JPH11262395A - 骨形成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトを含む哺乳動物での同種および異種移植
に於ける軟骨内骨形成が可能な二量体骨形成タンパク質
のサブ・ユニットとして有用な新規なポリペプチド鎖を
提供すること 【解決手段】 一対のジスルフィド結合ポリペプチドを
含む二量体骨形成タンパク質のサブユニットとして有用
なポリペプチド鎖であって、ＯＰＳと少なくとも70％配
列相同性を有するアミノ酸シーケンスを含有する活性領
域を含み、そして該活性領域は、（ａ）ＯＰ１タンパク
質の保存６システイン含有骨格を有し、そして該６シス
テイン含有骨格内に１つの付加システイン残基をさらに
含む；または（ｂ）ＯＰ１タンパク質の保存７システイ
ン含有骨格を有し、その中に１つの付加システイン残基
をさらに含み、該ポリペプチド鎖を含む二量体骨形成タ
ンパク質が、マトリックスと連携して哺乳動物に埋め込
まれたとき、軟骨内骨形成を誘発できる配座を有する、
ポリペプチド鎖。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なポリペプチ
ド鎖及び哺乳動物に於ける骨形成を誘発しうるポリペプ
チド鎖から成る骨形成タンパク質に係る。そして、ポリ
ペプチド鎖をエンコードする遺伝子、ＤＮＡ遺伝子組換
え技術を用いるそれらの製造方法、及び骨形成タンパク
質を用いる骨および軟骨組織修復方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の骨組織は、推定するに、骨の
成長及び自然治癒中に活発化する軟骨内骨形成に至る細
胞事象の展開カスケードを誘発し得る単一若しくは複数
のタンパク質物質を含むものと知られている。この活性
因子（又は因子類）は、文献では、骨形態形成タンパク
質、骨誘発タンパク質、骨形成タンパク質、オステオジ
ェニン又は骨誘発タンパク質等、様々に称名されてい
る。

【０００３】骨分化の展開カスケードは間充組織細胞の
レクリートメント、原種細胞の増殖、軟骨石灰化、管侵
入、骨形成、改造そして髄分化から成る（Ｒｅｄｄｉ
（１９８１）Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．
１：２０９−２２６）。

【０００４】これ等の表現型変換の基礎となる正確な機
構は不明確であるが、骨マトリックスの自然軟骨内骨分
化活性は分離的に抽出することができ、不活性の残離コ
ラーゲンマトリックスと再構成され完全な骨誘導活動を
回復する（Ｓａｍｐａｔｈａｎｄ Ｒｅｄｄｉ、（１９
８１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７８：７５９９−７６０３）。これにより、生体軟
骨内骨誘発能力を試す実験方法が提供される。数種の哺
乳動物は、異種移植実験で示されるように、密接に関連
するタンパク質を生成する（Ｓａｍｐａｔｈ ａｎｄ
Ｒｅｄｄｉ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６５９１−９５９５）。

【０００５】これ等のタンパク質の潜在的有用性は広く
認められてきた。これ等タンパク質が入手可能になれ
ば、整形外科、ある種のプラスティック外科と種々の歯
周及び頭顔処置を改革することになろう。

【０００６】これ等タンパク質画分の性質が観測される
と、種々の研究所で、骨形成活動の原因になる純粋な因
子、あるいは因子類を分離し、特定しようとする強力な
研究努力が惹起した。哺乳動物の骨から骨形成タンパク
質を純粋化しようとする技術の現状は、Ｓａｍｐａｔｈ
等により示されている。（（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７１０９−７
１１３）。Ｕｒｉｓｔ等は（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ． １７３：１９４−１
９９で、塩化カルシウム−尿素からなる無機−有機溶剤
混合物により脱塩皮質骨から抽出され、グアニジン−塩
酸塩と調製ゲル電気泳動で分別沈澱により回収されたヒ
トの骨形成タンパク質画分を開示している。彼らの報告
によれば、このタンパク質画分は酸性ポリペプチドのア
ミノ酸成分をもち、１７−１８ｋＤ領域の分子量を有す
る。

【０００７】Ｕｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：
３７１−３７５は酸性ポリペプチドの性質をもち、分子
量が約１８ｋＤの牛の骨形態形成のタンパク質を開示し
ている。その著者等の報告によれば、このタンパク質は
ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーにより分離
された画分中に存在し、マウスの体後半部の筋肉内に骨
形成、そしてラットと犬の頭骨内の冠状欠陥に骨再生を
誘発した。骨から抽出物を得る彼等の方法は、生成物が
不明瞭で、不純物を含んでいる。

【０００８】１９８５年１０月７日公開の欧州特許出願
第１４８，１５５号は、牛、豚及びヒト由来の骨形成タ
ンパク質を開示している。発明者等によって２２−２４
ｋＤの分子量をもつＰ３タンパク質と名付けられたタン
パク質の一つは、本質的に均一な状態に純化されたと述
べられている。この物質は動物に埋め込まれたとき、骨
形成を誘発すると報告されている。

【０００９】１９８８年１月１４日発行の国際出願ＰＣ
Ｔ／０８７／０１５３７は、骨誘導性質をもつ、牛の骨
からの未精製画分を開示している。出願人は又、ＤＮＡ
組換え技術によって生成された推定上の「骨誘導ファク
ター」を開示している。４個のＤＮＡシーケンスがヒト
又は牛ゲノム或いはｃＤＮＡライブラリーから回収され
遺伝子組換えのホストセル内に発現されている。出願人
は発現されたタンパク質が骨形態形成のタンパク質であ
り得ると述べているが、骨誘導は示されていず、遺伝子
組換えタンパク質は骨形成性のものではないことを示唆
している。同じグループはその後、４個のファクターの
うち３個は軟骨形成を誘発すると報告し、そして骨形成
活動は「調整分子の混合によるものであり」そして「骨
形成は．．．これ等分子の相互作用よって制御されると
いうのが極めて有り得ることである」と仮定する。再
び、如何なる骨形成もｃＤＮＡの発現生成物に起因され
なかった。「骨形態形成に伴う因子」を名称とするＵｒ
ｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， ＥＰＯ ２１２，４７４につ
いても参照のこと。

【００１０】Ｗａｎｇ等は、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５で、ゲル濾過から
決定した３０ｋＤの分子量に対応する塩基性タンパク質
の軟骨及び骨形成活性を有する脱塩骨のグアニジン抽出
物からの牛の骨形態形成タンパク質の精製を開示してい
る。このタンパク質の精製により、分離して不活性とな
った３０，１８及び１６ｋＤのタンパク質を得た。この
結果から、活性物質の正確な同定はできなかったことを
認めている。

【００１１】Ｗａｎｇ等は、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ａｓｉ．ＵＳＡ８７：２２２０−２２
２７で、ＰＣＴ ８７／０１５３７に記載されたｃＤＮ
Ａ鎖の一つの発現と部分精製を記載している。軟骨組織
及び／又は骨形成をこのタンパク質で首尾一貫して行お
うとすると純度５０％の物質の最低６００ｎｇを要す
る。

【００１２】１９９０年４月１９日刊行の国際出願第Ｐ
ＣＴ／８９／０４４５８（Ｉｎｔ．Ｐｕｂ．Ｎｏ．ＷＯ
９０／００３７３３）は、「３１−３４のＰ３」と呼ば
れる一骨形成因子ファミリーの純化と分析を記載してい
る。このタンパク質ファミリーは、ペプチド断片配列に
より特徴づけられる少なくとも４個のタンパク質を含
む。不純混合物「３１−３４のＰ３」は骨形成活性によ
り検定される。個々のタンパク質の活性は評価されず、
また論議もされていない。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の一つの目的
は、ヒトを含む哺乳動物での同種および異種移植に於け
る軟骨内骨形成が可能な二量体骨形成タンパク質のサブ
・ユニットとして有用な新規なポリペプチド鎖の提供に
ある。他の目的は、これらのポリペプチド鎖をコードす
る遺伝子、及びＤＮＡ組換え技術を用いてこれ等のポリ
ペプチド鎖から成る骨形成タンパク質の製造方法の提
供、そしてこれ等タンパク質に特異的に結合できる抗体
の提供にある。

【００１４】本発明のこれら及び他の目的と特徴は、以
下の記載、図面及び上記特許請求の範囲から明らかにな
ろう。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、マトリックス
と連携して哺乳動物内に埋め込まれたとき、埋め込み位
置に軟骨内骨形成と骨髄分化の十分な展開カスケードを
誘発できる二量体骨形成タンパク質の一方または両方の
サブ・ユニットとして有用な、新規なポリペプチド連鎖
を提供する。

【００１６】これ等の展開の鍵は、天然牛骨形成タンパ
ク質のアミノ酸シーケンスと構造データの解明にあっ
た。活発な、実質上純粋な骨形成タンパク質を、移植物
のｍｇ当たり約０．８から１．０ｎｇの半最大骨形成活
性を有する牛骨から回収するに至るプロトコルが開発さ
れた。物質が入手可能であったので、本発明者等は骨形
成を達成するに必要なタンパク質の重要な構造的詳細を
解明することができた。タンパク質のアミノ酸シーケン
スと他の構造的特徴の知識はヒトのゲノムに於ける天然
遺伝子の特定とクローニングを可能にした。

【００１７】部分シーケンスデータに基づくコンセンサ
スＤＮＡシーケンスと文献に示された調節タンパク質の
観測ホモロジーを、ヒトのゲノム及びｃＤＮＡライブラ
リーから骨形成タンパク質をコードする遺伝子を抽出す
るためのプローブとして用いた。コンセンサス・シーケ
ンスの一つは、これまで未特定であった遺伝子を分離す
るのに用いた。この遺伝子は、適切に修正され、適切な
マトリックスに挿入され、そしてここに開示されたよう
に埋め込まれるとき、軟骨内骨形成が可能な領域から成
るタンパク質をコードし、発現する。「ｈＯＰ１］又は
「ＯＰ−１」と呼ばれる遺伝子は、係属中の米国４２
２，６９９に詳細に記載されており、引例によって一体
化されて開示している。

【００１８】その天然型では、ｈＯＰ１発現は、約４０
０アミノ酸の未成熟翻訳物（「ｈＯＰ１−ｐｐ」ここで
「ｐｐ］は「プレプロ形式」を言う）を得られ、１３９
アミノ酸の成熟配列として（「ＯＰ１−１８」）その後
プロセッシングされる。このタンパク質の活性領域（機
能ドメイン）はｈＯＰ１シーケンス（「ＯＰＳ」）のＣ
末端９７アミノ酸から成る。長い活性シーケンスはＯＰ
７（Ｃ末端１０２アミノ酸から成る）である。

【００１９】哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーをｈＯＰ
１に固有なシーケンスで更に調べると、ここで「ＯＰ
２」（「ｈＯＰ２」又は「ｍＯＰ２」）と称する新規な
ＯＰ１類似のシーケンスが特定された。このＯＰ２タン
パク質は約７４％の有意のアミノ酸シーケンスホモロジ
ーをＯＰ１タンパク質の活動領域（例えばＯＰ７）と共
有し、又少なくとも成熟型とは２０％のホモロジーを有
する。ホモロジーを健全な成長形式（例えばＯＰ１−１
８、５８％アミノ酸ホモロジー）と共有する。

【００２０】ここに開示する骨形成タンパク質のアミノ
酸シーケンスは、コンセンサス・プローブをモデル化し
た調節タンパク質の変異体とも有意なホモロジーを共有
する。特に、これ等タンパク質は、骨形成タンパク質の
活性領域から成るそれ等のＣ末端シーケンスに於いて有
意義にホモロジーの共有をする。（例えば、ＯＰ１をシ
ョウジョウバエのＤＰＰとＸｅｎｏｐｕｓのＶｇ１と比
較。例えば、米国特許第５，０１１，６９１号参照。）
更に、これらのタンパク質は共通して、この領域に６又
は７の保存システイン骨格構造をもつ（例えば、これ等
Ｃ末端のシステイン残基の直列配置は異なるタンパク質
中に保存されている。）例えば、そのシーケンスが７シ
ステイン骨格構造をもつＯＰ７又はそのシーケンスが６
システイン骨格構造をもつＯＰＳ参照。ＯＰ２タンパク
質も、この領域に付加システイン残基を一つ含む。

【００２１】このように、一つの好ましい体様として、
本発明は、対立因子とその変種及び生化学合成突然変異
を含む、シーケンスＩＤ第３番または第５番によって記
述されたアミノ酸シーケンスから成るポリペプチド鎖か
ら成る骨形成タンパク質にあり、このポリペプチド鎖か
ら成る二量体タンパク質は、適切なマトリックスと連携
して哺乳動物に埋め込まれたとき、軟骨内骨形成を誘発
できる配座を有するものである。有用なタンパク質は全
長タンパク質、成熟タンパク質及びＣ末端によって記述
される機能範囲から成る切頭タンパク質を含む。

【００２２】更に、本発明はこれ等特定の構造体に限ら
ない。即ち、これ等のポリペプチド連鎖のいずれかから
成る本発明の骨形成タンパク質は、種々のグリコシル化
パターン、種々のＮ末端を有する形態、自然発生可能な
又は生化学的合成でできるアミノ酸シーケンスの領域を
有する一連の関連タンパク質、原核細胞又は真核細胞の
ホストセル内で組み替えＤＮＡの発現によってつくられ
る活性な切頭または突然変異型原アミノ酸シーケンスを
有する形態でも良い。本発明の骨形成タンパク質として
有用な活性シーケンスは、マトリックスと連携して哺乳
動物に埋め込まれたとき、軟骨内骨形成を誘発でき、Ｏ
ＰＳのアミノ酸シーケンスと少なくとも７０％、好まし
くは少なくとも８０％のシーケンス・ホモロジーを有す
るタンパク質を含むものとする。これは、あるタンパク
質のより長い形態と共に、対立因子変種及び保存Ｃ−タ
ーミナル・システイン骨格構造を変更することのあるも
のであってこの変更が尚、タンパク質をして、マトリッ
クスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、該哺乳動
物内に骨形成を誘発できる配座を有する二量体種を形成
せしめるような追加及び削除の突然変異体を含む。

【００２３】新規なポリペプチド鎖及びそれらを構成す
る骨形成タンパク質は、原核細胞又は真核細胞のホスト
セル内で未変の又は切頭ｃＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡ
から発現され、しかる後精製、切断、リフォールディン
グ、二量体化して実験動物に移植し得るものである。現
在の所より好ましいホストセルはＥ． ｃｏｌｉ又はＣ
ＨＯ、ＣＯＳ又はＢＳＣ細胞のような哺乳動物細胞を含
む。本発明の骨形成タンパク質は、種々のグリコシル化
パターン、種々のＮ末端、アミノ酸シーケンス・ホモロ
ジーの領域を有する関連するタンパク質ファミリー、及
びホストセル内の組換えＤＮＡによってつくられる天然
又は生合成タンパク質の活性な切頭又は突然変異形を含
んでも良い。

【００２４】かくして、この開示により、熟練した遺伝
子工学者は、適切なアミノ酸シーケンスをコードする様
々の異なる種のｃＤＮＡ又はゲノム・ライブラリーから
遺伝子を分離でき、若しくはオリゴヌクレチオドからＤ
ＮＡを構築でき、そして原核細胞及び真核細胞を含む種
々の形態のホストセル内でそれ等を発現し、ヒトを含む
哺乳動物内で骨形成を誘発できる活性タンパク質を大量
に調製できる。この開示により、当該技術分野の習熟者
は、標準の免疫学を用いて、ここに開示された骨形成タ
ンパク質とその断片に特異的に結合し得る抗体を創るこ
とができよう。

【００２５】骨形成タンパク質は、適切な受け渡し又は
支持システム（マトリックス）とともにして臨床応用に
有用である。マトリックスは多孔性材料の粒子から成
る。孔は原種細胞移動とそれに引き続く分化と拡散を許
容する寸法でなければならない。粒子の大きさは、７０
−８５０ｍｍ、より好ましくは１５０−４２０ｍｍの範
囲内であるべきである。粒状材料を骨欠損にまたがる形
状に密接に詰め込み、或いは材料を適宜生体適合性（非
炎症性）に構成し、「臨時的骨格」と移動原種細胞の補
充のための基盤として作用し、引き続くそれ等の固定と
拡散のための土台として作用するため、生体内分解可能
に構成する。現在の所より好ましい担体は、粒子状の、
脱塩化、グアニヂン抽出、種特異的（同種牲）骨、及び
特別に処理された粒子状、タンパク質抽出、脱塩化異種
発生骨を含む。任意には、かかる異種発生粉状マトリッ
クスは又、粒子間侵入の体積と表面積を増大するため
に、トリプシン及び／又は原繊維変性剤のようなプロテ
アーゼで処理しても良い。有用な用剤はジクロロメタ
ン、トリクロロ酢酸、アセトニトリル及びトリフルオロ
酢酸やふっ化水素のような酸を含む。或いは、マトリッ
クスは加熱酸性水溶液を含む、温度範囲を約３７℃から
７５℃とした加熱水溶液で処理しても良い。他の利用可
能なマトリックス材料は、コラーゲン、モノポリマー、
グリコール酸と乳酸のコーポリマー、ヒドロオキシアパ
タイト、燐酸トリカルシウム及び他の燐酸カルシウムか
ら成る。

【００２６】ここで可能になり、開示された骨形成タン
パク質及び埋め込み可能な骨形成装置により、医師は例
えば先天性及び後天性の頭顔及び他の骨格又は歯の異常
（Ｇｌｏｗａｃｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｌａｎ
ｃｅｔ １：９５９−９６３）の修正をすることができ
る。装置は、動物実験で示された癒着不良の破砕や、骨
形成を要する歯科及び歯周応用を含む他の臨床応用に使
用できる。他の潜在的臨床応用は、例えば、骨関節炎の
治療に於ける軟骨修復にある。

【００２７】本発明の以上に述べた目的とその他目的、
そして種々の特徴は、本発明自体と同様、添付する図面
とともに読まれるとき、以下の説明から、より充分に理
解されよう。

【００２８】

【発明の実施の形態】先ず、哺乳動物からの未処理タン
パク質抽出物中に存在する骨形成タンパク質の分離を可
能にする精製プロトコルを開発した。（１９８９年１０
月１９日刊行のＰＣＴ ＷＯ ８９／０９７８７及び１
９８８年４月８日出願の米国出願第１７９，４０６号参
照）。処置の展開は、新鮮な子牛の骨が入手可能であっ
たことと相侯って、実質的に純粋な牛骨形成タンパク質
（ｂＯＰ）の単離を可能にした。ｂＯＰは明確に特徴づ
けられた。それが猫、兎及びラットに於いて軟骨を誘発
し、ついに軟骨内の骨成長をし得ることが示され、検討
された。異種の骨抽出中の、以前には未知のタンパク質
に帰せられていた骨形成の完全な展開カスケードを誘発
し得ることが示された。この適用量依存且つ高度に特定
な活動は、タンパク質がグリコシル化しているいないに
関わらず存在した（Ｓａｍｐａｔｈ ｅｔａｌ．，
（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：１３
１９８−１３２０５）。牛由来の物から得られたシーケ
ンスデータは、ヒトの遺伝子を分離するのに用いられる
プローブ設計を示唆した。ＯＰヒト同等物タンパク質は
今、発現され、広範に特徴づけられている。

【００２９】これ等の発見は、個々にホモ二量体とし
て、又ヘテロ二量体として他の種を結合して、真の軟骨
内骨創製を可能にする全く新規且つ非天然タンパク質構
成物をコードするＤＮＡの作成を可能にした（１９８９
年１０月１９日刊行のＰＣＴＷＯ ０９７８８及び今米
国特許第５，０１１，６９１号となっている１９８９年
２月２３日出願の米国出願第３１５，３４２号参照）。
それ等は又、天然源から回収されたｃＤＮＡ及びゲノム
ＤＮＡからの、そしてここに開示された技術及び自動化
した市場で入手可能な装置を用いて作成された合成ＤＮ
Ａからの天然型、切頭型、ミューテイン、アナログ、融
合タンパク質及び様々な他の変種と構成物の発現を許容
した。ＤＮＡは、充分に確立されている分子生物学と組
換えＤＮＡ技術を用い、原核細胞又は真核細胞をホスト
セルとして発現され、生物学的に活性なタンパク質を製
造するため、必要に応じ、インビトロで酸化及びリフォ
ールディングされても良い。

【００３０】ヒトのゲノム及びｃＤＮＡライブラリーか
ら分離したＤＮＡシーケンスは、ここでＯＰ１と言及す
るこれまで未特定だった遺伝子をエンコードする。分離
されたＤＮＡによってコードされるタンパク質は初め、
ＴＧＦ−βファミリー中のタンパク質をもつアミノ酸ホ
モロジーにより特定化された。コンセンサス接合信号は
アミノ酸ホモロジーが終わり、エキソン−イントロン境
界を表示するところに見いだされた。三個のエキソンが
組み合わされ、七個のシステインを含む機能的ＴＧＦ−
β状領域を得た。（例えば、米国特許第５，０１１，６
９１号又はＯｚｋａｙｎａｋ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．，
（１９９０）ＥＭＢＯ． ９：２０８５−２０９３参
照）。ｈＯＰ１の全長ｃＤＮＡシーケンスとＮ末端シグ
ナルペプチドシーケンスを含むエンコードされた”ｐｒ
ｅｐｒｏ”型「ｈＯＰ１−ｐｐ」は、シーケンスＩＤ第
１番（残基１−４３１）に開示されている。哺乳動物細
胞に発現されたｈＯＰ１タンパク質の成熟型「ＯＰ１−
１８」は、シーケンスＩＤ第１番のアミノ酸残基２９３
−４３１によって記述される。ｈＯＰ１の全長型は、遺
伝子の種々の切頭型及び融合遺伝子と同様、Ｅ． ｃｏ
ｌｉと無数の哺乳動物細胞に発現されている（例えば、
１９９１年５月２日刊行のＰＣＴ出願ＷＯ ９１／０５
８０２参照）。

【００３１】そして、全て適切なマトリックスとともに
哺乳動物に埋め込まれたとき骨形成活性を有することが
示されている。

【００３２】以上のアミノ酸及びＤＮＡシーケンス情報
が与えられると、ｈＯＰタンパク質（例えば、ＯＰＳ又
はＯＰ７）の少なくとも活性領域及びその種々のアナロ
グ（対立因子及びその変種と遺伝子工学的に創られた突
然変異体を含む変種を含む）と共に融合タンパク質、成
長タンパク質の切頭型及び同様な構成体をエンコードす
る種々の核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）が創られる。更に、
ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブがｈＯＰ１ＤＮ
Ａの断片から創られ、又はｈＯＰ１ＤＮＡ又はアミノ酸
シーケンスに基づき新たに設計される。これ等のプロー
ブは次に、追加の骨形成タンパク質を特定するため、異
なるゲノム及びｃＤＮＡライブラリーをふるい分けるの
に用いられる。

【００３３】ＤＮＡは当該技術分野の熟練者によって、
ゲノム及びｃＤＮＡ分離、合成されたオリゴヌクレオチ
ドからの合成ＤＮＡの構築及びカセット変異発生技術を
含む良く知られたＤＮＡ操作技術を用いて創られる。１
５−１００ｍｅｒ オリゴヌクレオチドはＢｉｏｓｅａ
ｒｃｈ ＤＮＡ Ｍｏｄｅｌ ８６００ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒによって合成され、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ
−ＥＤＴＡバッファー中でポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）により純化される。ＤＮＡは次に、ゲ
ルから電気溶出される。重畳するオリゴマーはＴ４ポリ
ヌクレオチド・キナーゼにより加燐酸作用を受け、ＰＡ
ＧＥにより精製できるより大きなブロックにライゲーシ
ョンされる。

【００３４】ハイブリダイゼーションプローブとして用
いられるＤＮＡはラベルを付けても良く（例えば、ラヂ
オアイソトープで、ニックトランスレーションによっ
て）当業技術分野で良く知られている技術に従って、プ
ローブがハイブリダイズするＤＮＡを含む与えられたラ
インブラリー中のクローンを特定するのに用いられる。
ライブラリーは市場で得ても良く、或いは従来の分子生
物学技術を用い新たに創っても良い。ＤＮＡライブラリ
ー構成に係る更なる情報及び交配技術は当業技術分野の
熟練者に良く知られている多くのテキストに見いだされ
る。例えば、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ．， ｅｄ．，
Ｃｕｒｒｅｎｔｎ Ｐｒｏｒｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｖｏｌ．１，（１９８
９）参照。特に、ユニット５、”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌｉｂ
ｒａｒｉｅｓ”及びユニット６”Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌｉｂｒａｒｉｅ
ｓ．”。

【００３５】適切に特定したクローンは次に分離でき、
サブ・クローン化でき、（好ましくは、発現ベクトル
に）そしてシーケンスすることができる。目的のシーケ
ンスを含むプラスミドは次に、タンパク質の発現と更な
る特性化のため、適切なホストセルにトランスフェクト
することができる。非グリコシル化タンパク質であって
もタンパク質の骨形成活動に支障は無いから、ホストは
原核細胞でも真核細胞でも良い。有用なホストセルは、
Ｅ． ｃｏｌｉ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、昆虫／
バキュロウィルス細胞系、骨髄腫細胞及び種々の哺乳動
物の細胞を含む。ベクターは更に、遺伝子組換えタンパ
ク質の正確な発現を促進するため種々のシーケンスをエ
ンコードできる。シーケンスは、転写プロモーター及び
シーケンス、エンハンサーシーケンス、優先レボゾーム
結合サイトシーケンス、ｍＲＮＡリーダーシーケンス、
タンパク質分泌のための好ましいシグナルシーケンス等
を含む。目的の遺伝子をエンコードするＤＮＡシーケン
スは又、潜在的阻害配列を除去若しくは不必要な二次的
構造形成を最小化するため操作できる。遺伝子組換え骨
形成タンパク質は又、融合タンパク質として発現されて
も良い。翻訳後、タンパク質は細胞自体から純化しても
良く、又培養物から回収しても良い。全ての生物学的に
活性なタンパク質形式は、ＳＳ結合によって結合、或い
は個々のサブ・ユニットの発現後、適切な真核細胞また
は生体内の種々の組換えポリペプチド鎖の一以上の酸化
又はリフォールディングによって連携、創生された二量
体種からなる。Ｅ． ｃｏｌｉ中で遺伝子組換えＤＮＡ
から発現された骨形成タンパク質の詳細な説明は、ここ
で言及により挿入する１９９１年２月２７日出願の米国
出願第６６０，１６２号に開示されている。多くの異な
る哺乳動物細胞内で遺伝子組換えＤＮＡから発現された
骨形成タンパク質の詳細な説明は、ここでまた言及によ
り挿入するＰＣＴ ＷＯ９１／０５８０２に開示されて
いる。

【００３６】最後に、本文中になされた開示に鑑み、そ
してこの技術分野で公知な標準的方法を用いることによ
って、本技術分野の熟練者は、ここに開示されたポリペ
プチド鎖の全て又は一部に対するポリクロナール及びモ
ノクロナール抗体を得ることができる。該抗体はポリペ
プチド鎖上のエピトープ特異的に結合できる。有用なプ
ロトコルは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎ
ｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ ２ｎｄ ｅｄ．
１９８９）。Ｂｏｏｋ３，Ｓｅｃｔｉｏｎ １８参照。

【００３７】

【実施例】骨形成タンパク質をエンコードする追加ＤＮ
Ａシーケンスを同定するため、成長ＯＰ−１のＤＮＡの
Ｃ末端に特異的なハイブリダイゼーションプローブを、
当該技術分野で記述されているとおり、ＯＰ−１のＳｔ
ｕＩ−ＥｃｏＲＩダイジェスト断片（シーケンスＩＤ第
１番中のべースペア１０３４−１３５４）を用いて作成
し、当該分野で記述されているとおり、ニックトランス
レーションにより³²ｐのラベルを付した。上述したよう
に、ＯＰ−１ Ｃ末端は、キー機能領域、例えば、骨形
成活性のための「活性領域」をエンコードする。Ｃ末端
は又、そのアミノ酸シーケンスがアミノ酸シーケンスホ
モロジーを調整タンパク質ＴＧＦ−βスーパーファミリ
ー中の特定タンパク質と共有し、その蛋白質は保存シス
テイン骨格構造を含んでいる。

【００３８】１７．５日齢ｐ．ｃ．マウス胚由来の５’
ストレッチｃＤＮＡ（ｇｔ１０）ライブラリー（Ｃｌｏ
ｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）をプライムしたオリゴｄＴファージ７ｘ１０⁵をラ
ベル化プローブで選別した。これは、次の厳密なハイブ
リダイゼーション条件を用いて行った：４０％フォルマ
リン、５ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ溶液、０．１
％ＳＤＳ、３７℃１晩、次いで０．１％ＳＳＰＥ洗浄５
０℃で０．１％ＳＤＳ。

【００３９】スクリーニングを３度行って、５個の遺伝
子組換えファージを純化した。ファージＤＮＡは、５個
のファージ全てから作られ、ＥｃｏＲ１ダイジェスト
し、シングルストランドシーケンシングができるように
モディファイされた通常のｐＵＣタイププラスミドのＥ
ｃｏＲ１サイトにサブ・クローニングし、そして当該技
術分野で良く知られた手段を用いてシーケンスした。

【００４０】この処置によって、二つの異なるＤＮＡが
同定された。ここでｍＯＰ１とする第一のＤＮＡは成熟
形ＯＰ１（約９８％）に対する実質的ホモロジーを有す
る。この処置で同定された第二のＤＮＡは、関連遺伝子
のＣ末端をエンコードしており、ここではｍＯＰ２とす
る。遺伝子符号化ｍＯＰ２のＮ末端は、引き続き行われ
た第二のマウスｃＤＮＡライブラリー（マウス ＰＣＣ
４ ｃＤＮＡ（ＺＡＰ）ライブラリー、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のスク
リーニングによって同定された。

【００４１】マウスＯＰ２（ｍＯＰ２）タンパク質は、
明らかにアミノ酸シーケンス・ホモロジーを約７４％の
ｈＯＰ１活性領域（例えば、ＯＰＳ又はＯＰ７）アミノ
酸シーケンスと共有し、少くともホモロジーを約５８％
の完全な成熟形（例えば、ＯＰ１−１０）と共有してい
る。フルレングスｍＯＰ−２タンパク質について、ｃＤ
ＮＡシーケンスとコードされたアミノ酸シーケンスは、
シーケンスＩＤ第３番に描写されている。タンパク質の
フルレングスタイプはｍＯＰ−２（”ｍＯＰ２−ＰＰ）
のプレプロ型として示されており、そのＮ末端にシグナ
ルのペプチドシーケンスを含む。アミノ酸シーケンスＬ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（シー
ケンスＩＤ第３番のアミノ酸残基１３−１８）は、シグ
ナルペプチドシーケンスの除去のための切断位置を構成
し、発現する細胞から分泌されるべき中間形式のタンパ
ク質、「ｐｒｏ」形を残すものと思われる。アミノ酸シ
ーケンスＡｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ（シ
ーケンスＩＤ第３番のアミノ酸残基２５５−２５９）
は、ここで「ｍＯＰ２−Ａ」と言い、シーケンスＩＤ第
３番の残基２５９−３９７によって記述される成熟形タ
ンパク質を生成する位置を構成するものと思われる。シ
ーケンスＩＤ第３番の残基３０１−３９７は、保存され
た６個のシステイン骨格構造を決める領域に対応する。
シーケンスＩＤ第３番の残基２９６−３９７は、保存さ
れた７個のシステイン骨格構造を決める領域に対応す
る。

【００４２】ｍＯＰ２のプロ領域から作られたプローブ
（ＥｃｏＲ１ダイジェスト断片、シーケンスＩＤ第３番
ｂｐ４６７−７７１）を用い、マウス・ライブラリー・
スクリーンに対するのと本質的に同一の処理に従い、ヒ
ト海馬ライブラリーをふるいわけた（ヒト海馬ｃＤＮＡ
ｌａｍｂｄａ（ＺＡＰライブラリー Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。この
処理によって、ｍＯＰ２の系列ホモロジーをもつアミノ
酸シーケンスをエンコードする新規なＤＮＡのＮ末端が
同定された。遺伝子のＣ末端は次に、ヒト・ゲノム・ラ
イブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．， Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡのｌａｍｂｄａファージＥＭＢＬ−
３）を前記の新規なヒトＤＮＡでプローブして同定し
た。このＤＮＡにより符号化した新規なポリペプチド鎖
は、ここでｈＯＰ２タンパク質とし、殆ど完全なアミノ
酸同定（約９３％のアミノ酸シーケンスホモロジー）を
ｍＯＰ２−Ａと共有する（図１及び以下参照）。

【００４３】プレプロ形式のｈＯＰ２、「ｈＯＰ２−ｐ
ｐ」のｃＤＮＡシーケンス、符号化されたアミノ酸シー
ケンスは、シーケンスＩＤ第５番中に記述されている。
このフルレングス形タンパク質は又、そのＮ末端にシグ
ナルペプチドシーケンスを含む。アミノ酸シーケンスＬ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（シー
ケンスＩＤ第５番のアミノ酸残基１３−１８）は、シグ
ナルペプチドシーケンスの除去のための切断位置を構成
し、発現する細胞から分泌される中間形式のタンパク
質、プロ形式を残すものと思われる。アミノ酸シーケン
スＡｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ（シーケン
スＩＤ第５番のアミノ酸残基２５７−２６１）は、ここ
でｈＯＰ２−Ａ”と言い、シーケンスＩＤ第５番の残基
２６１−３９９によって記述される成熟形のタンパク質
と考えられるものを生成する切断位置を構成するものと
思われる。

【００４４】活動的と思われる他のｈＯＰ２成熟種は切
頭形シーケンス、「ｈＯＰ２−Ｐ」（シーケンスＩＤ第
５番の残基２６４−３９９によって記述される）及び
「ｈＯＰ２−Ｒ」（シーケンスＩＤ第５番の残基２６７
−３９９によって記述される）、そして僅かに長いシー
ケンス「ｈＯＰ２−Ｓ」（シーケンスＩＤ第５番の残基
２４０−３９９によって記述される）を含む。シーケン
スＩＤ第５番の残基３０３−３９９は保存された６個の
システイン骨格構造を決める領域に対応する。シーケン
スＩＤ第５番の残基２９８−３９９は保存された７個の
システイン骨格構造を決める領域に対応する。

【００４５】注目すべきことは、ｍＯＰ２とｈＯＰ２の
両方のプレプロ形式のＮ末端をエンコードする核酸配列
はグアニジンとシトシンの塩基対が豊富なことである。
当該技術分野の熟練者により理解されるように、かかる
「Ｇ−Ｃリッチ」領域をシーケンスすることには、活動
の進行を休ませがちにする及び／又は停滞の理由で問題
がある。従って、この領域内では、シーケンシングに誤
差が生じる可能性は排除できない。しかしながら、これ
等及び他の同様に同定されるタンパク質に対する決定的
アミノ酸シーケンスは、例えば、ここに開示される手段
のいずれかを用いることにより遺伝子操作ＤＮＡからタ
ンパク質を発現せしめ、当該技術分野で良く知られた従
来のペプチドシーケンスの諸方法によりポリペプチド鎖
の配列を容易に決定できる。

【００４６】図１（図１Ａおよび図１Ｂ）は、成熟ｍＯ
Ｐ２とｈＯＰのアミノ酸シーケンスを比較する。一致は
ｍＯＰ２シーケンス中の三つの点（．．．）によって示
されている。図から明かなように、これ等二つのタンパ
ク質の成熟型間のアミノ酸シーケンスホモロジーは、か
なりなものである（成熟シーケンス間の９２％のホモロ
ジー、Ｃ−ターミナル活性領域内では約９５％のホモロ
ジー（例えば、図１の残基３８−１３９又は４２−１３
９）。

【００４７】図２（図２Ａ〜図２Ｃ）は、ＯＰ１とＯＰ
２タンパク質の４種全ての成長形式のアミノ酸シーケン
スを比較する。ここでも又、一致は三つの点（．．．）
によって示されている。ｍＯＰ２タンパク質と同じよう
に、ｈＯＰ２タンパク質は有意のホモロジー（約７４
％）をＯＰ１活性領域を決めるアミノ酸シーケンスと共
有し（ＯＰＳ又はＯＰ７、図２中それぞれ残基４３−１
３９及び３８−１３９）、ＯＰ１−１８とはホモロジー
は少ない（約５８％ホモロジー）。両ＯＰ２タンパク質
はＯＰ１タンパク質に見られる保存された７個のシステ
イン骨格構造を共有する。更に、ＯＰ２タンパク質は、
この領域内の８個のシステイン残基から成る（図２の位
置７８参照）。

【００４８】マトリックスと連携して哺乳動物にに埋め
込まれたとき、軟骨内骨または軟骨形成を誘発できる二
量体骨形成タンパク質のサブ・ユニットとして有用であ
り、同定されたＯＰ１及びＯＰ２タンパク質間の最大ホ
モロジーを取り込んだより好ましい包括的なアミノ酸シ
ーケンスは、ここで「ＯＰＸ」とするシーケンスによっ
て記述され、以下及びシーケンス第７番に示されてい
る。

【００４９】

【表５】

【００５０】そして、ここで、Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．
２＝（Ｌｙｓ ｏｒ Ａｒｇ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅ
ｓ．３＝（Ｌｙｓ ｏｒ Ａｒｇ）；Ｘａａ ａｔ ｒ
ｅｓ．９＝（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｒｇ）；Ｘａａ ａｔ
ｒｅｓ．１１＝（Ａｒｇ ｏｒＧｌｎ）；Ｘａａ ａｔ
ｒｅｓ．１６＝（Ｇｌｎ ｏｒ Ｌｅｕ）；Ｘａａａ
ｔ ｒｅｓ．１９＝（Ｉｌｅ ｏｒ Ｖａｌ）；Ｘａａ
ａｔ ｒｅｓ．２３＝（Ｇｌｕ ｏｒ Ｇｌｎ）；Ｘ
ａａ ａｒ ｒｅｓ．２６＝（Ａｌａ ｏｒＳｅｒ）；
Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．３５＝（Ａｌａ ｏｒ Ｓｅ
ｒ）；Ｘａａａｔ ｒｅｓ．３９＝（Ａｓｎ ｏｒ Ａ
ｓｐ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．４１＝（Ｔｙｒ ｏｒ
Ｃｙｓ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．５０＝（Ｖａｌ
ｏｒＬｅｕ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．５２＝（Ｓｅｒ
ｏｒ Ｔｈｒ）；Ｘａａａｔ ｒｅｓ．５６＝（Ｐｈ
ｅ ｏｒ Ｌｅｕ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．５７＝
（Ｉｌｅ ｏｒ Ｍｅｔ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．５
８＝（Ａｓｎ ｏｒＬｙｓ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．
６０＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ ｏｒ Ａｓｎ）；Ｘａａ ａ
ｔ ｒｅｓ．６１＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ ｏｒ Ｖａ
ｌ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．６５＝（Ｐｒｏ ｏｒ
Ａｌａ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．７１＝（Ｇｌｎ ｏ
ｒ Ｌｙｓ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．７３＝（Ａｓｎ
ｏｒ Ｓｅｒ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．７５＝（Ｉ
ｌｅ ｏｒ Ｔｈｒ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．８０＝
（Ｐｈｅ ｏｒ Ｔｙｒ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅｓ．８
２＝（Ａｓｐ ｏｒ Ｓｅｒ）；Ｘａａ ａｔ ｒｅ
ｓ．８４＝（Ｓｅｒ ｏｒ Ａｓｎ）；Ｘａａ ａｔ
ｒｅｓ．８７＝（Ｉｌｅ ｏｒ Ａｓｐ）；Ｘａａ ａ
ｔ ｒｅｓ．８９＝（Ｌｙｓ ｏｒ Ａｒｇ）；Ｘａａ
ａｔ ｒｅｓ．９１＝（Ｔｙｒ、Ａｌａ ｏｒ Ｈｉ
ｓ）；そしてＸａａ ａｔ ｒｅｓ．９７＝（Ａｒｇ
ｏｒ Ｌｙｓ）である。

【００５１】種々のＯＰ１及びＯＰ２タンパク質間に示
される高度のホモロジーは、ここに同定される新規な骨
形成タンパク質が本質的にはＯＰ１と同様、或いはＯＰ
１にたいし開示されたプロトコルの僅かな修正で純化で
きることを示唆している。同様に、精製ｍＯＰ１、ｍＯ
Ｐ２及びｈＯＰ２タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルア
ミドの電気泳動ゲルに関する分子量基準との比較により
測ると、還元された単一のサブ・ユニットとして約１８
ｋＤａの見かけ上の分子量を、又酸化された二量体とし
て約３６ｋＤａの見かけ上の分子量をもつことが予示さ
れる。未グリコシル化二量体（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ
での組換え発現によって生成されたタンパク質）は、約
２７ｋＤａの見かけ上の分子量をもつことが推定され
る。成熟型のｍＯＰ２とｈＯＰ２タンパク質には、一つ
の潜在的Ｎグリコシル化位置があるようである。

【００５２】８個のシステイン残基から成る活性領域を
もつ骨形成タンパク質が特定されると、以下の鋳型アミ
ノ酸シーケンスいずれかに基づいて骨形成ポリペプチド
鎖を構築したり、このシーケンスをもつその他の骨形成
タンパク質を特定できる。考えられる鋳型シーケンス
は、保存された６個のシステイン骨格構造とＯＰ２タン
パク質中に特定される追加システイン残基から成る「Ｏ
ＰＸ−７Ｃ］及び保存された７個のシステイン骨格構造
とＯＰ２タンパク質中に特定される追加システイン残基
から成る「ＯＰＸ−８Ｃ」である。「ＯＰＸ−７Ｃ」及
び「ＯＰＸ−８Ｃ」シーケンスは以下及びシーケンスＩ
Ｄ第８、９番に記述されている。これ等の鋳型シーケン
ス中の各Ｘａａは２０個の天然型Ｌ型、αアミノ酸又は
その誘導体の一つを表す。この鋳型に基づく生合成構造
体は、当該分野で良く知られた従来のＤＮＡ合成又はペ
プチド合成技術を用いて容易に作られる。これ等のポリ
ペプチド鎖から成る骨形成タンパク質は、一旦構築され
ると、ここに開示されるように試験することができる。

【００５３】「ＯＰＸ−７Ｃ」（シーケンスＩＤ第８
番）：

【００５４】

【表６】

【００５５】「ＯＰＸ−８Ｃ」（保存されたシステイン
残基を含む、Ｎ末端に更に５個の残基から成るシーケン
スＩＤ第９番）：

【００５６】

【表７】

【００５７】マトリックスの調製 Ａ．マトリックス特性の一般的考察 現在の所より好ましい担体材料は、ここに開示されるよ
うに処理された移植性骨誘導の粒状材料である。この担
体は、生体内分解可能−合成または合成−無機母体（例
えば、ヒドロオキシルアパタイト（ＨＡＰ）、コラーゲ
ン、燐酸トリカルシウム又はポリ乳酸、ポリグリコール
酸及びこれ等の種々なコーポリマー）で置き換えても良
い。

【００５８】研究によれば、表面電荷、粒子サイズ、鉱
物の存在及びマトリックスと骨形成タンパク質を結合す
る方法等は全て、骨誘導を上手く達成するための役割を
果たす。化学的変異による電荷の摂動は、誘導反応を撤
廃する。粒子サイズは、新しい骨の定量的応答に影響を
与える。７５μｍから４２０μｍの粒子は最大の応答を
引き出す。マトリックスの骨ミネラルによる汚染は、骨
の形成を阻害する。極めて重要なこととして、ＯＰを母
体に作り出すのに用いられる処理は、骨形成タンパク質
とマトリックス両者の物理的及び化学的状態に極めて敏
感に作用する。

【００５９】骨マトリックス／骨形成タンパク質移植物
の界面に於ける順次の細胞反応は複雑である。多段階カ
スケードは、フィブリンとフィブロネクチンの埋め込ま
れたマトリックスヘの結合、細胞の化学的刺激によって
起こる移動運動、フィブロブラストの増殖、コンドロブ
ラストヘの分化、軟骨形成、管侵入、骨形成、改造及び
骨髄の分化を含む。

【００６０】骨形成タンパク質に適応した担体は、いく
つかの重要な機能を果たさねばならない。それは、骨形
成タンパク質を結合し、緩慢な放出送り出しシステムと
して作用し、骨の発達中細胞応答の各段階を調節し、そ
して骨形成タンパク質を非特異的なタンパク質加水分解
から保護しなければならない。更に、選ばれた材料は生
体適合性であって、好ましくは生体内可分解でなければ
ならない。担体は、新しい骨によって完全に置き換えら
れるまで、臨時の骨格として作用しなければならない。
ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及び
種々の組み合わせは、生体内で分解速度を異にする。骨
中、分解速度は、移植物が埋め込まれるのが皮層又は柱
状骨かどうかによって変化する。

【００６１】マトリックス形状、粒子サイズ、表面電荷
の存在及び粒子内と粒子間の多孔度の程度は全て、適応
したマトリックス遂行能力にたいして重要である。母体
を新しい骨の望まれる形状に成形し、癒着不良の欠陥に
またがるように寸法化することが好ましい。ラットを使
った研究によれば、新しい骨は本質的に、埋め込まれた
装置の寸法をもって形成される。

【００６２】マトリックスは、疎に接着した粒子材料、
例えばコラーゲンでできた形状保持固体で構成されても
良い。それは又、型込された多孔性固体から成っても良
く、或いは単に包囲する組織によって位置付けられた密
詰粒子の集合であっても良い。砕いて練った筋肉や他の
組織も又、用いられる。大きな同所骨移植体は、その骨
髄腔を清浄化し、粒子と分散する骨形成タンパク質で埋
めれば、母体の担体として作用できる。

【００６３】移植性骨から作られ、ここに開示のとおり
処理されたより好ましいマトリックス材料は、種々の臨
床設定に於いて有用な移植材料を生製する。種々の整
形、歯周及び改造処置に於ける骨形成のためのマトリッ
クスとしての用途に加えて、マトリックスは又、持続す
る放出担体として或いはインプラントのコラーゲン被覆
として用いられる。マトリックスは、手術に先駆けて望
ましいように成形されても良く、又手術中に医師又は技
術手によって成形されても良い。このように、材料は局
所的、皮下、腹腔又は筋肉内移植物として用いられる。
癒着不良の破砕にまたがるように又は骨欠陥を詰めるよ
うに成形できる。骨形成または誘導処置に於いて、材料
は緩っくりと身体に吸収され、そして移植物の形状又は
それに極めて近い形状の骨によって置き換えられる。

【００６４】種々の成長ファクター、ホルモン、酵素、
治療組成物、抗生物質及び他の身体処理剤もまた担体材
料の吸収されても良く、埋め込まれると、マトリックス
材料が緩っくりと吸収されるにしたがって、時間をかけ
て放出されることになる。即ち、ＥＦＧ、ＰＤＧＦ、Ｉ
ＧＦ、ＦＧＦ、ＴＦＧ−α及びＴＧＦ−βのような種々
の公知の成長ファクターが生体内で放出される。材料は
化学療法剤、インシュリン、酵素又は酵素抑制遺伝子を
放出するのに用いることができる。

【００６５】Ｂ．骨誘導マトリックス １．脱塩化骨の調製 脱塩化骨マトリックス、好ましくはウシ骨マトリックス
は公知の処理方法でつくられる（Ｓａｍｐａｔｈ ａｎ
ｄ Ｒｅｄｄｉ（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６５９１−６５９５）。
ウシの長骨幹骨（エイジ：１−１０日）を地域の屠殺場
から得、そのまま用いる。骨は、筋肉と脂肪を除去し、
骨膜を取り、骨髄を加圧冷水で取り去り、冷たい無水エ
タノールに浸し、−２０℃で貯蔵する。骨は次に、乾燥
し、粉砕により破断し、そして大型のミルで粉末化す
る。液体窒素を用い加熱を防ぐように注意を払う。粉末
化した骨は、７０−８５０μｍ、好ましくは１５０−４
２０μｍの範囲の粒子サイズに製粉し、３量のクロロホ
ルムとメタノール（３：１）で約２時間の洗浄を２回行
って脱脂する。粒子状の骨は次に、１量の無水アルコー
ル洗浄し、１量の無水エーテルで乾燥し、脱脂骨粉を生
ずる。脱脂骨粉は次に、４℃で４０分間、１０量の０．
５Ｎ ＨＣｌを使った引き続く４回の処理によって脱塩
化する。最後に、大量の水を用い、脱塩化骨粉に中性化
洗浄を施す。

【００６６】２．グアニジン描出 このような処理を行った脱塩化骨マトリックスを、４℃
で１６時間ｐＨ７．０の５０ｍＭのトリス−塩酸に溶解
した４Ｍグアニジン−塩酸５容量で抽出した。懸濁液を
濾過した。不溶物を集め、マトリックスの調製に使用し
た。材料は殆どが天然のコラーゲン性の物質であり、骨
形成活性または軟骨形成活性を有していない。

【００６７】３．マトリックスの処理 全ての骨マトリックスの主要成分は、タイプ−Ｉ型コラ
ーゲンである。コラーゲンに加えて、上に示したように
抽出した脱塩化骨は、その容積あたり５％の非コラーゲ
ン性蛋白質を含んでいる。異種移植性マトリックスで
は、これらの非コラーゲン性成分は強い抗原となる可能
性があり、免疫原及び／または拒絶成分となる可能性が
ある。これらの成分も、骨の分化の展開的カスケードに
伴う干渉によって同種性の移植物の骨形成を阻害する可
能性がある。コラーゲン繊維変質剤によるマトッリクス
粒子の処理は、マトリックスから望ましくない成分を潜
在的に除去し、マトリックス材料の表面構造を変質させ
ることを見出した。有用性のある薬剤としては、酸、有
機溶媒、加熱水溶性溶媒を含む。種々の処理を以下に述
べる。これらの繊維改質剤の作用の詳細な物理的分析は
脱塩作用に基づいており、グアニジン抽出骨コラーゲン
粒子は１９９０年９月７日公開のＰＣＴ ＷＯ９０／１
００１８に開示されている。

【００６８】繊維改質剤と接触後、処理されたマトリッ
クスを、以下に述べる一形式の処理によって、何れの抽
出成分をも除去するため洗浄する。

【００６９】１．ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝含塩物）１ｇ／
２００中で懸濁し、４℃で２時間かき混ぜる；若しくは
６Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．０（ＵＴＢＳ）または水中で懸濁
し、室温（ＲＴ）で３０分間（ｐＨを中和するに十分な
時間）かき混ぜる； ２．遠心分離し、洗浄ステップを繰り返す；そして ３．遠心分離し、浮遊物を放棄し、残しを水洗しそして
凍結乾燥する。

【００７０】３．１ 酸処理 １．トリフルオロ酢酸 トリフルオロ酢酸は、強い非酸化性酸で、タンパク質に
たいする公知の膨潤剤であって、コラーゲンの原繊維を
改変する。

【００７１】上述のようにして作られたウシ骨残渣
（滓）を篩いにかけ、適切な粒子サイズの粒子を回収す
る。これ等の粒子を、０℃又は室温で、終始かき混ぜな
がら、１−２時間、様々の比率（１．０％−１００％）
のトリフルオロアセテート及び水（ｖ／ｖ）を用い抽出
する。処理されたマトリックスは、濾過し、凍結乾燥し
又は水／塩で洗浄してから凍結乾燥する。

【００７２】２．ふっ化水素 トリフルオロ酢酸と同様、ふっ化水素は、強酸で膨潤剤
であり、また粒子内表面構造を変更できる。かくして、
ＨＦは、グアニヂン抽出後、マトリックスと更に連携す
る何れの糖タンパク質の抗原性炭水化物成分をも除去す
ることにより、これ等マトリックスの骨形成活性を増大
するように機能する。

【００７３】上述のようにして作られたウシ骨残渣
（滓）を篩いにかけ、適切な粒子サイズの粒子を回収す
る。サンプルは、Ｐ₂Ｏ₅上で真空乾燥し、反応容器に移
送し、−７０℃での蒸留による無水ふっ化水素（母体の
１０−２０ｍｌ／ｇ）に晒す。容器は０℃まで加温し、
反応混合物は同温度で１２０分間撹拌する。真空中でふ
っ化水素の蒸発後、残渣（滓）は、どんな微量の酸をも
除去するため、ＫＯＨのペレット上で充分に真空乾燥さ
れる。脱グリコシル化の程度は、非共有結合的に結合す
る炭水化物を除去するためサンプルを適切に洗浄した
後、ふっ化水素による処理の前後のマトリックスサンプ
ルの炭水化物分析から決定できる。ＨＦにより処理され
た材料からのＳＤＳ抽出タンパク質は、Ｃｏｎ Ａブロ
ッティングを行った場合と、炭水化物反応は陰性であ
る。

【００７４】脱グリコシル化骨マトリックスは次に、Ｔ
ＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝含塩物）又はＵＴＢＳ中で２回洗浄
し、水洗浄後、凍結乾燥する。

【００７５】他の酸処理も、ＨＦ及びＴＦＡと同様にお
こなえる。ＴＦＡはこれ等の処理で、その揮発性故に現
在の所より好ましい酸性化反応物質である。しかしなが
ら、酢酸や蟻酸のような、他の可能性として腐食性がよ
り少ない酸も用い得ることが理解される。

【００７６】３．２ 溶媒処理 １．ジクロロメタン ジクロロメタン（ＤＭＣ）はタンパク質を、その一次構
造に影響せず、変性できる有機溶媒である。この膨潤剤
は、自動化ペプチド合成で通例の反応物質であり、成分
除去のため洗浄工程で用いられる。

【００７７】上述のようにして作られたウシ骨残渣
（滓）を篩いにかけ、適切な粒子サイスの粒子を１００
％ＤＣＭ中で、又、より好ましくは９９．９％ＤＣＭ／
０．１％ＴＦＡ中でインキュベーションする。マトリッ
クスは、膨潤剤を用い、０℃又は室温にて１〜２時間培
養する。或いは、マトリックスはインキュベーションせ
ず、上記剤で短時間洗浄を３回（各２０分）行って処理
する。

【００７８】２．アセトニトリル アセトニトリルは（ＡＣＮ）はタンパク質を、その一次
構造に影響せず、変性できる有機溶媒である。それは、
高速液体クロマトグラフィーに用いられる通例の反応物
質であり、疎水性相互作用に摂動を起こさせることによ
ってシリカをべースとするカラムからタンパク質を溶出
するのに用いられる。

【００７９】上述のようにして作られた適切な粒子サイ
ズのウシ骨残渣（滓）粒子を、１００％ＡＣＮ（１．０
ｇ／３０ｍｌ）を用い、又、より好ましくは、９９．９
％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡを用い、室温で１〜２時間、
終始かき混ぜながら処理する。処理したマトリックスは
次に、水洗し又は尿素緩衝剤或いは４Ｍ ＮａＣｌで洗
浄した後、凍結乾燥する。或いは、ＡＣＮ又はＡＣＮ／
ＴＦＡ処理マトリックスは洗浄せずに凍結乾燥しても良
い。

【００８０】３．イソプロパノール イソプロパノールもまた、タンパク質をその一次構造に
影響せず変性できる有機溶媒である。それは、シリカＨ
ＰＬＣカラムからタンパク質を溶出するのに用いられる
通例の反応物質である。

【００８１】上述のようにして作られた適切な粒子サイ
ズのウシ骨残渣（滓）粒子を、１００％イソプロパノー
ル（１．０ｇ／３０ｍｌ）を用い、又、より好ましく
は、０．１％ＴＦＡ存在下で、、室温で１〜２時間、終
始かき混ぜながら処理する。母体は次に、凍結乾燥する
前に、水洗若しくは尿素緩衝剤又は４Ｍ ＮａＣｌで洗
浄する。

【００８２】４．クロロフォルム クロロフォルムもまた、上述の反応物質と同様、単独又
は酸性化して後、骨母体の表面積を増大するため、用い
ても良い。

【００８３】上述の処理は、材料が埋め込まれる前、病
原体の無いようにすることを確実にするために有効であ
る。

【００８４】３．３ 熱処理 現在の所最も好ましい用剤は、水のような加熱された水
溶性繊維改質剤で、マトリックス粒子の表面積と多孔度
を増大する。現在のところ最も好ましい水溶性媒体は、
ｐＨが４．５以下、例えばｐＨ２−ｐＨ４、の酸性水溶
性媒体で、加熱前のコラーゲンの膨潤を助長する。ｐＨ
が約３の０．１％酢酸が、現在の所、より好ましい。
０．１Ｍ酢酸を用いても良い。

【００８５】様々の量の脱脂、脱塩、グアニヂン抽出骨
コラーゲンを、水ジャケットを有するガラス・フラスコ
内の上記水溶性媒体（１ｇマトリックス／３０ｍｌ水溶
性媒体）の中で、終始かき混ぜながら加熱し、一定温度
に一定時間維持する。好ましい処理時間は約１時間だ
が、０．５〜２時間の晒し時間は許容できるようであ
る。採用される温度は一般に約３７℃−７５℃の範囲内
の温度で一定に保たれる。現在の所より好ましい熱処理
温度は４５℃−６０℃の範囲内にある。

【００８６】熱処理後、マトリックスは濾過され、洗浄
され、凍結乾燥の後、移植物として用いられる。酸性水
溶性媒体を用いるとき、マトリックスはまた、好ましく
は、洗浄と凍結乾燥前に中和される。現在の所好ましい
中和緩衝剤はｐＨ７．０の２００ｍＭ燐酸ナトリウムで
ある。マトリックスを中和するため、マトリックスは、
好ましくは先ず、熱処理に続いて冷却され、酸性水溶性
媒体（例えば、０．１％酢酸）は除かれ、中和緩衝剤で
置き換えられ、これとマトリックスは30分間かき混ぜら
れる。次に、中和緩衝剤は除かれ、マトリックスは洗浄
され、凍結乾燥される（以下参照）。

【００８７】マトリックスはまた、金属イオンキレート
剤に晒すこと等によって、汚染重金属を取り除くように
処理されても良い。例えば、０．１％酢酸を用いた熱処
理に引き続き、マトリックスは例えば２００ｍＭ燐酸ナ
トリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０のＥＤＴＡ
（ナトリウム−エチレンヂアミンテトラアセテート酸）
を含む中和緩衝剤中で中和されても良い。５ｍＭ ＥＤ
ＴＡは、約１００倍モル過剰のキレート剤をこれまで試
験された最も汚染されたマトリックス中に存在する残留
重金属に提供する。中和化に続く次の洗浄はＥＤＴＡの
大半を取り除くようである。マトリックス粒子のＥＤＴ
Ａ処理は試験された全ての金属（Ｓｂ、Ａｓ、Ｂｅ、Ｃ
ｄ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｂ、Ｈｇ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ａ
ｇ、Ｚｎ、Ｔｌ）の残留重金属成分を約１ｐｐｍ以下に
減少せしめる。ＥＤＴＡ処理マトリックスの生化学分析
によれば、金属イオンキレート剤による処理は骨誘導活
性を抑止しない。

【００８８】コラーゲンマトリックス材料は好ましく
は、非不溶性で、非接着性粒子から成る微細粉末の形式
を取る。それは、新しい骨成長又は持続放出が望まれる
容積内に単に詰め込むようにして用い、包囲する組織に
よって固定される。或いは、身体によって容易に吸収さ
れる、例えば、ジェラチン又はポリ乳酸のカプセルに収
納されても良い。粉末は、所定の体積に成形されて、例
えば、可溶性の種−生体適合性のコラーゲンを用い、粒
子間接着をすることによってその形状に維持されるよう
にしても良い。材料はまた、シート状、棒状、ビーズ状
又は他の微小形状に製作されても良い。

【００８９】ここに開示された実験の或るものに同種マ
トリックスとして用いられる脱塩化ラット骨マトリック
スを、ここに開示されたとおり、鼠の大腿部及び頚骨の
脱水骨幹の幾つかから製作し、４２０μｍの篩いを通過
するサイズの骨粒子を作成する。骨粒子は、４Ｍグアニ
ヂン−ＨＣｌで分離的抽出にさらす。かかる処理によっ
て、骨母体の固有の軟骨内で骨分化を誘発する能力が完
全に無くなる。残る非溶性材料が、マトリックスを製作
するのにもちいられる。材料は殆どコラーゲンの性質を
有し、埋め込み後、軟骨及び骨を誘発しない。新しい製
作物の全ては、使用前、ミネラル成分及び骨形成活性に
つき試験される。骨マトリックスの生化学活性の全面的
喪失は、活性な骨誘導タンパク質画分又は純粋な骨誘導
タンパク質調製物が生化学的不活性非溶性コラーゲンマ
トリックスで再構成されるとき、回復する。

【００９０】骨形成物の製作 上述のような自然界に源を有し遺伝子操作で作られるタ
ンパク質及び他の構造物は、以下に記載する方法の何れ
かを用いて適切なマトリックス製作物に組み合わされ、
分散される。一般に、５０−１００ｎｇの活性タンパク
質は不活性担体マトリックス（例えば、ラットのバイオ
アッセイにたいし２５ｍｇ）と組み合わされる。より大
きな移植物にたいし、より多量が用いられる。

【００９１】１．エタノール沈澱 母体を、グアニヂン−ＨＣｌに溶解されている骨形成タ
ンパク質に加える。サンプルは撹拌され、低温（例え
ば、４℃）でインキュベートされる。そして、サンプル
は更に撹拌される。冷温の無水エタノール（５量）が混
合物に添加され、後者は次に、かき混ぜられ、−２０℃
で、好ましくは３０分間培養される。遠心分離（マイク
ロフュージ、高速）の後、浮遊物はを除去する。再構成
されたマトリックスは、水中で低温高濃度エタノールに
より２回洗浄され、次に凍結乾燥される。

【００９２】２．アセトニトリル・トリフルオロ酢酸の
凍結乾燥 この処理では、アセトニトリル・トリフルオロアセチッ
ク（ＡＣＮ／ＴＦＡ）溶液を担体材料に添加する。サン
プルは何度も激しく撹拌され、そして凍結乾燥される。
この方法は現在の所より好ましく、種々の濃度と異なる
純粋度レベルに於いて骨形成タンパク質で試験された。

【００９３】３．尿素凍結乾燥 尿素緩衝剤中で作られる骨形成タンパク質にたいし、タ
ンパク質はマトリックス材料と混合され、何度も撹拌さ
れ、そして凍結乾燥される。凍結乾燥された材料は「そ
のまま」移植物として用いられる。

【００９４】４．緩衝食塩水凍結乾燥 生理食塩水中のＯＰ１及びＯＰ２生成物はまた、マトリ
ックスと撹拌され、そして凍結乾燥されて骨形成活性材
料を生成する。

【００９５】これ等の処理はまた、他の活性治療薬、ホ
ルモン及び種々の生物活性種を、持続する放出目的で、
マトリックスに吸着させるのに用いることができる。

【００９６】バイオアッセイ 本発明の種々のタンパク質と装置（デバイス）の機能
は、インビボバイオアッセイで評価できる。ラットでの
研究は適切な母体に於ける骨形成効果がマトリックス中
に分散する骨形成タンパク質の適用量に依存することを
示す。マトリックスだけが埋め込まれるときには、如何
なる活性も観測されない。ラットモデルで行われたイン
ビボバイオアッセイが示すところでは、文献に記載され
た形式の脱塩化、グアニヂン抽出自然発生的骨マトリッ
クス材料は、上に開示したように処理されなければ、埋
め込まれても、担体として有効でなく、骨を誘発せず、
また炎症性応答と生体過敏反応を生ずる。ある種では
（例えば、猿）、同種マトリックス材料はまた、担体と
して無効のようである。以下、上述のようにして作られ
たタンパク質とマトリックス材料から骨形成デバイスを
製作するための種々の方法とそれ等の骨形成の有用性を
評価する方法を述べる。

【００９７】Ａ．ラットモデル １．埋め込み ここで言及により挿入するＳａｍｐａｔｈとＲｅｄｄｉ
により記述された骨形成にたいするバイオアッセイ
（（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８０：６５９１−６５９５）は、軟骨内骨
分化活性をモニターするのに用いられる。このアッセイ
は、テストサンプルをエーテル麻酔下のレシピエント・
ラットの皮下位置に埋め込むことにより成る。２８−３
２日齢の雄のＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットが用いられ
た。胸部領域に亘る皮膚に、無菌状態で、縦の切り込み
（１ｃｍ）をつくり、鈍い切開によるくぼみを用意す
る。約２５ｍｇのテスト・サンプルをくぼみに深く埋め
込み、切れ込みは金属製皮膚クリップで密閉する。埋め
込み日は、実験の第１日と指定する。埋め込みは１２日
目に除去する。異型位置は、直交異方性の位置の場合起
こる曖昧さの無い骨誘導の検討を許容する。ここに開示
するとおり、同種（ラット骨母体）と異種（牛科動物骨
母体）移植の両方を分析した。

【００９８】２．細胞事象 成功した移植は、タンパク質誘導軟骨内骨発展の複数段
階を通して制御された進行を示し、これは：（１）第１
日目の多形核の白血球による暫時侵潤；（２）第２、３
日目の間充組織細胞の移動と拡散；（３）第５、６日目
の軟骨細胞の出現；（４）第７日目の軟骨母体形成；
（５）第８日目の軟骨石灰化；（６）第９、１０日目の
管侵入、造骨細胞の出現及び新しい骨の形成；（７）第
１２〜１８日目の造骨細胞と骨改造の出現と埋め込まれ
たマトリックスの溶出；及び（８）第２１日目の小骨内
の増血骨髄分化を含む。結果は、新しい骨の形状が埋め
込まれた母体（マトリックス）の形状に順応することを
示している。

【００９９】３．組織構造評価 組織構造の区分化と染色は移植物内の骨形成の程度を決
定するため好ましい。移植物はＢｏｕｉｎｓ溶液中で固
定され、パラフィン中に埋没され、そして６−８μｍの
区画に切断される。トルイジン・ブルー又はヘモトキシ
リン／エオシンを用いる染色は、軟骨内の骨の究極的発
展を明瞭に示す。２０日目の移植物は、移植物が新たに
誘導された骨を含んでいるかを決定するのに、通常充分
である。

【０１００】４．生物学的マーカー アルカリ性ホスファターゼ活性は、骨形成のマーカーと
して用い得る。この酵素活動は、移植物の均質化後、ス
ペクトル分光によって決定される。活動は、第９〜１０
日目に生体中最高に達し、その後緩やかに低下する。組
織構造による骨の発展を全く示さない移植物は、これら
等の分析条件下でアルカリ性ホスファターゼ活動を殆ど
又は全く有しない。分析は、定量化と、移植物をラット
から取り除いた後、速やかに骨形成の見積を得るため、
有用である。或いは、骨形成の量は、移植物のカルシウ
ム成分を測ることによって、決定できる。

【０１０１】本発明は、その精神と本質的特性から離れ
ることなく、他の特定形式で具体化できる。本実施例
は、従って、あらゆる観点で例示的と考えるべきであ
り、限定的とされるべきではない。本発明の範囲は、以
上の記載によるよりはむしろ上記特許請求の範囲によっ
て指定されるものであり、請求項の意味および等価の範
囲に入るあらゆる変更は、従って、それ等に包括される
ものと意図するものである。

【０１０２】

【発明の効果】本発明により、ヒトを含む哺乳動物での
同種および異種移植に於ける軟骨内骨形成が可能な二量
体骨形成タンパク質のサブ・ユニットとして有用な新規
なポリペプチド鎖が得られた。

【０１０３】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１８２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：ホモサピエンス 組織の種類：海馬 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４９．．．１３４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列

【０１０４】

【表８】

【０１０５】

【表９】

【０１０６】

【表１０】

【０１０７】配列番号：２ 配列の長さ：４３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 その他の情報：物質＝ｈＯＰ１−ＰＰ 配列

【０１０８】

【表１１】

【０１０９】

【表１２】

【０１１０】配列番号：３ 配列の長さ：１９２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１０３．．１２９３ 配列

【０１１１】

【表１３】

【０１１２】

【表１４】

【０１１３】

【表１５】

【０１１４】配列番号：４ 配列の長さ：３９７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 その他の情報：物質＝ｍＯＰ２−ＰＰ 配列

【０１１５】

【表１６】

【０１１６】

【表１７】

【０１１７】配列番号：５ 配列の長さ：１９４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源： 生物名：ホモサピエンス 組織の種類：海馬 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：５０７．．１７０３ 配列

【０１１８】

【表１８】

【０１１９】

【表１９】

【０１２０】

【表２０】

【０１２１】配列番号：６ 配列の長さ：３９９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 その他の情報：物質＝ｈＯＰ２−ＰＰ 配列

【０１２２】

【表２１】

【０１２３】

【表２２】

【０１２４】配列番号：７ 配列の長さ：１０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．１０２ その他の情報：ラベル＝ＯＰＸ 記載＝ここではＸａａは詳細な説明に定義した１または
それ以上の特定されたアミノ酸の群から独立的に選択さ
れる。 配列

【０１２５】

【表２３】

【０１２６】配列番号：８ 配列の長さ：９７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．９７ その他の情報：ラベル＝ＯＰＸ−７Ｃ 記載＝ここではそれぞれのＸａａは、２０種の天然に得
られるＬ型アミノ酸またはそれらの誘導体の一つを独立
的に意味している。 配列

【０１２７】

【表２４】

【０１２８】配列番号：９ 配列の長さ：１０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列の特徴 特徴を表す記号：蛋白質 存在位置：１．．１０２ その他の情報：ラベル＝蛋白質 記載＝ここではＸａａは、２０種の天然に得られるＬ型
アミノ酸またはそれらの誘導体の一つを独立的に意味し
ている。 配列

【０１２９】

【表２５】

【０１３０】

【図面の簡単な説明】

【図１】成長ｍＯＰ−２及びｈＯＰ−２ポリペプチド
鎖：ｈＯＰ２−Ａ及びｍＯＰ−Ａのアミノ酸シーケンス
を比較している図である。

【図２】成長ＯＰ１及びＯＰ２ポリペプチド鎖：ＯＰ１
−１８、ｍＯＰ１−Ｓ，ｈＯＰ２−Ａ及びｍＯＰ２−Ａ
のアミノ酸シーケンスを比較している図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 38/22 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 37/24 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 595148888 2725 Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ Ｒｏａｄ，Ｋ ａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ ｒｉｃａ (72)発明者 エンジン オズケイナック アメリカ合衆国 01757 マサチューセッ ツ， ミルフォード， パーデゥー ドラ イブ 44 (72)発明者 デイビッド シー． ルージャー アメリカ合衆国 02132 マサチューセッ ツ， ウエスト ロックスバリー， アプ ト．４， エッジメア ロード 150 (72)発明者 サンゲーベル クベラサンパス アメリカ合衆国 02053 マサチューセッ ツ， メドウェイ， スプリング ストリ ート ６

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号５の残基３０３−３９９
   によって記述されたアミノ酸シーケンスを含むポリペプ
   チド鎖。
2. 【請求項２】 （ａ）配列表配列番号５の残基２９８−
   ３９９；または（ｂ）配列表配列番号５の残基２６７−
   ３９９；または（ｃ）配列表配列番号５の残基２６４−
   ３９９；または（ｄ）配列表配列番号５の残基２４０−
   ３９９；または（ｅ）配列表配列番号５の残基１−３９
   ９によって記述されたアミノ酸シーケンスを含む、請求
   項１のポリペプチド鎖。
3. 【請求項３】 配列表配列番号３の残基３０１−３９７
   によって記述されたアミノ酸シーケンスを含むポリペプ
   チド鎖。
4. 【請求項４】 （ａ）配列表配列番号３の残基２９６−
   ３９７；または（ｂ）配列表配列番号３の残基２５９−
   ３９７；または（ｃ）配列表配列番号３の残基１−３９
   ７によって記述されたアミノ酸シーケンスを含む、請求
   項３のポリペプチド鎖。
5. 【請求項５】 一対のジスルフィド結合ポリペプチドを
   含む二量体骨形成タンパク質のサブユニットとして有用
   なポリペプチド鎖であって、該ポリペプチド鎖が、以下
   の配列 【表１】 【表２】 を有するＯＰＳと少なくとも７０％配列相同性を有する
   アミノ酸シーケンスを含有する活性領域を含み、そして
   該活性領域は、 （ａ）ＯＰ１タンパク質の保存６システイン含有骨格を
   有し、そして該６システイン含有骨格内に１つの付加シ
   ステイン残基をさらに含む；または（ｂ）ＯＰ１タンパ
   ク質の保存７システイン含有骨格を有し、その中に１つ
   の付加システイン残基をさらに含み、 該ポリペプチド鎖を含む二量体骨形成タンパク質が、マ
   トリックスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、軟
   骨内骨形成を誘発できる配座を有する、ポリペプチド
   鎖。
6. 【請求項６】 前記活性領域が、前記ＯＰＳと少なくと
   も８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含有す
   る、請求項５に記載のポリペプチド鎖。
7. 【請求項７】 前記アミノ酸シーケンスが、 （ａ）配列表配列番号５の残基２６１−３９９；または
   （ｂ）配列表配列番号３の残基３０１−３９７；または
   （ｃ）配列表配列番号３の残基２５９−３９７；または
   （ｄ）配列表配列番号５の残基２９８−３９９を含む、
   請求項５または６のポリペプチド鎖。
8. 【請求項８】 マトリックスと連携して哺乳動物に埋め
   込まれたとき、該哺乳動物内で軟骨内骨形成を誘発でき
   る二量体骨形成タンパク質であって、該タンパク質は、
   二量体種を構成する一対のジスルフィド結合ポリペプチ
   ド鎖を含み、該ポリペプチド鎖の各々は請求項５または
   ６のいずれか一項のポリペプチド鎖である、タンパク
   質。
9. 【請求項９】 ホストセル内で組換えＤＮＡの発現によ
   って生成される請求項１から７のいずれか一項のポリペ
   プチド鎖。
10. 【請求項１０】 前記ホストセルが、原核細胞または哺
    乳動物細胞である、請求項９に記載のポリペプチド鎖。
11. 【請求項１１】 前記ホストセルが、Ｅ． ｃｏｌｉ、
    ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＳＣ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
    ｓ、および骨髄腫ホストセルからなる群から選択される
    細胞である、請求項９または１０のポリペプチド鎖。
12. 【請求項１２】 グリコシル化されている、請求項１か
    ら７のいずれか一項のポリペプチド鎖。
13. 【請求項１３】 請求項１から７のいずれか一項のポリ
    ペプチド鎖をコードする核酸。
14. 【請求項１４】 以下を含む遺伝子によりコードされる
    ポリペプチド鎖： （ａ）配列表配列番号３により記述されるDNAシーケン
    ス；または（ｂ）配列表配列番号５により記述されるDN
    Aシーケンス；または（ｃ）配列表配列番号３のヌクレ
    オチド４６７−７７１とハイブリダイズでき、そして、
    以下の配列 【表３】 【表４】 を有するＯＰＳと少なくとも７０％配列相同性を有する
    アミノ酸シーケンスを含有する活性領域を含むポリペプ
    チド鎖をコードするDNAシーケンスであって、ここで該
    活性領域は、（ａ）ＯＰ１タンパク質の保存６システイ
    ン含有骨格を有し、そして該６システイン含有骨格内に
    １つの付加システイン残基をさらに含む；または（ｂ）
    ＯＰ１タンパク質の保存７システイン含有骨格を有し、
    その中に１つの付加システイン残基をさらに含み、該ポ
    リペプチド鎖を含む二量体骨形成タンパク質が、マトリ
    ックスと連携して哺乳動物に埋め込まれたとき、軟骨内
    骨形成を誘発できる配座を有する、ポリペプチド鎖。
15. 【請求項１５】 前記活性領域が前記ＯＰＳと少なくと
    も８０％配列相同性を有するアミノ酸配列を含有する、
    請求項１４に記載のポリペプチド鎖。
16. 【請求項１６】 マトリックスと連携して哺乳動物に埋
    め込まれたとき、該哺乳動物内で軟骨内骨形成を誘発で
    きる二量体骨形成タンパク質であって、該タンパク質
    は、二量体種を構成する一対のジスルフィド結合ポリペ
    プチド鎖を含み、該ポリペプチド鎖の各々は請求項１４
    または１５のポリペプチド鎖である、タンパク質。
17. 【請求項１７】 請求項１から１２および１４から１６
    のいずれか一項に記述されるポリペプチドまたはタンパ
    ク質にのみ結合特異性を有する、単離された抗体。
18. 【請求項１８】 前記抗体が、ポリクローナル抗体また
    はモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗
    体。
19. 【請求項１９】 以下からなる群から選択されるアミノ
    酸シーケンスを含むタンパク質に対して結合特異性を有
    する、請求項１７または１８の抗体： （ａ）配列表配列番号５の残基３０３−３９９； （ｂ）配列表配列番号５の残基２９７−３９９； （ｃ）配列表配列番号５の残基２６４−３９９； （ｄ）配列表配列番号５の残基１−３９９； （ｅ）配列表配列番号５の残基１８−２５７； （ｆ）配列表配列番号３の残基３０１−３９７； （ｇ）配列表配列番号３の残基２９６−３９７； （ｈ）配列表配列番号３の残基２５９−３９７； （ｉ）配列表配列番号３の残基１−３９７；および （ｊ）配列表配列番号３の残基１８−２５９。
20. 【請求項２０】 請求項１４または１５のポリペプチド
    をコードするＤＮＡ分子。
21. 【請求項２１】 前記分子が、 （ａ）配列表配列番号３により記述されるＤＮＡシーケ
    ンス； （ｂ）配列表配列番号５により記述されるＤＮＡシーケ
    ンス；または （ｃ）配列表配列番号３のヌクレオチド４６７−７７１
    とハイブリダイズできるＤＮＡシーケンスを含む、請求
    項２０のＤＮＡ分子。
22. 【請求項２２】 一対のポリペプチド鎖を含み、そして
    哺乳動物において軟骨または骨形成を誘導する能力を有
    するタンパク質であって、該ポリペプチド鎖の各々は、
    ＯＰＸ（配列表配列番号７）により記述されるアミノ酸
    シーケンスを含み、ここで残基４１のＸａａがＣｙｓで
    ある、タンパク質。
23. 【請求項２３】 生体適合性の生体内可分解の担体と組
    み合わせた請求項８または１６のタンパク質であって、
    該担体は、緩慢な放出送り出しシステムとして作用す
    る、タンパク質。
24. 【請求項２４】 請求項１から７、９から１２、および
    １４および１５のいずれか一項のポリペプチド鎖または
    請求項８、１６、２２および２３のいずれか一項のタン
    パク質を含む、埋め込み可能な骨形成装置。
25. 【請求項２５】 哺乳動物における埋め込みのための骨
    形成装置であって、 （ａ）該哺乳動物の生体からの移動性原始細胞の流入、
    差別、および増殖を可能にするに十分な大きさの孔を有
    する生体適合性の生体内可分解のマトリックス；および
    （ｂ）請求項１から７、９から１２、および１４および
    １５のいずれか一項のポリペプチド鎖、または請求項
    ８、１６、２２および２３のいずれか一項のタンパク質
    を含む、装置。
26. 【請求項２６】 前記マトリックスが同種性骨または異
    種性骨を含む、請求項２５の装置。
27. 【請求項２７】 前記マトリックスが、脱塩され、脱脂
    されたＩ型不溶性骨コラーゲン粒子を含む、請求項２４
    から２６のいずれか一項の装置であって、該コラーゲン
    粒子は、非コラーゲン性タンパク質において涸渇され、
    そして粒子内侵入体積および表面面積を増大するように
    処理された、装置。
28. 【請求項２８】 前記処理が、 （ａ）コラーゲン線維改質剤；または（ｂ）プロテアー
    ゼ；または（ｃ）溶剤；または（ｄ）酸；または（ｅ）
    ３７℃から７５℃までの範囲内の加熱水性媒体で処理さ
    れる、請求項２７に記載の装置。
29. 【請求項２９】 前記プロテアーゼがトリプシンであ
    る、請求項２８に記載の装置。
30. 【請求項３０】 前記溶剤が、ジクロロメタン、トリク
    ロロ酢酸、およびアセトニトリルからなる群から選択さ
    れる、請求項２８に記載の装置。
31. 【請求項３１】 前記酸が、トリフルオロ酢酸またはフ
    ッ化水素である、請求項２８に記載の装置。
32. 【請求項３２】 請求項２７の装置を生成するための方
    法であって、粒子内侵入体積および表面面積を増大する
    ようにコラーゲンを処理する工程を含む、方法。
33. 【請求項３３】 マトリックスと提携させた、請求項１
    から７、９から１２、および１４および１５のいずれか
    一項のポリペプチド鎖、または請求項８、１６、２２お
    よび２３のいずれか一項のタンパク質であって、ここで
    該マトリックスが、 （ａ）同種性骨；または（ｂ）異種性骨；または（ｃ）
    粒子内侵入体積および表面面積を増大するようにプロテ
    アーゼまたは線維改質剤で処理された、粒子状のタンパ
    ク質抽出し、脱塩した異種性骨；または（ｄ）コラーゲ
    ン、グリコール酸および乳酸のホモポリマーまたはコポ
    リマー、ヒドロキシアパタイト、およびリン酸カルシウ
    ムから選択される材料；または（ｅ）ゆるく接着された
    粒状物質の形状保持固体；または（ｆ）成形された有孔
    性固体；または（ｇ）咀嚼組織を含む、ポリペプチド鎖
    またはタンパク質。
34. 【請求項３４】 前記同種性骨が、粒子状の脱塩し、グ
    アニジン抽出した同種性骨である、請求項３３に記載の
    ポリペプチド鎖またはタンパク質。
35. 【請求項３５】 前記異種性骨が、粒子状のタンパク質
    抽出し、脱塩した異種性骨である、請求項３３に記載の
    ポリペプチド鎖またはタンパク質。
36. 【請求項３６】 前記リン酸カルシウムが、リン酸三カ
    ルシウムである、請求項３３に記載のポリペプチド鎖ま
    たはタンパク質。
37. 【請求項３７】 前記形状保持固体がコラーゲンであ
    る、請求項３３に記載のポリペプチド鎖またはタンパク
    質。
38. 【請求項３８】 前記咀嚼組織が筋肉である、請求項３
    ３に記載のポリペプチド鎖またはタンパク質。
39. 【請求項３９】 請求項１から７、９から１２、および
    １４および１５のいずれか一項のポリペプチド鎖、また
    は請求項８、１６、２２および２３のいずれか一項のタ
    ンパク質を含む、活性ヘテロ二量体骨形成タンパク質。
40. 【請求項４０】 前記ヘテロ二量体が、ジスルフィド結
    合により結合されている、または他の様式で会合されて
    いる、請求項３９のヘテロ二量体タンパク質。
41. 【請求項４１】 請求項３９または４０のヘテロ二量体
    タンパク質を生成する方法であって、２つまたはそれ以
    上のポリペプチド鎖を酸化し、リフォールディングする
    工程を含む、方法。