JPH03501445A - ステロイドを多重酸化する方法及びそのために用いる遺伝子操作した細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、異種ＤＮＡが少なくともＰ４ａｌｌ１７αタンパク質及びｐｎｓ。

Ｃ２１タンパク質を特徴とする請求項１または２の組換え宿主細胞。

４、宿主が微生物である請求項１−３のいずれか１つの組換え宿主細胞及びその 子孫。

５、宿主がサツカロマイセス、タルイベロマイセスもしくはバチルスの１つの種 またはエシェリキア・コリである請求項４の組換え宿主細胞及びその子孫。

６、組換え宿主細胞を栄養培地にタンパク質が培養中に生成、蓄積し得る条件下 に培養することよりなる組換え宿主細胞によってタンパク質混合物を製造する方 法であって、組換え宿主が請求項１−５のいずれか１つによって定義されるもの である方法。

７、ある化合物を生体外で選択的に多重酸化する方法であって、酸化すべき化合 物を少なくとも２つのタンパク質の存在下、酸化及び酸化された化合物の培養液 中への蓄積を可能にする条件でインキュベートし、ついで酸化された化合物を回 収することよりなる方法において、該タンパク質が請求項６の方法によって生産 されたものであることを特徴とする方法。

８、ある化合物を選択的に多重酸化する方法であって、組換え宿主細胞を該化合 物の存在下目的とする酸化が起こり培養液中に酸化した化合物が蓄積する条件で 培養し、ついで酸化した化合物を回収することよりなる方法において、該組換え 宿主細胞が請求項１−５のいずれか１つの細胞であることを特徴キする方法。

９．　ステロール化合物の側鎖の切断、３−ヒドロキシ、５　（６）　−デヒド ロ基の３−オキソ、４　（５）−デヒドロ基への酸化及び異性化、及び１７α− ヒドロキシル基、２１−ヒドロキシル基もしくは１１β−ヒドロキシル基の導入 よりなる群から選ばれた少なくとも２つの酸化工程を行う請求項７または８の方 法。

１０、酸化が結果としてＣ２１−ヒドロキシル基及びＣ１７α−ヒドロキシル基 のプレグネノロンまたはプロゲステロンへの同時導入になる請求項７または８の 方法。

１１、請求項１で定義したタンパク質をコード化する少なくとも２つの遺伝子を 特徴する請求項１−５のいずれか１つの組換え宿主中で作動し得る発現カセット 。

１２、異種ＤＮＡが酵素Ｐ＝ｓｏ　１７α及び酵素Ｐ４ｓｏＣ２１をコード化し 、発現カセットがｐＧＢ１７α／Ｃ２１−１である請求項１１の発現カセット。

１３、請求項９−１２のいずれか１つによって製造された活性化合物を含有する 医薬製剤。

明　細　書 ステロイドを多重酸化する方法及びそのために用いる遺伝子操作した細胞 本発明は医薬的に有用なステロイドの製造のための多重酸化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ 　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）方法に関する。

発明の背景 １１β、１７α、２１−トリヒドロキシ−４−プレグネン−３゜２０−ジオン（ ヒドロコルチゾン）はその薬理的性質ゆえにコルチコステロイドとして、及び多 くの有用なステロイド特に他のコルチコステロイドの製造のための出発化合物と して用いられる重要な医薬ステロイドである。ヒドロコルチゾンはを推動物の副 腎皮質で生産され、はじめは副腎皮質組織からの骨の折れる抽出によって少量得 ていた。構造解明後に始めて化学合成工程と微生物学的変換の組合せによって特 徴づけられる新しい生産ルートが開発された。用いられるステロール、胆汁酸、 サポゲニン等の出発化合物が豊富で安価であるというだけの理由で、現在の方法 はより高価でない生産物を与えるが、それでもかなり複雑である。現在の方法を 改善するためいくつかの可能性が案出され、また生化学的アプローチも試みられ た。

１つの試みは、ステロイドのヒドロコルチゾンへの生体内酵素変換の役を担うこ とが知られている、単離された副腎皮質タンパク質を用いて、適当な出発ステロ イドを生体外生化学系で変換することであった。しかしながらタンパク質の単離 の困難さ及び必要なコファクターの高価格が経済的に魅力的な大規模プロセスを 不可能にしたようであった。別のアプローチは触媒するタンパク質を天然の環境 に保ち、副腎皮質細胞に細胞培養物中に目的とするヒドロコルチゾンを生産させ ることであった。しかしながら実際には細胞の低生産性のため、かかる生化学的 方法を経済的に魅力的なものにすることは不可能であると思われた。

哺乳類及び他のを推動物の副腎皮質中での生体内プロセスはコレステロールから 始まり、種々の中間化合物を経由して最終的にヒドロコルチゾンを与える生化学 的経路（第１図参照）を構成する。この経路には８つのタンパク質が直接関与し 、それらのうち５つは酵素（そのうち４つはチトクロームＰ４Ｓ。酵素）であり 、他の３つの電子伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒｒ　１ｎｋ）タンパク質である。最初 の工程はコレステロールの３β−ヒドロキシ−５−プレグネン−２０−オン−（ プレグネノロン）への変換である。この変換、すなわちモノオキシゲナーゼ反応 においては３つのタンパク質が関与する：側鎖切断酵素（Ｐ４．。ＳＣＣ，ヘム −Ｆｅ−含有タンパク質）、アドレノドキシン（ＡＤＸ、ＦｅｚＳｉ含有タンパ ク質）及びアドレノドキシンリダクターゼ（ＡＤＨ，ＦＡＤ含有タンパク質）。

基質としてのコレステロール以外に、この反応は分子状酸素及びＮ　Ａ、　Ｄ　 Ｐ　Ｈを必要とする。

ついでブ１／グネノロンを脱水素／異性化によって４−プレグネン−３，２０− ジオン（プロゲステロン）に変換する。タンノぐり質３β−ヒドロキシステロイ ドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼ（３β−Ｈ３Ｄ）によって触媒されるこの反 応はプレグネノロン及びＮＡＤ”を必要とする。

ヒドロコルチゾンを得るため、プロゲステロンをついで３つの位置でヒドロキシ ル化する。この変換はモノオキシゲナーゼによって触媒される。プロゲステロン の１７α−ヒドロキシプロゲステロンへの変換には２つのタンパク質が関与する ニステロイド１７α−ヒドロキシラーゼ（Ｐｌ、。１７α、ヘム−Ｆｅ−含有タ ンパク質）及びＮＡＤＰＨチトクロームＰ４．。リダクターゼ（ＲＥＤ、ＦＡＤ −及びＦＭＮ−含有タンパク質）。この反応はプロゲステロン、分子状酸素及び ＮＡＤＰＨを消費する。

１７α−ヒドロキシプロゲステロンの１７α、２１−ジヒドロキシ−４−プレグ ネン−３，２０−ジオン（フルチキソロン）の変換のためにも、２つのタンパク 質が必要になるニステロイド−２１−ヒドロキシシラーゼＣＰ＝ｓａＣ２１、ヘ ム−Ｆｅ−含有タンパク質）及び前述のタンパク質ＲＥＤ、この反応は１７α− ヒドロキシプロゲステロン、分子状酸素及びＮＡＤＰＨを消費する。

コルチキソロンのヒドロコルチゾンへの変換においては３つのタンパク質が関与 するニステロイド１１β−ヒドロキシラーゼ（Ｐ、、。

１１β）、ヘムーＦ＝含有タンパク質及び上述のタンパク質ＡＤＸ及びＡＤＨ。

上記のごとくチトクロームＰ４．。タンパク質はコレステロールのヒドロコルチ ゾンへの生化学的変換に必須の酵素である。これらの酵素はチトクロームＰｕｔ 。タンパク質（または短縮して２４％。タンパク質）というより大なるグループ に属する。これらは原核生物（種々の細菌）及び真核生物（酵母、カビ、植物及 び動物）中に存在する、哺乳類では副腎皮質、卵巣、精巣及び肝臓に高レベルの Ｐａｓ。タンパク質が見い出される。

これらのタンパク質の多くは精製されており、また現在その性質がよく知られて いる。これらの特異的活性は決定されている。最近、このものについてのいくつ かの概説が発表されている：例えばに。

Ｒｕｃｋｐａｕｌ及びＨ，Ｒｅ１ｎ編「チトクロームＰａ５ｏＪ及びＰ、　Ｒ， ０ｒｔｉｚｄｅ　Ｍｏｎｔｅｌｌａｎｏ編「チトクロームＰ４ＳＯ１構造、機構 及び生化学」。

チトクロームＰ　４％Ｄタンパク質は一酸化炭素による還元後の４５０ｎｍでＱ それらの特異的吸収極大によって特徴づけられる。原核生物においてＰ　ａｓｏ タンパク質は膜に結合しているか、細胞質性である。

細菌Ｐ　ａｓｏタンパク質、例えばＰ　４％０　ｆｆｌｅｇ及びＰ　４８０　Ｃ ａｌを詳細に研究した限りではフェレドキシン及びフェレドキシンリダクターゼ はヒドロキシル化活性に関与することが示された。真核生物においては、２つの タイプのＰ　４Ｓ６タンパク質、■及び■が記述されている。これら２つの差異 は以下にある： １、亜細胞局在性。　タイプｌはミクロソーム分画に局在し、タイプ■はミトコ ンドリアの内裏に局在する２、電子がＰ　４”Ａ。タンパク質に伝達される方法 。　タイプＩはＰ　４ｓｓリダクターゼを介してＮＡＤＰＨによって還元される がタイプ■はフェレドキシンリダクターゼ（例えばアドレノドキシンリダクター ゼ）及びフェレドキシン（例えばアドレノドキシン）を介してＮＡＤＰＨによっ て還元させる。

ＥＰ−Ａ、−０２８１２４５によるとチトクロームＰａｓ。酵素はストレプトマ イセス種から調製され、化学化合物のヒドロキシル化に用いられる。酵素は単離 形態で用いるが、単離はかなり長たらしく費用のかかる操作である。特開昭６２ −２３６４８５　（ダーウェン）８７−３３１２３４）はサツカロマイセス・セ レビシェ中に肝１ｍチトクロームＰ４ｓ。酵素の遺伝子を導入し、それらを発現 させてそれらの酸化活性について用いる酵素を生成させることができることを教 示している。

しかしながら、上記文献にはチトクロームＰ　４％Ｇ酵素のステロイド化合物の 製造のための使用についての記載はない。

ここに参考に加入する我々の係属出願Ｅ　Ｐ　−Ａ　−８９２０１１７３，５＜ 出願日８１９８９年５月８日、発明の名称ニステロイドの生化学的酸化方法及び そのために用いる遺伝子操作した細胞）によって、高価で戸上）ステロイド出発 物質のより希少で高価な最終産物への酸化的変換のための多遺伝子系の構築に必 要なタンパク質の生産のために、多重度の発現カセットが提供され、そこにおい ては、かかる変換が天然（ｎａｔｉｖｅ）系で、酵素で触媒され、コファクター で媒介された多重度の変換によって行われる。

上記出願によると、コレステロールのヒドロコルチゾンへの変ｍの生化学的径路 中の別個の酸化工程を、単独でもしくは別のタンパク質と協同で、触媒すること ができる酵素をコード化する異種コードＤＮＡ配列を発現するために、発現カセ ットが組換え宿主細胞中に有効に仕組まれる。従って発現カセットは組換え宿主 中で以下のタンパク質を生産し得る配列を含む：側鎖切断酵素（Ｐ４．。５ＣＣ ）；アドレノドキシン（ＡＤＸ）、アドレノドキシンリダクターゼ＜ＡＤＲ）、 ３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼ（３β−Ｈ３Ｄ） 、ステロイド１７α−ヒドロキシラーゼ（Ｐ＜５ｏ１７α）　、ＮＡＤＰＨチト クロームＰａｓ。リダクターゼ（ＲＥＤ）、ステロイド−２１−ヒドロキシラー ゼ（Ｐ４ＳＯＣ２１）及びステロイド１１β−ヒドロキシラーゼ（Ｐ、ｓｏ　１ １β）。

上記出願はさらに、これらのベクターもしくはその発明の発現カセットで形質転 換された組換宿主細胞；上記酵素を生産する方法及びそれらの酵素を酸化のため に使用する方法；培養液中での特異的酸化のために該宿主細胞を用いる方法；及 び該方法によって製造された化合物を含有する組成物に関する。

特に上記出願は大規模生化学的生産反応器で用いるのに適する細胞の調製及び培 養、並びにこれらの細胞の化合物の酸化のための、特に第１図に示すステロイド の生産のための使用を扱っている。そこに記述された個々の反応は別々に行うこ とができる。多工程反応における工程の相互交換も包含されている。微生物が好 ましい宿主で＝１が、他の細胞例えば細胞培養物においてもしくは生きているト ランスジェニック植物もしくは動物において適用された植物もしくは動物の細胞 も同様に用いることができる。

これらの細胞は適当な受容体細胞、好ましくは適当な微生物細胞を、コレステロ ールのヒドロコルチゾンへの変換に関与するタンパク質、すなわち側鎖切断酵素 （Ｐ４．。５ＣＣ）　、アドレノドキシン（ＡＤＸ）、アトレッドキシリダクタ ーゼ（ＡＤＲ）　、３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラー ゼ（３β−Ｈ３Ｄ）、ステロイド−１７α−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４．。１７α ）、ＮＡＤＰＨチトクロームＰａｓ。リダクターゼ（ＲＥＤ）、ステロイド−２ １−ヒドロキシラーゼ（Ｐ、ｓｏ　Ｃ２１）及びステロイド−１１β−ヒドロキ シラーゼ（Ｐ４ｓｏｌｌβ）をコード化するＤＮＡ配列を含有するベクターで遺 伝子形質転換することによって得られる。ある宿主細胞は必要なタンパク質の１ 種以上を自ら十分なレベルですでに生産すことができ、その場合には補完ＤＮＡ 配列のみで形質転換しなければならない。かかる可能性がある自己タンパク質は フェレドキシン、フェレドキシンリダクターゼ、Ｐ　４８０−リダクターゼ及び ３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼである。

コレステロールのヒドロコルチゾンへの変換に関与するタンパク質をコード化す る配列の回収（ｒｅｔｒ　１ｃｖａ　ｌ）のため、適当なりＮＡ源が選択された 。コレステロールのヒドロコルチゾンへの変換に関与するすべてのタンパク質を コード化するＤＮＡの回収のために適当な原料はを椎動物の副腎皮質組織、例え ばウシ副腎皮質組織である。

種々の微生物からも関係するＤＮＡを回収できる。例えば３β−ヒドロキシステ ロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼをコード化すまたコルチキソロンの１１ β−ヒドロキシル化に関与するタンパクシＰ、５Ｏ３ＣＣ及びＰ４ｓｏｉｌβも しくはそれに対応する微生物タンパク質、ウシマドレッドキシン、ウシアト１ノ ツトキシンリダクターゼ、ウシもしくは微生物起源の３β−ヒドロキシステロイ ドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼ、ウシＰ、５ｏ１７α、ウシＰ４ｓｏＣ２１ 、及びウシもしくは微生物起源のＮＡＤＰＨチトクロームＰ４．。リダクターゼ をコード化するＤＮＡ配列を以下の工程に従って単離した：１、真核生物の配列 （ｃＤＮＡの配列）ａ　適当な組織から全ＲＮＡを調製するｂ　ＲＮＡ含有ポＩ ＪＡ”を転写して二本ｔＪｃＤＮＡとし、これをバタテリオファージベクターに 連結する。

Ｃ得られたｃＤＮＡライブラリーを目的きするｃＤＮＡに特異的なｓｔｐ標識オ リゴマーでスクリーニングするか、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ シド（Ｉ　ＰＴＧ）誘導λ（ラムダ）、−ｇゝ　１１　ｃＤＮＡライブラリーを 特異的Ｃ２５Ｉ−標識）抗体を用いてスクリーニングすることによってスクリー ニングした。

ｄ　陽性のプラーク形成ユニッ）　（ｐｆｕ）のｃＤＮＡ挿入物を、ｃＤＮＡの 全長をヌクレオチド配列決定によって確かめるため、適当なベクターに挿入した 。

２、原核生物遺伝子 ａ　適当な微生物からゲノムＤＮＡを調製した。

ｂ　ＤＮＡライブラリーを得るため、適当なベクター中にＤＮＡ断片をクローン 化し、適当なＥ、コリ宿主に形質転換した。

Ｃ該ＤＮＡライブラリーを当面の遺伝子に特異的な３Ｒｐ標識オリゴマーでスク リーニングするか、ＥＦＴ（Ｊｌｊ導λ−８１１１ＤＮＡライブラリーを特異的 （”Ｊ［ｋ）抗体を用いてスクリーニングすることによりスクリーニングした。

ｄ　陽性のコロニープラスミドを単離し、挿入されたＤＮＡ断片を遺伝子の全長 を確かめるために適当なベクター中にサブクローン化する。

注：　改善された方法によって特定のｃＤＮＡ　（真核生物配列）または遺伝子 （原核生物配列）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の公知方法に従い２つの 特異的オリゴマーを用いて増幅した（Ｓａｉｋｉ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９ ．４８７−４９１．１９８８）。

ついで増幅したｃＤＮＡまたはＤＮＡを適当なベクターに挿入した。

先の操作によって単離された異種ＤＮＡが転写及び翻訳のための適当なコントロ ール配列の間に置かれた適当な発現カセットを用意する。これによって該ＤＮＡ が適当な宿主の細胞道境で発現され、目的とするタンパク質を与えることが可能 となる。開始制御配列の後に分泌シグナル配列が続いてもよい。

該発現カセットによって適当な制御配列が構造ＤＮＡと共に導入されなければな らない。発現は適当な宿主細胞を、その宿主に適合性を有し、その発現が望まれ るコード配列に作動し得るように結合しているコントロール配列を含有するベク ターによって、形質転換することによって可能となる。別法として宿主ゲノムに 存在する適当なコントロール配列を用いる。発現は、適当な細胞を、宿主制御配 列が導入されたＤＮＡの発現を適当に制御するような方法で宿主ゲノムと相同組 換えすることを可能にする宿主配列が側面に位置する目的とするタンパク質のコ ード配列を含有するベクターで、形質転換することによって可能となる。

一般に理解されている如く、制御配列なる言葉はそれらが作動し得るように結合 しているコード配列の発現の適当な調節に必要なすべてのＤＮＡ断片、例えばオ ペレーター、エンハンサ−１及び特にプロモーター及び翻訳を制御する配列を含 む。

プロモーターは環境を調節することによって制御し得てもよく、それによって制 御し得なくきもよい。原核生物の適当なプロモーターは例えばｔｒｐプロモータ ー（トリプトファン欠乏によって誘導し得る）　、ｌａｃプロモーター（ガラク トースアナログＩＰＴＧによって誘導し得る）、β−ラクタマーゼブロモータ及 びファージ由来ＰＩ−プロモーター（温度変化によって誘導し得る）を包含する 。さらに特にバチルスにおける発現について有用なプロモーターはα−アミラー セ、フロテアーゼ、５ｐｏｈ、％５ｐｏｃ及び○／１０５のためのプロモーター 及び合成プロモーター配列を包含する。好ましいプロモーターは第５図に示すも のであり、ｒＨｐａＵ」として表示される。酵母での発現に適当なプロモーター は３−ホスホグリセレート（ｇｌｙｃｅｒａｔｅ　）キナーゼプロモーター及び 他の解糖酵素、及びアルコールデヒドロゲナーゼ及び酵母ホスファターゼのため のプロモーターを包含する。適当なものはまた転写伸長ファクター（ＴＥＦ）及 びラクターゼのためのプロモーターである。哺乳類の発現系は一般にアデノウィ ルスプロモーター及びＳＶ４０プロモーター等のウィルス由来プロモーターを採 用するが、重金属もしくはグルココルチコイド濃度によって制御されるノタロチ オネインプロモーター等の調節可能プロモーターも用い得る。現在のきころウィ ルスベースの昆虫細胞発現系や、ツバリン（ｎｏｐａ　Ｉ　１ｎｅ）シンセダー ｔ−プロモーター等の植物細胞プロモーターに基いた発現系も適当である。

翻訳制御配列は原核生物系ではリポソーム結合部位（ＲＢＳ）を含有し、真核生 物系では翻訳はＡＵＧ等の開始コドンを含有するヌクレオチド配列によって制御 し得る。

必要なプロモーター及び翻訳制御配列に加え、それらの調節終結（例えば真核生 物系におけるポリアデニル化配列に帰結する）を含む種々の他の制御配列を発現 制御に用いる。ある系は発現を行うのに望ましいが多くの場合必須ではないエン ハンサ−要素を含有する。

上記出願の別の面によると宿主細胞を形質転換するのに有用な種々のベクターが 記述されている。ｐＧＢＳＣＣ−ｎ　（Ｔｌは１〜１７のいずれかの整数である ）で示される１群のベクターが％Ｐ４ＳＯ８ＣＣ酵素をコード化するＤＮＡにつ いて特に開発されている。特別の態様によればｐＧＢｓｅｃ−７ベクターがＡＤ Ｘタンパク質をコード化”ンるさらなる異種遺伝子を閉じ込める（ｅｎｅｌｏｓ ｏ）するよう適合化されている。ｐＧＢＳＣＣ／ＡＤＸ−１と呼ばれる得られた 新規なベクターは共に機能し得る形態で生産されるｐ、、、ｓｃｃ及びＡＤＸタ ンパク質をコード化する。

ｐＧＢ１７α−ｎ　（ｎは１〜５の任意の整数である）で示される別の群のベク ターは特にＰ４ｓ。１７α酵素をコード化するＤＮＡについて開発された。

ｐＧＢｃ２１−ｎ　（ｎは１〜９のいずれかの整数である）で表示される別の群 のベクターはＰａｓ。Ｃ２１酵素をコード化するＤＮＡについて特に開発されて いる。

ｐＧＢ１１β−ｎ　（ｎは１〜４のいずれかの整数である）で表示されるさらに 別の群のベクターはＰａｓ。１１β酵素をコード化するＤＮＡについて特に開発 されている。

該発明のベクターを受け入れ、導入されたＤＮＡが発現されるの関与するタンパ ク質は細胞内容物中に出現する。目的とするＤＮＡの存在はＤＮＡハイブリッド 尼成操作によって、それらの転写はＲＮＡハイブリッド形成によって、それらの 発現は免疫学的アッセイによって、及びそれらの活性は生体外もしくは生体内で の出発化合物とのインキュベーション後の酸化産物の存在を量定することによっ てそれぞれ立証できる。

好ましい宿主は形質転換した微生物、特に細菌（より好ましくはエシェリキア・ コリ、及びバチルス及びストレプトマイセス種）及び酵母（例えばサツカロマイ セス及びタルイベロマイセス（ｋｌｕｙｖｅ−ｒｏｍｙｃｅｓ　））である。他 の適当な宿主生物はその単離した細胞が細胞培養物として用いられる、植物及び 昆虫を含む動物の間に見い出され、例えばＣＯ８細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細 胞及びスボドブテラ・フルギベルダ（ｓＰｏｄＯｐｔｅｒａｆｒｕｓｉｐｅｒｄ ａ　）　（Ｓｔ４）細胞を包含する。

別法としてトランスゲニックな植物もしくは動物を用いる。

特定のタイプの組換え宿主細胞は本発明による２以上の発現カセットが導入され たもの例えばＩ）ＧＢＳＣＣ／ＡＤＸ−１、または少なくとも２つの異種タンパ ク質をコード化する、細胞が第１図の径路に関与する少なくとも２つのタンパク 質を生産することを可能にする発現カセットによって形質転換されたものである 。

調製された新規細胞はステワイドの結果としてヒドロコルチゾンに至る酸化的変 換に関与するタンパク質を生産できるのみでなく、培養液に加えた対応基質化合 物の目的とする酸化変換においてその場でこれらのタンパク質を用いることもで きる。ステロイドは好ましい基質である。異種ＤＮＡで形質転換した細胞はβ− シトステロール（ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）を含む第１図に示したステロイドを用 いて培養するのに特に適している。結果として酸化されたステロイドが得られる 。

第１図の径路に関与するタンパク質をコード化する多重度の異種ＤＮＡの宿主細 胞中での存在により、ステロールの側鎖切断及び／またはＣ１ｌ、ＣＩ？、Ｃ３ 及びＣ２１上での酸化的修飾よりなるいくつかの生化学的変換が可能である。従 って該発明の発現カセットは第１図に示す配列における多工程の引き続いての細 胞内形質転換を同時に行うことができる多遺伝子系を構築するのに有用である。

必要とされるタンパク質を完全にコード化する発現カセットを望まれる宿主に導 入することが必要となるかも知れない。ある場合には径路に関与する１以上のタ ンパク質は同じ活性を発揮する天然タンパク質として宿主中にすでに存在してい るかも知れない。例えば、フェレドキシン、フェレドキシンリダクターゼ及びＰ 　４ＳＯリダクターゼは宿主中にすでに存在するかも知れない。かかる状況下で は組換え形質転換によって残りの酵素のみが供給される必要がある。

最近までは１つの生化学プロセスにおいて第１図の生化学径路の少なくとも２つ の工程を可能にする多遺伝子系を調製するこ２は不成功に終っていた。

本　発　明 本発明によればステロイド分子についての２つの別個の酸化を触媒することがで きるタンパク質、特に第１図に示すタンパク質をコード化する遺伝子を１つの宿 主生物中にクローン化することが今や達成された。特に、１つの同じ宿主生物中 でステロイド１７α−ヒドロキシル化及びステロイドＣ２１−ヒドロキシル化の 役割を演するタンパク質をクローン化し、その宿主生質にそのタンパク質を機能 的形態で発現させることが実現された。さらに本発明の別の面によれば、発酵培 地中で増殖させたときに該形質転換微生物が培地中でステロイド基質をステロイ ド分子の２つの異なる位置で同時に酸化する方法が提供される。特に１７α−の みならず２１−ヒドロキシル基の導入のための１工程プロセスが達せられる。好 ましい宿主生物はタルイベロマイセス・ラクティス（Ｉａｃｔｉｓ）であるが、 他の宿主生物特に微生物、特に前述したものも用い得る。さらに特定的には第１ 図に示した生化学的経路の遺伝子をクローン化し発現するための〔我々の以前の 出願の国及び名前：　ＰＣＴ／ＮＬ８９１０００３２〕に記述された微生物が適 当である。

多重ステロイド酸化を行うことができる宿主を調製する１つの方法は各々１つの 酸化工程のための遺伝子を含有する２以上のベクターで宿主を形質転換すること である。別の方法は目的とする多重酸化反応に必要なタンパク質をコード化する すべての遺伝子を有する発現カセットを含有する１つのベクターで宿主を形質転 換することである。本発明によれば発現カセットは適当な制御配列によって各々 側面に位置された少なくとも２つの構造遺伝子を含有する。１つの例示された発 現カセットはタンパク質Ｐ４ｓｏｌ？−ａ及びＲ４，。

−Ｃ２１をコード化するＤＮＡ　＜ｐＧＢｌ　？−α／Ｃ２１−１）を含有する 。本発明方法を用いて、当技術分野で既知の方法に従い類似の発現カセット及び それを含有する宿主細胞を調製することが可能であり、それにより他の多重ステ ロイド酸化及び結果としてコレステロールのヒドロコルチゾンへの変換を単一の 発現プロセスで行うことが可能である。

図面の説明 すべての図面中で用いられた略記号： Ｒ，Ｅｅ、Ｒ１、ＨＨｌ、、ＩＩＩ、　Ｋ　ＫｐｆｉＩ、Ｘ　ＸｂＡＩ、ＲｖＥ ＝、ＲＶＳ　５ＩＳＡｃＩ、Ｂ　Ｂ−ＨＩ、　Ｓ＋＋　Ｓ、−１１、Ｓ、、Ｓ、 ＬＩ　及び　ｘｌ、Ｘゎ。Ｉ００ｌ図は哺乳類の副腎皮質で起こるコレステロー ルのヒドロコルチゾンへの変換における一連の工程に関与するタンパク質の概観 図を示す。

第２図は発現力セラＩ・ｐＧＢ１７α−５の物理地図を示す。

第３図は、発現カセットｐＧＢｃ２１−９の物理地図を示す。

第４図は共にラクターゼプロモーターによって駆動するＰｎｓ。

１７α及びＰ　＝ｓｏ　Ｃ２１についてのコード配列を含有する発桓カセット　 ｐＧＢ１７α／Ｃ２１−１の構築を表す。

本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、それらは本発明を限定するも のと解釈すべきでない。

実施例１ ウシチトクロームＰ　４５０・ステロイド１７α−ヒドロキシラーゼ及びウシチ トクロームＰ　４Ｓ。ステロイドＣ２１−ヒドロキシラーゼをコード化する発現 カセットの酵母クルイベロマイセス・ラクティスにおける構築及び形質転換 （ａ）　発現カセットの構築 ＥＰ−Ａ−８９２０１１７３，５（実施例１４）に記述された発現カセ−／　ｌ ・ｐ　Ｇ　Ｂ　１７α−５（第２図）をＳａｃ■及びＨｉ−ａｌＩＩで（部分的 に）消化し、粘着末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて充填した。ラクタ ーゼプロモーターの一部、Ｐ４Ｓｏ１７αをコード化する配列及びラクターゼタ ーミネータ−よりなるＤＮＡ断片を分離し、アガロースゲル電気泳動によって単 離し、ついでＥＰ−Ａ−８９２０１１７３，５（実施例１９）に記述され、まず Ｘｂ、１消化によって線形にしくｂｅ　１ｉｎｅａｒｉｚｅｄ）、その粘着末端 をクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて充填したｐＧＢＣ２１−９（第３図）中 に挿入した。得られた発現力セラ１−ｐＧＢ１７α／Ｃ２１−１（第４図）は、 Ｐ４ｓｏ１７α配列の側面に位置す（ｂ）Ｋ、ラクティスの形質転換 に、ラクティスｃＢｓ２３６０の形質転換は唯一の５Ａｃｎ制限部位で線形にし た１５μｇのｐＧＢ１７α／Ｃ２Ｌ−１を用い、ＥＰ−Ａ−８９２０１１７３， ５、実施例５（Ｃ）に記述した方法に従って行った。１つの形質転換体１７α／ Ｃ２１１０１をＰ　４％。

１７α及びＰ４ｓｏＣ２１の生体外及び生体内活性についてさらに分析した（実 施例２及び３参照）。

実施例２ タルイベロマイセス・ラクテイス１７α／Ｃ２１−１０１から得られたＲ４．。

１７α及びｐ、ｓ、Ｃ２１の生体外活性実施例１に記述した如くして得たに、ラ クテイス１７α／Ｃ２１−１０１、ＥＰ−Ａ−８９２０１１７３，５（実施例１ ４）に記述されたに、ラクティス１７α−１０１、及びに、ラクテイスＣＢ５２ ３６０を培地Ｄ１００ｍｆ中で増殖させた。

培地りの組成（蒸留水ｌｌ中） 酵母エキス（ディフコ）　１０ｇ バタトペプトン（オキソイド（Ｏｘｏｉｄ））　２０　ｇ殺菌及び３０℃に冷却 後、２５ｍｇのゲネテイシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８サルフエート、 ギブコ（Ｇ曲ｃｏ）社）の蒸留水１　ｒａ１２溶液（膜濾過で殺菌）を加えた。

培養物を３０℃で７２時間増殖した。

菌体を遠心分離（４０００ｘｇ、１５分）で回収し、ペレ７）をリン酸緩衝液（ ５０ｍＭ、　ｐＨ＝７．０）で洗浄し、菌体を遠心分離（４０００Ｘｇｓ１５分 ）で回収した。ペレットをリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐｉ（＝７．０）に取り、 ０．５ｇ湿重量７ｍｌを含有する懸濁液にした。この懸濁液を音波処理〔ブラウ ンラブソニック（Ｂｒａｕｎ　Ｉａｂｓｏｎｉｃ）１５１０、１２×１分、５０ ワツト〕によって破砕した。未破壊菌体は遠心分離（１’２０００ｘｇ、１５分 ）で除去した。

菌体フリー抽出液のＰ４５゜１７α活性及びＰ４ＳＯＣ２１活性をＮＡＤＰＨの 存在下１７α、２１−ジヒドロキシプロゲステロンの生成を測定することによっ てアッセイした。アッセイ混合物は以下の溶液よりなっていた： 溶液Ａ ＥＤＴＡ　３ｍＭ、ＮＡＤＰＨ２ｍＭ、グルコース−ｂ−リン酸及びグルコース −６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨ再生系）１６　単位／ｃａｌを含有 する５０ｍＭＩＪン酸カリウム緩衝液＜ｐ）！＝　７．０　） 溶液Ｂ（基質） リン酸カリウム緩衝液（７５ｍＭＳｐｆｌ＝７．５　）中の、１０％（ｖ／ｖ） テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ”）　Ｎ　Ｐ　４０　／　エタノール（１：１ 、（ｖ／ｖ）中の［４−１Ｃ］プロゲステロン（３０Ｃｉ１モル）８０μＭのミ セル溶液 アッセイは溶液Ａ、７５μｌを溶液Ｂ５０μｌ及び菌体フリー抽出液１２５μｌ と混合することによって開始した。混合物は３０℃で緩やかに撹拌した。６０分 のインキュベーション後サンプル（５０μＩ２）を取り、メタノール１００μｌ 及びクロロホルム５０μｌの混合物に加えた。ついでクロロホルム１００μ！及 び水１００μｌを加えた。クロロホルム層を遠心分離（５０００ｘｇ、２分）に よって回収し、水／メタノール層をクロロホルム１００μｌで再抽出した。２つ のクロロホルム層を合し、乾燥した。乾燥残渣をアセトニトリル／ＨａＯ（９： 　１、ｖ／ｖ）１０（ｌｕｊ！に溶解し、サンプル＜５０ａｉ＞をＨＰ　Ｌ　Ｃ カラム〔クロムバッタリクル（ｃｈｒｏｍｐａｃｋｌｉｃｈｒ、）　Ｉ　Ｑ　Ｒ Ｐ　１８．２５０　Ｘ　４．６ａｕ＋１を用いるアセトニトリル／　Ｈ＋ｌ○（ ５８：４２、Ｖ／Ｖ　）で溶出した。溶出液中のステロイド基質及び生産物をフ ローシンチレーションカウンター及びＵ、Ｖ。

検出器によって検出した。回収画分の放射能を液体レンチ１／−ジヨンカウンタ ーで測定した。

Ｋ、ラクティス１７α／Ｃ２１−１０１から得られた菌体フリー抽出液が１７α 、２１−ジヒドロキシプロゲステロンを生成していたが、Ｋ。ラクティス１７α −１０１及びに、ラクティスＣＢ５２３６０から得られた菌体フリー抽出液は生 成していなかったことが、このアッセイを用いて見い出された。Ｋ。ラクティス １７α−１０１によって生産された主生成物は１７α−ヒドロキシプロゲステロ ンであると思われた。

実施例３ タルイベロマイセス・ラクティス　１７α／Ｃ２１−１０１中のＰ４ｓｏ１７α 及びＰ　４ｓｏ　Ｃ２１の生体内活性実施例１に記述した如くして得られたに、 ラクテイス１７α／Ｃ２１−１０１及びに、ラクテイスＣＢＳ　２３６０を培地 Ｄ２５ｍｌに植菌した。培地りの組成（蒸留水１１中）酵母エキス（ディフコ） 　１０ｇ バタトベプトン（オキソイド）　２０ｇデキストロース　２０ｇ Ｐ）Ｉ＝６．５ 殺菌及び３０℃への冷却後、蒸留水１　ｒｎｌに溶解し、膜濾過によって殺菌し たゲネティシン２５ｍｇを培地Ｄ１１に加えた。

ついで基質［：４−”Ｃ：］プロゲステロンを含有する溶液１００μｌを完全培 地２５ｍｊ！に加えた。基質溶液は１　ｙａｗｌあたり１０％（ｖ／ｖ　）テル ギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ”）　Ｎ　Ｐ　４０　／　Ｘタノール（１：１、ｖ ／ｖ　）中の８００μｇの（４−”Ｃ〕プロゲステロン（８Ｃｉ／ｌｌ１ｏｌｅ ）を含有していた。

ロータリーシェーカー（２４Ｏｒｐｍ）中３０℃で培養菌を増殖させ、０及び６ ８時間後にサンプル２ｍｌをそれぞれ取った。各サンプルをメタノール２　ｍ１ ２と混合した。４℃で２４時の抽出後混合物を遠心分離した（４０００Ｘｇ、１ ５分）。このようにして得られた上清液からのサンプル２００μｌをＨＰＬＣカ ラム（クロムバッタリクル　１ＯＲＰ１８．２５０Ｘ４．６ｍｍ）を用いアセト ニトリル／Ｈ２０（５８：　４２Ｖ／Ｖ　）　テ溶出Ｌり。

溶出液中のステロイド基質及び生産物を検出した。回収した両分６８時間増殖さ せたに、ラクテイス１７α／Ｃ２１−１０１の培養菌から得た両分の１つは１７ α。２１−ジヒドロキシプロゲステロンの存在を明確に示したが、この化合物は コントローＪし株に、うＩＧ　ｉ ％−七へ 国＠調査報告 ＰＣで／ＮＬ　１１９１０００７２ １″＋−ａ″５ｅａｌ　Ａｌｌ″ｌｌｈ＠１１１＋１、−国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １． コレステロールのヒドロコルチゾンヘの変換の生物学的径路における、 コレステロールのプレグネノロンヘの変換、プレグネノロンのプロゲステロンヘ の変換、プロゲステロンの１７α−ヒドロキシプロゲステロンヘの変換、１７α −ヒドロキシプロゲステロンのコルテキソロンヘの変換及び コルテキソロンのヒドロコルチゾンヘの変換よりなる群から選はれる酸化工程を 、単独でもしくは１以上の別のタンパク質と共同で、触媒する機能を有するタン パク質よりなる群からのタンパク質をコード化する異種ＤＮＡ；またはコレステ ロールのヒドロコルチゾンヘの変換のための生物学的径路の天然タンパク質であ る、 側鎖切断酵素（Ｐ４５０ＳＣＣ）、 アドレノドキシン（ＡＤＸ）、 アドレノドキシンリダクターゼ（ＡＤＲ）、３β−ヒドロキシステロイドデヒド ロゲナーゼ／イソメラーゼ（３β−ＨＳＤ）、 ステロイドー１７α−ヒドロキシラーぜ（Ｐ４５０１７α）、ＮＡＤＰＨチトク ロームＰ４５０リダクターゼ（ＲＥＤ）、ステロイド−２１−ヒドロキシラーゼ （Ｐ４５０Ｃ２１）及びステロイド−１１β−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４５０１１ β）よりなる群からのタンパク質をコード化する異種ＤＮＡを、適当な制御配列 の他に、含有する、徴生物、植物もしくは動物の細胞よりなる組換え宿主細胞及 びその子孫であって、少なくとも２つの別個の酸化工程を触媒する少なくとも２ つの発現可能なタンパク質をコード化する異種ＤＮＡによって特徴づけられた該 粗換え宿主細胞及びその子孫。
2. ２．異種ＤＮＡコード配列がウシ種に由来する請求項１の組換え宿主細胞。
3. ３．異種ＤＮＡが少なくともＰ４５０１７αタンパク質及びＰ４５０Ｃ２１タン パク質をコード化する請求項１または２の組換え宿主細胞。
4. ４．宿主が微生物である請末項１−３のいずれか１つの組換え宿主細胞及びその 子孫。
5. ５．宿主がサッカロマイセス、クルイベロマイセスもしくはバチルスの１つの種 またはエシエリキア・コリである請求項４の組換え宿主細胞及びその子孫。
6. ６．組換え宿主細胞を栄養培地にタンパク質が培養中に生成、蓄積し得る条件下 に培養することよりなる組換え宿主細胞によってタンパク質混合物を製造する方 法であって、組換え宿主が請求項１−５のいずれか１つによって定義されるもの である方法。
7. ７．ある化合物を生体外で選択的に多重酸化する方法であって、酸化すべき化合 物を少なくとも２つのタンパク質の存在下、酸化及び酸化された化合物の培養液 中への蓄積を可能にする条件でインキュベートし、ついで酸化された化合物を回 収することよりなる方法において、該タンパク質が請求項６の方法によって生産 されたものであることを特徴とする方法。
8. ８．ある化合物を選択的に多重酸化する方法であって、組換え宿主細胞を該化合 物の存在下目的とする酸化が起こり培養液中に酸化した化合物が蓄積する条件で 培養し、ついで酸化した化合物を回収することよりなる方法において、該組換え 宿主細胞が請求項１−５のいずれか１つの細胞であることを特徴とする方法。
9. ９．ステロール化合物の側鎖の切断、３−ヒドロキシ、５（６）−デヒドロ基の ３−オキソ、４（５）−デヒドロ基への酸化及び異性化、及び１７α−ヒドロキ シル基、２１−ヒドロキシル基もしくは１１β−ヒドロキシル基の導入よりなる 群から選ばれた少なくとも２つの酸化工程を行う請求項７または８の方法。
10. １０．酸化が結果としてＣ２１−ヒドロキシル基及びＣ１７α−ヒドロキシル基 のプレグネノロンまたはプロゲステロンヘの同時導入になる請求項９または８の 方法。
11. １１．請求項１で定義したタンパク質をコード化する少なくとも２つの遺伝子を 含有する、請求項１−５のいずれか１つの組換え宿主中で作動し得る発現カセッ ト。
12. １２．異種ＤＮＡが酵素Ｐ４５０−１７α及び酵素Ｐ４５０Ｃ２１をコード化し 、発現カセットがｐＧＢ１７α／Ｃ２１−１である請求項１１の発現カセット。
13. １３．請求項９−１２のいずれか１つによって製造された活性化合物を含有する 医薬製剤。