JPH03501201A

JPH03501201A - 組み換え技術により産生した、３−デス−ヒドロキシ−シスタチンｃポリペプチドまたはその修飾物

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Publication number: JPH03501201A
Application number: JP63504682A
Authority: JP
Inventors: グラッブ，アンデルス; ルントウォール，アケ; アブラハムソン，マグルス; ダルボゲ，ヘンリク
Original assignee: ダコ・エー／エス
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1991-03-22
Anticipated expiration: 2015-02-21
Also published as: EP0362259A1; FI102191B1; NO890260D0; ATE135049T1; DE3855078D1; WO1988009384A1; IL86476A; ES2013337A6; DE3855078T2; DK260987D0; NO890260L; JP3011274B2; FI895553A0; CA1340862C; IL86476A0; EP0362259B1; AU619750B2; AU1939988A; NO301985B1; FI102191B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】シスタチンＣまたはその修飾物の製造方法およびこの方法を実施する際に使用するＤＮＡ塩基配列この発明は、シスタチンＣ（以前は８−トレース（８−ｔｒａｃｅ　）もしくはポスト−８−グロブリン（ｐｏｓｔ−８−ｇｌｏｂｕｌｉｎ　）と呼ばれていた）の製造方法に関する。この発明は、また、この方法を実施する際に使用するＤＮＡ塩基配列およびプラスミドおよび微生物にも関する。

完全な（ｍａｔｕｒｅ）シスタチンＣは、１２０個のアミノ酸を有する公知のタンパク質である。そのアミノ酸配列は以下の通りである。

Ｓｅｔ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ− Ｖａ　１−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｍｉ　ｓ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−５−５ｅｒ− Ａｒ工１ｅ−ｖａｌ−ｊｄａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔ’ｆｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ９−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−’！’ｈｒ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ −Ａｓ　ｎ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−ｐｈｅ−ｎｉ　５−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｎ−Ｐ　ｒＯ７ＭＩＳ−Ｌｅｕ−ＬｙＳ−Ａｒ　９−’ＬＹＳ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣｙＳ− ８ｅ　ｒ　−Ｐｈｅ−にｉｎ−°工１ｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＭｅセーＴｈｒ−Ｌｅｕ−５ｅ　ｒ−Ｌｙｓ− ５ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ生来のヒト・シスタチンＣは、２つの型の混合物である。

これらは、■型が５ｅｒ−８ｅｒ−ＯＨＰｒｏ−Ｇ　Ｉ　ｙ−−−−Ａ　Ｉ　ａというアミノ酸配列を有するのに対して、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣと呼ばれる■型が以下に示す配列を有することが異なる。

５ｅｒ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−−Ａｌａ　（１）このように、２つの型は第３のアミノ酸残基が異なるだけである。調製品の起源および抽出方法によって２つの型の相対比が多少変化するために、調製品の生物学的活性も多少変化する。

この発明によって調製されるシスタチンＣは、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣ型であり、そのため一定の活性を有していると考えられる。

文献から知られるように、シスタチンＣはシステインープロテイナーゼ、例えば（ｉ、ａ、）パパインおよびカテプシンＢの効率の良い阻害剤である。

システインープロテイナーゼは、タンパク質およびペプチドの細胞内代謝、プロホルモンのタンパク質加水分解性の変換、コラーゲンの細胞外分解および悪性水種細胞による正常組織の侵入に関与する。

シスタチンＣは、癌の増殖または転位−形成を促進するシステインープロテイナーゼを阻害するので、潜在的な癌阻害剤である。

さらに、シスタチンＣは抗ウィルス活性を有し、おそらく抗菌活性を有している。

システインープロテイナーゼ、例えばキモパパインは、ずれた椎間板（ｓｌｉｐｐｅｄ　ｄｉｓｃ）の治療に使用することができる。

これらのシステインープロテイナーゼが脳を髄液中に拡散した場合には、ずれた椎間板の治療処置の重大な副作用とじて脳出血が起こるであろう。シスタチンＣはそのような副作用を阻止するので、これに関して治療的な有用性がある。

アミロイド−シスによる脳出血の遺伝的傾向を打ち消すシスタチンＣの活性は特に重要である。それは、アミロイドとして動脈壁に沈積する。若者を襲うこの病気においてシスタチンＣの代謝は変化しており、沈積したシスタチンＣの配列は、この病気を持たない人々から単離したシスタチンＣに関して最初に記載されたものから、ある位置で逸脱している。

ある型の遺伝性脳出血においては、ｌＯアミノ−末端アミノ酸が分離した後、シスタチンＣがアミロイドの形態で破裂する脳動脈に沈積する。これらの型の遺伝性脳出血の場合には、６８番目にロイシン残基の代わりにグルタミン酸残基を有するシスタチンＣ分子が存在する。

組織中のコラーゲンの分解には、ｉ、ａ、システインプロテイナーゼが関与するので、シスタチンＣはおそらくそのような組織の分解を阻害するであろう。

ヒトの尿から単離したシスタチンＣのアミノ酸配列は、Ｃ−Ｈａ−ｒａｓ腫瘍遺伝子生成物に多少一致しているようであり、そのように特徴付けられているこの発明は、システィンＣまたはその修飾物をコードするコドンを含む新規のＤＮＡ塩基配列の使用を基にしている。

この発明の一実施例は、ヒトの細胞または胎盤に基づいて形成されたＤＮＡコピーまたはｃＤＮＡ塩基配列に関与する。

その故に、この発明はそのようなりＮＡ塩基配列にも関連し、その構造は請求項２に記載されている。

さらに、この発明は、修飾シスタチンＣにも関与する。この修飾シスタチンＣにおいては、５−１７．５５−５９および／または６８番目の１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられている。そのような修飾シスタチンＣの例は、６８番目のＬｅｕがＧｌｎに代えられた誘導体である。

また、この発明は、生合成シスタチンＣもしくは修飾シスタチンＣの製造方法に関与する。そのような方法では、細菌、酵母細胞もしくは噴孔動物細胞株のような宿主生活体を使用する。この宿主生活体には、シスタチンＣもしくは修飾シスタチンＣの発現に適した構造を有する、プラスミドのようなベクター、が含まれる。

問題のＤＮＡ塩基配列は、微生物に組み込まれたプラスミドに、シグナル配列、プロモーター等と一緒に挿入される。

微生物は、実質的に、それ自体は公知の方法で培養されたものである。

この発明による方法においては、シスタチンＣをコードするＤＮＡ塩基配列を含む宿主生活体は基質中で培養され、生成したシスタチンＣはこの培養培地から実質的に抽出される。

好ましい宿主生活体はＥ、Ｃｏ１１であるが、原理的には、ビール酵母菌のような酵母細胞を含むいかなる微生物を用いることもでき、あるいは噴孔動物細胞によって培養することができる。

生成したシスタチンＣは、それ自体公知の方法で培養培地から抽出される。公知の方法としては、例えば、溶媒を介した抽出およびクトマトグラフィーによる精製によるものかあたアフィニティクロマトグラフィーが、純粋なシスタチンＣの単離に特に適していることが明らかになっている。

ｃＤＮＡクローンの単離および分析は、組換えファージ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｈａｇｅｓ）をスクリーニングすることにより達成されている。このため、ヒト胎盤および肝臓ｍＲＮＡからのλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーが使用されている。スクリーニングは、１３０ｍｍのベトリ皿に５０．０００プラークの密度で、アフィニティ精製した（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ　）抗体物質を用い、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｌｓに従った方法によるものであった。

結合した抗体物質は、アルカリホスファターゼが結合した抗物質（ａｎｔｉ−ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）によって示された（ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ　）。

プレート・リーサット（ｐｌａｔｅ　１ｙｓａｔ　）法によって生成したλファージは、遠心によって、ＣｓＣ１勾配で単離した。ＤＮＡは標準法で抽出した。

サザーンプロット実験において、混合された、シスタチンＣに特異的なオリゴヌクレオチド・プローブは、ＥｃｏＲＩと反応したファージＤＮＡの生成物とハイブリッドを形成した。ハイブリッドを形成したｃＤＮＡ挿入物をＥｃｏＲＩ−開裂（ＥｃｏＲＩ−１１ｎｅａｒｉｚｅｄ）　ｐＵｃ１８プラスミドベクターに結合させ、このプラスミドベクターを次にＥ、ｃｏｌｉＪＭＢ８３細胞の形質転換に使用した。プラスミドはアルカリ溶解法によって生成した。Ｍ１３ｍｐ８中のサブクローン（ｓｕｂ−ｃｌｏｎｅ　）である挿入物のＤＮＡ塩基配列の決定は、変形ジデオキシ鎖末端技術を用いて行なった。

以下、この発明を実施例によって説明する。

実施例１肝臓、前立腺および胎盤からのヒト細胞から作成したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを、シスタチンＣをコードするクローンに対して行なった。約１．２Ｘ　１０’個の肝臓細胞の組換え体および約３ＸＩＯ’個の前立腺細胞からの組換え体を、抗物質を用いてスクリーニングし、オリゴヌクレオチドプローブを混合した。このスクリーニングの結果は陰性であった。一方、胎盤細胞からの組換え体６Ｘ１０’個のスクリーニングは、抗物質と反応する９種のクローンをもたらした。

これらクローンのうちの、それぞれＣ５、Ｃ６ａおよびＣＩ２と呼ばれた３種を以下に用いた。それぞれ、８００．８００および７００塩基対のそれらの挿入物は、サザーンプロット実験によって、混合したオリゴヌクレオチドと選択的にハイブリッドを形成した。混合したオリゴムヌクレオチドは、タンパク質−配列データから組み立てた。

ＥｃｏＲＩ切断Ｍ１３ｍｐ８中のサブクローンである、クローンＣ６ａおよびＣＩ２からの挿入物の配列決定によって、この挿入物が、ポリアデニル環シグナルＡＡＴＡＡＡを含む同じ３°−配列を共有することが明らかになった。

ランダムにオーバーラツプする断片の配列を決定することによって、８１３ｍｐ８中のサブクローンであるクローンＣ６ａｃＤＮＡ挿入物の両方の繊維（ｓｔｒｉｎｇｓ　）の全ての配列が決定された。各ヌクレオチドは、平均５．６３回決定された。クローンＣ６ａおよびＣＩ２のｃＤＮＡ挿入物の配列を端から決定することによって達成されたデータは、Ｃ１２挿入物の配列がＣ６ａの９１番目から始まることを示した（第１図参照）。

Ｃ６ａ挿入物は、７７塩基対の５゛−非コードづけ配列（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）および２６２塩基対の３°−非コードづけ配列を含む７７７塩基対を有する。７５Ｂ−７８１番目のポリアデニルシグナルＡＡＴＡＡＡの後には、１５個のヌクレオチドが続いている。Ｋｏｚａｋによって発見された配列に一致する可能な翻訳開始は、停止コドンの６ｂｐ下流に見出された。この位置での開始および５１Ｂ−５１８番目のＴＡＧコードでの翻訳停止は、最終的に、アミノ酸残基２６個のシグナル配列を持つアミノ酸１２０個の長シスタチンＣとなる。問題のタンパク質は、尿から単離されたシスタチンＣと同一であろう。

第１図は、ヒトのシスタチンＣｃＤＮＡ挿入物の配列決定手順を説明するものである。クローンＣＩ２およびＣ６ａの挿入物は、チェイン−ターミネータ−（ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）法によって、それらの末端から配列が決定された。Ｃ６ａ挿入物の両方のＤＮＡ繊維の配列決定には、「ショットガン」配列決定−分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ａｎａｌｙｓｉｓ　）技術が用いられた。

水平の矢印は、各々の配列決定の方向と範囲を示している。Ｃ６ａ挿入物のタンパク質コードづけ領域は箱型に囲み、線形を付けた部分は完全なタンパク質をコードする領域を示す。

シスタチンＣをコードするＤＮＡ構造は、ヒトのプレシスタチンＣをコードするクローンＣ６ａ　ｃＤＮＡのアミノ酸配列から誘導されたヌクレオチドを有する。ヌクレオチド配列の番号付けは、最初のヌクレオチドから始まり、５°から３ °の方向に進む。アミノ酸の番号付けは、完成したタンパク質中のアミノ酸から始める。アミロイド−シスによる遺伝的な脳出血を患う患者にアミノイドとして沈積したシスタチンＣ断片において置換したアミノ酸は、箱型に囲んだ。Ｋｏｚａｋ開始およびポリアデニル環シグナルは、下線を付した。

シスタチンＣに対するｃＤＮＡを存するプラスミドｐｕｃ１ｇ／Ｃ６ａを制限酵素Ｎｃｏｌ／Ｈｉｎｄｌｌ！で切断し、その後、プラスミド断片を精製した。次に、アミノ酸メチオニンのコード配列および完全なシスタチンＣの最初の約４０個の塩基を有する合成りＮＡリンカ−を、ＮｃｏｌおよびＨ１ｎｄｌ１１部位の間に挿入した（第２図）。シスタチンＣのｃＤＮＡに存在するコドンの代わりに、Ｅ、ｃｏｌｉで高タンパク収量が得られるコドンを使用した。このプラスミドを制限酵素Ｃ１ａｌ／ＥｃｏＲＩで切断し、その後、高メチオニン・シスタチンＣのコード配列を含有する約６００の断片を精製した。

合成プロモーターと、シャインおよびダルガルノ（Ｓｈｉｎｅａｎｄ　Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列とを含有するプラスミドｐＨＤ１８２を制限酵素Ｃ１ａｌ／ＥｃｏＲＩで切断し、その後、プラスミド断片を精製した。次いで、このプラスミド断片を上述のｅｏｏ　ｂｐの断片と結合し、シスタチンＣ発現プラスミドｐＨＤ２６２　（メチオニン・シスタチンＣをコードする）を形成した（第３図）。この発現プラスミドを含有するＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１を以下に述べる通りに培養した。

実施例２において言及したプラスミドｐＵｃ１　ｇ／Ｃ６ａを制限酵素Ｎｃｏｌ／Ｈ１ｎｄｌｌｌで切断し、その後、プラスミド断片を精製した。次に、Ｅ、ｃｏｌｉからの外膜タンパクＡ　（ＯｍｐＡ）のコード配列および完全なシスタチンＣの最初の約４０の塩基を含有する合成りＮＡリンカ−を、Ｎｅｏ　ＩおよびＨ１ｎｄｌ１１部位の間に挿入した。最適のＥ、ｃｏｌｉコドンを使用した。次いで、このプラスミドを制限酵素Ｃ１ａｌ／ＥｃｏＲＩで切断し、その後、０ＩＩｌｐ人シグナルペプチドおよびシスタチンＣのコード配列を含有する約７００　ｂｐの断片を精製した。

次に、上記断片を、λＰＲプロモーター、最適シャインおよびダルガルノ配列、プラスミドｐＬＩｃ１８からのポリリンカー領域およびλからの感温性ＣＩ　リプレッサー遺伝子を含有する発現プラスミドに導入した。次いで、このように形成されたプラスミドｐＨＤ３１３　（第４図）を、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１に導入した。シスタチンＣの発現とシスタチンＣの精製は、ここに記載されたように行なった。

プラスミドｐＵｃ１８をＡｐａｌ／ＥｅｏＲ１で切断して約６８０塩基対の断片を精製し、さらにこの断片を、プレシスタチンＣの最初の約３個のアミノ酸のコード配列を含有する合成Ａｐａｌ／Ｃ１ａｌルミｌ／Ｃ１ａｌリンカにこの断片を、実施例３において言及した、温度誘導λＰｉ？プロモーターを含有する発現プラスミドに導入した。

表現プラスミドｐＨＤ３１３　（実施例３）から約７００　ｂｐのＨｉｎｄｌｌｌ／ＥｃｏＲ１断片を単離した。この断片をＭ１３　ＭＰ１８に導入し、シスタチンＣに対するコード配列が下記第１表に見出される修飾の１種以上を含むものに代わるように、インビトロ変異誘発を行なった。インビトロ変異誘発の後、多量のクローンを培養し、配列を決定した。次に、正しい配列を有するクローンをＣ１ａｌ／ＥｅｏＲＩで切断し、その後、約７００　ｂｐの断片を単離して発現プラスミドｐＨＤ３１３に導入した。このようにして形成したプラスミドを培養し、生成物を上述の通りに精製した。

１、Ｌｅｕ”　−＊　Ｇ１ｎ２、Ｓｅｒ”　−Ｖａｌ”の削除３、　１＋２４、Ｇｌｙ”　−陽電荷基、例えばＡｒｇ５．　Ｑｌｙｌｌ　＝　陰電荷基、例えばＧｌｕ６、　０１ｙ”　−強い疎水性基、例えばＴｒｐ７、　４Ｉ；Ｉｙ” 　−”　Ａｌａ”、　５Ｇｌｙ”　−Ｓｅｒ”８、単一のアミノ酸の置換、例えば、ａ、）　Ａｒｇ”　−”　Ｇｌｕｂ、）　Ｌｅｕ９→Ａｒｇ、　Ｇｌｕｃ、）　Ｖａｌ”　−”　Ａｒｇｓ　Ｇｌｕｄ、）　Ｇｌｙ１２−”　ＡｒｇＳＧｌｕｅ、）　Ｐｒｏ１３４　Ａｒｇｓ　Ｃ１ｕ　ｓ　Ｔｒｐｆ、）　Ａｒｇ” 　−”　Ａｒｇｓ　Ｇｌｕ９、サブ領域の置換、例えば、Ａｒｇ”　−Ｍｅｔ１４−　Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙｌｏ、Ａｒｇ’　−Ｎｅｔ”の削除１１、Ｃｙｓ８３　→　ｃｒｙ１２、Ｃｙｓ９７−＋　Ｇ！ｙ１３、Ａｓｎ”　−＋　Ａｌａ１２’の削除１４、Ａｓｐ８１−　Ａｌａ１２° の削除１５、ｌｌｅ””　−Ａｌａ１２’の削除実施例６バッチ発酵によるテクニカルスケールでのシスタチンＣの製造正しいＮ−末端を有するシスタチンＣを発現するＥ、ｃｏｌｉＭＣｌｏＢｉ　ｐＨＤ３１３−１−１を、アンピシリンを有するＩ、Ｂベトリ皿で培養する。単一のコロニーを、ＬＢ培地および５０１＋１ｇ／Ωのアンピシリンを有する１００ −シェーカーフラスコに移す。これを３０℃ｓ　２０Ｏｒｐｍで２０時間インキュベートする。

発酵は、１０ｇ実験室用発酵器において、第１７エーズではｐＨ−７，２、通気 −１ｖｖＭ、撹拌−１００Ｏｒｐｍおよび温度−３０”Ｃの条件下で行なわれる。使用される培地は、酵母エキス、カザミノ酸および種々の塩からなる。

発酵器にシェイクフラスコから採った１００−の培養菌を接種し、バイオマス濃度がＯＤ、２．、、　ｓｓ５となったときにグルコースの投与を開始する。その供給速度は３．５ｇグルコース７１時間でなければならず、それはプロセスを通して維持される。シスタチンＣの形成は、増殖相（ＯＤ５２５−−−５０）において、発酵器内の温度を４０℃まで上げることによって誘起される。シスタチンＣは素早く生成する。昇温の２時間後、温度を２０℃まで下げ、ｐ）ｌを９．０に上げることにより発酵が終了する。全発酵プロセスは約１２時間続く。

このプロセスにより、約１０００ｍｇ／ρのシスタチンＣ最終濃度が達成される（シスタチンＣは、細胞中の全タンパク質の１０％をなす）。

シスタチンＣの抽出Ｅ、ｃｏｌｌからのシスタチンの抽出Ｉ発酵により得られた細胞懸濁液を遠心する。この細胞を、２０−２５％ｖ／ｗショ糖、Ｏ，１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．２Ｍ　トリスｐＨ９，０に再懸濁し、２０分間撹拌する。遠心によって細胞を除去し、１゜分間激しく撹拌する条件下で、ベレットを０℃の１０ｍＭ０ｍＭトリスルに素早く再懸濁する。

得られた上滑は、周辺質相からのシスタチンＣを含有する（機械的均質化による全抽出の７０％）Ｅ、ｃｏｌｉからのシスタチンＣの抽出■発酵により得られた細胞懸濁液を、５Ｍ　ＮａＯＨを用いてｐＨ−１０，５に調整する。２０分間撹拌した後、懸濁液を遠心する。得られた上滑はシスタチンＣを含有する。

Ｅ、ｃｏｌｉからのシスタチンＣの抽出■発酵により得られた細胞懸濁液を遠心し、０．５Ｍ　）リスｐ）Ｉ−１０，５に再懸濁する。２０分間撹拌した後、この懸濁液を遠心する。得られた上滑にはシスタチンＣが含有されている。

実施例７抽出物を、スペクトロボア”　（ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ）型の？ｉ　折ＪＩｉ！（遮断分子量３５００）を用いて、２０ｎＭエタノールアミンｐＨ−１０，０に対して透析し、次いで、２０１ｎＭエタノールアミンｐＨ−１０，０で平衡にしたＱ−セファロースカラムに通す。シスタチンＣ（３−デス−ＯＨシスタチンＣ）を含有する分画を合わせ、ダイアフローＴＭ（Ｄｉａｆｌｏ）　ＹＭ２型のフィルターで濃縮する。

次に、この物質を０．０５Ｍ炭酸水素アンモニウムで平衡にしたバイオゲルＴＭ（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　）　Ｐ６０型カラムに流す。シスタチンＣを含有する分画が集められる。この単離手順によって、収最適のＥ、ｃｏｌｉコドンを使用することによる、シスタチンＣをコードする合成遺伝子の組み立て高度に発現したＥ、ｅｏｌｉタンパク質が、個々のアミノ酸に対するある特定のコドンを使用することは、文献により知られている。シスタチンＣに対するｃＤＮＡの生成と同時に、シスタチンＣ遺伝子が公開されたアミノ酸配列に基づいて合成された。この遺伝子は、高度に発現したＥ、ｃｏｌｉ蛋白質に好ましいコドンを有していた。この遺伝子はまた、Ｅ、ｃｏｌｉの外膜タンパクＡからのシグナル配列またはＥ、ｃｏｌ　ｉの繊維タンパク（ｒｉｂｒｉａ−ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｋ８８／９９からのシグナル配列のいずれかと融合することができるような方法で修飾した。合成の後、プラスミドｐｕｃｉｓにおいて、上記遺伝子を段階的にクローニングした。その後、この遺伝子を単離し、上記シグナル配列のうちの一つと一緒に実施例３において言及した発現プラスミドに導入した。このプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０８１に導入し、上述の通りに培養した。

最適のＥ、ｃｏｌｉコドンを有するＯｍ　ｐＡ−シスタチンＣＧＡＣ−ＧＣＴ− ＴＭ−ＴＡＧ実施例８３−デス−０）１−シスタチンＣの生成および単離３−デス−０１（−シスタチンＣを含有するバクテリア培地を遠心し、無菌培地をダイアフローＴＭＹＭ２フィルターで濃縮した。

濃縮した物質を、スペクトラポール７Ｍ透析膜（遮断分子量３５００　）において、２０ＩｎＭエタノールアミン、ｐＨ１０，０に対して透析し、次いで、２０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ１０，０で平衡にしたＱ−セファロース〒Ｍに流した。３−デス−０Ｈ−シスタチンＣを含有する分画を溜めておき、ダイアフロー ”　ＹＭ２フィルターで濃縮した。次に、この物質を、０．０５Ｍ重炭酸アンモニウムで平衡にしたバイオゲル７Ｍカラムに流した。３−デス−０Ｈ−シスタチンＣを含有する分画を合わせた。この単離手順により、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣの収率は典型的には５０−６０％である。

３−デス−０Ｈ−シスタチンＣの特徴付けｐ）ＩＤ　３１３−形質転換Ｅ、ｃｏｌｊの培養菌から上述の通りに単離した３−デス−０Ｈ−シスタチンＣを、生物学的活性を予想して、物理学的−化学的に特徴付けした。特徴付けによる結果を、対応するヒト・シスタチンＣの分析の結果と比較した。

オフタロ二−二重免疫拡散法を用いた分析は、ヒト・シスタチンＣに対して生じたポリクローナル抗血清によって認識されたシスタチンＣ−エピトープの全てが、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣにも存在することを示した。ｐＨ８，６でのアガロースゲル電気盆（ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｅ　）および還元もしくは非還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥは、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣおよびヒト・シスタチンＣが電荷および分子量に関して同一であることを示した。アミノ酸分析は、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣのアミノ酸組成がヒト・シスタチンＣの組成とほとんど同じものであることを示した。自動配列決定は、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣがＮ−末端配列を有することを示した。

３−デス−０Ｈ−シスタチンＣにおける、各部位においてヒト・シスタチンＣに見出されたものと同一（７）　ＳＳＰＧＫＰＰＲＬＶＧＧＰＭＤＡＳＶＥＥＥＧＶ−ＡＬＤＦＡＶＧＥＹＮＫＡＳＮＤＭＹ　（文献１を参照）および、加えて、３番目のプロリン残基の１００％は、ヒドロキシル基を欠いていた。ジスルフィド結合したペプチドのアミノ酸分析は、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣがＣｙｓ７３−Ｃｙｓ８３およびＣｙｓ７３−Ｃｙ　ｓ　８３の間に、即ちヒト・シスタチンＣの場合と同様に、ジスルフィドブリッジを有することを示した（文献５を参照）。

３−デス−０Ｈ−シスタチンＣの生物学的活性を、濃度が決定されたパパインに対する力価決定により測定した。３−デス−０Ｈ−シスタチンＣは８３％活性であり、これはヒト・シスタチンＣの対応する数値（５５％）より高い。システインプロテイナーゼであるパパイン（ＥＣ３，４，２２，２）　、カテプシンＢ　（ＥＣ３，４，２２，１）およびジペプチジルペプチダーゼＩ　（ＥＣ３，４，１４，１＞への３−デス−０Ｈ−シスタチンＣの結合力を決定した。３−デス− ０）Ｉ−シスタチンＣ酵素複合体の解離の平衡定数（＜　０．００５ｎＭ、０．５０ｎＭおよび３．５ｎＭ）は、実験誤差範囲内で、ヒト・シスタチンＣ酵素複合体の平衡定数（＜　０．００５ｎＭ、０．２７ｎＭおよび３．５ｎＭ）と同じであった。

このように、物理学的−化学的特徴付け、および３−デス−０Ｈ−シスタチンＣとシステインプロテイナーゼとの相互作用の分析は、３−デス−０Ｈ−シスタチンＣが完全な生物学的活性を有し、それが３番目の残基にヒドロキシル基を完全に欠いていることを除いて、ヒト・シスタチンＣと同一であることを示している。

実施例９座骨神経痛のキモバピン処置における、ＣＮＳ保護剤としての３−デス−０Ｈ− シスタチンＣの治療的な使用座骨神経痛を患う患者のキモパパン処置の直前に、使用しようとするキモバピンのモル量の３倍のモル量の３−デス−０Ｈ−シスタチンＣを脳を髄液に注入する。例えば、８ｎｇのキモバピン（市販の医薬の活性成分：　ＤｉｓｅａｓｅＴＭ；Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｉｅｓ　Ｌｔｄ、、ＴｈｅｔｆｏｒｄＳＵＫ　およびＣｈｙｒｎｏｄ５ａｃｔｉｎ”　；　５ＩＩｌｉｔｈＬａｂｏｒａｔｉｅｓ、、Ｉｎｃ、、ＲｏｓｅｍｏｎｔＳＩＬ、　ＵＳＡ　）を椎間板内注射（ｉｎｔｒａｄｉｃａｌ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）する場合には、１２ｍｇの３−デス−０Ｈ−シスタチンＣを脳を髄液に注入する。この３−デス−０Ｈ−シスタチンＣは、無菌の生理食塩水１１当り５ｍｇの３−デス−０Ｈ−シスタチンＣからなる。これは、脳を髄液へのキモパパインの不適切な注入によって生じる神経組織のタンパク質加水分解での崩壊による副作用に対して保護する。

意図する椎間板内キモパパイン注射を実行した時点、またはその後に、脳を髄液へのキモパパインの不適切な注入の臨床的またはラジオグラフ的な徴候が観察された場合には、キモパパインの組織損傷効果を阻止するために、使用されたキモパパインのモル量の３倍のモル量の３−デス−０Ｈ−シスタチンＣを直ちに脳を髄液に注入する。

３−デス−０Ｈ−シスタチンＣの注入の直後、患者は、ある程度、穏やかに運動する。この運動は、患者の脳を髄液による、注入した３−デス−０Ｈ−シスタチンＣ溶液の迅速な分配をもたらす。

文　献１．　Ｇｒｕｂｂ、Ａ　＆　Ｌａｆｂｅｒｇ、Ｌｔ：　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７９゜３０２４−３０２７，１９８２２、　Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ　Ｍ、Ｂａｒｒｅｔｔ　Ａ　Ｊ、５ａｌｖｅｓｅｎ　Ｇ、Ｇｒｕｂｂ　Ａ、Ｊ。

Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９８６；２６１（２４）＝１１８２−９゜３、　Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ　Ｍ、Ｒｉ仁ｏｎｊａ　Ａ、Ｂｒｏｗｎ　Ｍ　Ａ、Ｇｒｕｂｂ　Ａ。

Ｍａｃｈｌｅｉｄｔ　Ｗ、Ｂａｒｒｅｔｔ　Ａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ１９Ｂ７，２６２（２０）：９６８Ｂ−９４゜４、　Ｂａｒｒｅｔｔ　Ａ　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｓｃｉ　１９８７；１２（Ｓ）＝１９３−６゜５、　Ｂａｒｒｅｔｔ　Ａ　Ｊ、Ｆｒ１ｔｚ　Ｅ！、Ｇｒｕｂｂ　Ａ、工ｓａ＋ｒ＋ｕｒａ　Ｓ、ＪａｒｖｉｎｅｎＭ、Ｋａｔｕｎｕｍａ　Ｎ、Ｍａｃｈｌｅｉｄ七　Ｗ、Ｍｕｌｌｅｒ　Ｅｓｔｅｒｌ　Ｗ、ＳａｓａｋｉＭ、Ｔｕｒｋ　Ｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　１９８６；２３６（１）＝３１２゜５、Ｂｕｔｔｌｅ　Ｄ　Ｊ、Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ　Ｍ、Ｂａｒｒｅｔｔ　Ａ　Ｊ、５ｐｉｎｅ１９８６；１１（７）：６８８−９４゜７、　Ｄｅｌａｉｓｓ６　ＪＭ、Ｅｅｃｋｈｏｕｔ　Ｙ、Ｖａｅｓ　Ｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　ＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ、Ｃｏ＋ｎｍｕｎ　１９８４；１２５（２）＝４４１−７゜８、　Ｆｏｒｄ　Ｌ　Ｔ、Ｃ１１ｎ　０ｒｔｈｏｐ　１９６９；６７：６Ｂ−７１゜９、　Ｇａｒｖｉｎ　Ｐ　Ｊ、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ　ＲＢ、Ｓｍｉセｈ　Ｌ、Ｇｅ５ｌｅｒ　ＲＭ。

Ｃｈｙｍｏｐａｐａｉｎ、Ｃ１１ｎ　０ｒｔｈｏｐ　１９６５；４１：２０４− ２３゜Ｌａｆｂｅｒｇ　Ｅ、ＭａｌｍＪ、Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ　１９８４；３１１（２４）；１５４７−９゜１１、　Ｇｒｕｂｂ　Ａ、Ｇｒｉｍｓｂｅｒｇ　Ｖ、Ｇｒｕｂｂ　Ａ、Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｎ　５ｃａｎｄ１９８６；７３：３０９−３１０゜１２、　Ｊｅｎｓｓｏｎ　Ｏ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ　Ｇ、Ａｒｎａｓｏｎ　Ａ、Ｂｌδｎｄａｌ　ＨｅＰｅセｒｕｓｄｏセセｉｒ　Ｘ、Ｔｈｏｒｓ七ｅｉｎｓｓｏｎ　Ｌ、Ｇｒｕｂｂ　Ａ、ＬａｆｂｅｒｇＥ、Ｃｏｈｅｎ　Ｄ、Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ　Ｂ、Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｌ　５ｃａｎｄＬ９８７；７６：１０２ −１４゜１３、　Ｎａｃｈｅｍｓｏｎ　Ａ　Ｌ、Ｒｙｄｅｖｉｋ　Ｂ、Ａｃｔａ　Ｏｒヒｈｏｐ　５ｃａｎｄ１９８８．５９（１）　＝５６−６２゜１４、　Ｇｒｕｂｂ　Ａ；　Ａｃｔａ　０ｒｔｈｏｐ　５ｃａｎｄ　１９８８；５９（１）＝６３− ６５゜１５、　Ｇｒｕｂｂ　Ａ；　Ｌａｆｂｅｒｇ　Ｈ＆　Ｂａｒｒｅｔｔ　Ａ、、Ｊ　Ｐ’ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

１．７０．３７０−３７４，１９８４．０国際調査報告１＋１１４ｆｉｊｌｌｌ＋ｔｌｌ　Ａ工１４１＋、＊　１＋６．　Ｐ口丁／ＤＫ８８１０００８２ニス−２２３５５ルンド　メルランノ（ングスヴエイエスー２２３６４　ルンド　タフ・）１ンマースクショ

Claims

【特許請求の範囲】（１）シスタチンＣまたはその修飾物をコードするコドンを有するＤＮＡ塩基配列。（２）下記の構造もしくはこの構造の断片を有するＤＮＡコピーまたはｃＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ塩基配列。【配列があります】（３）シスタチンＣまたはその修飾物をコードする、合成により製造されたＤＮＡ塩基配列からなるＤＮＡ塩基配列。（４）微生物における発現に最適なコドンを有するＤＮＡ塩基配列。（５）３−デス−ヒドロキシ−シスタチンＣからなる組換えシスタチンＣ。（６）５−１７、５５−５９および／または６８番目のアミノ酸の１種またはそれ以上が、他のアミノ酸と置き換えられているシスタチンＣの構造を有する修飾シスタチンＣ。（７）６８番目のＬｅｕがＧｌｎに変えられている請求項６に記載の修飾シスタチンＣ。（８）請求項６に記載の修飾シスタチンＣをコードするコドンを有するＤＮＡ塩基配列。（９）下記の修飾の１種またはそれ以上を受けたシスタチンＣをコードするコドンを有するＤＮＡ塩基配列。１．Ｌｅｕ６８→Ｇｌｎ２．Ｓｅｒ１−Ｖａｌ１０の削除３．１＋２４．Ｇｌｙ１１→陽電荷基、例えばＡｒｇ５．Ｇｌｙ１１→陰電荷基、例えばＧｌｕ６．Ｇｌｙ１１→強い疎水性基、例えばＴｒｐ７．４．Ｇｌｙ１１→Ａｌａ１１、５Ｇｌｙ１１→Ｓｅｒ１１８．単一のアミノ酸の置換、例えば、ａ．）Ａｒｇ８→Ｇｌｕｂ．）Ｌｅｕ９→Ａｒｇ、Ｇｌｕｃ．）Ｖａｌ１０→Ａｒｇ、Ｇｌｕｄ．）Ｃｌｙ１２→Ａｒｇ、Ｃｌｕｅ．）Ｐｒｏ１３→Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐｆ．）Ａｒｇ１４→Ａｒｇ、Ｇｌｕ９．全領域の置換、例えば、Ａｒｇ８−Ｍｅｔ１４→Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ１０．Ａｒｇ８−Ｍｅｔ１４の削除１１．Ｃｙｓ８３→Ｇｌｙ１２．Ｃｙｓ９７→Ｃｌｙ１３．Ａｓｎ６１→Ａｌａ１２０の削除１４．Ａｓｐ８１→Ａｌａ１２０の削除１５．ｌｌｅ１０１→Ａｌａ１２０の削除（１０）生合成シスタチンＣまたは修飾シスタチンＣの製造方法であって、シスタチンＣもしくは修飾シスタチンＣをコードするＤＮＡ塩基配列を有する宿主生活体を基質中で培養し、次いで、生成したシスタチンＣまたは修飾シスタチンＣを培養生活体から抽出する方法。（１１）使用される宿主生活体が細菌、酵母細胞または哺乳動物細胞株である請求項１０に記載の方法。（１２）使用される微生物がＥ．ｃｏｌｉまたはピール酵母菌である請求項１１に記載の方法。（１３）ＤＮＡ塩基配列が、請求項２ないし４のいずれか１項または８ないし９のいずれか１項に記載の構造を有する請求項１１または１２に記載の方法。（１４）シスタチンＣの生合成的発酵に使用される宿主生活体に導入されるプラスミドであって、プロモーター、シグナル配列等の他に、請求項２ないし４のいずれか１項または８ないし９のいずれか１項に記載のＤＮＡ構造を有するプラスミド。（１５）請求項１４に記載のプラスミドを有する微生物。（１６）請求項１０ないし１３項のいずれか１項に記載の方法によって製造されたシスタチンＣまたは修飾シスタチンＣを含有する治療用調合薬。（１７）シスタチンＣを用いた脳出血の治療処置。（１８）座骨神経痛に関する、組織損傷効果の治療処置または予防。