCC	ATG CCA TGC CCC OAO CTC	OTC CGC OAG CCO CGC TGC	OGC TGC TGC TCO CTO
Ala Ala Val Ala	Gly Gly Ala Arg	HET Pro Cya Ala Olu Lau	Val Arg Olu Pro Oly Cya	Gly Cya Cya Sar Val
404	419	4)4	449	464
TCC CCC CCC CTG	CAG CGC GAG CCO	TCC GGC CTC TAC ACC CCO	CGC TCC CGC CAG GGG CTG	CGC TGC TAT CCC CAC
Cya Ala Aro Lau	Olu Oly Olu Ala	Cya cly Val Tyr Thr Pro	Arg Cya Gly Cln Gly Lau	Arg ^eTyr Pro lila
479	494	509	524	5)9
CCC ' CCC TCC CAG	CTG CCC CTG CAG	CCG CTC CTC ATG GGC GAC	GGC ACT TCT CAC AAC CGC	CCC CAC CCC CAG TAT
Pro Gly Sar Clu	Lau Γιο l.ou Gin	Ala Lau Val HET Cly Glu	Cly Thr Cya Clu Lya Arg	Arg Asp Ala Clu Tyr
554	569	584	599	614
CCC GCC AGC CCC	GAG CAG Γ.ΤΓ GCA	CAC AAT GGC GAT GAC CAC	TCA OKA CCA OGC CTG ΟΓΟ	CAG AAC CAC CTC GAC
Oly Ala Sar Pro	Clu Clu Val Ala	Asp Asn Gly Asp Aap lila	Sar OluGly Cly Lau Val	Olu Asn llls Vel Asp
679	644	659	674	689
ACC ACC ATG AAC	ATC TTC GGC GGG	GCA GGC AGT CCT GGC CGC	AAG CCC CTC AAG TCC GGT	ATG AAC CAG CTG CCC
Sar Thr HET Aan	HET Lau Cly Gly	Oly Gly Sar Ha Cly Arg	Lys Pro Lau I.ys Sar Cly	HET Lys Clu Lau Ala
704	719	734	749	764
GTG TTC CCC GAG	AAC GTC ACT CAG	CAC CAC CGC CAC ATC CCC	AAC GGT CGC AAO CAT CAC	CTT CGC CTG GAG GAC
Val Pha Arg Clu	Lya Val Thr Glu	Cln llls Arg Cln HET Cly	Lys Cly Cly Lys llls Ilia	Lau Gly Lau Clu Clu
779	794	809	824	8)9
CCC AAC AAC CTC	CCA CCA CCC CCT	CCC ACC ACT CCC TCC CAA	CAC GAA CTO CAC CAG GTC	CTG GAC CGC ATC TCC
Pro Lys Lys Lau	Arg Pro Pro Pro	Ala Arg Thr Pio Cya Gin	Cln Clu Lau Asp Cln Val	Lau Clu Arg U· Sar
854	869	884	899	914
ACC ATC CCC CTT	CCb GAT GAC CGC	CCC CCT CTC CAC CAC crc	TAC TCC CTC CAC ATC CCC	AAC TCT CAC AAG CAT
Thr HET Arg Lau	Pro Asp Clu Arg	Oly Pro Lou clu His I-o u	Tyr Sor Lau llio Ho Pro	Aan Cya Asp I.ys Ihs
929	944	959	974	989
GCC CTC TAC AAC	CTC AAA CAC TCC	AAC ATC TCT CTC AAC CGC	CAC CCT CGC GAG TGC TGG	TGT CTC AAC CCC AAC
Cly Lau Tyr Asn	Lau I.ys Cln Cya	Lya HET Sar Lou Asn Cly	Cln Arg Gly Clu Cys Trp	Cya Val Asn Pro Hn
1004	1019	10)4	1049	1064
ACC CGC AAC CTC	ATC CAC CCA CCC	CCC ACC ATC CCC CCC CAC	CCC GAC TCT CAT CTC TTC	TAC AAT CAG CAC CAC
Thr Cly Lya Lau	He Cln Gly Ala	Pro Thr Ha Aig Gly Asp	Pro Clu Cys llls Lau Pho	Tyr Asn Clu Cln Cln
1079	1094	110) 1116 1126 1136	, 1146 1156

GAG CCT TCC CCC CTG CAC ACC CAG CCC ATG CAG TAG ACCCCACCCA CCCGCTGCCT GGCCCCCCTG CCCCCCCCCC CTCTCCAAAC

Clu Ala Cya Ciy Val Ule Ttir Cln Arę HET Cln .

1166	1176	1186	1196	1706	1216	1226	12)6	1246
ACCGCCAGAA	AACCCACACT	CCJ-CGCCTCG	TCCGTGCTCG	ACGATTTrCC	A^^^TCTCACA	CACCTATITA	ΤΑΤΠΟΟΑΑΑ	GAGACCACO
1256	1 766	1776	1206	1296	1306	1316	1)26	13)6
CCGACCTCGG	CACCTCCCCC	gcctctctct	TCCCAGCTCC	AbATCCCACA	ccrccrccri	criGcrrfCC	CCGGCCCAGC
1346	1)56	1)66	1)76	1 306	1)96	1406	1416	1426
TCGTCGGCCA	GCTCGCCTAC	ACC1TTCCCG	ACCCGCAAGA		ITiTTCircc	CCTCICICCC	TITreaTAA	TTI*ΓTAATCA

36

AGGAAAGTA A

162 290

Figuro Ί (a) <-lu-Val.-Leu-Pha-Arg-Cys-Pro-Pro-Cys-Thr(b) Phe-Arg-Cys-Pro-Pro-Cys-Thr-Pro-Glu-Arg-Leu-Ala-Ala-Cys (c) Ala-Pro-Trp-Gln-Cys-Ala-Pro-Cys-Sar-Ala-Glu-Lys-Leu-Ala-Lau-Cyi (b) -ly-Pro-Pro-Pro-Asp-Ala-Pro-Cys-Ala--lu-Leu-Val-Arg--lu(c) Pro-Pro-Val-Sar-Ala-Sar-Cys-S«r--lu-Val-Thr-Arg-Ser(b) Pro--ly-Cys.

(c) Ala--ly-Cys.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patento we

1. Sposób wytwarzania białka wiążącego czynniki wzrostu podobne do insuliny (IGF-BP), obejmującego sekwencję aminokwasów, która wykazuje co najmniej 85% homologii z sekwencją aminokwasów przedstawioną na fig. 2, i która zaczyna się w pozycji 1 i kończy się w pozycji 289, lub dowolny jej fragment zwierający więcej niż 20 reszt aminokwasów, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej zrekombinowanym fragmentem DNA zawierającym sekwencję nukleotydów kodującą wymienione białko IGF-BP.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania IGF-BP obejmującego sekwencję aminokwasów według fig. 2, zaczynającą się w pozycji -39, -38 lub 1 i kończącą się w pozycji 289, prowadzi się hodowlę linii komórkowej stransformowanej zrekombinowanym fragmentem DNA zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą IGF-BP o takiej sekwencji.