JPH03501128A - ヌクレオシドおよびポリヌクレオチドチオホスホラミダイトおよびホスホロジチオエイト化合物並びに方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオシドおよびボリヌクレ゛オチドチオホスホラミダイトおよびホスホロジ チオエイト化合物並びに方法ここに記載する発明をなしたことに導いた研究は、 一部分、アメリカ合衆国の資金で支持された。したがって、米国政府は、ここに 記載する発明に対しである種の法令で定められた権利を有する。

これは、１９８８年５月２６日に出願されたわれわれの早く出願された米国特許 出願第１９８．８８６号の一部継続出願である。

本発明は、リンに結合した類催体を有するポリヌクレオチドの製造においてとく に有用である、新規なかつ有用なリン化合物に関する。

本発明は、新規なかつ有用なヌクレオシドチオホスホルアミダイト、ポリヌクレ オチドジチオエイトホスホルアミダイトおよびポリヌクレオチドホスホルチオア ミダイトホスホルアミダイト化合物ならびに方法に関し、ここでこれらの化合物 はホスホロジチオエイト、ホスホロチオアミダイト、ホスホロチオトリエステル 、およびホスホロチオエイトインターヌクレオチド結合を存する新規ななモノヌ クレオチドおよびポリヌクレオチドの合成に使用することができる。これらのモ ノヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、多くの生物学的、治療学的、およ び診断の用途に使用することができる。

可能な治療学的用途は、腫瘍、ウィルスの感染およびバクテリアの感染の処置を 包含する。さらに、これらの化合物は、金属イオン、トキシン、金属封鎖剤およ び、細胞および組織中の特異的部位に対するポリヌクレオチドおよびタンパク質 の生化学的反応性を変更する他の試薬を放出するために使用することができる。

これらの化合物は、また、診断の目的に使用することができる。蛍光性のまたは 他の化学的に反応性の試薬、抗原、抗体、タンパク質、および金属イオンをこれ らの化合物に取り付けることによって、細胞、組織、および体液、例えば、血液 および尿の病気および正常および異常の生化学を診断するために使用することが できる。また、現代の生物学および化学において同様によく多くの用途が存在す る。例えば、これらの化合物は、ＤＮＡの配列決定および切断、Ｘ線結晶学、Ｎ ＭＲｌおよび電子顕微鏡検査、および酵素反応の研究のための改良された方法の 開発に使用することができる。

高い収率の方法は、自然のインターヌクレオチド結合を有する配列が定められた ポリヌクレオチドの迅速な合成のために現在利用可能である（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕ ｔｈｅｒｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０＋　２８１−２８５＋　１９８５　；　 Ｍ、Ｈ，ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＳ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ、米国特許第４， ４１５．７３２号；　Ｍ、Ｈ，ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＭ、Ｄ、Ｍａｔｔｅｕ ｃｃｉ　、米国特許第４．４５８，０６６号）、この方法における重要な工程は 、水性ヨウ素を使用する中間体のホスファイトトリエステルの天然に産出するホ スフェートトリエステルへの酸化である。

これらのホスファイトトリエステルは、また、無水条件下に、アミンまたはアン モニアおよびヨウ素で酸化して種々の報告された量のホスホルアミダイトを生成 するか、あるいはイオウで酸化してホスホルチオエートを生成することができる （Ｂ、ｕｚｎａｎｓｋｉ、　Ｍ、Ｋｏｚｉｏｌｋｉｃｖｉｃｚ、　Ｗ、Ｊ、５ｔ ｅｃ、　Ｇ、Ｚｏｎ、　Ｋ、５ｈｉｎｏ−ｚｕｋａ、およびり、Ｍａｒｚｉｌｉ 、　Ｃｈｅｍｉｃａ　５ｃｒｉ　ｔａ　２６＋　２２１．２２４＋１９８６　； 　Ｍ、Ｊ、Ｎｅｍｅｒおよびに、に、０ｇ１ｌｖｉｅ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ　Ｌｅｔｔ。

２１、４１４９−４１５２．１９８０）、　Ｈ−ホスホネートインターヌクレオ チド結合を使用する他の方法を、また、使用してホスホルアミダイトを合成する ことができる（Ｂ、Ｃ，Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｔｅｔｒａｈｅ−ｄｒｏｎ　Ｌｅ ｔｔ、２７．５５６５−５５６８．１９８６）。不都合なことには、これらの手 順のいずれも、ホスホロジチオエートまたはホスホロチオアミダイトのインター ヌクレオチド結合を含をするポリヌクレオチドを合成するために使用することが できない。

ウリジン２’、３’−環状ホスホロジチオエートの製造は、文献（Ｆ、Ｅｃｋｓ ｔｅｉｎ＋　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　９２＋　４７１８−４７３２＋ 　１９７０）に記載されている。不都合なことには、この方法は、ジチオエート 結合を含有するポリヌクレオチドの合成に有用なデオキシヌクレオシドホスホロ ジチオエートまたはヌクレオシドホスホロジチオエートの合成に使用することが できない。この手順は、また、ホスホロジチオエートおよびホスホロチオエート の部分を有するヌクレオチドの混合物を生成する。さらに、ウリジン２’、３’ −環状ホスホロジチオエートの収率はわずかに２８％であり、そして環状ホスホ ロジチオエートの合成における使用するＲ２０．の酸度および高い温度は、デプ リネイションを行うであろう保護されたデオキシアデノシンを使用するこの手順 の使用を排除するであろう。

同様に、アデノシン環状３’　、５’−ホスホロジチオエートは、適当な保護さ れたアデノシンを４−ニトロフェニルホスホルアノリドクロリドチオエートで処 理し、次いでカリウムｔ−ブトキシドで環化し、そして水素化ナトリウム／二硫 化炭素との反応においてジチオエートに転化することによって合成することがで きる（Ｊ、Ｂｏｒａｎｉａｋおいて縁、５ｔｅｃ、　Ｊ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、Ｔｒａｎｓ、Ｉ、　１６４５．１９８７）。不都合なことには、これら の反応条件および低い合成収率は、ホスホロジチオエート結合を有するオリゴヌ クレオチドの合成のためのこの化学の使用を排除する。

本発明は、リンにおいて構造の変更を有する新規なかつ有用なヌクレオチド、ジ ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを提供する０本発明は、また、これらの化 合物の合成に最初に導いた方法を記載する。

一般に、本発明による化合物は、一般式１および■：により表すことができる、 式中、Ｒ＋　はＨまたはブロッキング基であり；ｐ　（Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ ）はリン誘導体であり、こうしてり、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚは置換基であり、ここ で異種原子はリンに共有結合しており；ＡはＫまたはＫＲ：であり、ここでＫは ＯＨ，Ｈ，ハロゲン、ＳＨ，ＮＨｚまたはアジドであり、そしてＫＲｔはＫとし て酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種原子置換もしくは非置換の ブロッキング基であり；Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であ り；Ｒ１はＨまたはブロッキング基である。

置換基Ｖ、Ｗ、ＸおよびＹはまた、異種原子置換もしくは非置換のアルキル、了 り−ル、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、 シクロアルケニル、アラルケニル、アルキニル、アラルキニル、またはシクロア ルキニル基に共有結合することができる。

Ｌ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺが置換基であり、ここで異種原子がリンに共有結 合している、−ｉ式Ｉおよび■の化合物は、異種原子がイオウ、窒素および酸素 であるものを包含する。置換基■はリンおよびＨまたはＲ４に単結合した酸素で あり、ここでＲ４は異種原子置換もしくは非置換のアルキル、アリール、アラル キル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アラルケニル、 シクロアルケニル、アルケニル、アラルキニル、またはシクロアルキニル基であ る。置換基ＹはリンおよびＨまたはＲ４に単結合した酸素であり、ここでＲ１は 異種原子置換もしくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキ ル、シクロアルキルアルキシ、アルケニル、アラルケニル、シクロアルケニル、 アルキニル、アラルキニル、またはシクロアルキニルである。

置換基ＷおよびＸは窒素の異種原子であり、ここでＷは第一アミノ、ＮＨＲ，で あり、そしてＸは第二アミノ、ＮＲＪＲＪｌｅである。Ｒ１およびＲ１は別々に 各々異種原子置換もしくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、シクロア ルキル、シクロアルキルアルキル、アラルケニル、シクロアルケニル、アルケニ ル、アラルキニル、シクロアルキニルまたはアルキニル基である。Ｒ，およびＲ １は、−緒になったとき、主鎖中に５個までの炭素原子を有しかつ合計１０個ま での炭素原子を有するアルキレン鎖を形成し、鎖の両末端の原子価結合はＲ６お よび、が結合している窒素原子に結合しており、そしてＲ４および、は、それら が結合する窒素原子と一緒になったとき、窒素、酸素、およびイオウの群からの 少なくとも１つの追加の異種原子を含む窒素の複素環を形成する。

一般式Ｉの新規な化合物は、２つのクラスＩａおよびＩｂをもつ；クラスＩａは リンが２つの置換基、ＸおよびＹの各々に異種原子を通して単結合しており、こ こでＹがＲ３に結合しているものから成り；そしてクラスｒｂはＺがリン十基■ およびＹからの２つの他の置換基に二重結合したイオウであり、ここでこれらの 置換基の各々の異種原子がリンに単結合しているものである。クラスＴａにおけ る化合物は、ホスホロジチオエートおよびホスホロチオエートのインターヌクレ オチド結合を含有するポリヌクレオチドの合成において有用である。クラスＩｂ における化合物は、治療および生物学の研究においておよびホスホロジチオエー ト部分を有するヌクレオチドの合成における中間体として使用である。

一般式■の化合物は、すべての化合物がＺまたはＬに二重結合しそして置換基ｖ 、ｘ、ｙまたはＷの１つに単結合したリンを有するものである。化合物■は、好 ましくは、イオウに二重結合しそしてｙ、ｖ、ｗまたはχに単結合しているリン である。一般式Ｈの化合物は、また、Ｌがリン＋Ｙに二重結合した酸素であり、 そしてＹはリンに単結合している。化合物■は、種々の治療、診断、および生物 学の研究のために、および、また、治療、診断、または研究の試薬として有用で ある。ホスホロジチオエート、ホスホルチオアミダイト、ホスホロチオエートの トリエステルおよびホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートのインター ヌクレオチド結合を含有するポリヌクレオチドの合成のために使用である。

ここで使用するとき、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドのための記号は、生 化学の命名の推奨のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢコミッション（ＩＵＰＡＣ−ＩＬＩＢ　 Ｃｏｍｍ１ｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｒｅｃｏｏ＋ａ＋ｅｎｄａｔｉｏｎｓ）　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　９＋　４ ０２２＋　１９７０）に従う。

本発明において使用するいくつかの化学用語は、次のとおりである：これらの定 義は、特別の場合を除いて、これらの用語が異なるように定義されないかぎり、 適用される。

アルキル−１〜２０（好ましくは１〜１２）個の炭素原子を有する、非環状の直 鎖状もしくは分枝鎖状の炭化水素基。

異種原子、好ましくは酸素、イオウ、または窒素は、炭素原子、好ましくは１〜 ４個の炭素原子と、この非環状の直鎖状もしくは分枝鎖状の基において、置換す る（か、あるいは炭素原子に結合する）することができる。

アリール−芳香族炭化水素から１つの水素原子の除去により誘導体された有機基 。この基は、芳香族炭化水素環系の一部として１または２以上の異種原子を含有 することができる。

アラルキル−１または２以上、好ましい１〜３、のアリール基がアルキルの水素 原子と置換されている有機基。

シクロアルキル−３〜２０（好ましくは３〜１２）の炭素原子を含有する環状炭 化水素基；異種原子、好ましくは酸素、イオウ、および窒素はこの環状炭化水素 基中の原子と置換（または結合）することができる。

シクロアルキルアルキル−１または２以上、好ましくは１〜３、のシクロアルキ ル基が１〜２０、好ましくは１〜１２の炭素原子を含有するアルキル基の水素原 子と置換したを機基。

アルキニル−少なくとも１つの二重結合および２〜２０（好ましくは３〜１０） の炭素原子を有する、脂肪族の、不飽和の、直鎖状もしくは分枝鎖状の炭化水素 基、異種原子、好ましくはイオウ、酸素、および窒素は、この基中の飽和炭素原 子と置換するか、あるいは飽和炭素原子に結合することができる。

アラルケニル−１または２以上、好ましくは１〜３、のアリール基がアルケニル 基の水素原子と置換されている有機基。

シクロアルケニル−３〜２０（好ましくは４〜１２）の炭素原子、および少なく とも１つ二重結合を有する環状炭化水素基。異種原子、好ましくは酸素、イオウ および窒素は、この基中の飽和炭素原子と置換するか、あるいは飽和炭素原子に 結合することができる。

アルキニル−少なくとも１つの三重結合および２〜２０（好ましくは３〜１０） の炭素原子を含有する、脂肪族、不飽和、直鎖状もしくは分枝鎖状の炭化水素基 、異種原子、好ましくは酸素、イオウ、そして窒素は、この基における飽和炭素 原子と置換（または結合）することができる。

アラルキル−１または２以上、好ましくは１〜３、のアリール基がアルキニルの 水素原子と置換されている、有機基。

シクロアルキニル−６〜２０、好ましくは７〜１２の炭素原子、および１つの三 重結合を含有する、環状炭化水素基。

異種原子、好ましくは酸素、イオウおよび窒素は、この基中の飽和炭素原子と置 換することができる。

異種原子置換基−アルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロア ルキルアルキル、アラルケニル、アラルケニル、シクロアルケニル、アルケニル 、アラルキニル、およびシクロアルキニルを包含する、すべてのこれらの基にお いて、異種原子、好ましくはイオウ、酸素、窒素、そしてハロゲンは、炭素に結 合した水素原子と置換することができる。各基についての定義において記載した ように、異種原子、好ましくは酸素、イオウおよび窒素は、アルキル、アリール 、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アラル ケニル、シクロアルケニル、アルケニル、アルキニル基およびシクロアルキニル 基中の飽和位置にある炭素原子とＷ摸することができる。異種原子、好ましくは イオウ、酸素、および窒素は、また、アリール基の一部として炭素と置換するこ とができる。もちろん、異種原子は、置換すべき炭素原子がリンに結合した異種 原子に接続している基中の炭素原子と置換することができない。

ホスホロジチオエートのインターヌクレオチド結合−ＢおよびＡが前に定義した とおりである、次の構造で例示することができる、一般式５′−ヌクレオシド− ｏ−ｐｓ、−０−ヌクレオシド−３′を有するインターヌクレオチド結ホスホロ チオエートのインターヌクレオチド結合−ＢおよびＡが前に定義しとおりである 、次の構造で例示することができる、一般式５′−ヌクレオシド−ｏ−ｐｏｓ− ｏ−ヌクレオシド−３′を有するインターヌクレオチド結合。

ホスホルチオアミダイトのインターヌクレオチド結合−Ｂ　、　Ａ　、　Ｒｈお よびＲ１が前に定義したとおりである、次の構造で例示することができる、一般 式５′−ヌクレオシド−ＯＰＳＮＨＲ＆　Ｏ−ヌクレオシド−３′および５′− ヌクレオシド−ＯＰＳＮＲ６ＲＩ　Ｏ−ヌクレオシド−３′を有するインターヌ クレオチド結合。

ホスホルアミダイトのインターヌクレオチド結合−Ｂ。

Ａ、Ｒ＆およびＲ７が前に定義したとおりである、次の構造で例示することがで きる、−ｍ式５′−ヌクレオシド−〇　−ＰＯＮＨＲ＆　−０−ヌクレオシド− ３′および５′−ヌクレオシド−〇　ＰＯＮ）ｌＲ６Ｒ７０−ヌクレオシド−３ ′を有するインターヌクレオチド結合。

ホスホロチオトリエステルのインターヌクレオチド結合−ＢおよびＡが前に定義 したとおりである、次の構造で例示することができる、一般式５′−ヌクレオシ ド−〇−ＰＳＯＲ４−ヌクレオシドー３′を有するインターヌクレオチド結合。

置換基Ｗを誘導することができるアミンは、次のものを包含する：広範な種類の 第一アミン、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロ ピルアミン、アニリン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、２０までの炭 素原子を含有する多環式アミン、１０までの異種原子、好ましくは酸素、イオウ 、窒素またはハロゲンを有する、異種原子置換アリールまたはアルキルアミン、 および２０までの炭素原子を含有する同様なアミン。置換基Ｘを誘導体すること ができるアミンは、次のものを包含する：広範な種類の第二アミン、例えば、ジ メチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メチ ルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシクロプロピルアミン、エチ ルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチル アミン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルホリン、チオモリホリン、ピロリジ ン、ピペリジン、２，６−シメチルビペリジン、ピペラジン、および２０までの 炭素原子およびイオウ、酸素、窒素およびハロゲンから成る群からの１０までの 異種原子を含有する、異種原子置換アルキルまたはアリールアミン。

上の式中ＯＢにより表されるヌクレオシドおよびデオキシヌクレオシド塩基（ｂ ａｓｅ）は、よく知られており、そして次のものを包含するニブリン、例えば、 アデニン、ハイポキサンチン、グアニン、およびそれらの誘導体、およびピリミ ジン、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、およびそれらの誘導体。

上の式中のＲ，、Ｒ，およびＲ８により表されるブロッキング基は、次のものを 包含するニトリフェニルメチル（トリチル）、ｐ−アニシリルジフェニルメチル （メトキシトリチル）、ジ−ｐ−アユシルフェニルメチル（ジメトキシトリチル ）、ピバリル、アセチル、４−メトキシテトラヒドロビラン−４−イル、テトラ ヒドロピラニル、フェノキシアセチル、イソブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチ ルジメチルシリル、トリイソプロピルシリル、アルキルまたはアリールカルボニ ル、およびこの分野においてよく知られている同様なブロンキング基。

化合物ＩａおよびＩｂの合成の一般的反応の概要Ａを、次に示す。

好ましい反応の概要Ａは、次のように表される：■ａ　Ｖｍａ 式中、Ｒ１，Ｒ，、Ｂ、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＬおよびＹは上に定義した通りであり ；そしてＭはリンおよびＲ，に単結合したイオうであり、ここでＲ８は異種原子 置換もしくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シク ロアルキルアルキル、アラルケニル、シクロアルケニル、アルケニル、アルキニ ル、アラルケニル、またはシクロアルキニルである。化合物■および■ａは、リ ンがＹに単結合で、そしてＺまたはＬに二重結合で結合しているものである。こ うして、化合物■および■ａは化合物■の部分集合であることが理解できる。同 様に、化合物ＶおよびＶａは化合物１ａの部分集合である。

反応概要Ａの方法は、ｍａをＩＶａ、好ましくはビス（ジメチルアミノ）クロロ ホスフィンまたはジビロリジニルクロロホスフィンと、トリエチルアミンの存在 下に、縮合させてＩＸａを生成することを包含する。メルカプタン、好ましくは ２．４−ジクロロベンジルメルカプタンを、第１工程において発生したトリエチ ルアミン塩酸塩の存在下に、添加すると、ＩＸａはＶａに転化する。表１は１系 列のＶａ誘導体の”Ｐ−Ｎ？ＩＲ特性決定データを記載し、ここでヌクレオシド ベース（Ｂ）、アミンの官能価（Ｘ）、およびメルカプタン（Ｍ）は系統的変化 させである。ＶａとＶａおよび活性化剤（例えば、テトラゾール、５−置換テト ラゾールおよび置換トリアゾール、テトラフルオロボレートのアルキルアンモニ ウム塩、アリールアンモニウム塩、置換および非置換のピリジウム塩、および酸 の置換および非置換のピリジウムおよびイミダゾリウムの塩、５−置換テトラゾ ール、ハロゲン化カルボン酸およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）ホスフ ァイトを生成し、これはジヌクレオシド、Ｓ−（２，４−ジクロロベンジル）ホ スファイトを生成し、これは、好ましくは、イオウで酸化して■ａ、Ｐ（Ｘ、Ｚ ）とのジヌクレオシドホスホロジチオエートトリエステルを生成する。もちろん 、し−ブチルペルオキシドを使用する酸化は、対応するジヌクレオシドホスホロ チオエートトリエステルＰ（Ｘ、Ｌ）を生成する。

表１．デオキシヌクレオシドホスホルチオアミダイト（Ｖａ）の”Ｐ−ＮＭＲ特 性決定 Ｔ　ピロリジニル　２．４−ジクロロベンジル　１６４．８　；　１６１．８Ｔ 　ピロリジニル　４−クロロベンジル　１６４．２　；　１６１．ＯＴ　ジメチ ルアミノ　４−クロロベンジル　１７２．３　；　１７０．５Ｔ　ジメチルアミ ノ　２．４−ジクロロベンジル　１７２．１　？　１７０．４０１　ピロリジニ ル　２．４−ジクロロベンジル　１６５．１　？　１６２．６（、”　ヒロリ’ ；ニル４−）ｙｏｏへ７シル１６１．８；１５９．９ＣＩ！　ジメチルアミノ　 ４−クロロベンジル　１７１．９　；　１７０．７ＣＩ！　ジメチルアミノ　２ ．４−ジクロロベンジル　１７２．０　；　１７１．０Ａ１２　ピロリジニル　 ２．４−ジクロロベンジル　１６３．８　；　１６２．７ＡＩ２　ピロリジニル 　４−クロロベンジル　１６３．５　；　１６２．３Ａ　ｌ　ｔ　ジメチルアミ ノ　４−クロロベンジル　１７１．８　；　１７０．９Ａ”　ジメチルアミノ　 ２，４−ジクロロベンジル　１７１．７　；　１７０．９表１　（続き） ｃ”　ピロリジニル　２．４−ジクロロベンジル　１６３．９　；　１６０．９ Ｇ”　ピロリジニル　４−クロロベンジル　１６３．４　；　１６１．６Ｇ”　 ジメチルアミノ　４−クロロベンジル　１７１．５　；　１６９．５Ｇ１　ジメ チルアミノ　２．４−ジクロロベンジル　１７１．９　；　１６９．６”　”Ｐ −ＮＭＲはＣＤＣｌ３中でブルンカー（Ｂｒｕｃｋｅｒ）　ＷＭ−２５０で、外 部標準として８５％の水性Ｐ２０．を使用して記録した。Ｔ。

Ｃ富２．Ａｇ３、およびＧｉｌは、それぞれ、チミン、Ｎ−ベンゾイルシトシン 、Ｎ−ベンゾイルアデニン、およびＮ−イソブチリルグアニンを意味する；Ｒ３ はジメトキシトリチルである；Ａは水素である。

化合物１ａおよび■の合成の第２の一般的反応の概要を次に示す。

好ましい反応の概要は、次のように表される：■ａ ■ａ こうして、理解できるように、反応の概要ＡおよびＢの方法は、■およびＶａを 発生させるための、２つの異なる試薬を使用すること以外は同一である。試薬Ｖ ａはビス（第二アミン）クロロホスフィンであるが、ＩＶｂはビス（第二アミン ）メルカプチルホスフィンである。ＩＶａの使用は、これらのビス（第二アミン ）クロロホスフィンが蒸留によりより容易に精製されるので、■およびＶａに導 くより一般的反応である。

もちろん、ＩＶａの使用は中間体ジアミダイト、■およびＩＸａを発生させ、こ れらにメルカプタンを添加してＶおよびＶａを生成する。■およびＶａに直接法 ＜ＩＶｂの使用は、化合物■に制限され、ここでチオジアミダイトは分解なしに 結晶化または蒸留により精製することができる。反応の概要Ｂの方法は、■ａと ４−クロロベンジルメルカプチル−ビス（ジイソプロピルアミノ）ホスフィンで あるＩＶｂとを縮合させて、触媒としてテトラゾールを使用して、Ｖａを生成す る反応を包含する。ＶａとＶＩａおよび活性化剤（例えば１．５−置換テトラゾ ールおよび置換トリアゾール、テトラフルオロボレートのアルキルアンモニウム 塩、アリールアンモニウム塩、置換および非置換ピリジニウム塩、および酸の置 換および非置換ピリジニウムおよびイミダゾリウム塩、５−置換テトラゾール、 ハロゲン化カルボン酸およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の反応は、■ ａ１ジヌクレオシド５−（４−クロロベンジル）ホスファイトを生成し、これは 好ましくはイオウで酸化して、■ａ、、Ｐ　（Ｙ、Ｚ）とのジヌクレオシドホス ホロジチオエートトリエステルを生成することができる。

もちろん、ｔ−ブチルペルオキシドを使用する酸化は、対応するジヌクレオシド ホスホロチオエートトリエステル、Ｐ（Ｙ、Ｌ）を生成する。テトラゾールより 酸性の活性化剤、例えば、ある種の５−置換テトラゾール（例えば、５−（ｐ− ニトロフェニル）テトラゾール）は、首尾よく使用してＶａを活性化することが できる。しかしながら、ある種の副反応は正しいピロリジノの収率を減少するこ とがある。

第３の反応の概要、概要Ｃ１は、また、化合物■の合成の目的に発見された。化 合物■の合成の一般的反応の概要Ｃは次のとおりである： 好ましい反応の概要Ｃは、次のように表される：ａ 式中、Ｒ、Ｒｓ　、　Ｂ　、　Ａ　、　Ｘ　、　Ｗ　、　Ｚ　、　Ｙ、および■ は上に定義した通りであり、そしてＱはＨである。化合物■およびＸＩＩａは、 Ｚがリン＋リンに単結合している置換基Ｖ、Ｗ。

ＸおよびＹの群からの他の置換基に二重結合しているイオウであるものである。

これらはＸＩまたはＸｌａから誘導される。化合物Ｘ■およびＸＩＩａは、また 、してあることができ、Ｌはリン＋リンに単結合しているＹに二重結合した酸素 である。これらはＸＩまたはＸＩａから誘導される。

反応の概要Ｃの方法は、保護されたヌクレオシドおよびビス（第二アミン）クロ ロホスフィンからのＩＸａの合成および引き続＜Ｘａを生成するＶａとの縮合を 包含する。ＸａとＨ２Ｓおよび活性化剤、例えば、テトラゾールとの反応は、ジ ヌクレオシドパーホスホノチオエート、Ｘｌａ、を生成し、後者はイオウで酸化 してジヌクレオシドホスホロジチオエート、Ｐ（Ｚ、Ｙ）に；アミンの存在下に ヨウ素で酸化してホスホルチオアミダイト、Ｐ（Ｚ、ＷまたはＸ）に；対応する ジヌクレオシドホスホロジチオエートをアルキル化してホスホロチオエートトリ エステル、Ｐ（Ｚ、Ｙ）に；アルコールの存在下にヨウ素で酸化してホスホロチ オエートトリエステル、Ｐ（Ｚ、Ｖ）に；および水性ヨウ素で酸化してホスホロ チオエート、Ｐ（Ｚ、Ｖ）に、化学的に転化することができる。

化合物Ｘａは、また、メルカプタンと活性化剤、例えば、テトラゾールの存在下 に反応させて、ジヌクレオシドホスホロチオエート、■ａ、を生成することがで き、後者はイオウで酸化してジヌクレオシドホスホロチオエート、Ｐ（Ｚ、Ｙ） に；およびｔ−ブチルペルオキシドまたは水性ヨウ素で酸化してホスホロチオエ ート、Ｐ（Ｌ、Ｙ）に、化学的にＸＩ［ａに転化することができる。こうして、 理解できるように、方法Ｃにより合成された化合物Ｘ■およびＸｆｆａは、２つ の中間体Ｘ　Ｉ’ａおよび■ａからか、あるいはこれらの２つの中間体の１つか ら誘導することができる。例えば、ＸＩＩａ、ここでＰ（Ｚ、、Ｙ）は中間体Ｘ Ｉａまたは■ａから誘導することができる。ＸＩｒａここでＰ（ＺおよびＸまた はＷ）ＸＩＩａについて、ＸＩａを使用してこのクラスの化合物を合成すること ができる。

リンに共有結合した置換基を含有する異なる異種原子を有する構造式■の本発明 の新規な化合物は、こうして、方法Ａ。

ＢおよびＣにより調製することができる。ＺおよびＹがリンに結合しており、し たがってジメチルスルホキシドホスホロジチオエートを生成する場合において、 方法Ａ、ＢおよびＣのすべてを使用して同一化合物を生成することができる。こ れは、また、ある種の他の化合物、例えば、ＹおよびＬがリンに結合しているＨ についての場合である。あるいは、リンに結合したＺおよびＸまたはＷまたは■ （ここで■はリンにおよび上に定義したように水素以外のある基に共有結合して いる）を有する化合物■を、方法Ｃにより合成することができる。こうして、理 解できるように、これらの方法は、■により記載されるすべての化合物の合成に 導く。

次いで、■およびＶａにより定義される部分集合として、化合物Ｉおよび■を使 用して、ホスホロジチオエート、ホスホルチオアミダイトおよびホスホロチオエ ートのインターヌクレオチド結合を有するポリヌクレオチドを合成することがで きる。これらの方法は、ポリマーの支持体の技術に基づくか、あるいはこれらの 支持体の不存在下に完結することができる。

もちろん、本発明のヌクレオシド部分は、追加のインターヌクレオチドホスフェ ートジエステル結合と組み合わせて１または２以上のリン部分を有するオリゴヌ クレオチドとして縮合される、ある数のヌクレオシドを包含することができる。

これらのオリゴヌクレオチドは、また、Ｈに示すようにリン部分のみを含有する ことができる。■におけるようなここに記載する結合を含むインターヌクレオチ ド結合の混合物あるいは■に記載するような結合のみを有するポリヌクレオチド は、本発明の１つの面と、他のポリヌクレオチド結合を合成する好ましい従来の ホスホルアミダイトの方法との組み合わせからなる新規な方法を使用して調製さ れる（他の方法、例えば、ホスフェートトリエステルおよびホスフェートジエス テルおよびＨ−ホスホネートの手順を、また、使用してこれらの追加の結合を合 成することができるが）。これらの縮合工程はポリマーの支持体上で最良に実施 されるが、ポリマー以外の支持体を使用することができる。

本発明はデオキシヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはポリ デオキシヌクレオチドを含有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ ＲＮＡ）の化学的合成においてとくに有用である。同一のポリヌクレオチドの一 部として任意の組み合わせでデオキシヌクレオチドおよびヌクレオチドの要素を 含有するハイブリッド構造は、また、化合物Ｉおよび■を使用して可能である。

これらの新規なりＮＡまたはＲＮＡ化合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する ような結合を含有する１または２以上のインターヌクレオチドのリンにおいてリ ンに共有結合した類似体の置換基り、Ｗ、Ｖ。

Ｘ、Ｙ、またはＺを有する。

一般式ｌｂに従う化合物の合成は、次の反応の概要、概要りにより表すことがで きる： 好ましい反応の概要りは、次のように表される：ｍａ　ＸＩ［Ｉａ 式中、Ｒ１，ＢＡ、Ｑ、Ｘ、Ｚ、Ｙ、Ｗ、および■は上に定義した通りである。

化合物Ｘ■およびＸＶＩａは、すべての化合物がＺに二重結合しそして、また、 ■＋Ｙに単結合したリンを有する。

概要りの方法は、ｍａおよびＸ■またはＸＩ［［ａからのＸＩＶおよびＸＩＶａ の合成を包含する。ＸＩＶまたはＸＩＶａとＨａｓおよび活性化剤、例えば、テ トラゾールとの反応は、新規な化合物、ＸＶａ、ヌクレオシドビーホスホノチオ エートを生成し、後者の化合物は固体で酸化してヌクレオシドホスホロジチオエ ート、Ｐ（Ｚ、Ｖ、Ｙ）に、およびヌクレオシドホスホロジチオエートをヌクレ オシドホスホロジチオエートトリエステル、Ｐ（Ｚ、Ｖ、Ｙ）に、化学的に転化 することができる。

本発明による好ましい新規な化合物は、一般式１ａおよび■の化合物であり、式 中（Ｉａについて）ＹはリンおよびＲ２に単結合したイオウを有する置換基であ り、ここでＲ３は異種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；ＡはＨ でありＳＲ，はブロッキング基であり、Ｂはブロッキング奉からの技術を有する ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドのベースであり；そしてＸは第二アミ ノ基であり；そして（■について）Ｚはリンに二重結合したイオウであり；Ｙは リンにおよびＲ３に単結合したイオウであり、ここでＲ３は異種原子置換もしく は非置換のブロンキング基であり；Ｂは技術がｔＲｉＪしたブロッキング基を有 するヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドのベースであり；そしてＲ３はＨ である。次いで、これらの新規な化合物を使用して、Ｐ（Ｚ、Ｙ）をもつホスホ ロジチオエートのインターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを調製 する。これらのオリゴヌクレオチドは、また、好ましいかつ新規な新しい化学的 実在物である。

本発明の新規な化合物は、概要Ｃに示すように、当業者が認識する出発物質、例 えば、ＩＸａ、ヌクレオシド３′−ホスホルアミダイトから調製することができ る。初期の反応は、ヌクレオシドを有機溶媒、例えば、遊離した塩酸を吸収する ためにトリエチルアミンを含有するジオキサンまたはテトラヒドロフラン中に溶 解し、そしてビス（ジアルキルアミノ）クロロホスフィンを添加することによっ て達成される。生ずるヌクレオシドホスホロジアミダイトを、単離しないで、第 ２ヌクレオシドと反応させる。この反応の単離した生成物は、ジヌクレオシドジ アルキルアミノホスホルアミダイト、Ｘａ。

であり、後者は２つの異なる方法で反応させてＸＩＩａを生成することができる 。好ましい方法は、Ｘａをメルカプタンとテトラゾールの存在下に反応させて■ ａを生成し、さらに後者を元素状イオウで処理して、デオキシヌクレオチドホス ホロジチオエート、ＸＩ［ａ、を形成することである、ここでＰ（Ｚ、Ｙ）。第 ２の方法は、Ｘａを硫化水素およびテトラゾールで有機溶媒、例えば、アセトニ トリル中で処理して、ジヌクレオシドＨ−ホスホノチオエート、ＸＩａ、を生成 することである。単離したジヌクレオシドＨ−ホスホノチオエートを元素状イオ ウと、有機溶媒、例えば、トルエンおよびルチジンの混合物中でさらに反応させ ると、ジヌクレオシドホスホロジチオエート、ＸＩ［ａ、が生成する、ここでＰ （Ｚ。

Ｙ）。ジヌクレオシドホスホロジチオエートとチオールをアルキル化することが できるアルキルまたはアリールハライドと反応させると、イオウ保護されたジヌ クレオシドホスホロジチオエートトリエステル、ＸＩＩａ、が生成する。次いで 、本発明のこれらの新規な化合物を使用して、選択したリンのインターヌクレオ チド結合においてホスホロジチオエート部分を有するポリヌクレオチドを合成す ることができる。これは、まずＲｓを普通の方法によりＸＩ［ａから除去して■ を生成し、次いでこの化合物を好ましくはポリヌクレオチドの調製においてシン トン（ｓｙｎｔｈｏｎ）として使用するジヌクレオチド３′−ホスホルアミダイ トに導く、技術が認識するホスホロジチオエートと反応させることによって可能 である。化合物■は、また、ジヌクレオシド３′−ホスフェート、３′−ホスフ ェートジエステル、または３’　−Ｈ−ホスホネートに転化することができる。

次いで、オリゴヌクレオチドの合成は、任意のこれらのジヌクレオチドシントン をシリカに基づくポリマーの支持体上で使用して、認識された手順によるか、あ るいはポリマーの支持体の不存在下に反応溶液中で進行させることができる。

本発明のそれ以上の実施態様として、ジヌクレオシドホスホロジチオエートは、 好ましくは、反応の概要ＡまたはＢにより調製し、ここでＡはＢより好ましい。

これらの反応の概要はＶおよびＶａ、ヌクレオシドホスホルチオアミダイトを調 製する方法において異なる０反応の概要Ａについて、ビス（第二アミノ）クロロ ホスフィン（これは標準の手順により調製される）をアセトニトリルおよびトリ エステル中に溶解した、適当に保護されたヌクレオシドと反応させる。次いで、 生ずるヌクレオシドジアミダイトを、単離せずに、メルカプタンと反応させて、 ヌクレオシドチオアミダイト、Ｖａ、を生成し、これは水性で抽出および沈澱に より単離する。反応の概要Ｂについて、メルカプチル−ビス（ジアルキルアミノ ）クロロホスフィン、ｒＶａ、をまず形成し、次いで選択したヌクレオシドとア セトニトリル中でテトラゾールを活性化剤として使用して縮合させて、ヌクレオ シドチオアミダイト、Ｖａ、を生成する。次いで、化合物Ｖａを第２ヌクレオシ ドと活性化剤を使用して縮合して、Ｓ−アラルキルジヌクレオシドホスファイト 、■ａ、を生成し、後者は、元素状イオウによる酸化後、Ｐ（Ｚ、Ｙ）をもつ■ ａ、ジヌクレオシドホスホロジチオエートトリエステル、を生成する。概要Ａお よびＢに示すこれらの手順は、概要Ｃに示すようなポリヌクレオチドの調製のた めのシントンとしてジヌクレオシドホスホロジチオエートトリエステルの要件を 排除し、したがって好ましい。こうして、ヌクレオシドＳ−アラルキルジアルキ ルアミノホスホルアミダイトまたはチオアミダイト（Ｖａ）および技術が認識す るヌクレオシドホスホルアミダイトを、それぞれ、元素状イオウまたは水性ヨウ 素の酸化手順と組み合わせて、任意の所望の順序で使用して、ホスホロジチオエ ートおよびホスフェートインターヌクレオチド結合の選択した組み合わせを有す るポリヌクレオチドを生成することができる。５−８−アラルキルジアルキルア ミノホスホルアミダイトまたはチオアミダイトＶａのみをイオウの酸化と組み合 わせて使用することによって、ホスホロジチオエート結合のみを有するポリヌク レオチドを調製することができる。

アラルキルメルカプチル−ビス−（ジアルキルアミノ）ホスフィン、ＩＶｂ、の 合或は、有機溶媒溶液中で実施し、ここでビス（ジアルキルアミノ）−クロロホ スフィン、ｌＶａ、をまず合成し、次いでさらにアラルキルメルカプタンと縮合 する。最初の工程において、三塩化リンを有機溶媒、例えば、テトラヒドロフラ ンまたはジオキサン中で５倍過剰のジアルキルアミンと反応させる。この反応は 、窒素またはアルゴンの乾燥雰囲気中で還流において円滑に進行する。生成物の 溶液を添加したアミンの沈澱した塩酸塩から分離し、そしてジアルキルアミンが 少なくともジイソプロピルアミン程度に大きい場合、減圧下に濃縮して固体にす る。次いで、この固体を化学的不活性の溶媒、例えば、ペンタン、ヘキサンおよ びヘプタンから再結晶化する。また、ビス（ジアルキルアミノ）クロロホスフィ ンの蒸留は、ことにより低い分子量の化合物について、可能である。次いで、こ れらのビス第二アミノクロロホスフィンを直接使用して、化合物ＩＸａ　（概要 ＡおよびＢ）を生成するか、あるいはＩＶｂを合成することができる。

ＩＶｂの合成のために、次に工程はアラルキルメルカプタンを不活性溶媒、例え ば、エチルエーテル、テトラヒドロフランまたはジオキサン中に溶解し；当量の 水素化ナトリウムを添加してメルカプタンをメルカプチドに転化し；そして最後 にビス（ジアルキルアミノ）クロロホスフィンを反応混合物に添加することを包 含する。Ｓ−アラルキルメルカプチル−ビス（ジアルキルアミノ）ホスフィンは 、室温において数時間かけて定量的に生成する。塩化ナトリウムを除去し、次い で溶媒、例えば、アセトニトリルから再結晶化すると、所望の生成物が得られる 。生成物、ＩＶｂ、を結晶化することができない場合、精製は真空蒸留により可 能である。しかしながら、蒸留が分解に導く場合、ヌクレオシドチオアミダイト は、中間体としてＩＶｂの合成を必要としない概要Ａを使用する、好ましい方法 により合成すべきである。

■ｂをこの転化に使用する、ホスホロジチオエート結合を含有するインターヌク レオチド結合の合成は、プロトン供与体である活性化剤を必要とする。こうして 、これらのホスフィンは酸性化合物により、最初にチオホスファイトトリエステ ルを含有する所望のインターヌクレオチド結合の形成を促進するプロトン化によ って、活性化する。ＩＶｂを含む最初の活性化工程は、酸性種、好ましくは温和 に酸性の種を必要とし、そしてテトラゾールおよび３−ニトロトリアゾールを含 む。生ずるヌクレオシドチオアミダイト、Ｖａ、は活性化が困難であり、そして より酸性の種、例えば、強酸の芳香族アミン塩、Ｐ−ニトロフェニルテトラゾー ル、ピリジニウムテトラフルオロボレート、トリフルオロメチルフェニルテトラ ゾールおよびトリフルオロメチルテトラゾール塩を必要とする。これはことにＸ がジイソプロピルアミノである場合である。しかしながら、ヌクレオシドチオア ミダイトが立体障害の程度が低いＸ、例えば、ジメチルアミノまたはピロリジノ を含有するとき、より温和な酸、例えば、テトラゾールによる活性化は可能であ り、そして好ましい。これらの立体障害の程度が低いヌクレオシドチオアミダイ トは反応の概要Ａを経て最も容易に調製される。

メルカプチル部分は構造がかなり多様であることができる。

条件は、それがＶａの活性化を促進すること、およびポリヌクレオチドの合成後 その除去が容易であることである。こうして、好ましいメルカプタンはベンジル および異種原子置換ベンジル部分、例えば、２．４−ジクロロベンジル、フェニ ルおよび異種原子検出フェニル、および置換もしくは非置換のアルキル置換基、 例えば、β−シアノエチルおよびメチルを包含する。

ホスフィンＩＶａおよび■ｂおよびヌクレオシドチオアミダイトＶａの一部とし て第二アミノ基分は、好ましくは、これらの中間体を貯蔵および合成に対して安 定化する置換基である。これらの第二アミノ基は、また、好ましくはインターヌ クレオチド結合の形成に導く反応の間、ホスフィンの活性化を促進する。これら の条件は、置換基、例えば、ジメチルア・　ミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロ ピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ、ジエチルアミノ、ピロリジノ 、ピペラジノ、種々の異性体のアルキル基、およびまた、アラルキル基により最 も容易に満足される。

本発明の新規な化合物を使用してポリヌクレオチドを形成するとき、それらは技 術が認識しているヌクレオシドホスホルアミダイトと組み合わせるか、あるいは ヌクレオシドホスホルアミダイトの不存在下に使用する。こうして、通常のホス フェートジエステル結合をポリヌクレオチド中に挿入すべき部位において、技術 が認識している手順、例えば、テトラゾールによる活性化、水性ヨウ素による酸 化、合成を技術が認識しているポリマーの支持体上で実施する場合、酢酸無水物 によるキャンピング、および酸により脱トリチル化を合成のために使用する。ホ スホロジチオエート結合をポリヌクレオチド中に組み込むべき部位において、ヌ クレオシドチオアミダイト、Ｖａ、をテトラゾール、芳香族アミン塩、ピリジニ ウムテトラフルオロボレート、Ｐ−ニトロフェニルテトラゾール、トリフルオロ メチルアリールテトラゾールまたは同様な試薬で活性化し、次いで生長するポリ ヌクレオチドにカップリングし、チオホスファイトインターヌクレオチド結合を 、好ましくは元素状イオウで、酸化して、ジチオエートを生成する。ポリヌクレ オチドの合成においてＶａを利用する他の工程は、技術が認識しているヌクレオ シドホスホルアミダイトと同一である。ホスホロジチオエート結合のみを含有す るＤＮＡを調製すべきとき、Ｖａを前述のように活性化し、縮合し、そしてイオ ウで酸化し、ヌクレオシドを反復してポリマーの支持体に結合して、ホスホロジ チオエート結合を有するポリヌクレオチドを生成する。ジヌクレオシドホスホロ ジチオエートトリエステル■ａまたはＸＩ［ａ、ここでＰ　（Ｌ。

Ｚ）は、また、ポリヌクレオチド合成のためのシントンとして使用することがで きる。これらの新規な化合物は、ここに記載する新規な方法を使用して調製する 。好ましくは保護されたジヌクレオシドホスホロジチオエート３′−ホスホルア ミダイトに転化した後、それらはテトラゾールで活性化し、そして直接ジヌクレ オシドシントンとして、通常の技術が認識しているポリヌクレオチドの合成手順 を経て、好ましくはポリマーの支持体上で、あるいはポリマーの支持体の不存在 下に溶液中で、使用することができる。

もちろん、通常の結合およびホスホロジチオエート結合の両者を含む、ポリヌク レオチドのインターヌクレオチド結合がいったん合成されるか、あるいはポリヌ クレオチドがもっばらホスホロジチオエート結合を有するとき、生成物は、必要 に応じて、ブロッキング基をもたないことができる。こうして、最初の工程は好 ましくはトリアルキルアンモニウムチオフェルレートで処理して、アラルキルブ ロッキング基をジチオエート部分から除去するか、あるいは、必要に応じて、メ チル基を使用して通常のまたはホスホロジチオエートのインターヌクレオチド結 合を保護し、メチル基をこれらのトリエステルから除去することである。次いで 、糖、ベースまたはリン上に残るブロッキング基、およびまた、ポリヌクレオチ ドを支持体に接合する結合（合成をこの方法で完結した場合）を、技術が認識し ている手順、例えば、水性アンモニア使用して除去することができる。チオフェ ルレートより試薬に対して不安定であるイオウ上のブロッキング基（であるトリ クロロエチルまたはβ−シアノエチル）を使用する場合、脱保護のプロトコルは それに応じて変更すべきである。

本発明による化合物の生成を記載する次の実施例および手順は、本発明のより完 全な理解および例示のために提供する。

実施例■ ビス（ジメチルアミノ）クロロホスフィンを、トリス（ジメチルアミノ）−ホス フィン（３６，３蔵、３２．６ｇ、　０．３２モル）およびトリクロロホスフィ ン（８，７ｄ、１３．７ｇ、　０１１モル）を無水エーテル（１００ｄ　）に添 加することによって調製した。

室温において３時間撹拌した後、溶媒を室温において真空濃縮により除去した。

次いで、生成物を減圧（はぼ１６ｍｍＨｇ）下に水アスピレータ−を使用して蒸 留（沸点７２−７５°Ｃ）して、３０ｇの生成物を得た。　”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＨ ＣＩｓ）δ１６３．０６．この手順を、また、使用してジビロリジニルを生成す る。Ｖａ（反応の概要Ａ）として表される、式 のチオホスホルアミダイトの調製、ここでＢ＝１−チミニル； Ｂ＝１−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−６−ベンゾイル アデニニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ ＝ジーＰ−アニシルフェニルメチル（ジメトキシトリチル）； Ｍ＝４−クロロベンジルまたは２．４−ジクロロベンジル；Ｘ＝Ｎ、Ｎ−ジメチ ルアミノまたはピロリジニル：およびホスホロジチオエートインターヌクレオチ ド結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのこれらの化合物のそれ以上の 使用。

次の実施例は、５′−〇−ジメトキシトリチルーＮ４−ベンゾイルデオキシシチ ジル−３’　−３（４−クロロベンジル）ホスホルチオピロリシナイトの合成を 記載する。同一手順を他の適当な保護されたジヌクレオシドについて使用するこ とができる。同様に、同一手順は２．４−ジクロロベンジルおよび４−クロロベ ンジルで保護されたイオウ誘導体およびＮ。

Ｎ−ジメチルアミノおよびピロリジニルアミダイトに有用である。表１はすべて のこれらのアミダイトについての”Ｐ−ＮＭＲのデータを要約する。

５’−０−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイルデオキシシチジン（３１７■ 、０．５ミリモル）を、アルゴン雰囲気下に、アセトニトリル（２ＩｎＩｔ）お よびトリエチルアミン（１ｄ）中に溶解した。ビスピロリジニルクロロホスフィ ン（１２４■、０．６ミリモル）を添加し、次いで沈澱が直ちに形成した（反応 生成物の”Ｐ−ＮＭＲは１３３．８ｐｐｍであった）。室温において５分間撹拌 した後、４−クロロベンジルメルカプタン（１５９■、１ミリモル）を反応混合 物に添加し、そして沈澱を含む溶液を室温において真空濃縮するとガラスが得ら れた。このガラスをアセトニトリル（２ｄ）中に懸濁した０反応混合物の”Ｐ− ＮＭＲスペクトルは、主要なリン含有生成物がチオアミダイトのジアステレオマ ーであることを示した（１６１．５．１５９．７ｐｐｍＬ　少ない不純物はビス ピロリジニルクロロホスフィンおよび４−クロロベンジルメルカプタンの付加物 （１０７，０ｐｐｍ）および加水分解生成物（１２，４ｐｐｍ）であった。次に 、トリエチルアミンを反応混合物に添加した。この溶液を脱酸性化した酢酸エチ ル（５０ｄ）で希釈し、そして水性飽和重炭酸ナトリウム（５０ＩＩｌｘ　２　 ）およびブラインで抽出した。−緒にした水溶液を脱酸性化した酢酸エチル（１ （ｌｄ）逆抽出した。有機溶液ヲー緒にし、１０％（体積）のトリエチルアミン の存在下に１時間硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濾過ケークを５ｄ脱 酸性化した酢酸エチルで洗浄した。次いで、有機溶液を真空ｆＡ縮して白色の泡 を得た。この泡を１％のトリエチルアミンを含有するトルエン（ＩＭ）中に溶解 し、そしてｎ−ペンタン：トリエチルアミン（９９９：　１　、　ｖ／ｖ）中の 沈澱により単離した。濾過後、生成物を五酸化リンおよび水酸化カリウムで真空 乾燥し、そして８３．１％の収率（７４１■）で単離した。

’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）　８．７６（ｂｒｏａｄ　ｓ、　ＩＨ，ＮＨ）、　 ８．３７（ｄ、　Ｊ、ｌ、＋□７．４７）１ｚ、　ｏ、ｓｏ、　Ｈ５＋　シトシ ン）、　８．３Ｈｄ、　ＪＨ）Ｉ＝７．４８）＋２．０．５Ｈ，８ｓ。

シトシン）＋　７．９４（ｄ＋　ＪＨ）Ｉ＝７．３７Ｈ２，２Ｈ，ｆｈ　ａｎｄ 　１（ｔｈｏｆベンゾイル基）、　７．６８−７．５４（ｍ、　３ｔｌ、　Ｈ： ｌ＋　Ｈ−、Ｈｓ　ｏｆベンゾイル基）。

７．４４−７．１４（囮、　１４８．　４−クロロベンゾイルの芳香族プロトン 。

Ｈ２＋　アニシルのＨｂ（ＤＭＴｒ）、　ｐｈ−プロトン（ＤＭＴｒ）、　Ｈ＆ シトシン）。

６．９Ｈｄ＋　Ｊｏｇ−７，５７Ｈｚ＋　４Ｈ＋　Ｈｓ＊　Ｈ５ｏｆアニシルＤ ＭＴｒ）、　６．３３　（＋ｎ、　Ｉｌ、　１’　Ｈ）、　４．７２（ｍ、　Ｉ Ｈ，３’　Ｈ）、　４．２２（ｍ、　ＩＬ　４’　Ｈ）。

３．８４（ｄ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅｔｔｓ、　６Ｈ＋　アニシルＤＭＴｒのメチ ルプロトン）。

３．８４−３．７６（ｍ、　２Ｈ，４−クロロベンジル基のメチレンプロトン） 、　３．５９−３．３５（ｍ、　２Ｈ，５’　Ｈ）、　３．１９−３．０１（ｗ 、　４Ｈ，ピロリジニル基ａ−窒素のメチレンプロトン）、　２．８４−２．７ ５．２．３７−２．２６（ｍ、　２８．２’　Ｈ）、　１．７９−１．７Ｈ１１ ，４Ｈ，ピロリジニル基す一窒素のメチレンプロトン）。Ｓ’Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ Ｃ１３）１６１．７９．１５９．９７゜Ｆａｂ”：９２３（Ｍ　＋　Ｓ）”、　 ９０７（Ｍ　＋　Ｏ）’、　ｔｌｃ：Ｒｆ、７５　（クロロホルム：酢酸エチル ニトリエチルアミン（４５：４５：１０．　ｖ／ｖ／Ｖ）。

シリカに基づくポリマーの支持体に３′−ヒドロキシにより共有結合したジヌク レオシド（米国特許第４．４５８，０６６号）を使用して、ホスホロジチオエー ト結合を含有するジヌクレオチドの合成を第１図に概説する反応順序に従って進 行させた。化合物Ｖａ（１０当量）およびテトラゾール（５０当量）の乾燥アセ トニトリル溶液を１Ｈモルのジヌクレオシドをシリカ上で３０秒間（工程ｉ）反 応させ、次いで４００秒間５％のイオウでビリジン：二流化炭素（１：　１　、 　ｖ／ｖ、工程ｉｉ）中で酸化して合成を実施した。カップリングを２回実施し て、高い収率（９８％より大きい）を保証した。未反応のジヌクレオシドのアシ ル化（工程１ｉｉ）、脱トリチル化（工程ｉｖ）および種々の洗浄は、ジヌクレ オシドホスホルアミダイトからの天然のＤＮＡの合成について従来記載されたも の（米国特許第４，４１５．７３２号及び５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．２８１−１ ９８５）と同一であった。

次いでこのサイクルの多数の反復は、もっばらホスホロジチオエート結合を含有 するＤＮＡの合成を導くか、あるいはジヌクレオシドホスホルアミダイトと組み 合わせて使用するとき、ホスホロジチオエートおよびホスフェートのインターヌ クレオチド結合の両者を含有するデオキシオリゴヌクレオチドの合成に導いた。

合成のデオキシオリゴヌクレオチドは、２工程のプロトコル（チオフェノールニ トリエチルアミン：ジオキサン、１：２　：　２　、ｖ／ｖ／／ｖ、２４時間、 次いで濃水酸化アンモニウム、２４時間）を経て保護基を除去して単離し、次い で標準の手順（ポリアクリルアミドゲルの電気泳動および逆相ｈｐｌｃ）により 均質に精製した。ホスホロジチオニー）ＤＮＡの”Ｐ−ＮＭＲスペクトル（第２ 図）は、この合成のプロトコルがもっばらホスホロジチオエートのインターヌク レオチド結合を含有するＤＮＡを生成したことを示した。ボスホロチオエート（ ’Ｐ−ＮＭＲ５６）またはホスフェートへのこれらのジチオエートの加水分解は 観測されなかった。これまでに１４のジチオエート結合を含有するペンタデカマ ーのホモポリマー、規定した部位に多数のジチオエートをもつｌａｃおよびｃｒ ｏオペレーター（０，１）、および１７の連続のジチオエートを含有するｃｒｏ オペレーターのセグメントが合成された。

第１図。ポリマーの支持体上のＤＮＡの合成、［Ｆ］、シリカに基づくポリマー の支持体。

第２図。ポリヌクレオチド誘導体の”Ｐ−ＮＭＲスペクトル。

もっばらホスホロジチオエートのインターヌクレオチド結合を含有するａ　（Ｃ ）　＋　Ｓのスペクトル（１１３ｐｐｍ、　ＤｚＯ）　、”Ｐ−ＮＭＲスペクト ルをパリアン（Ｖａｒｉａｎ）ＶＸＲ−５００Ｓ、水性８５％のＨｓＰＯａは外 部の標準であった。

実施例■ Ｖａ（反応の概要Ｂ）として表される、式のチオホスホルアミダイトの調製、こ こでＢ＝１−チミニル； Ｂ＝１−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−６−ベンゾイル アデニニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ ＝ジメトキシトリチル； 化合物Ｖａの合成は、４−クロロベンジルメルカプチル−ビス−（ジイソプロピ ルアミノ）ホスフィンの調製で開始した。三塩化す７（０，５モ／Ｌ／、６８． ６６５　ｇ、４３．６ｄ）を３０ｏＩｄノ無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中 に溶解した。ＰＣ３溶液をＮａＣｌ氷混合物により一１８°Ｃに冷却した０次い で、ジイソプロピルアミン（２，５モル、２５２．９８３ｇ、３５０．４ｄ）を 、滴下漏斗を経てゆっくり添加した。まず反応は激烈であり、そして激しく撹拌 しく機械的撹拌機）かつ冷却しながら実施しなくてはならならった。ビス−（ジ イソプロピルアミノ）クロロホスフィンへの反応の完結後、反応混合物を１２時 間還流して所望の生成物を得た。１２時間後、反応混合物を室温に冷却し、そし てジイソプロピルアンモニウムクロライドをジュレンクーフリット（Ｓｃｈｌｅ ｎｋ−ｆｒｉｔｔ）で濾過して除去した。塩をＴＨＥで洗浄した後１、透明反応 混合物を再び１２時間還流して所望の生成物を、反応混合物中の唯一のリン含有 物質として得た（”Ｐ−ＮＭＲ１２３，４ｐｐｍ）。新しく形成したジイソプロ ピルアンモニウムクロライドを、濾過により除去し、そして無水エーテルで洗浄 した。濾液を減圧下にの蒸発させて（回転蒸発器）黄色がかった固体が得られ、 これをヘキサンから再結晶化して無色の結晶質固体を得た。この化合物は空気安 定性であり、そして湿気に対して感受性であった。４−クロロベンジルメルカプ タン（５０ミリモル、７．９３ｇ、６．６ｍ）を無水エーテル（３００ａｆ）中 に溶解し、そして５０ミリモル（２，４ｇ）に等しい油中の水素化ナトリウム懸 濁液（油中の５０％のＮａＨ）をメルカプタン溶液に添加した。溶液を撹拌しな がら（磁気）、発生した水素はナトリウム４−クロロベンジルメルカプチドの形 成を示した。２時間後、ビス−（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（５ ０ミリモル、１３．３４　ｇ　）を添加し、そしてガスの発生が止むまで（室温 において４時間）反応混合物を撹拌した。反応混合物の”　Ｐ−ＮＭＲは、副反 応なしにクロロホスフィンの所望の生成物への定量的転化を示した（”Ｐ−ＮＭ Ｒ９１，４ｐｐｍ）、塩（塩化ナトリウム）をスレンクツリットで濾過して除去 し、そして無水エーテル（５０ａｆ）で洗浄した。無色の濾液を蒸発すると、白 色の泡（４−クロロベンジルメルカプチル−ビス−（ジイソプロピルアミノ）ホ スフィン）が得られ、これを少量の熱アセトニトリル＜１００ｒｄ　）中に溶解 し、そして同一の溶媒から再結晶化して白色の結晶質生成物が得られた。

５’−０−ジメトキシトリチルヌクレオシド（５ミリモル）および４−クロロベ ンジルメルカプチル−ビス−（ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（６ミリモル 、２．３３ｇ）を、乾燥アセトニトリル中に溶解した。テトラゾール（１０ミリ モル、０．６９ｇ）を添加し、そして反応を１６時間室温において撹拌した。最 初に存在した固体（ホスフィンおよびヌクレオシド）は反応時間の間に溶解し、 そして結晶質固体（ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド）が沈澱する。１ ６時間後、反応をピリジン（１ｄ）で急冷し、そして酸不含酢酸エチル（１００ 戚）中に希釈した。この溶液を重炭酸ナトリウムの水性飽和溶液で２回、次いで 順次に１回ブラインで洗浄した。

有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。この塩の除去後、溶媒を真空蒸発すると、 ガラスが得られ、これをクロロホルム、酢酸エチルおよびトリエチルアミン（４ ５：　４５　：　１０　、　ｖ／　ｖ／Ｖ）の混合物中に再溶解し、そしてシリ カゲルのクロマトグラフィーにかけ、同一溶媒を使用した。所望の生成物を含有 するクロマトグラフィーの分画を一緒にし、そして溶媒を真空蒸発させた。生成 物をトルエン中に溶解し、そしてｎ−ペンタン中に沈澱させた。沈澱をＰｚＯｓ ／　ＫＯＨで真空乾燥した後、ヌクレオシドホスホルチオアミダイトが単離され た（３．３３ｇ。

８０．１％の収率）。

”Ｐ−ＮＭＲ１６１，３および１５９．９７ｐｐｍ（２つのジアステレオマー） チミジン誘導体についてＨｆｆＰＯ，の外部標準に関して。

’ＨＮＭＲ８，０（Ｎ−）１）、　７．５９及び７．５８（２ｘｄ、　ＪＨＮ− １−２Ｈｚ）＋　７．４２−７．１９（ａ）、　６．８３（ｄ、　Ｊｕｇ−８， ７Ｈｚ）、　６．３７（ｑ、　Ｉｔ’　）、　４．６５−４．５８（ａ、　Ｈｓ ’　）、　２．０５−１．８３（ｍ、　Ｈｈ’　）、　３．８０−３．６０ｍ、 　ＣＨｚ、Ｐ−クロロベンジル）、３．７８（ｓ−Ｈｂ）、３．４８−３．２９ （＋＋、　Ｉｓ’　）、　２．４５−２．２４（ｉｎ、　Ｈ，／　）、　１．４ ４（ＣＨ３−Ｔ）、　１．１７−１．０４（ａｔ、　ＣＨｓ＋　イソプロピル） 。

実施例■ ■ａ（反応の概要Ｂ）として表される、式のジヌクレオシドホスホロジチオエー トトリエステルの合成、ここで、 Ｂ＝１−チミニル； Ｂ＝１−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）；Ｂ−９−（Ｎ−６−ベンゾイルア デニニル）；Ｂ−９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ＝ジ メトキシトリチル ５′−ジメトキシトリチルチミジン−３’　−３−（４−クロロベンジル）ジイ ソプロピルアミノホスホルアミダイト（化合物■ａ、実施例旧（０，２ミリモル 、１６６．３■）および３′−〇−アセチルチミジン（０，２ミリモル、５６． ８■）を、無水ジメチルホルムアミド（２Ｉｎ１）中に溶解した。４−ニトロフ ェニルテトラゾール（１ミリモル、１９１．２■）を次にこの溶液に添加した。

１５分後、ジヌクレオシドチオホスファイトの反応をイオウ（１原子当量、３２ ■）で急冷した。次いで反応混合物を酢酸エチル（５０ｄ）で希釈し、そしてイ オウを綿のプラグで濾過した。高い真空中で溶媒の除去後、所望の生成物を酢酸 エチル（１０ａ２１り中に溶解し、そして重炭酸ナトリウムの水性飽和溶液で２ 回およびブラインで１同順次に洗浄した。生成物をシリカのクロマトグラフィー にかけ、１゜１　、１−トリクロロエタンおよびメタノール（９２，５：　７． ５　。

ｖ　／　ｖ　）の混合物を使用した。生成物の分画を一緒にし、そして溶媒を真 空除去した。ジヌクレオシドホスホロジチオエートをトルエン中に溶解し、そし てｎ−ペンタン中に沈澱させた（”Ｐ−ＮＭＲ９７，８，９６，２、外部標準と して８５％のＨ２ＰＯ４に関して）。ＦＢＡ−質量スペクトル、１０４１０４７ （、９２１（−ｐ　−クロロベンジル）、　７４３　（−ＤＭＴ）、　６１９（ −ＤＭＴおよび４−クロロベンジル）、　５１９　（３’　−０−アセチルチミ ジン　５′−〇−４−クロロベンジルホスホロジチオエート）、３９５（３’− 〇−アセチルチミジン５′−〇−ホスホロジチオエート）。

４−クロロベンジル基をホスホロジチオエートトリエステルから、ジオキサン： トリエチルアミン：チオフェノール（２：　２　：　１　、　ｖ　／ｖ／ｖ）の 混合物で１．５時間室温において除去した。

これらのジヌクレオシドホスホロジチオエートトリエステルは、また、活性化剤 としてピリジニウムテトラフルオロボレートを使用して調製することができる。

ピリジニウムテトラフルオロボレートは、ＨＢＦ４　（１０モル、１．９ｇのジ エチルエーテレート、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ　Ｃｏ、）を乾燥ジクロ ロメタン（５ｄ）中に溶解し、そしてこの溶液を撹拌しながら乾燥エチルエーテ ル（５０ｒｎＩｌ）中の乾燥ピリジン（７９１■、１０ミリモル）に添加するこ とによって調製した。２時間後、塩を濾過により除去し、乾燥エーテルで洗浄し 、そしてデシケータ−内でＰ２Ｏ，により乾燥した。典型的な反応において、３ ’　−〇−アセチルチミジン（１４２■、０．５ミリモル）を５’−０−ジメト キシトリチルチミジン−３’　−３（４−クロロベンジル）ジイソプロピルアミ ノホスホルアミダイト（８３３■、１ミリモル）をピリジニウムテトラフルオロ ボレート（３３４■、２ミリモル）の存在下に乾燥アセトニトリル（５ｄ）中で 反応させた。１０分後、反応混合物をピリジン（２−）中の２０原子当量のイオ ウ（６４０■）の添加により急冷し、真空濃縮するとガムが得られ、酢酸エチル （５０ｄ）中に再溶解し、そして過剰のイオウを濾過により除去した。この実施 例において前述のように、標準の水性仕上げ、およびカラムクロマトグラフィー （ＣＨ３ＣＣ１３；　ＣＨ３０Ｈ＋　９５　：　５　、　Ｖ　／　Ｖ　）後、保 護された形態のジヌクレオシドホスホロジチオエートがペンタン中の沈澱により 単離された（６０％の収率）０次のジヌクレオシドホスホロジチオエートをほぼ ６０％の収率で、この手順を経て調製した。

ａ）５’−０−ジメトキシトリチルチミジン５−（４−クロロベンジル）−３’ 　−０−（５’−０−チミジジリル）−ホスホロジチオエート。ＦＢＡ　”質量 スペクトル、１１００５（＋）。

８４７（Ｍ−４−クロロベンジルメルカプチル）、　７０３（Ｍ−ＤＭＴ＋Ｈ） ”。

４５５（Ｍ−ＤＭＴ−４−クロロベンジルメルカプチル＋Ｈ）′″；ＦＢＡ−質 量スベクトル、８７９（Ｍ−ｐ−クロロベンジル）−、７７９（Ｍ−チミジリル ）、　４７７　（チミジン−３−４−クロロベンジルホスホロジチオエート）＋ 　３５５　（チミジン５′−ホスホロジチオエート）　；　”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ Ｃ１３）９６．４４ＵＶ（ＥｔＯ）１）ｍａｘ２２８．２６８ｍｍ。

ｂ）５’−〇−ジメトキシトリチルチミジンＳ−（４−クロロベンジル）　−３ ’　−０−（５’　−０−Ｎ２−イソブチリルデオキシグアノシニル）−ホスホ ロジチオエート。ＦＢＡ”質量スペクトル、１２７７（Ｍ−Ｎａ）”　、　９５ ２（Ｍ−ＤＭＴｒ）”　；　”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｈ）９５．８．９６．１４Ｕ ν（ＥｔＯＨ）＋ｎａｘ２６２ｍａ＋。

ｃ）５’−０−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイルデオキシアデノシンＳ− （４−クロロベンジル）−３’　−０−（５’−０−Ｎ４−ベンゾイルデオキシ シチジン）−ホスホロジチオエート。コ’Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｈ）９３．８９． ９３．３１゜ことに強酸触媒、例えば、４−ニトロフェニルテトラゾールまたは ピリジニウムテトラフルオロボレートを使用する、ジヌクレオシドホスホロジチ オエートの合成は、不活性雰囲気下に実施すべきである。空気中の取り扱いは種 々の量の対応する酸化物の形成に導く、また、４−クロロベンジルホスホノチオ アミダイトとして試験的に割り当てた化°合物は、ホスホノチオアミダイトを酸 性触媒と反応させるとき、生成する。しかしながら、これらの反応はカップリン グを必ずしも妨害しない、なぜなら、ジヌクレオシドチオホスファイトへの３′ −保護されたジヌクレオシドの完全な転化は、過剰のチオアミダイトおよび高い 濃度の両者のジヌクレオシド誘導体を使用して達成することができるからである 。予備的研究において、また、生ずるチオアミダイトトリエステルは非親核塩基 に対して安定であり、そして水素ホスホネートへの２、速な酸触媒の加水分解を 行うことが明らかとなった。それらは空気またはｔ−ブチルペルオキシドにより ホスホロチオエートを生成し、そしてイオウによりホスホロジチオエートトリエ ステルに急速に酸化されやすい。

実施例■ Ｘｌａ　（反応の概要Ｃ）として表される、式のジヌクレオシドビーホスホノチ オエートの合成、ここでＢ＝１−チミニル； Ｂ＝１．−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−６−ベンゾイ ルアデニニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭ Ｔ＝ジメトキシトリチル 第１工程は、５′−０−ジメトキシトリチルチミジンをビス（ジイソプロピルア ミノ）クロロホスフィンと、トリエチルアミンを含有するジオキサン中で縮合す ることであった。

生ずるホスホロジチオエートを、単離せずに、３′−〇−アセチルチミジンと反 応させ、シリカゲルのクロマトグラフィー（酢酸エチル中の５％のトリエチルア ミン）後、６２％の収率で均質なジヌクレオシドアミダイトを生成した。ジヌク レオシドをＨ−ホスホノチオエートの合成は、ジヌクレオシドのホスホルアミダ イト（４７０■、０．５ミリモル）をアセトニトリル（５ｄ）中に溶解し、Ｈｚ Ｓを溶液を通して１分間泡立てて通人し、テトラゾール（３５■、０．５ミリモ ル、１ｄのアセトニトリル中）を添加し、そして最後に密閉した反応フラスコ内 で１６時間撹拌した。反応混合物を回転蒸発器で濃縮してガムが得られ、酢酸エ チル（５０ｄ）中に再溶解し、そして２モルのトリエチルアンモニウムビカーボ ネート（ｐＨ１，４、２０−各々）で２回抽出した。真空濃縮してガムが得られ 、生成物をジクロロメタン（５ｄ）中に溶解し、そしてペンタン中に沈澱させて 単離した（４００■、９０％）。ＦＢＡ　”質量スペクトル、５２７（無水ＤＭ Ｔ　ｄｔ）　：　ＦＢＡ−質量スペクトル、８９０（Ｍ−）。

６２３（ＤＭＴ　ｄｔ−３’　−ＰＨＯｚ−）、　３６３（Ｍ−５２７，５’− ＰＨＯｚ−ｄＴ−３’　−０Ａｃ）；３１　ＮＭＲ７１，７及び７０．７（’Ｊ ）ｌＦ＝６７３．８Ｈ２及び６７６．３Ｈｚ、；　’ＨＮＭＲ７，８１及び７． ８０（Ｐ−Ｈ，’Ｊ）ＩＰ＝６７１．４Ｈ２及び６７６．７１（ｚ）、　７．５ ５及び７．５３（３，）１６）、　７．３７−７．２０（ｇ＋、　ａｒｏｍａｔ ｉｃ）、　６．８２（ｄ、　Ｊ＝８．８）１ｚ。

ＤｔｌＴ）、　６．４９及び６．２６（ｍ、　Ｌ’　）、５．４９及び５．２５ （ｍ、　Ｈｚ’　）。

４．３５　（ＩＩ、）１４’　）、４．１９（ｍ、）Ｉｓ’　）、４．０７（１ １，）１４’　）、３．７６（ｓ、Ｍｅｎ−ＤＭＴ）、３．４２（＋ａ、Ｈｓ’ 　）、２．５４−２．３２（ｍ、Ｈｚ’　）＋　２．０８及び２．０７（２ｘｓ 、　ＣＨｓ−アセチル）、　１．９０（ｍ、　ＣＨｚ−Ｔ）、　１．４３（ｓ。

ＣＨｓ−Ｔ）　、　Ｒｒ＝０．３５　ａｎｄ　０．２８（メタノール／ジクロロ メタン、１　：　９　、　ｖ／ｖ）。

実施例Ｖ Ｘｍａ　、　Ｐ　（Ｚ　、　Ｙ）（反応の概要Ｂ）として表される、式のジヌク レオシドホスホロジチオエートの合成、ここでＢ＝１−チミニル； Ｂ−１−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）；Ｂ−９−（Ｎ−６−ベンゾイルア デニニル）；Ｂ−９−（Ｎ−２−イソプチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ＝ジ メトキシトリチル ジチミジンホスホロジチオエートを、ジヌクレオシドビーホスホノチオエート（ １０４■、０．１ミリモル、ジクロロメタン中）を元素状イオウ（１ミリモル、 ２ＩＩｄｌのトルエン：２，６−ルチジン、１９：　１　、ｖ／ｖ中）とともに ０．５時間撹拌することによって合成した。シリカゲルのカラムクロマトグラフ ィー（ジクロロメタン中の０−１２％のメタノールおよび０．５％のトリエチル アミン）を経て精製すると、７０％の単離された収率。ＦＢＡ”質量スペクトル 、３０３　（ＤＭＴつ；　ＦＢＡ−質量スペクトル、”’（Ｍ”）＋３９５（５ ’　−ＰＳ！０−　−ｄＴ−３’　−０八Ｃ）　；　”Ｐ　ＮＭＲ１１２，７； ’ＨＮＭＲ８，１２（ｓ、　ＮＯ）、　７．９０　ａｎｄ　７．６０（２ＸＳ、 Ｈ＆）、　７．４４０−７２４（。

芳香族）、　６．８０（ｄ、　ＪＨＦ−８，８８２，ＤＭＴ）、　６．４３（Ｉ Ｉ、　ｕ、／　）、　５．４６−５．３６（ｍ、　Ｉｓ’　）、　４．４０（ｓ 、　Ｈａ’　）、４．１６（ｍ、　Ｈｓ’　）、３．７６（ｓ。

Ｍｅｎ−ＤＭＴ）、　３．５２（ｍ、　Ｈｓ’　）、　２．２８（ｍ、　Ｈｚ’ 　）、　２．０５（Ｃｔ＋ｓ−アセチル）　、　１．９７（ＣＨ３Ｔ）、　１． ５８（ｓ、　Ｃ）ｌａＴ）、　Ｒｆ＝０．１４　（メタノール／ジクロロメタン 、１：９．ｖ／ｖ）。

ジヌクレオシドホスホロジチオエートを標準の手順により脱保護し、そしてエー テル抽出（３Ｘ）、セファデックスＧ１０ゲル濾過（Ｈｇｏ）　、およびアンモ ニウムとして凍結乾燥後、８６％の収率で単離された。ＦＢＡ”質量スペクトル 、５７９（Ｍ）　；”Ｐ　Ｎ？ＩＲ（Ｄ！０）１１３．３　；　ＩＨＮＭＲ７， ６０及び７．４６（２Ｘ３．　Ｈ＆）、６．１１及び５．９９（ｓ、　Ｊ’　） 、　５．１７（ａ、　Ｈｚ’　）、　４．８５（Ｉｏ、　８３’　）、　４．１ ５（１１，Ｈａ’　）、　４．０３及び３．６２（ｍ、　Ｉｓ’　）、　２．２ ０ｍ、　Ｈｚ’　）、　１．８８ｍ。

ＣＨ＋−Ｔ）　、　Ｒｔ　＝　０．２５　（メタノール／トリエチルアミン／ク ロロホルム、１５：　１　：８４．ｖ／ｖ／ｖ）、ジヌクレオシドホスホロジチ オエートをＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼおよび〔γ−”Ｐ）ＡＴＰでリン酸 化し、キナーゼ化の速度は同一条件下に未変化の３’−５’ジチミジンホスフエ ートのそれのほぼ半分であった。ヘビの毒液のホスホジェステラーゼ（Ｃｒｏｔ ａｌｕｓ　ａｄａｍａｎｔｅｕｓ　ｖｅｎｏｎ、　Ｓｉｇｍａ）使用してさらに 試験すると、天然のジヌクレオチドが完全に加水分解する条件を使用するとき、 ホスホロジチオエートは安定であることが示された（逆相ＨＰＬＣによりアッセ イした）。この化合物は、また、濃水酸化アンモニウムに対して５５°Ｃにおい て（１６時間）、分解または異性化が観測されなかった（”Ｐ−ＮＭＲ，薄層ク ロマトグラフィー）ので、安定であることが観測された。

実施例■ Ｘ■ａ（反応の概要Ｂ）として表される、式０式％ ダイトの合成、ここで Ｂ＝１−チミニル； Ｂ＝１−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−６−ベンゾイル アデニニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ ＝ジメトキシトリチル ホスホロジチオエートの結合をオリゴヌクレオチド中に導入するために、ホスホ ロジチオエートのインターヌクレオチド結合についての保護／脱保護の概要を開 発した。こうして、保護された形態のジヌクレオシドホスホロジチオエート（Ｘ １１ａ）（５７ｍｇ、０．０６ミリモル）を、ａ、２．４−トリクロロトルエン （５０ｍ、１時間、５５°Ｃ）をアセトニトリル中でアルキル化して、ジヌクレ オシドホスホロジチオエートトリエステルを定量的に生成した。さらに試験する と、それはＤＮＡの合成において使用する試薬（ジクロロメタン中の１％のトリ クロロ酢酸および水性ルチジン／ＴＨＦ中のヨウ素）に対して完全に安定である こと、およびホスホロジチオエートトリエステルはチオフェルレートで処理する ことによって特別にＳ−説アルキル化される（チオフェノールニトリエチルアミ ン：ジオキサン、１　：　１　：　２　、　ｖ／ｖ／ｖ　、　ｔ　１／２＝３分 、室温において）ことが明らかにされた。ＦＢＡ　”質量スペクトル、５２７（ 無水ＤＭＴ　ｄｔ）　ｉ　ＦＢＡ”質量スペクトル、９２３（Ｍ＋１−ジクロロ ベンジル）、　８１３（ＤＭＴ　ｄＴ−３’　−ＰＳＯＳ−ｄｃｂ）。

５５３（５’　−ＰＳＯＳ−ｄａｂ−ｄＴ−３’　０八ｃ）　；　”Ｐ　ＮＭＲ （ＣＨ，ＣＮ＋　ｅｘｔ、１ｏｃｋ）９４゜４及び９３．７．　’ＨＮＭＲ７， ５５及び７．５２（２ＸＳ、　Ｈ＆）、　７．３７−７．２３（ｍ、芳香族）、 　６８Ｈｄ、　Ｊ＝４．６Ｈｚ、　ＤＭＴ）、　６．３４及び６．２８（ｍ。

Ｈａｙ’　）、　５．３８及び５．０１（鎖、　Ｈｓ’　）、４．２４−４．０ ８（Ｉｔ、　ＣＨｚ−ベンジル、　Ｈｓ’　）　＋Ｈ４’　）、　３．７６（Ｓ 、　ＭｅＯ−ＤＭＴ）、３．４２（ｌＩＩ、Ｈｓ’　）。

２．３９（ｍ、　Ｈｚ’　）、２．０８（ｓ、　Ｃ）ｌｉ−アセチル）、　１． ８９及び１．８７（２ＸＳ　ＣＨ３−Ｔ）、１．４３及び１．４２（２ｓ、　Ｃ Ｈ３−Ｔ）、　Ｒｆ＝０．７４　（メタノール／トリエチルアミン／クロロホル ム、１８：１：８．ｖ／Ｖ／Ｖ）。

ＤＮＡの合成に有用なシントンへの転化は、２工程の方法であった。ジヌクレオ シドホスホロジチオエートトリエステルを、まず、メタノール中の０．１５モル のむ一ブチルアミンを使用して脱アシル化（３′アセチル基）しく０°Ｃ１１０ 時間）そしてシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製してＩ［ａを生成した 。インターヌクレオチド結合の５％より少ない開裂（”Ｐ−ＮＭＲ，ＴＬＣ）が 観測された０次いで、脱アシル化した化合物をビス（ジイソプロピルアミノ）− ２−シアノエチルホスフィン（１，５当量）とテトラゾール（１当量、１時間、 室温）の存在下に反応させて、３′−ホスホルアミダイトとしてジヌクレオシド ホスホロジチオエートトリエステルを７６％の収率で生成した。　”ＩＰ　ＮＭ Ｒ１４９，４，１４９，２，１４８，９及び９７．２゜９５．７．９５．５．　 ’Ｈ−ＮＭＲ７，５６（Ｓ、　Ｈ＆）、７．３３−７．２７　（ｍ、芳香族）。

６．８４（ｄ、　Ｊ　＝８．５Ｈｚ、　ＤＭＴ）、　６．３９−６．２９（＋ｏ 、　Ｈ＋’　）、５．４４（ｍ。

Ｈｚ’　）＋　３．７９（ｓ、　Ｍｅｎ−ＤＭＴ）、　１．９０（３１ＣＨ３− Ｔ）１１．４５（ｓＩ　Ｃ１（ｚ−Ｔ）＋１．１８（ｄ、　Ｊ＝６．６Ｈｚ、　 ＣＨ＋−１Ｐｒ）、　Ｒｒ＝０．２９　；および０．１７（クロロホルム／酢酸 エチル／トリエチルアミン、４５：４５：１０．　Ｖ／Ｖ／Ｖ）。生ずるジヌク レオチドホスホルアミダイト、ＸＶＨａ、は未変性のモノヌクレオシドホスホル アミダイトと組み合わせて、ホスホロジチオエート結合を含有する２６マーのＤ ＮＡ断片の合成に首尾よく使用された（９８．２％のカップリング効率）。これ らの合成は、シリカに基づくポリマーの支持体上でおよびホスホルアミダイトの カップリングの方法と組み合わせて完結された（米国特許第４，４５８，０６６ 号および米国特許第４．４１５，７３２号；また、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．２ ８１−２８５゜１９８５）。オリゴデオキシヌクレオチドは次の配列を有し、こ こで各セグメント中のホスホロジチオエートの結合をＸでしるしをつけ、そして 通常のホスフェートのインターヌクレオチド結合をｐでしるしをつける。

ｄ　（ＴｐＧｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＴｘＴｐＧｐＴｐＧｐＡｐＧｐＣｐＧｐＧ ｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴ）ｄ　（ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＴｐＴｐ ＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＣｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｘＴｐＣｐＣｐＡｐＣｐ Ａ）実施例■ ■ Ｃｔｔコ ＸＩＩａ、Ｐ（Ｚ、Ｗ） ＸＩ［ａ、Ｐ（Ｚ、Ｖ） ＸＩ［ａ、Ｐ（Ｚ、Ｖ） のジヌクレオシドチオアミダイト、チオトリエステル、およびチオエートの合成 、ここで Ｂ＝１−チミニル； Ｂ＝１−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）：Ｂ＝９−　（Ｎ−６−ベンゾイル アデニニル）：Ｂ−９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ＝ ジメトキシトリチル ジヌクレオシドビーホスホノチオエートは、また、定量的収率（”Ｐ−ＮＭＲ） でいくつかの類憤体の急速に（５分）調製するとき汎用のシントンとして有用で あることがわかった。こうして、ヨウ素／ｎ−ブチルアミンで酸化するとき、ホ スホロチオエート、ＸＩｒａ、（Ｚ、Ｗ）、は９２％の収率で単離された。　Ｆ ＢＡ−質量スペクトル、９６１（Ｍ−）＋　６９５（ＤＭＴ　ｄＴ−３’−ＰＯ ＳＮＨＢＵ）、４３４（５’　−ＰＯＳＮＨＢＵ−ｄＴ−３’　−０Ａｃ）　； 　”Ｐ　ＮＭＲ７４，４及び７４．０　ｉ　’ＨＮＭＲ８，３６及び８．３４（ ２ｘｓ、　ＮＨ）、　７．５９及び７．５６（２ＸＳ、Ｈ＆）、７．４４−７． ２４（ＩＩ、ａｒｏｎ＋ａｔｉｃ）、６．８２（ｄ、Ｊ＝８−７Ｈｚ＋ＤＭＴ） 、　６．４１　ａｎｄ　６．２８（ｌ＋＋、　）Ｉｔ’　）、　５．２８及び５ ．２３（ｍ、　Ｊ’　）。

４．２１及び４−１３（ＩＩＩ　Ｈ４’　（２Ｘ）＋Ｈ５’　）、　３．７７（ Ｓ、　ＭｅＯ−ＤＭＴ）、　３．４３（ｍ、　）Ｉｓ’　）、２．９４（ｍ、　 ＣＨｚ−Ｎ）、２．４１（ｌＩｌ、　Ｈｚ’　）、２．０９及び２．０７（２ｘ ｓ、　ＣＯ，−アセチル）、　１．９３　ａｎｄ　１．８８（２ＸＳ、　ＣＨ３ −Ｔ）、　１．４２（ｓ、　ＣＨｓ−Ｔ）　、１．３９−１．２３（ｍ、　ＣＨ ｚ）　、　０．９０及び０．８３（２ｘｔ、　Ｊ＝７．２Ｈｚ及び７．１Ｈｚ、 　ＣＨｓ）、　Ｒｒ＝０．５６　（メタノール／ジクロロメタン、１：９．ｖ／ ｖ）。

ジヌクレオシドビーホスホノチオエートを、ヨウ素および９−アントラセニルメ タノール（１０当量）を無水条件下に酸化することによってホスホロジチオエー トトリエステルに定量的に転化した、ＸＩＩａ　、　Ｐ　（Ｚ　、　Ｖ）　、Ｆ ＢＡ”質量スペクトル、５２７（無水ＤＭＴ　ｄｔ）　：　ＦＢＡ−質量スペク トル、９０６（ｍ　−アントラセニルメチル）、　６３９（ＤＭＴ　ｄｔ−３’ 　−ＰＳＯｔ−）＋　３７９（５’−ＰＳＯｚ−−ｄｔ−３’　−０Ａｃ）　、 　”Ｐ−ＮＭＲ５１，７および５１．０゜Ｒｔ＝Ｏ１４１（メタノール／ジクロ ロメタン、１：９．ｖ／ｖ）。

ジヌクレオシドビーホスホノチオエートをヨウ素およびピリジンの水溶液で技術 の形態の条件を使用して処理すると、ジヌクレオシドホスホロチオエート、ＸＩ Ｉａ、Ｐ（Ｚ、Ｖ）、が８７％の収率で得られた。　ＰＢＡ−質量スペクトル、 ９０６　（／Ｍ−）　。

６０３（Ｍ−ＤＭＴ）、３７９（５’　−ＰＳ（ｈ−ｄｔ−３−Ｏａｃ）　−” Ｐ−ＮＭＲ６０，２およびＳＯ，Ｏ。

実施例■ ＸＩＩａ、Ｐ　（Ｚ、Ｙ）、（反応の概要Ｃ）として表される、式 のジヌクレオシドホスホロジチオエートトリエステルの合成、Ｂ＝１−（Ｎ−４ −ペンゾイルシトシニル）；Ｂ＝９−　（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）；Ｂ −９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ＝＝ジメトキシトリ チル Ａｃ＝アセチル およびデオキシジシチジン誘導体の種々の位置にホスホロジチオエートのインタ ーヌクレオチド結合を有するデオキシシチジンオリゴデオキシヌクレオチドへの それ以上の転化。

Ａ、ホスホロジチオエートインターヌクレオチド結合を有するチミジンジヌクレ オチドの合成。

５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン（１，２ｇ、　２．２１ミリモル）を無 水ＴＨＦとの同時蒸発により乾燥し、次いでＴＨＦ（１０ｄ）およびトリエチル アミン（０，４６ｄ、３゜３ミリモル）中に溶解した。ビス（ジイソプロピルア ミノ）クロロホスフィン（６５０■、２．４モル）を添加し、そしてこの溶液を 室温において撹拌した。３５分後、沈澱を濾過により除去し、そしてＴＨＦ（ｌ ｄ）で洗浄した。ジヌクレオシドホスホロジチオエートを含有する一緒にした濾 液をプールし、真空濃縮し、そしてそして（５ｄ）中に再溶解した。３′−〇− アセチルチミジン（６３０■、２．２５ミリモル〕およびテトラゾール（１４２ ■、２．０ミリモル）をＴＨＦ　（Ｌｏａｄ）と同時蒸発させ、アセトニトリル （５ｄ）中に再溶解し、そしてジヌクレオシドホスホロジチオエートのアセトニ トリル溶液に添加した。

室温において４５分後、反応混合物をジクロロメタン（７５ｄ）で希釈し、重炭 酸ナトリウムの水溶液（５％ｗ　／　ｖ　）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し 、濾過し、そして真空濃縮してガムを得た０次いで、生成物をカラムクロマトグ ラフィー（１００ｄのシリカ、酢酸エチル：ジクロロメタン：トリエチルアミン 、Ｖ　／　Ｖ　／　Ｖ　）により精製すると、１．５９ｇのドキシジヌクレオシ ドホスホルアミダイトが生成した（１．６６ミリモル、７５％）。３’Ｐ−ＮＭ Ｒ（ＣＨ３ＣＮ　１４８．５．１４８．１）　。

次いで、デオキシジヌクレオシドホスホルアミダイトを、デオキシジヌクレオシ ドホスホロ・ジチオエートトリエステルに転化した。デオキシジヌクレオシドホ スホルアミダイト（１，５９ｇ　、　１．６６ミリモル）をアセトニトリル（７ ｄ）中に溶解した。次いで、４−クロロベンジルメルカプタン（１，０ｌ１ｔ１ ．１．２０ｇ、７．６ミリモル）およびテトラゾール（２８１■、４．０１ミリ モル）を添加し、そして反応混合物を室温において３０分間撹拌した。トルエン ：２．６−ルチジン中のイオウの溶液（１９：　１　、ｖ／ｖ、４ミリモル原子 のイオウ）を添加し、そして生ずる溶液を１０分間撹拌した０反応混合物を酢酸 エチル（７５ｄ）で希釈し、重炭酸ナトリウムの水溶液（５％ｗ　／　ｖ　）で 抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空濃縮して油を得た。この 油を酢酸エチルＣ４０７”）中に溶解し、そしてヘキサン（２００ｍ）で粉砕し て、粗生成物を白色粉末としてえた。シリカのカラムクロマトグラフィー（１０ ０ｄのシリカ、？８１ｔｉＩ剤の％とじてジクロロメタン中の２〜１２％のメタ ノール）により精製すると、デオキシヌクレオシドホスホロジチオエートトリエ ステル（１，５９ｇ、　１．５２ミリモル、９１％）を生成する。　”Ｐ−ＮＭ Ｒ（ＣＤＣ１３）　９７．９．９６．４　。

３’−０−アセチルの除去（メタノール中の０．１５モルのｔ−ブチルアミン、 ０°Ｃ１１０時間）は、ＤＮＡの合成に使用することができるデオキシヌクレオ シドホスホロジチオエートを生成する（１．２６ｇ、１．２８ミリモル、８４％ ）　、　”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｈ）９７．３．９６．９゜デオキシヌクレオシド ホスホロジチオエートを３′−ホスホルアミダイトに転化しく参照、実施例Ｖ） 、次いでポリマーの支持体上のＤＮＡの合成に使用する。

Ｂ、ホスホロジチオエートを含有するデオキシシチジンのオリゴマーの合成 ５′−〇−ジメトキシトリチルーＮ−１−ルオイルデオキシシチジンは、発表さ れた手順の小さい変更法により調製した（Ｈ，Ｋｏｓｔｅｒ＋　Ｋ、Ｋｕｌｉｎ ｏｗｓｋｉ、　Ｔ、Ｌｉｅｓｅ＋　Ｗ、Ｈｅ１ｋｅｎｓ　、、およびＶ、Ｋｏｈ ｌｉ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３７＋　３６３＋　１９８１）を、無水ピリ ジンとともに２回同時蒸発し、そしてピリジン（５０Ｉｄ）中に再懸濁した。ト リメチルクロロシラン（７，５ａｄ！、５９ミリモル）を添加し、そしてこの混 合物を４５分間室温において撹拌した。〇−トルオイルクロライド（１，４４ｄ 、　１１モル）を添加し、そして反応混合物をさらに２時間撹拌した０反応混合 物を水浴中で冷却し、メタノール（１０ｄ）および２５％の水酸化アンモニウム （２０Ｉｄ）　３０分間で処理し、そして懸濁液を濾過により除去した。生ずる 溶液を真空濃縮乾固した。生ずる固体を４０ＩｒＩｌのジクロロメタン；メタノ ール（８：　２）中に懸濁し、そして不溶性塩を濾過により除去した。濾液を真 空濃縮して油が得られ、これをピリジンの添加後再び２回真空濃縮し、そしてピ リジン（５０ｄ）中に再び溶解した。０３ｇ当量のジメトキシトリチルクロライ ド（３，０５ｇ）の添加後、反応混合物を０℃において３０分間および室温にお いて３０分間撹拌した。ジメトキシトリチルクロライド（０，３当量）を添加し 、そして３０分間撹拌した０反応をメタノール（ｌＩｄ）の添加により急冷し、 そして溶液を真空濃縮した。生ずる油をジクロロメタン相を硫酸ナトリウムで乾 燥し、濾過し、真空濃縮乾固し、ジクロロメタン；ピリジン（９９，５：　０． ５　、　ｖ／ｖ）中に溶解し、そして生成物をカラムクロマトグラフィー（５０ ｇのシリカ、ジクロロメタン：メタノール：ピリジンの０〜３％のメタノールの 勾配；　４００ａｆの各々）、５’−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−）ルオイル デオキシシチジンを含有する分画をプールし、真空濃縮し、酢酸エチル中に再溶 解し、そしてペンタン中に沈澱させた（５．０１ｇ、７．７ミリモル、７７％） 。

３′−０−フェノキシアセチル−Ｎ−トルオイルデオキシシチジンを、発表され た手順の小さい変更により調製した（Ｃ，Ｂ、ＲｅｅｓｅおよびＪ、Ｃ，Ｍ、Ｓ ｔｅｗｒｔ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４２７３＋１９８６ ）。５’−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−トルオイルデオキシシチジン（１，９ ４ｇ、３ミリモル）およびフェノキシ酢酸無水物（１，７２ｇ、６ミリモル）を テトラヒドロフラン（５０−）中に溶解した。ピリジン（０１７３ｄ、９ミリモ ル）の添加後、この溶液を室温において１４時間撹拌し、次いで真空濃縮した。

生ずる油をジクロロメタン（７５ａｆ）中に溶解し、５％の重炭酸ナトリウムの 水溶液（１００Ｗ１．　ｗ　／　ｖ　）で２回抽出し、そして−緒にした水性相 をジクロロメタン（５０ｄ）で抽出した。−緒にした有機相中の生成物を硫酸ナ トリウムで乾燥し、濾過し、真空Ｓ縮乾固し、そして酢酸エチル中に再溶解し、 そしてペンタン中で沈澱させた。完全に保護されたデオキシシチジンに相当する 固体をジクロロメタン：メタノール（８：　２　、　ｖ／ｖ）中に溶解し、そし て水浴中で冷却した。

ジクロロメタン：メタノール（５０ｄ、８　：　２　、ｖ／ｖ）中のｐ−）ルエ ンスルホン酸（２，２８ｇ、　１２ミリモル）の溶液を添加し、そしてこの溶液 を水浴中で１時間撹拌した。次いで、反応を５％の重炭酸ナトリウムの水溶液の 添加により急冷した。有機層をブラインで抽出し、そして水性相をジクロロメタ ン（６０ｄ）で再抽出した。−緒にした有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過 し、そして真空濃縮乾固した。生ずる油をジクロロメタン中に溶解し、そして生 成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（２０ｇのう・リカ、ジクロロメ タンおよびジクロロメタン：メタノール（１〜３％のメタノール）で溶離する） により精製した。３’　−〇−フェノキシアセチルーＮ−）ルオイルデオキシシ チジンを含有する分画をプールし、そして生成物を沈澱として酢酸エチル（１， ２０ｇ　、　８３％）の添加により単離した。

保護された形態のデオキシシチジンホスホルアミダイトは、次の手順を使用して 調製した。５’−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−）ルオイルデオキシシチジン（ ６７８■、１ミリモル）をＴＨＦとともに同時蒸発させ、ＴＨＦ　（５ｄ）およ びトリエチルアミン（０，２１ｄ、１．５ミリモル）中に溶解し、そしてビス（ Ｎ　、　Ｎ−ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（３２０ｇ、　１．２ミ リモル）と反応させた。アルゴン下に９０分後、反応混合物アルゴン圧力下に濾 過して不溶性塩を除去した。

塩をＴＨＦ　（２ａ！りで洗浄した。濾液を濃縮乾固し、そして生成物を再びア セトニトリル中に溶解した。３’−０−フェノキシアセチル−Ｎ−トルオイルデ オキシシチジン（５２７■、１．１ミリモル）およびテトラゾール（７０■、１ ミリモル）をアセトニトリル（４ｉ）中に懸濁させ、そしてフラスコの洗浄に使 用した１、　５　ｄのアセトニトリルを含む上の溶液をを添加した０反応混合物 をアルゴン下に１０５分間撹拌し、次いで酢酸エチル：トリエチルアミン（９９ ：　１　、　ｖ／　ｖ　、　５０Ｉｄ）中に注いだ、２モルのトリエチルアンモ ニウム重炭酸塩（２０１１ｔｌ各々）で２回抽出し、そして水性相を酢酸エチル ：トリエチを硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空濃縮した。

精製をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（２５ｇ　、ヘキサン：ジクロロ メタン：トリエチルアミンＨ５０：　５０　：　０．５゜４００ｄ　；４５：５ ５：　０．５．２００ｄ　；４０：６０：０．５．２００ａｄ！　；および３５ 　：　６５　：　０．５．１００ａｄ！で溶離）により達成した。生成物の分画 をプールし、真空濃縮し、そしてペンタン中に沈澱させた（６７％）。

コ’Ｐ−ＮＭＲ（ＣＨＣＩｓ）１４９．３．１４９．１．’Ｈ−ＮＭＲ８，２２ 及び８．１９（ｓ、　Ｈｍ）。

７．５４−６．８０（ｍ、　ＨＡｒ）、　６．３０（ｍ、　ＨＩ’　）、、　５ ．３９（Ｉｌ、　［３’　）、　４．６７（ａ＋、　Ｃｔ＋ｔフェノキシアセチ ル＋Ｈ１Ｐｒ）、　４．２５（Ｉｌ、　Ｈ４’　）、　３．７８（２ｓ、　Ｍｅ 　ＤＭＴ）＋　３．５（Ｌ　Ｏｓ’　＋　５”　Ｌ　２．８及び２．３（ａｌｌ 　ｏ、ｌ　１２”　Ｌ　２．４７（＋ａ、　Ｍｅ　ｔｏｌ）、　１．１４（＋ａ 、　Ｍｅ　１Ｐｒ）。

デオキシシチジンホスホロジチオエートは、次の手順で使用して調製した。上の 手順で調製したデオキシシチジンホスホルアミダイト（１，４０ｇ、　１．１２ ミリモル）をアセトニトリル（５Ｉｄ）（前取てヘリウムでフラッシュシでチオ ホスファイトの酸素の酸化を回避した）中に溶解し、そして４−クロロベンジル メルカプタン（０，５ｄ、３．７ミリモル）およびテトラゾール（１９０■、２ ．７ミリモル）を添加した。この溶液をアルゴン下に３０分間撹拌しそして、単 離せずに、生ずるチオホスファイト（”Ｐ−ＮＭＲにより示されるように１５分 で完全に生成した。粗製反応混合物中の１９３．４ｐｐｍ）を、トルエン：ルチ ジン（１９，１，ｖ／ｖ）中のイオウの０．４モルの溶液の添加により、ホスホ ロジチオエートトリエステルに酸化した。　”Ｐ−Ｎ？ＩＲ（δ９４．９．９４ ．７）に基づいて、酸化は１０分後に完結した。反応混合物を酢酸エチル（７５ ｄ）で希釈し、２回５％の重炭酸ナトリウムの水溶液（７５ｄ各々）で抽出し、 −緒にした水性相を酢酸エチル（５０ｄ）で逆抽出した。−緒にした有機相を硫 酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして真空濃縮すると油が得られた。この油を 少量のジクロロメタン中に溶解し、酢酸エチルでほぼ４０ｍに希釈し、そして２ ００ｄのヘキサンの添加により生成物を沈澱させた。白色沈澱を濾過し、ジクロ ロメタン中に再び溶解し、そしてこの溶液を濃縮乾固した。生成物をシリカゲル のカラムクロマトグラフィー（４０ｇのシリカゲル、ジクロロメタン：ヘキサン ニトリエチルアミン、６６：３３　：　０．０３　、４０ｄおよびジクロロメタ ン：トリエチルアミン、１００　：　０．０３　、　２００ｄで溶離）により精 製した。完全に保護された生成物を含有する分画をプールし、真空濃縮、ジクロ ロメタン中に再び溶解し、そしてペンタン中に沈澱させた（６０％）。

”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＯＣｌ２）９７．５．９６．７．’Ｈ−ＮＭＲ８，Ｈｍ、　Ｌ ）、　７．６−６．８軸、　ＢＡｒ）、　６．２５（ｍ、　Ｈ＋’　）、　５． ２５（ｍ、　Ｌ’　）、　４．７０（ｍ、　ＣＨｚフェノキシアセチル）、　４ ．５−４．０（蒙、　ＣＨ，ベンジル、）Ｉｓ’　、　Ｈａ’　）。

３．７９（ｓ、　Ｍｅ　ＤＭＴ）、　３．７３−３．３５（ｍ、　Ｏｓ’　）＋ 　３．０４．５５及び２．４５−１．９５（Ｉｌ、Ｈｚ’　、２”　Ｌ　２．５ ０（ｍ＋　Ｍｅ　ｔｏｌ）。

３′−〇−フェノキシアセチルの保護基は、次の手順を使用して除去した。完全 に保護されたデオキシシチジンホスホロジチオエートトリエステル（３５５■、 ０．２６４ミリモル）をアセトニトリル（３ｄ）中に溶解し、そしてメタノール （９ｄ）で希釈した。水浴中で溶液を冷却した後、メタノール中のｔ−ブチルア ミン（０，３モル、１２ｄ）を添加し、そして反応混合物を水浴中で９０分間撹 拌した。反応溶液を濃縮乾固し、そして生成物をシリカゲルのカラムクロマトグ ラフィー（３０ｇのシリカゲル、ジクロロメタン：トリエチルアミン、１００： ０．０３．　３００ｍ、次いでジクロロメタン：メタノール：トリエチルアミン 、９９：　１　：　０．０３．９８：　２　：　０．０３および９７　：　３　 ：　０．０３の各々の２００ｄで溶離）により精製した。生成物の分画を濃縮乾 固し、ジクロロメタン中に再び溶解し、そしてペンタン中に沈澱させた（９５％ 収率）。

”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｈ）９６．５．９６．２．’Ｈ−ＮＭＲ８，２−８，０６ （ＩＩ、　Ｈｍ）、７．５２−６．８１（Ｒ１，ＨＡｒ）、　６．２５（ｓ、　 Ｈｔ’　）、　５．２４（ｍ、　Ｉｓ’　）、　４．５−４．０Ｃｍ、　ＣＨｔ ベンジル、Ｈｘ’　＊　Ｈａ’　＋　Ｏｓ’　）＋　３．７９（ｓｔ　Ｍｅ　Ｄ ＭＴ）＋３．６−３．３（ｍ、　Ｈｓ’　）、　２．９５’２．５５及び２．４ ５−２．０５（ＩＩ、　Ｈｚ’　、　２”　）。

２．５０（ｍ、　Ｍｅ　ｔｏｌ）。

次に、デオキシシチジンホスホロジチオエートを、ジチオエートのインターヌク レオチド結合を含をするＤＮＡの合成のためのシントンとして有用である、３′ −ホスホルアミダイトに転化した。遊離の３′−ヒドロキシルを存するデオキシ シチジンホスホロジチオエート（３０４■、０．２５１ミリモル）をアセトニト リル（５ｄ）中に溶解した。ビス（ジイソプロピルアミノ）β−シアノエトキシ ホスフィン（１２１■、０．４０２ミリモル）およびテトラゾール（２０■、０ ．０２８６ミリモル）をアルゴン下に添加し、そしてこの溶液を２時間撹拌した 。酢酸エチル：トリエチルアミン（１９，５：　０．５　）で急冷し、そしてさ らに酢酸エチル（２０ｄ）で希釈した後、反応混合物を２回２モルのトリエチル アンモニウム重炭酸塩（１３ｄ各々）で抽出し、そして水性相を酢酸エチルニト リ円チルアミン（１９，５：０．５）で逆抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで 乾燥し、濾過し、そして真空濃縮して油を得た。生ずる油を乾燥酢酸エチル中に 再溶解し、そしてペンタン中に沈澱させた（８７％の収率）。

”Ｐ−Ｎ？ＩＲ（ジクロロメタン＞　１４９．５．１４９．２．１４９．帆９６ ．５゜９６．０゜ 選択した部位にホスホロジチオエートのインターヌクレオチド結合を含有するデ オキシシチジンベンタデカマ−を、前述の３’−０−（β−シアノエチル）　− Ｎ　、　Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト部分を含有するデオキシ シチジンホスホロジチオエートおよび５′−〇−ジメトキシトリチルーＮ−ベン ゾイルデオキシシチジン−３’　−０−（β−シアノエチル）−Ｎ、Ｎ−ジイソ プロピルアミノホスホルアミダイトを使用して合成した。標準の合成方法を使用 した（Ｍ、Ｈ，ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＳ、　Ｌ、　Ｂｅａｕｃａｇｅ、米国 特許第４．４１５．７３２号およびＭ、Ｈ，ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＭ、Ｄ、 Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ｓ米国特許第４．４５８．０６６号）、平均のカップリン グ効率は９９％であった（３分のカップリング時間、支持体として制御された孔 のガラス上の０．２モルのデオキシシチジン）、チオフェノールニトリエチルア ミン：ジオキサン（１：　１　：　２　、　ｖ／ｖ／ｖ）の溶液で室温において ６時間処理して、生成物から保護基を除去しく多少の生成物はＳ−保護されたジ チオエイト（５〜１０％）として残る）（ゲルの電気泳動により分析したとき） 、そして５５℃において濃縮した（１５時間）。最終生成物の精製は、ポリアク リルアミドゲルの電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーにより実施した 。特定した位置にホスホロジチオエートの結合を有する３つのペンタデカマーが 合成され、そして次の配列を有した： ｄ　（ＣｐＣｘＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｘＣｐＣ）ｄ　（ ＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｘＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣｐＣ）ｄ　（ＣｘＣ ｐＣｘＣｐＣｘＣｐＣｘＣｐＣｘＣｐＣｘＣｐＣｘＣｐＣ）ここでＸはジチオエ イト結合であり、そしてｐは天然のインターヌクレオチド結合である。

実施例■ ＸＶＩａとして表される、式 のヌクレオシド３′−ホスホロジチオエートの合成、ここでＢ寓１−チミニル； Ｂ−１−（Ｎ−４−ペンゾイルシトシニル）；Ｂ−９−（Ｎ−６−ベンゾイルア デニニル）；Ｂ−９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そしてＤＭＴ＝ジ メトキシトリチル ３’　−０−（ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエチルホスフィノ−５’− ０’（ｄ−ｐ−メトキシトリチル）チミジン（２７，７■、０．０４ミリモル） を、技術の形態の方法により調製しＣＭ、Ｈ，ＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＳ、Ｌ 、Ｂｅａｕｃａｇｅ、米国特許第４．４１５，７３２号）、次いで無水アセトニ トリル中に溶解した（４４１）、硫化水素を１分間泡立てて通人し、そしてテト ラゾール（７，０■、２２０２のＣＨ３ＣＮ中、０．２ミリモル）を添加した。

１０分後、”Ｐ−ＮＭＲのスペクトルは、ヌクレオシドＨ−ホスホノチオエート の２つのジアステレオマーへの定量的転化を示した（７０．９および７０．２ｐ ｐｍ　、’Ｊｐｂ＝６７５Ｈｚ）。過剰の元素状イオウは、Ｈ−ホスホノチオエ ートを定量的収率で１７２時間以内に撹拌しながら室温においてヌクレオシド３ ′−ホスホロジチオエートに転化した。”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＨｓＣＮ）１１４．０ ｐｐｍ、　ＦＡＢ−７０８（Ｍ−）、１８２（Ｍ−ＤＭＴｄＴ＋０）’ＨＮＭＲ （ＣＤＣ１３）７．５３（Ｓ、　Ｌ）、７．３５−６．８Ｈｍ芳香族）、６．１ ５（ｔ、　Ｈｒ’　、Ｊ＝６．４Ｈｚ）、　５．１２（＋ｅ、　Ｈ３’　）。

４．２０（ｍ、　Ｉｓ’　）、３．９５（ｍ、　’Ａａ’　）、３．１８（ｓ、 　ＭｅＱ−ＤＭＴ）、３．４７（ｍ、　ＣＨｚＯ−Ｐ）、　２．７７（ｔ、　Ｃ ＨｚＣＮ、　Ｊ＝６．２Ｈｚ）、２．５６−２．４４（ａ＋。

Ｈｚ’　）＋　１．９１（Ｓ、　Ｃ）＋３−Ｔ）　。

保護されたヌクレオシド３′−ホスホロジチオエートを８０％の水性酢酸（４ｄ ｌ＞中に溶解し、そして室温において３０分間放置した０次いで、反応混合物を 水（４ｄ）で希釈し、そして３回エーテル（５Ｊｄ）で抽出した。水相を蒸発さ せると油が得られ、次いで水（５ｄ）と同時蒸発させた。油を２５％のアンモニ ア中に再び溶解し、そして５５℃において１６時間インキュベージジンした。こ の混合物を再び蒸発させ、そして水で凍結乾燥してヌクレオシド３′−ホスホロ ジチオエートを得た。　ＦＢＡ−３３８（Ｍ−）、　ＦＢＡ″″３３Ｂ（ｄｔ− Ｐ”ｓ＋＜＝Ｓ）。

実施例Ｘ ＸＶｆａとして表される、式 ％式％ Ｂ＝９−　（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）；そして無水ＣＨＣｌ　！　（ ５ｒｔｄｌ　）およびテトラゾール（７６■、１．１ミリモル、ＣＨ３ＣＮ中（ ２，２ｄ）中のＮｈ−ベンゾイル−２−３−メトキシメチリデン−アデノシンの 溶液を、２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトライソプロピルホス ホルアミダイト（３４５■、１．１ミリモル）に添加し、そして室温において２ ０分間撹拌した。アンモニウムテトラゾリドの沈澱は１７２時間後に現れた。反 応混合物をＣＨｚＣｈ　（５０ｄ）で希釈し、そしてＮａＨＣＯｓ　（５％ｗ／ ｖ、５０ｄ）で抽出し、ＣＨｚＣｌｉ　（２５ｍ）で逆抽出し、有機相をＮａｚ ＳＯａで乾燥し、濾過し、そして真空濃縮乾固した。”Ｐ−ＮＭＲの分析（ＣＨ ３ＣＮ）は、１４７．９９ｐｐｍを示した。粗生成物（０，７１ｇ　）を無水Ｃ ＨｓＣＮ（５ｍ）中に溶解し、そして硫化水素を１分間泡立てて通人した。テト ラゾール（１７５■、２．５ミリモル、Ｃｌ１ｊＣＮ中）を添加し、そして再び 硫化水素を反応混合物を通して１分間泡立てて通人した０反応混合物を密閉し、 １０分後、アンモニウムテトラゾリドの沈澱が現れた（”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｈ ）　７２．２および７１．８ｐｐｍ＋　’ＪＰＮ＝６６９１（Ｚ）。

反応混合物を真空蒸発して油が得られ、これを酢酸エチル（５０ｄ）中に再溶解 し、ＴＥＡＢ　（１モル、ｐＨ＝７．４．５０ｄ）で抽出し、そして酢酸エチル （５０ｄ）で逆抽出した。−緒にした有機相をＮａ、ＳＱ、で乾燥し、濾過し、 蒸発させ、そして油をｃｎｚｃｉ□（５Ｉｎｌ）中に再溶解した。過剰の元素状 イオウ（８０■、２．５ミリモル、５ｄのトルエン／２．６−ルチジン、１９： １ｍｖ／ｖ中）を添加した。室温において１時間撹拌すると、ホスホロジチオエ ート生成物が得られた。　”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＨ３ＣＮ）１１４．４および１１４ ．３　、　Ｒｒ　（シリカ）　＝０．３４　、　ＣＨｚＣｌｇ　（９：　１ｖ　 ／　ｖ　）。

こうして、われわれは本発明の好ましい実施態様を例示しかつ記載したが、本発 明は変更および変化が可能であり、したがってここに精確に記載した用語に限定 されず、本発明を種々の用途および条件に応用することができる、このような変 化および変更は有効である。したがって、このような変化および変更は同等の実 施態様の完全な範囲内に入り、しだがって次の請求の範囲の限界内に入る。

本発明およびそれを構成しかつ使用する方法をこのように完全に明瞭に、簡潔に 、そして正確な用語で記載したので、当業者は本発明を構成しかつ使用すること ができるであろう。

手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 ヌクレオシドおよびポリヌクレオチド チオホスホラミダイトおよびホスホロジチオエイト化合物並びに方法 ３゜補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ユニバーシティ　バテンツ、′ 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 の欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）委任状 ７、補正の内容 （１）（３）　別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（３）委任状及びその翻訳文　各 １通 国際調査報告 ｍ＋ｅｌＩｉａ＋１ｅｎａｌ　Ａ＋１１１１−ｇ暴嘩−ａｓＮ・　Ｉ）−〒／＋ １ｌＪＩＯ／Ｉ’＋５）Ｏｆｆ

Claims (77)

【特許請求の範囲】
1. １．式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼式 中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドの塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種 原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１はブロッキング基であり ；Ｘは式ＮＲ６Ｒ７の第二アミノ基であり、ここでＲ６およびＲ７は別々に各々 異種原子置換もしくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキ ル、シクロアルキルアルキル、アラルケニル、シクロアルケニル、アルケニル、 アラルキニル、シクロアルキニルまたはアルキニルであり、Ｒ６およびＲ７は、 一緒になって、主鎖中に５個までの炭素原子を有しかつ合計１０個までの炭素原 子を有するアルキレン鎖を形成し、鎖の両末端の原子価結合はＲ６およびＲ７が 結合している窒素原子に結合しており、そしてＲ６およびＲ７は、それらが結合 する窒素原子と一緒になったとき、窒素、酸素、およびイオウの群からの少なく とも１つの追加の異種原子を含む窒素の複素環を形成し；そしてＭはリンおよび Ｒ８に単結合するイオウであり、ここでＲ６は異種原子置換もしくは非置換のア ルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ア ラルケニル、シクロアルケニル、アルケニル、アラルキニルまたはシクロアルキ ニルである、 に従う化合物。
2. ２．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドの塩基であり；ＡはＫまた はＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドで あり、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異 種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１はブロッキング基であ り；Ｘは式ＮＲ６Ｒ７の第二アミノ基であり、ここでＲ６およびＲ７は別々に各 々異種原子置換もしくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、シクロアル キル、シクロアルキルアルキル、アラルケニル、シクロアルケニル、アルケニル 、アラルキニル、シクロアルキニルまたはアルキニルであり、Ｒ６およびＲ７は 、一緒になって、主鎖中に５個までの炭素原子を有しかつ合計１０個までの炭素 原子を有するアルキレン鎖を形成し、鎖の両末端の原子価結合はＲ６およびＲ７ が結合している窒素原子に結合しており、そしてＲ６およびＲ７は、それが結合 する窒素原子と一緒になったとき、窒素、酸素、およびイオウの群からの少なく とも１つの追加の異種原子を含む窒素の複素環を形成し；そしてＭはリンおよび Ｒ８に単結合するイオウであり、ここでＲ８は異種原子置換もしくは非置換のア ルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ア ラルケニル、シクロアルケニル、アルケニル、アラルキニルまたはシクロアルキ ニルである、 に従う化合物。
3. ３．Ｒ１がトリチル基、ジ−ｐ−アニシルフェニルメチル基またはｐ−アニシル ジフェニルメチル基である、請求の範囲第１または２項記載の化合物。
4. ４．Ｒ８がベンジル、置換ベンジル、２，４−ジクロロベンジル、低級アルキル 、異種原子置換低級アルキルまたはβ−シアノエチルである、請求の範囲第１ま たは２項記載の化合物。
5. ５．はＭがリンおよびＲ８へ単結合するイオウである、請求の範囲第４項記載の 化合物。
6. ６．Ｘが第二アミノ基ＮＲ６Ｒ７である、請求の範囲第１または２項記載の化合 物。
7. ７．Ｘがジイソプロピルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジブチル、 およびピロリジニルである、請求の範囲第６項記載の化合物。
8. ８．Ｂがアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、およびチミジンである、請 求の範囲第１または２項記載の化合物。
9. ９．Ｒ１がジ−ｐ−アニシルフェニルメチルであり、Ｂがチミジルであり、Ｍが ２，４−ジクロロベンジルメルカプチルであり、ＡがＨであり、そしてＸがジメ チルアミノである、請求の範囲第２項記載の化合物。
10. １０．Ｒ１がジ−Ｐ−アニシルフェニルメチルであり、Ｂが９−（Ｎ−６−ベン ゾイルアデニニル）であり、Ｍが２，４−ジクロロベンジルメルカプチルであり 、ＡがＨであり、そしてＸがジメチルアミノである、請求の範囲第２項記載の化 合物。
11. １１．Ｒ１がジ−ｐ−アニシルフェニルメチル、Ｂが１−（Ｎ−４−べンゾイル シトシニル）であり、Ｍが２，４−ジクロロベンジルメルカプチルであり、Ａが Ｈであり、そしてＸがジメチルアミノである、請求の範囲第２項記載の化合物。
12. １２．Ｒ１がジ−ｐ−アニシルフェニルメチルであり、Ｂが９−（Ｎ−２−イソ ブチリルグアニニル）であり、Ｍが２，４−ジクロロベンジルメルカプチルであ り、ＡがＨであり、そしてＸがジメチルアミノである、請求の範囲第２項記載の 化合物。
13. １３．Ｘがジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチル アミノ、メチルプロピルアミノ、メチルヘキシルアミノ、メチルシクロヘキシル アミノ、エチルシクロプロピルアミノ、メチルベンジルアミノ、メチルフェニル アミノ、エチルクロロエチルアミノ、メチルトルイルアミノ、メチル−ｐ−クロ ロフェニルアミノ、メチルシクロヘキシルメチルアミノ、ブロモブチルシクロヘ キシルアミノ、メチル−ｐ−シアノフェニルアミノ、エチル−β−シアノエチル アミノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピロリジノ、ピペリジノ、２，６−ジメ チルピペリジノおよびピペラジノから成る群より選択される、請求の範囲第１項 記載の化合物。
14. １４．Ｘがジメチルアミノである、請求の範囲第１項記載の化合物。
15. １５．Ｘがジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチル アミノ、メチルプロピルアミノ、メチルヘキシルアミノ、メチルシクロヘキシル アミノ、エチルシクロプロピルアミノ、メチルベンジルアミノ、メチルフェニル アミノ、エチルクロロエチルアミノ、メチルトルイルアミノ、メチル−ｐ−クロ ロフェニルアミノ、メチルシクロヘキシルメチルアミノ、ブロモブチルシクロヘ キシルアミノ、メチル−ｐ−シアノフェニルアミノ、エチル−β−シアノエチル アミノ、モルホリノ、チオモルホリノ、ピロリジノ、ピペリジノ、２，６−ジメ チルピペリジノおよびピペラジノから成る群より選択される、請求の範囲第２項 記載の化合物。
16. １６．Ｘがジメチルアミノである、請求の範囲第２項記載の化合物。
17. １７．Ｍがエチルメルカプチル、メチルメルカプチル、プロピルメルカプチル、 ブチルメルカブチル、β−シアノエチルメルカプチル、ベンジルメルカプチル、 ４−クロロフェニルメルカプチル、４−クロロベンジルメルカプチル、２，４− ジクロロベンジルメルカプチル、シクロヘキシルメルカプチル、および４−ニト ロフェニルエチルメルカプチルから成る群より選択される、請求の範囲第１項記 載の化合物。
18. １８．Ｍが２，４−ジクロロベンジルメルカプチルである、請求の範囲第１項記 載の化合物。
19. １９．Ｍがエチルメルカプチル、メチルメルカプチル、プロピルメルカプチル、 ブチルメルカブチル、β−シアノエチルメルカプチル、ベンジルメルカプチル、 ４−クロロフェニルメルカプチル、４−クロロベソジルメルカブチル、２，４− ジクロロベンジルメルカプチル、シクロヘキシルメルカプチル、および４−ニト ロフェニルエチルメルカプチルから成る群より選択される、請求の範囲第２項記 載の化合物。
20. ２０．Ｍが２，４−ジクロロベンジルメルカプチルである、請求の範囲第２項記 載の化合物。
21. ２１．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの３′−ＯＨまたは５′−ＯＨ基 を、前記ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏまたは ３′−Ｏを通してカップリング剤により、請求の範囲第１または２項記載の化合 物と縮合する工程を含んでなる、オリゴヌクレオチドを製造する方法。
22. ２２．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５′−ＯＨを、前記ヌクレオシ ドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏを通してカップリング剤に より、次の式：▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｒ１はブロッキング基であり；Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオ シドの塩基であり；ＡはＫまたはＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン 、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであり、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまた は窒素であり、そしてＲ２は異種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であ り；Ｘは式ＮＲ６Ｒ７であり；そしてＭはリンおよびＲ８に単結合するイオウで あり、ここでＲ６，Ｒ７およびＲ８は上に定義した通りである、 の請求の範囲第２項記載の化合物と縮合する工程を含んでなる、オリゴヌクレオ チドを製造する方法。
23. ２３．Ｂがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、そしてＡがＨで ある、請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．Ｘがジメチルアミノである、請求の範囲第２２項記載の方法。
25. ２５．Ｍが２，４−ジクロロベンジルメルカプチルである、請求の範囲第２２項 記載の方法。
26. ２６．遊離の５′−ＯＨ基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドがポ リマーの支持体へ結合している、請求の範囲第２２項記載の方法。
27. ２７．カップリング剤が、テトラゾール、置換テトラゾール、テトラゾリド塩、 置換テトラゾリド塩およびアミン塩である、請求の範囲第２２項記載の方法。
28. ２８．生ずるチオホスファイトトリエステルをホスホロジチオエートトリエステ ルに酸化する工程をさらに含む、請求の範囲第２２項記載の方法。
29. ２９．元素状イオウが酸化剤である、請求の範囲第２８項記載の方法。
30. ３０．チオホスファイトトリエステルをホスホロチオエートに酸化する工程をさ らに含む、請求の範囲第２２項記載の方法。
31. ３１．ｔ−ブチルヒドロペルオキシドが酸化剤である、請求の範囲第３０項記載 の方法。
32. ３２．請求の範囲第１または２項記載の化合物を使用して、ホスホロジチオエー トおよびホスホロチオエートのインターヌクレオチド結合を任意のかつすべての 組み合わせで有するオリゴヌクレオチドを、ホスホロジチオエートまたはホスホ ロチオエートの結合のみを有するオリゴヌクレオチドを生成する反復方法。
33. ３３．ホスホロジチオエートまたはホスホロチオエートのインターヌクレオチド 結合のみを有する保護されているか、あるいは保護されない形態のオリゴヌクレ オチド。
34. ３４．請求の範囲第１または２項記載の化合物を、ヌクレオシドホスホルアミダ イト、ヌクレオシドホスフェートジエステル、ヌクレオシドホスフェート、また はヌクレオシドＨ−ホスホネートと組み合わせて使用して、天然のホスフェート 、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートおよびホスホルアミダイトのイン ターヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを形成し、ここでこれらの結 合の組み合わせば、適当なチオホスファイト、Ｈ−ホスホネートまたはホスファ イトを、水またはアミンと組み合わせた−ブチルヒドロペルオキシド、イオウま たはヨウ素で酸化することによって生成する、反復方法。
35. ３５．天然のホスフェート、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートの インターヌクレオチド結合を任意のかつすべての組み合わせで有し、ここでこれ らのインターヌクレオチド結合の少なくとも１つはホスホロジチオエートまたは ホスホロチオエートである、保護されているか、あるいは保護されない形態のオ リゴヌクレオチド。
36. ３６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩であり；ＡはＫまたはＫ Ｒ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであり 、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種原 子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１およびＲ３はブロッキング 基であり；そしてＲ５はブロッキング基である、の化合物。
37. ３７．Ｒ１がジ−ｐ−アニシルフェニルメチルであり、Ｒ３がアセチル、レプリ ニル、フェノキシアセチルまたは他のブロッキング基であり、そしてＲ５が２， ４−ジクロロベンジルメルまたはβ−シアノエチルであり、ＡがＨであり、そし てＢがデオキシヌクレオシド塩基である、請求の範囲第３６項記載の化合物。
38. ３８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種 原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５ はブロッキング基であり；そしてＲ６およびＲ７は異種原子置換もしくは非置換 のアルキル、アリールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
39. ３９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２、はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異 種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１，Ｒ４およびＲ５はブ ロッキング基であり；そしてＲ６およびＲ７は異種原子置換もしくは非置換のア ルキル、アリールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
40. ４０．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの３′−ＯＨまたは５′−ＯＨ基 を、前記ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏまたは ３′−Ｏを通してカップリング剤により、請求の範囲第３８または３９項記載の 化合物と縮合させ、次いで５価のリンに酸化する工程を含んでなる、オリゴヌク レオチドを製造する方法。
41. ４１．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５′−ＯＨを、前記ヌクレオシ ドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏを通してカップリング剤に より、請求の範囲第３９項記載の化合物と縮合、次いで５価のリンに酸化する工 程を含んでなる、オリゴヌクレオチドを製造する方法。
42. ４２．Ｂがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、そしてＡがＨで ある、請求の範囲第４１項記載の方法。
43. ４３．ＮＲ６Ｒ７がジイソプロピルアミノであり、Ｒ４はメチルまたはβ−シア ノエチルであり、Ｒ５がメチル、２，４−ジクロロベンジルまたはβ−シアノエ チルであり、そしてＲ１がジ−ｐ−アニシルフェニルメチルである、請求の範囲 第４１項記載の方法。
44. ４４．遊離の５′−ＯＨ基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドはポ リマーの支持体へ結合しており、そして合成を多数回反復して定められた配列の オリゴヌクレオチドを形成する、請求の範囲第４１項記載の方法。
45. ４５．ブロッキングされているか、あるいはブロッキングされおらず、そしてホ スホロジチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチド。
46. ４６．式中、Ｂがヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡがＫ またはＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジ ドであり、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２ は異種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１およびＲ３がブロ ッキング基であり；そしてＲ５がブロッキング基である、請求の範囲第３６項記 載の化合物から製造された、保護されているか、あるいは保護されていず、そし てホスホロジチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチド。
47. ４７．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシ塩基であり；ＡはＫまたはＫ Ｒ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであり 、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種原 子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；そしてＲ１およびＲ３はブロッ キング基である、 の化合物。
48. ４８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種 原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；そしてＲ１およびＲ３はブロ ッキング基であり；そしてＲ６およびＲ７は異種原子置換もしくは非置換のアル キル、アリールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
49. ４９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシオリゴヌクレオチド塩基であり；ＡはＫ またはＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジ ドであり、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２ は異種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１，Ｒ３およびＲ４ はブロッキング基であり；そしてＲ６およびＲ７は異種原子置換もしくは非置換 のアルキル、アリールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
50. ５０．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種 原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１およびＲ４はブロッキン グ基であり；そしてＲ６およびＲ７は異種原子置換もしくは非置換のアルキル、 アリールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
51. ５１．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの３′−ＯＨまたは５′−ＯＨ基 を、前記ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏまたは ３′−Ｏを通してカップリング剤により、請求の範囲第４９または５０項記載の 化合物と縮合させ、次いで５価のリンに酸化する工程を含んでなる、オリゴヌク レオチドを製造する方法。
52. ５２．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５′−ＯＨを、前記ヌクレオシ ドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏを通してカップリング剤に より、請求の範囲第５０項記載の化合物と縮合、次いで５価のリンに酸化する工 程を含んでなる、オリゴヌクレオチドを製造する方法。
53. ５３．Ｂがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、そしてＡがＨで ある、請求の範囲第５２項記載の方法。
54. ５４．３価のリンに結合するＮＲ６Ｒ７がジイソプロピルアミンであり、Ｒ４が メチルまたはβ−シアノエチルであり、そしてＲ１がジ−ｐ−アニシルフェニル メチルである、請求の範囲第５２項記載の方法。
55. ５５．遊離の５′−ＯＨ基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドがポ リマーの支持体へ結合しており、そして合成は多数回反復して定められた配列の オリゴヌクレオチドを形成する、請求の範囲第５２項記載の方法。
56. ５６．請求の範囲第５２項記載の方法により製造された、ブロツキングされてい るか、あるいはブロッキングされていず、そしてホスホロジチオエート結合を含 有するオリゴヌクレオチド。
57. ５７．式中、Ｂがヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡがＫ またはＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジ ドであり、そしてＫＲ２はＫとして酵素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２ は異種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１がＨまたはブロッ キング基であり；Ｒ３がＨまたはブロッキング基であり、そしてＲ６およびＲ７ は異種原子置換もしくは非置換のアルキル、アリールまたはアラルキル基である 、請求の範囲第４８項記載の化合物から製造された、ブロッキングされているか 、あるいはブロッキングされていず、そしてホスホロジチオエート結合を含有す るオリゴヌクレオチド。
58. ５８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種 原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；そしてＲ１およびＲ３はブロ ッキング基であり；そしてＲ６は異種原子置換もしくは非置換のアルキル、アリ ールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
59. ５９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種 原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１，Ｒ３およびＲ４はブロ ッキング基であり；そしてＲ６およびＲ７は異種原子置換もしくは非置換のアル キル、アリールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
60. ６０．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたは ＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであ り、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種 原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１およびＲ４はブロッキン グ基であり；そしてＲ６およびＲ７は異種原子置換もしくは非置換のアルキル、 アリールまたはアラルキル置換基である、 の化合物。
61. ６１．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの３′−ＯＨまたは５′−ＯＨ基 を、前記ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏまたは ３′−Ｏを通してカップリング剤により、請求の範囲第５９または６０項記載の 化合物と縮合させ、次いで５価のリンに酸化する工程を含んでなる、オリゴヌク レオチドを製造する方法。
62. ６２．ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５′−ＯＨを、前記ヌクレオシ ドまたはオリゴヌクレオチドの、それぞれ、５′−Ｏを通してカップリング剤に より、請求の範囲第６０項記載の化合物と縮合、次いで５価のリンに酸化する工 程を含んでなる、オリゴヌクレオチドを製造する方法。
63. ６３．Ｂがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり、そしてＡがＨで ある、請求の範囲第６２項記載の方法。
64. ６４．３価のリンに結合するＮＲ６Ｒ７がジイソプロピルアミンであり、Ｒ４が メチルまたはβ−シアノエチルであり、そしてＲ１がジ−ｐ−アニシルフェニル メチルである、請求の範囲第６２項記載の方法。
65. ６５．遊離の５′−ＯＨ基を有するヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドがポ リマーの支持体へ結合しており、そして合成を多数回反復して定められた配列の オリゴヌクレオチドを形成する、請求の範囲第６２項記載の方法。
66. ６６．請求の範囲第６２項記載の方法により製造された、ブロッキングされてい るか、あるいはブロッキングされていず、そしてホスホロジチオエート結合を含 有するオリゴヌクレオチド。
67. ６７．式中、Ｂがヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡがＫ またはＫＲ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジ ドであり、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２ は異種原子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１がＨまたはブロッ キング基であり；Ｒ３がＨまたはブロッキング基であり、そしてＲ６が異種原子 置換もしくは非置換のアルキル、アリールまたはアラルキル基である、請求の範 囲第５８項記載の化合物から製造された、ブロッキングされているか、あるいは ブロッキングされていず、そしてホスホロジチオエート結合を含有するオリゴヌ クレオチド。
68. ６８．請求の範囲第４７項の化合物を、Ｒ４ＯＨ（ここでＲ４は異種原子置換も しくは非置換のアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアル キルアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アラルケニル、アルキニル、ア ラルキニル、またはシクロアルキニル置換基である）を酸化によりホスホロジチ オエートトリエステルに転化する方法。
69. ６９．酸化剤がＩ２およびＲ４ＯＨであり、そしてＲ４がアントラセニルメチル である、請求の範囲第６８項記載の方法。
70. ７０．請求の範囲第４７項記載の化合物を酸化によりホスホロチオエートジエス テルに転化する方法。
71. ７１．請求の範囲第７０項記載の方法により製造された、ホスホロチオエートジ エステルを含有するオリゴヌクレオチド。
72. ７２．請求の範囲第３６項記載の化合物からＲ３またはＲ１としてＨ−ホスホネ ート、ホスフェートモノエステルまたはホスフェートを使用することによってオ リゴヌクレオチドを製造する方法。
73. ７３．ホスホロジチオエートを含有するオリゴヌクレオチド。
74. ７４．請求の範囲第４８項記載の化合物からＲ３またはＲ１としてＨ−ホスホネ ート、ホスフェートモノエステルまたはホスフェートを使用することによってオ リゴヌクレオチドを製造する方法。
75. ７５．ホスホロジチオエートを含有するオリゴヌクレオチド。
76. ７６．請求の範囲第５８項記載の化合物からＲ３またはＲ１としてＨ−ホスホネ ート、ホスフェートモノエステルまたはホスフェートを使用することによってオ リゴヌクレオチドを製造する方法。
77. ７７．次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼式 中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩基であり；ＡはＫまたはＫ Ｒ２であり、ここでＫはＯＨ，Ｈ、ハロゲン、ＳＨ，ＮＨ２またはアジドであり 、そしてＫＲ２はＫとして酸素、イオウまたは窒素であり、そしてＲ２は異種原 子置換もしくは非置換のブロッキング基であり；Ｒ１はＨまたはブロッキング基 であり；ＣはＨ，ＯＨまたはＯＲ３であり、ここでＲ３はブロッキング基である 、 により表される化合物。