JPH03501563A - リボヌクレオチド混合物の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リボヌクレオチド混合物の調製方法 発明の分野 本発明は医学に関し、そしてより詳しくは１．リボヌクレオチド混合物の調製方 法に関する。

壁板網膜アビオトロフィーは、進行性の視力低下および失明により特徴づけられ る人間の遺伝病の一種である。この病気はかなりありふれており、その発生率は 人口１０００人当り０．２〜５人に及ぶ。この壁板網膜アビオトロフィーの高い 発生率にもかかわらず、それを治療する有効な手段がない。

従来技術において知られるのは、治癒性質を有するリボヌクレオチド混合物の調 製方法である（Ｂｕｌｌｅｔｅｎ　ｅｋｓｐｅｒｉｍ。

ｂｉｏｌｏｇｉｉ　ｉ　ｍｅｄｉｔ、５ｙｎｙ、　１９８９．　Ｍｏｓｅｏｗ＋ 　ｋｇ、　ｐ、２３　２６）。

この方法によれば、５−１０■／祇の濃度のリボ核酸が４５°Ｃの温度にて１時 間膵リボヌクレアーゼで処理される。

前記方法はあまり有効でない。得られたりボヌクレオチド混合物は、タンパク質 、高分子発熱性物質を含むので、外用にのみ適用され得る。該製剤の経口投与は 、そのヌクレオチドの著しい分解を引き起こし、従って該製剤の治癒効果が低下 する。

リボ核酸を膵リボヌクレアーゼで加水分解し、そして得られた加水分解物を透析 し、最終生成物の単離および濃縮を行うことにより、リボヌクレオチド混合物を 調製する別の方法が従来技術において知られている（Ｖｅｓｔ、ｎｉｋ　Ａｋａ ｄ、　Ｍｅｄ、　ＮａｕｋＳＳＳＲ＋　１９７１．　Ｍｅｄｉｔｓｉｎａ、　Ｎ ｏ、７＋ｐ−６３６９）　ｏ　このようにして調製された混合物の収率は、４０ −４３重量パーセンＩ・である。

前記方法は低収率を有し、低および高分子発熱性化合物による汚染のために最終 生成物の純度が不十分である。この製剤の筋肉投与は、非常に苦痛を伴い、そし て大部分の患者において体温上昇およびアレルギー反応を引き起こす。結膜下投 与は、耳下腺リンパ節の肥大および圧痛を伴う眼球結膜の充血および水腫を引き 起こす。

発明の開示 本発明は、最終生成物の収率を増加させ、品質を向上させ、そして発熱性を取り 除き得る改良された方法を提供する課題に基づく。

この課題は、膵ヌクレアーゼにょろりボ核酸の加水分解、加水分解物からのりボ ヌクレオチド画分の単離、次いで最終生成物の単離によるリボヌクレオチド混合 物の調製方法を提供することにより解決され、ここで本発明によれば、リボ核酸 をｐＨ４，５−５，６で加水分解し、次いで５０−１５０人の孔径を有する膜上 で加水分解物からりボヌクレオチド画分を分離する。

−最終生成物の収率を増加させるために、加水分解を６２−６５°Ｃの温度で行 うことが推薦される。

温度が６２°Ｃを下回れば、膵リボヌクレアーゼによる酵素的加水分解が遅（な り；温度が６５°Ｃを超えると、酵素が部分的に変性し、結果として加水分解が 不完全である。

微生物の繁殖を防ぐために、リボヌクレオチド画分の分離前に、加水分解物に１ ５−３０容量パーセントの量でエタノールを添加することが推められる。加水分 解物に添加されるエタノールの量が１５容量パーセントよりも低い場合、微生物 の増殖がゆっくり起こる。エタノールの割合が３０パーセントの上限を超えれば 、リボヌクレオチドが部分的に沈澱する。

リボヌクレオチド画分は、好ましくは２０−３０°Ｃの温度および０．１５−０ ．４　ＭＰａの圧力において膜上で分離すべきである。

０．１５　ＭＰａの未満の圧力および２０°Ｃ未満の温度下での混合物の濾過は 、生成物の収率を増加させることなしに該工程の時間を実質的に延長させ、微生 物による汚染が起こり得る。圧力がＱ、　４　ＭＰａを超え、そして温度が３０ °Ｃを超えると、最終生成物の組成が変化し、そして膜が破壊され得る。最終生 成物は、本発明によれば、リボヌクレオチド画分を８−１００倍容エタノールで 沈澱せしめ、次いで該溶媒を除去し、そして最終生成物を乾燥することにより、 単離される。リボヌクレオチド混合物を８−１００倍容エタノールで沈澱せしめ 、溶媒を除去し、残りの混合物を０．５５−０．６６バーセントの塩化ナトリウ ム溶液中に３．３−３．７重量パーセントの濃度に溶解し、得られた溶液を２０ ００−２２００人の孔径の膜を通して７８−９８ｋＰａの圧力で濾過することに より、最終生成物が単離され得る。リボヌクレオチド混合物の沈澱を８倍容未満 の量のエタノールで行えば、低分子の発熱性不純物が完全には除去されない、ア ルコールの容量が１００倍容超えても、この方法の正の効果は増加しない。

３．７重量パーセントよりも大きいりボヌクレオチドの濃度を有する製剤は顕著 な発熱作用をもたらし、一方３．３重量パーセントよりも小さい濃度を有する製 剤の投与は多量の液体を必要とし、患者にとって望ましくない。

２０００人よりも小さい孔径を有する膜により濾過を行うと、この工程が遅くな り、２２００人を超える孔径を通した濾過は、発熱物質含量を増加させ、そして 該製剤を不規格にする。

提案される方法は、既知の方法と比較して最終生成物の収率を８−１５パーセン ト増加させ、そして最終生成物の品質を改良し、発熱物質不含有にする。

発明を実施する最良の形式 酵母の核酸を蒸留水に懸濁する。アルカリの添加により、溶液のｐ）ｌを４．５ −５．５に調整する。次いで該溶液に膵リボヌクレアーゼを添加し、混合物を６ ２−６５°Ｃに加熱し、そしてこの温度でリボ核酸を加水分解する。加水分解の 終了後、加水分解物を冷却し、エタノールを添加し、そして混合物を撹拌する。

次いでミクロフィルター上で微細な沈澱物を分離する。

透明な溶液を、５０−１５０人の孔径を有する膜を通して、好ましくは２０−３ ０°Ｃの温度および０．１５−０．４　？ｌＰａの圧力において、限外濾過によ り分画し、該濃縮物に蒸留水を加え、そして濾液の別の部分を得る。収得した限 外濾過液にエタノールを撹拌下で添加する。混合物を静置しておき、次に上滑を デカンテーションし、一方法澱物を少量のエタノールで洗い、これをフィルター 上で分離し、そして沈澱物を乾燥する。最終生成物は溶液であることもでき、乾 燥素材であることもできる。

８−１０倍容のエタノールでの最初の沈澱後に単離されたりポヌクレオチド混合 物を、３．３−３．７重量パーセントの濃度になるように０．５５−０．６５パ ーセントの塩化ナトリウム溶液に溶解する。得られた溶液を、７８　９８ｋＰａ の圧力下で２０００−２２００人の孔径を有する膜に通過させる。

調製された最終生成物は、白色またはわずかに黄色を帯びた非晶質粉末であり、 水および塩化ナトリウム水溶液に易溶−チルに不溶である。この製剤は、モノ− オリゴリボヌクレオチドの混合物（ヘクタマーを含む）であり、主要画分（４０ 重量パーセントまで）はジヌクレオチドである。

このようにして調製されたりボヌクレオチド混合物を臨床的に試験した。この試 験は、視野の測定、網膜電位図、暗適応、および視力の測定を含んだ、該調製物 を２５００人の患者において試験した。処置は１０−１５日間連続で与えられた 。４−６時間間隔の２回の注射により、毎日１５０−２００■の製剤を筋向的に 投与した。

２５００人の患者のうち、４６７人を長期間処置し、４〜１４年（それ以上）間 観察した。

長期に渡る観察の結果は、深刻な進行性の病気が安定化したか、または患者の６ ０パーセントにおいて改善を伴い安定化したことを示す。患者は主観的に野外お よび室内における見当識の改善を報告した。

本発明のより良い理解のために、実際的な実施態様の例を説明のために次に記載 する。

例１ ７０ｇの酵母核酸を４３０−の蒸留水に溶解し、溶液のｐ）Ｉを２Ｎ　ＮａＯＨ で５．１に調整する。次に１４０■の膵リボヌクレアーゼを添加し、そして６５ ″Ｃの温度で５時間加水分解を行う、加水分解物の全容量は４６５ｍである。こ の混合物を２５−３５°Ｃに冷却し、そして１２０ｍのエタノールを添加する。

沈澱した物質をフィルター上で分離し、そして濾液を０．４１１Ｐａの圧力およ び３０°Ｃの温度下において、１００人の孔径を有するアセチルセルロースｙ＜ この膜の濾過面積は１００ｄである）に通す。

得られた濾液は３６０ｄの容量である。濾過残渣に７０ｍの水を２回添加し、更 に１４０ｉの濾液部分を得る。収集した濾液部分（５００，ｄ）を５Ｊ２（１０ 倍容）のエタノールと混合し、得られた混合物を０〜＋４°Ｃの温度に冷却し、 去してこの温度を４時間維持する。沈澱物をフィルター上で分離し、０．３６０ ｆのエチルアルコールで洗浄し、そして真空乾燥菌中で乾燥する。

最終生成物の収量は３６ｇである。

びに２３０ｉｍ、２６０ｉｍおよび２８０ｉｍの波長における吸光度（Ａ）は次 のようである： Ａ　２６０／２３０　３．１５ Ａ　２６０／２８０　１．６０ 最終生成物の組成は、重量パーセントで次のようである：ヌクレオシド　−１． ５ モノヌクレオチド　２５．６ ジヌクレオチド　２８．１ トリヌクレオチド　２３．８ テトラヌクレオチド　１２．８ ペンタヌクレオチドおよび 高級オリゴヌクレオチド　合計で１００パーセントまで。

例２ ６７ｇの酵母核酸を４００ｍの蒸留水に溶解し、溶液のｐＨを２Ｎ　ＮａＯＨで ４．５に調整する０次に１３０■の膵リボヌクレアーゼを添加し、そして６２° Ｃの温度で５時間加水分解を行う、加水分解物の全容量は４３０ｉである。　２ ５−３５°Ｃに冷却された加水分解物に６４．５ｄのエタノールを添加し、そし て混合物を濾過する。次に、２０°Ｃの温度および０．３　ＭＰａの圧力下で、 １５０人の孔径を有するアセチルセルロース膜（濾過面積１００ｄ　）に該濾液 を通過させる。６時間で３８０ｄの濾液が得られる。

濾過残渣に６５−の水を添加し、更に６５ｄの濾液を得る。濾液の全容量は４４ ５ｉである。それを３．６！のエタノールと混合し、沈澱した物質をフィルター 上で分離し、０．３２のエタノールで洗浄し、そして真空乾燥菌中で乾燥する。

最終生成物の収量は３９ｇである。

λ２６０ｎｓｍおよびｐＨ２における比吸光度Ｅ　＝２４０゜ｐＨ７並びに２３ ０ｉｍ、２６０ｉｍおよび２８０ｎ＋＋＋の波長における吸光度（Ａ）は次のよ うである： Ａ　２６０／２３０　３．９０ Ａ　２６０／２８０　１．７０ 最終生成物の組成は、重量パーセントで次のようである：ヌクレオシド　４．８ モノヌクレオチド　１９．３ ジヌクレオチド　２３．１ トリヌクレオチド　２０．２ テトラヌクレオチド　１６．９ ペンタヌクレオチドおよび 高級オリゴヌクレオチド　合計で１００パーセントまで。

例３ ７７ｇの酵母核酸を４６０−の蒸留水に溶解し、溶液のｐ）Ｉを２Ｎ　ＮａＯＨ で５．２に調整する０次に１５０■の膵リボヌクレアーゼを添加し、そして６５ ℃の温度で５時間加水分解を行う。加水分解物の全容量は５００ｄである。この 混合物を２５−３５°Ｃに冷却し、そして１５０ｄのエーテルを添加する。沈澱 した物質をフィルター上で分離し、そして濾液を０．２　ＭＰａの圧力および２ ５゛Ｃの温度下において４時間に渡り５０人の孔径を有するアセチルセルロース 膜（濾過面積１００ｃｆｆｌ）に通す。濾液（５６０１ｄ）を８倍容（４，５４ ２）のエタノールと混合し、そして得られた混合物をＯ〜＋４°Ｃの温度に冷却 し、この温度を４時間維持する。沈澱物をフィルター上で分離し、０．４！のエ タノールで洗浄し、そして真空乾燥菌中で乾燥する。

最終生成物の収量は４０ｇである。

びに２３０ｉｍ、２６０ｉｍおよび２８０ｉｇ＊の波長における光吸収比は次の ようである： Ａ　２６０／２３０　４ Ａ　２６０／２８０　１．５５゜ 最終生成物の組成は、重量パーセントで次のようである：ヌクレオラド　２．１ モノヌクレオチド　１２．６ ジヌクレオチド　２５．２ トリヌクレオチド　２４．２ テトラヌクレオチド　１８．５ ペンタヌクレオチドおよび 高級オリゴヌクレオチド　合計で１００パーセントまで。

例４ 例１に記載のようにして、酵母核酸を加水分解し、そしてリボヌクレオチド画分 を分離する。沈澱物（３６ｇの乾燥混合物）を蒸留水中０．６パーセントの塩化 ナトリウム水溶液（９５８城）に溶解し、そして撹拌して完全に溶解させる。得 られた黄色溶液を脱脂綿とカーゼフィルターに通し、次いで９８ｋＰａの圧力下 で２０００人の孔径を有する膜に通す。リボヌクレオチド溶液を無菌条件下で無 彩色ガラスアンプル（３ｍｌり中に入れ、そして１１９°Ｃの温度で３４分間オ ートクレーブ処理する。

最終生成物中のりボヌクレオチドの濃度は３．３パーセントであり；比重は１． ０１である。このようにして調製された生成物は、非毒性で、無菌で、そして発 熱物質を含まない、その組成は例１において指摘されたものと同じである。

例５ 酵母核酸の加水分解およびリボヌクレオチド画分の分離は、例２に記載のように して行われる。沈澱物（乾燥質量３９ｇ）を蒸留水中の０．５５パーセントの塩 化ナトリウム溶液（９９５ＩＲ１）に溶解し、完全に溶解するまで混合する。得 みれた黄色溶液を脱脂綿とカーゼ布に通し、次いで７８ｋＰａの圧力下で２２０ ０人の孔径を有する膜に通す。リボヌクレオチド溶液を無菌条件下で無彩色ガラ スアンプル（３−）中に入れ、そして１２２”Ｃの温度で３２分間オーＩ・クレ ープ処理する。最終生成物中のりボヌクレオチドの濃度は３．７バーセントであ り、比重は１．００８である。この最終生成物は非毒性であり、無菌であり、そ して発熱物質を含まない。その組成は、例２において指摘されたものと同じであ る。

産業上の利用可能性 火傷および疾患を治療するためにも利用できる。

該方法は、他の生物活性物質、例えば個々のオリゴヌクレオチドおよびそれらの 混合物、低分子タンパク質、ペプチド等を調製するためにも適当である。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．リボヌクレオチド混合物の調製方法であって、膵リボヌクレアーゼによる酵 母リボ核酸の加水分解、得られた加水分解物からのリボヌクレオチド画分の分離 、次いで最終生成物の単離を含んで成り、前記酵母リボ核酸の加水分解が４．５ 〜５．５のｐＨにて行われ、そして前記加水分解物からのリボヌクレオチド画分 の単離が５０〜１５０Åの孔径を有する膜上で行われることを特徴とする方法。
2. ２．前記加水分解が６２〜６５℃にて行われることを特徴とする、請求項１に記 載の方法。
3. ３．前記リボヌクレオチド画分の分離の前に、加水分解物に加水分解物容量の１ ５−３０パーセントの量においてエタノールが添加されることを特徴とする方法 。
4. ４．前記リボヌクレオチド画分が２０〜３０℃の温度および０．１５〜０．４Ｍ Ｐａの圧力において膜上で分離されることを特徴とする、請求項１または２に記 載の方法。
5. ５．前記最終生成物が、８〜１０倍容のエタノールを用いてリボヌクレオチド画 分を沈澱せしめ、次いで溶媒を除去しそして最終生成物を乾燥することにより単 離されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記最終生成物が、８〜１０倍容のエタノールを用いてリボヌクレオチド画 分を沈澱せしめ、次いで溶媒を除去し、該混合物を０．５５〜０．６５パーセン トの塩化ナトリウム溶液中に３．３〜３．７重量パーセントの濃度に溶解し、そ して得られた溶液を７８〜９８ｋＰａの圧力下で２０００−２２００Åの孔径を 有する膜を通して濾過することにより得られることを特徴とする、請求項１に記 載の方法。