JPH0635966B2 - チオール化合物を検出するのに有用な分析試薬、及びそれを用いた検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、反応工程で一時的に発生するチオール化合物
をはじめとする、液体系中のチオール化合物を測定する
ための分析試薬及び方法に関する。更に詳しくは、本発
明の分析試薬及び方法は、チオール化合物の比色分析に
関するものであり、チオール化合物の存在に関連した
り、その原因となる試薬又は酵素の存在の測定に用いる
ことができる。

発明の背景 チオール化合物は天然に存在し、また、化学反応によっ
て製造することもできる。かかる反応としては、次式： のようなジスルフィドの還元反応及び生化学的反応を挙
げることができる。

数多くの方法がチオール基を含む化合物の検出に関して
公知である。特に有用であり、しばしば引用される方法
は、G.K.EllmanによってArch.Biochem.Biophys.,第８２
巻70〜77頁（1959年）に記載されているものである。こ
の方法は、３−メルカプト−６−ニトロ−安息香酸の黄
色のアニオンを生成する３，３′−ジチオービス−６−
ニトロ安息香酸（Ellman試薬）とのチオール反応に基づ
くものである。

しかしながら、Ellman法の一つの欠点は、還元されたジ
スルフィド類によって黄色の色合いのみしか生じないと
いう事である。赤色又は青色領域の色合いが出れば、通
常、はるかに望ましいと考えられており、したがって、
チオール類の視覚測定により、より適するであろう。

したがって、本発明の目的は、試薬及び方法によって与
えられる色が赤又は青の領域である、チオール化合物を
比色分析するための、信頼性があり、正確で安価な分析
試薬及び方法を提供することである。

本発明の他の目的は、本明細書及び請求項を読めば当業
者に明らかになろう。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明の試薬及び方法は、次の反応式に関するものであ
る。

２R-SH＋2Fe³⁺→R-S-S-R＋2Fe²⁺ この反応において、チオール化合物は＋３の酸化状態の
鉄と相互作用し、該イオンを＋２の状態に還元せしめ、
これによって、該チオール化合物を酸化せしめてジスル
フィドを形成せしめる。得られるＦｅ²⁺イオンは好適な
リガンドと錯体を形成し、色変化を起こすことができ
る。本方法においてＦｅ³⁺のモル減少率（molar extinc
tion）、及び発色リガンド：Ｆｅ²⁺錯体によって得られ
る色変化は、系中に最初に存在しているチオール化合物
の量に直接関連する。

数多くの方法が、発色錯体として好適な錯体リガンドに
よるＦｅ²⁺イオンの検出に関して公知である。この目的
のために好適なリガンドの例としては、フェロイン類、
クプロイン類及びテロイン類からなる群より選択される
化合物が挙げられる。特に好適な錯体リガンドとして
は、ヒドラゾン類及びその互変異性アゾ体、テトラゾイ
ルピリジン類、ピリジルキゾリン類、ビス−イソキノリ
ン類、イミン類、フェナントロリン類、ビピリジン類、
ターピリジン類、ビジアジン類、ピリジルジアジン類、
ピリジルベンズイミダゾール類、ジアジルトリアジン
類、ｏ−ニトロアニリン類、フェノール類、テトラジン
類、トリアジン類、ピリジン類、フェナジン類、キノキ
サリン類、ベンズイミダゾール類、置換メチル又はフェ
ニル−２−ピリジルケトン類のオキシム類が挙げられる
［Smith,Analyt.Chem.,26,1534〜1538(1954年）；Schil
tら，Talanta,15,475〜478(1968年）；Schiltら，Talan
ta,15,1055〜1058(1968年）；及び、Schiltら，Talant
a,16,448〜452(1969年)]。他の錯体リガンドに関する記
載は、BlandamerらのJ.Chem.Soc.,Dalton 1001〜1008(1
978年)、CaseのJ.Org.Chem.,31,2398〜2400(1966年)
に、また、英国特許出願第701,843号において見られ
る。もちろん、ここに示したもの以外の錯体リガンドを
用いることもできる。

試験片型材中に錯体リガンドを組み込んで本発明の実施
態様を用いる場合には、疎水性基又はイオン交換官能基
も有するようにすることが有利である。これによって錯
体リガンドのマトリクスへの結合が改善され、それによ
って試験片が「ブリード」するのが防止される。用いる
ことができる疎水性基の例としては、長鎖のアルキル又
はアラルキル基が挙げられる。錯体リガンドのポリマー
結合も考えられる。

本発明によれば、該試験用試薬をリポン酸アミド(lipon
ic acid amide)、チオコリン、グルタチオン又は補酵素
Ａのようなチオール類、あるいはチオグリコシド類のチ
オール類を検出するために用いることができる。更に、
チオエステル、チオエーテル、ジスルフィド又はチオア
セタールが試験系において生成する場合などにチオール
前駆物質を検出することもできる。

本発明の試験用試薬は、チオエーテルヒドロラーゼ類、
チオエステラーゼ類又はチオグリコシダーゼ類のような
チオ化合物を開裂する酵素を分析するのに好適である。
更に、コリンエステラーゼ（ＣＨＥ）のようなエステラ
ーゼ類も検出することができる。ＣＨＥの通常の基質は
アセチルコリンであるが、この酵素はアセチル−及びブ
チリルチオコリンを開裂することもでき、該試験用試薬
は開裂によって生成する遊離チオール基を検出すること
ができる。本発明はまた、還元されたニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在下での、エポ
ンアミドデヒドロゲナーゼ(liponamide dehydrogenase)
を触媒として用いるリポン酸(liponic acid)の還元のよ
うな酸化還元反応によって遊離チオール基が生成する生
化学的反応と共に用いることもできる。

したがって、本発明の試験用試薬は、ＮＡＤＨによる反
応の分析に用いることができる。ＮＡＤＨによる酵素の
典型例としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、
グリセロールアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グリセロー
ルホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲ
ナーゼなどが挙げられる。ＮＡＤＨはまた、グルタメー
トオキサルアセテートトランスアミナーゼ（ＥＣ ２．
６．１１）、グルタメートピルベートトランスアミナー
ゼ（ＥＣ ２．６．１２）又はクレアチニンキナーゼ
（ＥＣ ２．７．３２）の分析の場合のように、多段酵
素反応の最終生成物であってもよい。

ＮＡＤＨはまた、ラクテート、グルコース、マレート、
尿素などのような基質の分析においては反応生成物であ
ってもよい。ＮＡＤＨによる反応の分析において本発明
の試験用試薬を用いることにより、ＮＡＤＨ１モルあた
り２モルのＦｅ²⁺が生成し、いくつかの場合の発色錯体
が非常に高い吸光係数を有するので感度が実質的に向上
する。

チオール基質に結合しているＦｅ³⁺錯体を提供すること
が有利であることが証明され、可能な錯体形成用試薬
は、ＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、クエン酸、リンゴ酸、乳
酸、例えばアラニン、グリシン、及びグルタミンのよう
なアミノ酸類、例えば１８−クラウン−６、フェニルア
ザ−１５−クラウン−５、ベンゾ−１５−クラウン−５
及びジベンゾピリジノ−１５−クラウン−５のようなク
ラウンエーテル類、又はトリアジノファン類及びクリプ
テート類である。

チオール：Ｆｅ³⁺の濃度比は少なくとも１：１でなけれ
ばならず、好ましくは約１：５である。反応を最も早く
するためには１：１０の比も好ましいが、１：２０の比
が特に好ましい。

本発明に関する試験用試薬又は試験系を用いてセル中の
分析対象物を測定することができる。Ｆｅ³⁺イオン及び
錯体リガンドに加えて、該試験用試薬は、酵素、基質、
補酵素、エフェクター、抗原、抗体などのような、特定
の分析に必要なすべての試薬を含有することもできる。
これらの試験用試薬は、緩衝剤、湿潤剤及び安定化剤の
ような、反応しない物質を含有することができる。

上記記載のように、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを補酵素と
して用いてチオール基を生成する酵素、例えばリポンア
ミドデヒドロゲナーゼ及びグルタチオンレダクターゼを
測定することができる。試薬配合物を酵素、試薬及び既
に述べた物質から調製することができ、また、溶液又は
粉末として又は錠剤もしくは凍結乾燥物の形態で混合す
ることができる。試薬配合物は既に溶液状態になっては
いない場合は、水又は他の好適な溶液中に溶解すること
ができ、試薬溶液はこれによって調製される。試薬配合
物が個々の成分からなる場合は、これらを互いに混合す
る。試料（例えば基質溶液、酵素溶液、血清、血漿又は
尿）を試薬混合物の一部と混合した後に、得られた色を
光度計で測定する。次に、特定の濃度、又は基質濃度
を、モル吸光係数及び加えた試薬又は試料の量から計算
する。動的測定及び終点測定のいずれも可能である。

Ｆｅ³⁺／リガンド系を、 １．特定のパラメーター検出に必要な１以上の試薬又は
他の酵素； ２．緩衝系； ３．湿潤剤； ４．活性化剤；及び、 ５．他の助剤 と共に吸収性試薬担持体（例えば紙、フリースなど）上
に含浸せしめることもできる。これについては、試薬又
は助剤がどの程度溶解するかによって、水溶液、有機溶
液又は混合溶液の形態で１以上の含浸溶液を調製するこ
とができる。

吸収性又は膨潤性担持体、好ましくは紙、又はガラス
もしくはプラスチックの吸収性フリースにこれらの溶液
を含浸又は噴霧し、次に乾燥する。このようにして製造
された試薬担持体を、液体試料、すなわち、血液、尿も
しくは唾液のような体液、又は果汁、牛乳などのような
食品の含有物を直接測定するための迅速診断薬として用
いることもできる。それによって液体を試薬担持体に直
接施すか、又は担持体を液体中に短時間浸漬する。比較
用の色を、このようにして生成した色に対して配置する
ことによって半定量的分析が可能である。定量的分析は
反射光度計によって行なうことができる。

本発明による試験用試薬を、注型成形用溶液から製造さ
れる担体マトリクス中に組み込むことも可能である。こ
こで示しうる例は、セルロース、セルロース誘導体、ゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、又はポリウレタン及びアクリ
ルアミドのようなプラスチックである。ここで、試験用
試薬、及び、適当な場合には他の必要な試薬を注型成形
用溶液に直接加えると有利である。それによって、一つ
の操作で担体及び試薬からなる試験具を製造することが
できる。

上記記載の試薬を、水又は緩衝剤又は血清によって吸収
性担体から溶出せしめることによって試薬溶液を得るこ
とができる。次に基質又は酵素を上記記載のように光度
計のセル中で測定することができる。

記載された試験用試薬に好適な緩衝剤は、アルカリ金属
又はアンモニウム対向イオンを有するリン酸塩、クエン
酸塩、ホウ酸塩、及びＧＯＯＤ緩衝剤である。しかしな
がら他の系を用いることもできる。pH６．５〜７．５が
好ましいが、目的とするpH値は６〜１０である。

湿潤剤は、本発明による化合物とイオン性相互作用を起
こすアニオン及びカチオン湿潤剤が特に好ましい。酵素
を活性化する非イオン湿潤剤を用いることもでき、ラウ
リル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリ
ウム及びアルキルアリールポリエーテルアルコール類が
好ましい。

用いることができるエフェクターは特定の酵素反応に関
して公知のものである。

適当な他の助剤は、他の色原体を用いた対応する試験に
おいて公知のもののような、通常の増粘剤、可溶化剤、
乳化財、光学的増白剤、一定媒体などである。

実施例 ＦｅＣｌ_３及び錯体リガンドによるチオールの分析 記載された試験系においてＮＡＤＨを検出するために、
次の試薬成分をセル中に入れた。

試薬ブランク値を測定後、ＮＡＤＨ溶液２０μを加え
ることによって反応を開始させた。５１５ｎｍにおいて
最大吸光度が測定された。動的測定によって、僅か１時
間の反応時間後に安定な終了点（２０分以内の吸光度変
化が１％）が示された。

作用能力及び直線性を試験するために、１〜１０ミリモ
ル／の範囲のＮＡＤＨ濃度を回分試験で測定した。５
１５ｎｍにおいて測定した吸光度の違いを表１に示し
た。

種々の錯体リガンドを用いて得られる色、及び対応する
最大吸光度を表２に示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/68 7055−2Ｊ (56)参考文献 特開 昭61−153564（ＪＰ，Ａ) 日本分析化学会編分析化学便覧丸善昭和 46年Ｐ．430−433

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】＋３の酸化状態であり、少なくとも検出す
   るチオール化合物の量と等量の鉄、及び、 ＋２の酸化状態の鉄と選択的に錯体を形成することがで
   き、それによって該鉄との錯体形成に基づく色変化を示
   すリガンドからなることを特徴とする、液体試料中のチ
   オール化合物、又はチオール化合物の存在に関連する物
   質を比色分析するための分析試験用試薬。
2. 【請求項２】＋３の酸化状態の鉄からなり、かつ、＋２
   の酸化状態の鉄と選択的に錯体を形成することができ、
   それによって、＋２の酸化状態のかかる鉄イオンとの錯
   体形成により、色変化を起こすリガンドからもなってい
   る液と、液体試料を一緒にすることを特徴とする、液体
   試料中のチオール化合物、又はチオール化合物の存在に
   関連する物質の分析方法。