JPH03501928A - ウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウレアーゼ゛　を　るタンノ〜り　をコード　るヌクレ±上」υを 本発明は江吐辻吐吐匡二旺匡吐で天然Ｃ：発現されるようなウレアーゼをコード するヌクレオチド配タリ、及び特に人体又は環境中における虹Ｍの検出のための 、該ヌクレオチド配列の生物学的適用に係る。

Ｃ，１ｏｒｉは今日、人体の胃の腔部分の粘膜の表面、より−−ＬＬ−−−− 特定的叫は胃及び十二指腸潰瘍の病変部及びクレータ−の周囲のみに見いだされ るグラム陰性菌である０人口の２５％はり」１１部」−の保菌者であり、そのう ち８％ζよ潰瘍患者、９％は非潰瘍性の消化不良患者、８％は無症候保菌者であ る。

今日単離及び報告されている全り旺匡吐４よ次の３つの１寺性を有する。

該細菌は高い活性を有するウレアーゼを産生ずる。

該細菌は胃の粘膜の上皮細胞に非常に強く密着し、この特性はｉｎ　ｖｉｔｒｏ でヒーラ−細胞に非常番二強く密着することを意味する。

Ｃ１１ｏｉは、粘°液を分解し、従って胃粘膜を保護する自熱障壁を弱めるタン パク分解活性を有する酵素を産生及び放出する。

しかしながら、人体及び環境中で虹ｍをｉｎ　５ｉｔｕで検出し、その病原能（ 該細菌は人体で活性な胃炎に関与すると考えられる）を検査するには、この細菌 の培養が困難であるという問題がある。

該細菌は増殖速度が非常に遅く（血液寒天培地で６〜７日）、微好気性条件で増 殖しなければならず、空気中の酸素は有毒である。

本発明者らはこの細菌の検出手段を研究した結果、虹遺伝子内フラグメントのヌ クレオチド配列を決定することにより、虹旺匡吐の特異的同定のための検出用プ ローブとして使用可能なツールを取得するに至った。

従って、本発明の目的は、虹圧国吐で発現されるようなウレアーゼ活性を有する タンパク質をコードすることが可能な新規ヌクレオチド配列を提供することであ る。

本発明の別の目的は、７−の検出用プローブとして使用可能なこの配列のフラグ メントを提供することである。

本発明の更に別の目的は、虹旺国註で発現されるようなウレアーゼ活性を有する 高純度のタンパク質、及びこのタンパク質のフラグメントを提供することである 。

本発明のヌクレオチド配列は、７で発現されるようなウレアーゼ活性を有するタ ンパク質をコードする配列の少なくとも一部を含むことを特徴とする。

本発明のより特定的な目的は、Ｄｅｎｈａｒｄｔ媒質（１％Ｆｉｅｏｌｌ、１％ ポリビニルピロリドン、１％ウシ血清アルブミン）中、トリウムｐＨ７とから構 成される）の条件下で、７−で発現されるようなウレアーゼ活性を有するタンパ ク質をコードする遺伝子とハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列を 提供することである。

本発明の別の態様によるとヌクレオチド配列は、夫々虹旺肢吐で発現されるよう なウレアーゼ活性を有するタンパク質又は該タンパク質のフラグメントに対する 抗体との間で免疫複合体を形成することが可能な、ウレアーゼ活性を有するタン パク質又はそのフラグメントの産生に必要な情報を担持することを特徴とする。

本発明の配列は更に、ＥｃｏＲＩ　（Ω１１　、ＢａｍＨｒ　）７Ｐｓｔ　Ｉ（ Ｉｌｉｎｄｌｌｌ　）制限フラグメントに対応する約８ｋｂのフラグメントの少 なくとも一部を含むことを特徴とする。

このフラグメントの酵素制限地図を第２図に示す。

特に好適な配列は、第２図のＢ２部位から約０．５５ｋｂ上流、及び第２図のＢ １部位から約０．７ｋｂＴ流に夫々配置された末端ヌクレオチドにより画定され る約４．ｚｋｂ（±５％）のフラグメントの少なくとも一部を含む。

このフラグメントにより構成される配列は、７−で天然に発現されるようなウレ アーゼ活性を有するタンパク質の発現に必要な情報を担持する。

これらの配列の発現は、これらの配列に担持される情報を利用することが可能な 他の全微生物、特にウレアーゼ活性を有するタンパク質の産生をコードする遺伝 子を元々欠で生じ得る。

更に別の態様によると、本発明は上記配列の１つと、場合により該配列の転写を 調節することが可能なプロモーター及び転写終結信号をコードするＤＮＡ配列と を組み合わせて含む組換体配列に係る。

本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド連＊（１）：Ｍ套■ｍ笠司て宜熱Ｇ 万范ｍτα、ｍ　−−お３ＮすχλあＩＴ’Ｒス■ｕカフＡ美ｆｌ刀　ｌ　・・ コ σ１刀ス　′℃ＷαＤａ 又はヌクレオチド連鎖（［ｂｉｓ）： 龜　ｇ、　、　″″ ＮＬＶ＾ン入臥宵ユＣユ　、、１　。

ＣＪＧＣ口漬　”　劇刀 Ｇバ　コ　請ＭＧｖａＣ ｍ　、 α℃式０シα 貫口α℃−Ｘｎｒ　↓　゛　にλτ　よＧコ℃λ魔フ 仄りズ℃ 又は上記連鎖（１）、（ＩＩ）及び（Ｉｌｂｉｓ）に夫々相補的なヌクレオチド 連鎖を有する配列から形成されたプローブとハイブリダイズすることが可能であ ることを特徴とする。

本発明のヌクレオチド配列は、上記ヌクレオチド連鎖を含むか又は該連鎖の少な くともｍ−により構成されることを特徴とする。

当然のことながら、このような配列から作成されるプローブが【」ｌ±ｏｒｉ− のウレアーゼ活性を有するタンノ（り質をコードする遺伝子の存在を認識する能 力に関して特徴的且つ明確な応答を与える限り、該当ヌクレオチド配列の塩基＆ 立遺伝子中に見いだされる順序と異なる順序でもよく、及び／又はこれらの塩基 は場合により置換されてもよい。

対応するＲＮＡの酵素的逆転写又は化学的合成により得られるような上記ヌクレ オチド連鎖の配列とハイブリダイズ可能な全ヌクレオチド配列も本発明の範囲に 含まれる。

本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、次のアミノ酸配列の少なくとも一部に対応 するヌクレオチド配列にも係る。

本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、（ヌクレオチド配列（Ｉｌｂｉｓ）により コードされる）次のアミノ酸配列（■）：の少なくとも一部に対応するヌクレオ チド配列にも係る。

本発明は更に、適当な宿主を形質転換することが可能な発現及びクローニング用 組換体ベクターにも係り、該ベクターは上記のようなヌクレオチド配列を発現さ せることがも一部を含む。

好適な組換体ベクターは、上記の約４．２ｋｂの配列の少なくとも一部を含む。

微生物の形質転換株も本発明の範囲に含まれる。これらの株は上記ヌクレオチド 配列の１つ又は上記組換体ベクターを含む。

１９８８年８月１６日付けで寄託番号ｌ−７９５でパリ（フランス）、パスツー ル研究所のＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　ｄｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（Ｃ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、）に寄託された大腸 菌株５１７−１は、上記の約８ｋｂの制限フラグメントＥｃｏＲＩ　（Ｃｈｉ　 Ｉ　、　Ｂａｍ［１１）−Ｐｓｔ　Ｉ　（ＢｉｎｄＩ［［）を含む約１６．３ｋ ｂのプラスミドｐｌＬＬ５９０を担持する。

本発明は更に、ｍで天然に発現される型のウレアーゼ活性を有するタンパク質、 及び該タンパク質のペプチドフラグメントにも係る。

本発明のタンパク質及びそのフラグメントは、汎用遺伝暗号に従い上記ヌクレオ チド配列、特に約４．２ｋｂの配列の少なくとも一部に対応する。

本発明のタンパク質は更に、宿主細胞を上記のような組換体ベクターにより形質 転換し、形質転換した宿主細胞を適当な培地で培養し、これらの細胞から又は直 接培養培地からタンパク質を回収することにより得られるようなタンパク質であ ることを特徴とする。この方法によるウレアーゼ又はそのフラグメントリ製造も 本発明の一部を構成する。

本発明のタンパク質及び、同様に化学的合成により得られるそのフラグメントは 、有利には高純度を有しており、常法に従ってポリクローナル抗体を形成するた めに使用される。

上記タンパク質及びそのフラグメントを特異的に認識することが可能なこのよう なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体も本発明の目的を構成する。

上記ヌクレオチド配列は遺伝子工学の常法に従い、Ｌ旺匡註でウレアーゼ活性を 有するタンパク質の合成に関与する遺伝子のクローニング及び同定により得られ る。

本発明はヌクレオチド配列、対応するタンパク質及びモノクローナル又はポリク ローナル抗体の生物学的適用にも係る。

これらの適用は、遺伝子内フラグメントからのｍの検出用プローブの作成も含む 、この作成は特に、プローブとして使用可能な１重鎖配列を、得るために２重鎖 配列を変特表平３−５０１９２８　（６） 性させる段階を含む。

種々のりす上Ｌｂ睦ａｃｔｅｌ”−及び異なる属に含まれる微生物に場合により 存在する相補配列を検出するためにこのようなフラグメントを用いて試験を行っ た処、これらのフラグメントの高い特異性が明らかになった。

従って、本発明は上記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むことを特徴とす る検出用プローブにも係る。

ｍのゲノムにハイブリダイズする特性を改変しないようなヌクレオチドを置換又 は変更によってのみヌクレオチド配列レベルで前記プローブから区別される全プ ローブは本発明の範囲に含まれる。

プローブとして使用されるＤＮＡフラグメントは、必要な特異性及び安定なハイ ブリッドの形成を得るために十分な数のヌクレオチドを含む。

何ｋｂにも達するフラグメントを使用することが可能であるが、より短い約２５ 〜４０ヌクレオチドのフラグメントを用いても高特異性の結果が得られる。

この型の検出に適当なプローブは、有利には放射性元素又は被験ＤＮＡを含む試 料とハイブリダイズした状態で認識することが可能な他の任意の基により標識さ れる。

常法に従い、プローブのヌクレオチド配列と被験物質中に場合により含まれる相 補的配列とのハイブリダイゼーションが可能な条件下で、これらのプローブを細 菌を含む生物学的試料、又は直接これらの細菌もしくはその核酸と接触させる。

例えばプロットハイブリダイゼーション法を使用することができる。この方法は 、腔生検に由来する細菌から予め採取したＤＮＡを変性後、このＤＮへのアリコ ート量をニトロセルロースメンブラン上に置く段階と、通常条件下で各メンプラ ンをプローブにハイブリダイズさせる段階と、形成されたハイブリッドを常法で 検出する段階とを含む。

サザン法に従ってレプリカハイブリダイゼーション法を使用することもできる。

この方法は、ＤＮＡを制限酵素により処理した後に形成されるＤＮＡフラグメン トをアガロースゲル中で電気泳動により分画する段階と、アルカリ変性後に適当 なメンプランに移す段階と、通常条件下でメンプランをプローブにハイブリダイ ズさせる段階とを含む、必ずしもＤＮＡを予め発現させる必要はない、　ＤＮＡ をプローブに接触できるようにすれば十分である。

虹旺匡吐の特異的同定のための検出は同様に、ＤＮ＾増幅法（ＰＣＲ）により実 施することもできる。これらの方法は特にＣｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 名義の米国特許第４６８３２０２及び４６８３１９５号に記載されている。

これらの方法を実施するためには１０〜４０ヌクレオチド、有利には約２０ヌク レオチドから成る２つのプライマーを使用し、これらのプライマーは上記ヌクレ オチド配列の１つに含まれるか又は上記ヌクレオチド配列もしくはその相補的配 列の１つの一部とハイブリダイズすることが可能である。有利には、これらのプ ライマーは増幅すべきＤＮＡの鎖にハイブリダイズ（又は結合）するとき、相互 に約２００〜２５０ヌクレオチドの間隔で配置される。一方の配列は増幅すべき ＤＮＡフラグメントの一方の鎖のヌクレオチド配列に結合することが可能であり 、この配列はこのフラグメントの一方の末端（例えば５゛末端）のレベルに配置 され、他方の配列は増幅すべきＤＮＡフラグメントの第２の蛸のヌクレオチド配 列に結合することが可能であり、この配列は上記末端と反対側のこのフラグメン トの末端（提案例ではこの末端を同様に３°末端と呼称する）のレベルに配置さ れる。

好適なプライマーは第２図のＨ２〜Ｈ３制限フラグメントのヌクレオチド配列に 含まれ、相互に約２００〜２５０ヌクレオチドの間隔で配置される。

特に、該プライマーはこの制限配列旧ｎｄｌ［［−ＨｌｎｄＩ［［の各末端に夫 々位置するフラグメントである。

生物学的試料中に場合により存在する１霞！±のｉｎ−ｖｉｌｇ−検出方法は、 該試料中に含まれ得るヌクレオチド配列の一方の鎖の５゛末端と該ヌクレオチド 配列の他方の鎖の３゛末端とに夫々結合することが可能な上記のようなプライマ ーに践試料を接触させ、その後、ＤＮＡポリメラーゼ及び４種のヌクレオシド三 リン酸ｄＡＴＰ、　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの存在下で遺伝子増幅し、こ れらのプライマーハイブリダイゼーション及び遺伝子増幅操作を複数回繰り返す ことにより、該ヌクレオチド配列の量を場合により予め増幅する段階と、本発明 のヌクレオチドプローブと該ヌクレオチド配列との間で形成されるハイブリダイ ゼーション複合体を産生じ得る条件下で、該当生物学的試料を該ヌクレオチドプ ローブと接触させる段階と、ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階とを 含む。

従って１本発明は培養を実施する必要なく迅速にｉｎ　５ｉｔｕ及び環境中で高 特異性で虹旺琢吐を検出することが可能なツールを提供する。

ごのような検出用ツールは、これらの細菌の天然源、感染方法、伝播方法及び汚 染方法を調査するために特に有用である。また、生検で実施される江」旦正診断 においてこれらのプローブを使用すると、専門機関でなければ実施できないよう な技術を必要とする現状の方法、即ち細菌学的方法又は電子顕微鏡を使用する方 法に比較して大幅な時間の利得が得られる。

上記約８ｋｂのフラグメントを遺伝子内プローブとして使用することにより、再 現可能な結果が得られた。

これらのプローブは７−に対する特異性を有するので、同様に非常に有利なツー ルを構成する。

従って、感染を予防するように虹５の病原能を調査するために、潰瘍疾病の発生 において上圧１ｏｒｉが果たす役割を調査することが可能であり、また、動物モ デルで試験され得る虹旺Ｉｏｒｉの等遺伝子突然変異体（即ち感染の病理発生に 役割を果たすと思われる決定基の各々を遺伝的に改変した細菌）をｉｎ　ｖｉｔ ｒｏで形成できるように、この細菌の病原能に関与していると思われる遺伝的決 定基を同定することが可能である。

本発明は更に、上記ヌクレオチドプローブ及び適当な制限酵素による、（」１上 ｏｒｉ−でウレアーゼをコードする遺伝子の多形性の検出にも係る。この検出を 実施する条件は、Ｊ。

ｏｆ　Ｃｌ１ｎ、　−ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ　（１９８６）、　７７、 　ｔ７２３−１７２６に所収のＧｕｓｅｌｌａ　Ｊ、Ｆ、の論文中により詳細に 記載されている。

本発明は、特に特異的抗血清並びにポリクローナル及びモノクローナル抗体の製 造のための、コード化タンパク質の免疫学的適用にも係る。ポリクローナル抗体 は常法に従い、動物にタンパク質を注入１−１抗血清を回収した後、例えばアフ ィニティクロマトグラフィーにより抗血清から抗体を回収することにより形成さ れる。

モノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を本発明のタンパク質により予め免疫し た動物の牌細胞と融合することにより常法通りに製造される。

本発明は更に、上圧国吐を含有し得る生物学的試料中に場合により存在するり」 ｌ１兜１−のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法にも係る。

該方法は、７−により産生されるウレアーゼ活性を有するタンパク質の全部又は 一部と本発明の抗体との間に形成される免疫複合体を産生じ得る条件下で、試料 を該抗体と接触させる段階と、免疫複合体を検出する段階とを含む。

ヌクレオチドプローブの使用に基づく上記ｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法を実施する ためには、場合により少なくとも１対の本発明のプライマーと、所定量の本発明 のヌクレオチドプローブと、有利な要素として検出すべき配列とプローブとの間 のハイブリダイゼーション反応の形成に夫々適当な媒質と、有利な要素としてハ イブリダイゼーション反応時にヌクレオチド配列と１０−ブとの間に形成される ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする試薬とを含む装置又はキット を利用すると有利である。

抗体の使用に基づく上記ｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法を実施するためには、所定量 の本発明の抗体と、有利な要素として、虹ｊ山ユ株により産生きれるウレアーゼ 活性を有するタンパク質の少なくとも一部と抗体との間の免疫反応の形成に適当 な媒質と、有利な要素として、免疫反応時にウレアーゼ活性を有するタンパク質 の少なくとも一部と抗体との間に形成される免疫複合体の検出を可能にする試薬 とを含む装置又はキットを利用すると有利である。

上記４．２ｋｂのフラグメントを精査した結果、らｍ−のウレアーゼの主要なポ リペプチドサブユニットをコードする構造の遺伝子を位置決定することができた 。

この調査は、ウレアーゼを合成することができない大腸菌及び虹江江畦に導入し た組換体プラスミドで突然変異体を構築することにより実施した（Ｂａｓｋｅｒ ｖ　ｉ　ｌ　ｌｅ−＾、　Ｎｅｗｅｌｌ　Ｄ。

（１９８８）、　Ｃｕｔ、２９．４６５−４７２）、大腸菌のｉｎ　ｖｉｔｒｏ 転写−翻訳系及びミニ細胞発現系を使用してウレアーゼのサブユニットをコード する遺伝子全体を艷」１土ｏｒｉ−の４．２ｋｂフラグメント中で同定及び位置 決定した。　２６ｋＤｉ及び６１ｋＤａの２つの主要なタンパク質が同定された 。同時に、４．２ｋｂのフラグメントに種々の欠失を形成後、大腸菌から４株へ の接合による伝達系（伝達系の型については以下の詳細な説明を参照されたい） を使用して、ウレアーゼ活性の発現に不可欠な領域を同定し、領域の欠失をポリ ペプチドの消失及びウレアーゼ活性に相関させた。この結果、ウレアーゼ活性の 発現に必要な２つのポリペプチドをコードする遺伝子は、第２図のＨ３部位の下 流でＢ１にまたがる３、３５ｋｂの中心領域に位置することが判明した。　６１ ｋＤａ又は２６ｋＤａのポリペプチドをコードする遺伝子の転写はＥｃｏＲｌ　 −Ｐｓｔ　１方向に行われる。　３．３５ｋｂフラグメントは４におけるウレア ーゼ活性の発現に必要であるが十分ではない、大腸菌におけるポリペプチドの発 現に無関係であると思われる上流の０．８５ｋｂの隣接領域が、４におけるウレ アーゼ活性の発現に不可欠な領域である。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写−翻訳による欠失突然変異体を分析した処、２６及び６１ ｋＤａの２つのポリペプチドは隣接する２つのＤＮＡフラグメントによりコード されることが判明した。

本発明はヌクレオチド配列（■）： φ・・ 、ｔ の全部又は一部に係る。

本発明はより特定的には、汎用遺伝暗号に従い（ヌクレオチド配列（Ｖ）により コードされる）次の２６ｋＤａのアミノ酸配列（■）： 旧Ｘ店習需瓦征橙■Ｉ　ＩＡ田Ｗｍπσ（２３９アミノ酸、分子量２６５２２ダ ルトン）の少なくとも一部に対応する全ヌクレオチド配列に係る。

本発明は更に、ヌクレオチド配列（■）：八〜フζ Ｒフａ工口ψＱψ ＋７１０ の全部又は一部に係る。

本発明はより特定的には汎用遺伝暗号に従い（ヌクレオチド配列（■）によりコ ードされる）次の６１ｋＤａのアミノ酸配列く■）： Ｋｌ）（ＥＤＷＧＴｒＰＳＡＩＮ）ｔＡＬＤＶＡＤＫＹＤＶＱＶ＃）ｒｒＤＴＬ ＮシｋＧＣＶＥＤＴＭＡＡＩＡＧＲＴＭ）ｌ［ＬＫεεＫＧＯＮＤＮＦＲＩｆｆ １人ＩＡ）（３ｍへΔ３ＳＶεＶＧＫＶＡＤＬＶＬＷＳＰＡＦＦＧＶ）ｆＪ’Ｎ ）Ｊ１区ＧＧ［巳ＭＦ＆（５６９アミノ酸、分子量６１７２９ダルトン）の少な くとも一部に対応する全ヌクレオチド配列に係る。

アミノ酸配列■を特にＥ’ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ　１７５．１５１−１ ６５（１，５８８＞に記載されているインゲンマメ（タチナタマメ）ウレアーゼ のアミノ酸配列と比較した処、意外にも高いレベルのアミノ酸相同性が判明した 。このように構造が維持されることから、本発明者らは上記配列■の２０６及び ３３８位に位置するアミノ酸により画定されるポリペプチド配列中に完全に又は 部分的に含まれる６１ｋＤａのウレアーゼサブユニットの活性部位を推定するこ とができた。

本発明は更に、配列■及び配列■から連続的に構成されるヌクレオチド配列■の 全部又は一部にも係る。

本発明は更に、汎用遺伝暗号に従い、配列■及び配列）Ｉから連続的に構成され る８７ｋＤａのアミノ酸配列（Ｘ）の少なくとも一部に対応する全ヌクレオチド 配列にも係る。

本発明は更に、生物学的試料中に場合により存在する虹−ネ１且ｄ−の検出用プ ローブに係り、該プローブは上記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むこと を特徴とする。

自明のことながら、このような配列から作成されるプローブが一１１Ａｍｌ−の ウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の存在を認識する能力に 関して特徴的且つ明確な応答を与える限り、該当ヌクレオチド配列の塩基は遺伝 子に見いだされる順序と異なる順序であってもよく及び／又はこれらの塩基は場 合により、置換されてもよい。

対応するＲＮＡの酵素的逆転写又は化学的合成により得られるような上記ヌクレ オチド連鎖の配列とハイブリダイズすることが可能な全ヌクレオチド配列も本発 明の範囲に含まれる。

虹ｕ劫≦９ゲノムにハイブリダイズする形質を変えないようなヌクレオチド置換 又は変更によってのみヌクレオチド配列のレベルにおいて上記プローブから区別 される全プローブも本発明の範囲に含まれる。

該プローブは上記生物学的試料中に場合により存在するＬ圧国註のｉｎ　ｖｉｔ ｒｏ診断法で使用可能である８本発明は更に、約１０〜約４０ヌクレオ′チドの ヌクレオチドブライマーにも係り、これらのプライマーは上記ヌクレオチド配列 ■又は■の１つ（又はこれらの配列■及び■がら誘導される配列の１つ）に含ま れるが、又は（特に上記ハイブリダイゼーション条件下で）上記ヌクレオチド配 列の一部もしくはその相補的配列にハイブリダイズすることが可能本発明は更に 、上記方法に従い生物学的試料中に含まれ得るＬＬ匡吐のヌクレオチドの量を予 備増幅するための、上記ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法におけるこれらのプライマーの 使用に係る。

本発明は更に、上記ヌクレオチド配列Ｖ、■及び■又はこれらの配列から誘導さ れるヌクレオチド配列の全部又は一部を含む適当な宿主細胞を形質転換すること が可能な発現用及びクローニング用組換体ベクターにも係る。

本発明は更に、上記配列■、■及びＸの全部又は一部に対応するタンパク質の製 造方法にも係り、該方法は適当な宿主細胞（特に上記宿主細胞）を上記ベクター により形質転換させる段階と、こうして生成されたタンパク質を回収する段階と 、場合によりこれらのタンパク質を精製する段階とを含むことを特徴とする。

上記タンパク質の製造方法は場合により、生成すべきタンパク質をコードする遺 伝子を予備増幅する段階を含み、該段階は上記方法に従い本発明の１ライマ一対 を用いて実施される。

本発明は更に、上記ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド（又はタ ンパク質）にも係る。特に本発明は、上記８７ｋＤａのアミノ酸配列Ｘ、２６ｋ Ｄａの配列■及び６１ｋＤａの配列■並びにそれらのフラグメントにも係る。

本発明は更に、上記ポリペプチドの全部又は一部がら得られ且つ該ポリペプチド との間で免疫複合体を形成することが可能なポリクローナル及びモノクローナル 抗体に係る。

本発明は特に、配列■又は配列■の少なくとも約１０〜１５個のアミノ酸のペプ チド配列を用いて得られる抗体、特にモノクローナル抗体に係る。

本発明の好適なモノクローナル抗体は、配列■の２０６及び３３８位に位置する アミノ酸により画定される配列の全部又は一部に特異的であり、より特定的には 配列■の２０６及び３３８位に位置するアミノ酸により画定される配列に由来す る少なくとも約１０〜１５個のアミノ酸のペプチド配列により得られる抗体であ る。

本発明は更に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断法を実施するため、及び上記のようなし江 匡註による個体の感染のｉｎ　ｖｉｔｒＯ診断用キットにおける上記抗体の使用 に係る。

本発明は更に、上記ポリペプチドの全部又は一部、より特定的には配列■の２０ ６及び３３８位に位置するアミノ酸により画定されるポリペプチド配列の全部又 は一部を医薬上許容可能なビヒクルと組み合わせて含む免疫学的組成物にも係る 。

このような免疫学的組成物は上圧肢註による個体の感染の予防用ワクチン組成物 として使用可能である。

本発明は更に、上記のような抗体、より特定的には配列ＳＩの２０６及び３３８ 位に位置するアミノ酸により画定されるペプチド配列の全部又は一部との間で免 疫複合体を形成することが可能な１又は複数の抗体を、医薬上許容可能なビヒク ルと組み合わせて含む医薬組成物にも係る。

本発明のこのような医薬組成物は、上圧抜柱による個体の感染に結び付けられる 病理、特に胃炎並びに胃及び十二指腸潰瘍の治療に使用可能である。

本発明の他の利点及び特徴については、虹旺匡住でウレアーゼ活性を有するタン パク質の産生に関与する遺伝子のクローニング、ウレアーゼ活性を有するタンパ ク質の発現に関連する領域の配列決定、及び虹旺匡吐の検出のためのヌクレオチ ドプローブの特異性に関する以下の記載に報告この記載は第１図及び第２図を参 照するものであり、第１図はｆｉ−でウレアーゼを発現するのに必要な情報を担 持する組換体コスミドｌＩＤ２のＰｓｔ　ｆ−旺邸Ｉフラグメントの制限地図、 第２図はｐＩＬＬ５９０の約８ｋｂのフラグメントの制限地図である。

１）コスミドシャトルベクターにおけるゲノムバンクの作成、上圧匡註でウレア ーゼの産生に関与する遺伝子のクローニング。

高分子量のＤＮＡフラグメントを形成するようにｍ株（８５Ｐ）の染色体ＤＮＡ を調製し、この染色体ＤＮＡ約３００ｕｇを制限エンドヌクレアーゼシリ−３八 で制御下に部分的消化し、ショ糖勾配に重層し、３５〜４５ｋｂの消化フラグメ ントを選択的に単離した。エンドヌクレアーゼＢａｍ１ｌ　Ｉにより直鎖化し且 つ脱ホスホリル化したマスミドシャトルベクターｐｌＬＬ５７５に、これらのフ ラグメント１．５目をｉｎ　ｖｉｔｒｏで連結した。　ｐｌＬＬ５７５は、Ｌａ ｂｉｇｎｅ−Ｒｏｕｓｓｅｌ他によりＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９：５ ３２０−５３２３．１９８７に記載されているシャトルコスミドｐｌＬＬ５５０ から構築し、ｐｌＬＬ５５０にλファージのｅｏｓ部位を挿入（ｐｌＬＬ５５０ のＰｖｕ　Ｉｆ部位にｐＥＲｃ１５３の１．７ｋｂのＢｇ！ＩＩフラグメントを 挿入）したものであり、従って接合により自己増殖可能であり、大腸菌及びＣａ ｍ　Ｉｏｂａｃｔｅｒで同時に発現されるカナマイシン耐性（Ｋｍ’）をコード し、大腸菌のみで機能的な複製起点と一遍」」旦Ｉ左υ■−のみで機能的な複製 起点との２つの複製起点の存在により大腸菌及び４で同時に複製する。この連結 産物をλ粒子にｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングし、その後、組換体コスミドの 伝達基をトランス配置で相補うことが可能なプラスミドＩｎｃＰを棲息させる大 腸菌株に該連結産物をトランスフェクションにより導入した。感染させたカナマ イシン耐性の大腸菌コロニーをすぐに個々に一８０℃に維持し、約５００個の独 立したクローンを維持することにより、恒肚辻吐弦匡り旺匡註のゲノムの全体を 表すコスミドゲノムバンクを大腸菌で作成した。

次に組換体コスミドの各々を、当然ウレアーゼ−であるＣａｗ＋　Ｉｏｂａｃｔ ｅｒ　’ｅ’ｕｎｉ　Ｃ３１の受容株に大腸菌の接合により伝達した。

これらのカナマイシン耐性トランス接合体の各々について、Ｃａｎ　Ｉｏｂａｃ ｔｅｒ　’ｅ’ｕｎｉによりウレアーゼが合成されたか否かを検査した。

分析した１０６個のコスミドから、Ｃｔｖａ上Ｌｂｊ工弓」ニーｉｊ見１−Ｃ３ １にウレアーゼを産生ずる能力を与える遺伝子情報を担持する１つのコスミドを 単離した０組換体コスミド（１１０２）は５４ｋｂの寸法を有する。この配列上 の制限エンドヌクレアーゼＰｓｔ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ　、　Ｓ＠ａ　Ｉ及びＥ ｃｏＲｌによる切断部位の相対位置を第１図に示す。

２）　Ｃａｍ　１ｏｂａｃｔｅｒ　１ｏｒｉでウレアーゼを産生ずるために必要 な遺伝子の同定。

８〜１５ｋｂの部分的消化フラグメントを形成するように、大腸菌で作成したコ スミドＤＮＡ　ＩＩＤＺからエンドヌクレアーゼＳａυ３Δで部分的消化を行う ことにより、ウレアーゼ遺伝子のサブクローニングを実施した。大腸菌でクロー ニングしたハイブリッドプラスミドで、接合による受容すＪ且しレーｂａｅｔｅ ｒへの伝達後にウレアーゼを産生ずる能力を与える最小のハイブリッドプラスミ ドを調査した。

試験した３７個のプラスミドのうち４個のプラスミド即ちｐｌＬＬ５８６、ｐＩ ＬＬ５８９及びｐｌＬＬ５９０（第２図）は、−１」弓旦Ｉ左上虹−−ＬｊｌＩ −でウレアーゼを発現するのに必要な情報を担持していた。

これらの４つのハイブリッドの制限地図を比較すると、４つのハイブリッドに共 通する４　、２ｋｂのヌクレオチド配列の存在が認められ、従って、この配列が ウレアーゼの発現に必要な領域であると予想される。これらの結論を立証するた めに、所定数の欠失を形成したく第２図）。

ｐＩＬＬ５９０からＢａ論ｉｌｌ及びＨｉｎｄｌ［Ｉにより形成した種々の制限 フラグメントが８５Ｐに存在することを立証するために、ｐｒＬＬｓ９ｏのＥｃ ｏＲＩ　−ＰｓＬ　ｌフラグメントを（」１土ｏｒｉ８５Ｐの完全ＤＮＡとのハ イブリダイゼーションにおけるプローブとして使用した。得られた結果によると 、ｐｌＬＬ５９０中に存在する８ｋｂの配列は種々のクローニング段階の間に再 配置を受けていなかった。

３）ウレア・−ゼの発現に関連する領域のヌクレオチド配列。

Ｈ２及びＨ３部位の間に含まれるＢｉｎｄ■フラグメントの配列は、連鎖（１） の２９４ヌクレオチドの配列に対応する。

次の連鎖（Ｉｆ）の６１０ヌクレオチドの配列は、Ｈ４及び８１部位（第２図） により規定されるフラグメントの内側に位置する。

４）　ｑす」ヱとリリｓ±ｉＬ」ヱ上幻」−の検出用ヌクレオチドプローブの特 異性。

ｐｌＬＬ５９０に由来する８ｋｂの旺健ｉ　−Ｐｓｔ　ｌフラグメントを、ハイ ブリダイゼーション実験の放射性プローブとして使用３２株のｑす」１上１■ｊ １１Ｌ」上上幻づ−をコロニーハイブリダイゼーションで試験した処、陽性の徴 候を得た。試験した３５株の１１上り匹上見０ＬＬ−ｉ」ジｉ−、ム旦互及び飢 のうちで、慣用緊縮ハイブリダイゼーション条件下（５０％ホルムアミド、３７ ℃、３ｘＳＳＣ）で陽性の徴候を与えるものは皆無であった。

いずれも天然にウレアーゼを産生ずる微生物である１ｊ旦１」上ハエ見■ユ犯」 工（３株）、ｌ動刃互１１ｍ’男至駐■ｂ！（３株）、Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒ ａｂｉｌｉｓ（３株）、Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｏｒ　ａｎｉｉ（３株）、（３株） 、ウレアーゼ１＾ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（５株）、ウレアーゼ０Ｅｓｃｈｅ ｒｉｅｈｉａ　ｅｏｌｉ（２株）及びウレアーゼ゛Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒ ｅｕｎｄｉｉ（３株）を上記と同一の条件下で８ｋｂの７−プローブで試験した が、陽性の徴候は認められなかった。

８ｋｂフラグメントで擬似陽性は認められず、従って、本発明のヌクレオチドプ ローブの特異性を保証することができる。

抗体製造方法は、動物を上記ポリペプチドにより免疫感作する段階と、形成され た抗体を常法に従って回収する段階とを含む。

化学的経路による本発明の核！ｉ！（２重鎖核酸の場合、最大２００ヌクレチオ ド即ちｐｂを含む）の適当な製造方法は、Ｂｉｏ−ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　４：　２７４−３２５．１９８６に記載されているβ−シアノエチル ホスホラミシト（ｃｙａｎｅｔｈｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の自 動化方法を使用することによりＤＮＡを合成する段階と、こうして得られたＤＮ Ａを適当なプラスミドベクターでクローニングし、適当なプローブとハイブリダ イズさせることによりＤＮＡを回収する段階とを含む。

２００ヌクレチオド即ちｐｂ（２重鎖核酸の場合）を越える長さの核酸を化学的 経路により製造する方法の１例は、Ｐｒｏｅ　。

Ｈａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０；　７４６１−７４６５．１９８ ３に記載されている原理に従って天然ポリペプチドのアミノ酸連鎖と適合可能な 配列を有する異なる制限部位を末端に有する化学的に合成されたオリゴヌクレオ チドを結合する段階と、こうして得られたＤＮＡを適当なプラスミドベクターで クローニングし、適当なプローブとハイブリダイズさせることにより所望の核酸 を回収する段階とを含む。

国際調査報告 一一一一一＾−””　”−ＰＣｒ／ＦＲ８９１００５１Ｂ国際調査報告 ＳＡ　３１９０１ 第１頁の続ぎ

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ．ｐｙｌｏｒｉにより発現されるようなウレアーゼ活性を有するタンパク 質をコードする配列の少なくとも一部を含むことを特徴とするヌクレオチド配列 。
2. ２．Ｄｅｎｈａｒｄｔ媒質中、６８℃、６×ＳＳＣの条件下でＣ．ｐｙｌｏｒｉ で発現されるようなウレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とハ イブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列。
3. ３．ウレアーゼ活性を有するタンパク質、又は夫々Ｃ．ｐｙｌｏｒｉにより発現 されるようなウレアーゼ活性を有するタンパク質もしくは該タンパク質のフラグ メントに対する抗体との間で免疫複合体を形成することが可能な該タンパク質の フラグメントの産生に必要な情報を担持することを特徴とするヌクレオチド配列 。
4. ４．第２図に示す酵素制限地図を有する約８ｋｂのＥｃｏＲＩ（ＣｌａＩ，Ｂａ ｍＨＩ）−ＰｓｔＩ（ＨＩＮｄＩＩＩ）フラグメントを含むことを特徴とする請 求項１から３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
5. ５．夫々第１図のＨ２部位から約０．５５ｋｂ上流、及び第２図のＢ１部位から 約０．７ｋｂ下流に夫々配置された末端ヌクレオチドにより画定される約４．２ ｂ（士５％）のフラグメントの少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項４ に記載のヌクレオチド配列。
6. ６．請求項１から５のいずれか一項に記載の配列と、場合により該配列の転写を 調節することが可能なプロモーター及び転写終結信号をコードするＤＮＡ配列と を組み合わせて含むことを特徴とする組換体ヌクレオチド配列。
7. ７．ヌクレオチド連鎖（Ｉ）： 【配列があります】 又はヌクレオチド連鎖（ＩＩｂｉｓ）：【配列があります】 又はヌクレオチド連鎖（Ｖ）： 【配列があります】又はヌクレオチド連鎖（ＶＩＩ）：【配列があります】 又は上記連鎖（Ｉ）、（ＩＩ）、（Ｖ）及び（ＶＩＩ）の夫々相補的ヌクレオチ ド連鎖を有する配列から形成されるヌクレオチドプローブとハイブリダイズする ことが可能であることを特徴とするヌクレオチド配列。
8. ８．請求項７に記載のヌクレオチド連鎖を含むか又は該連鎖の少なくとも一部に より構成されることを特徴とするヌクレオチド配列。
9. ９．汎用遺伝暗号に従い次のアミノ酸配列（ＩＩＩ）：【配列があります】 に対応するヌクレオチド配列。
10. １０．汎用遺伝暗号に従い次のアミノ酸配列（ＩＶ）：【配列があります】 に対応するヌクレオチド配列。
11. １１．汎用遺伝暗号に従い次のアミノ酸配列（ＶＩ）：【配列があります】 に対応するヌクレオチド配列。
12. １２．汎用遺伝暗号に従い次のアミノ酸配列（ＶＩＩ）：【配列があります】 に対応するヌクレオチド配列。
13. １３．組換体ベクター、特に組換体プラスミド又はコスミドであって、適当な宿 主細胞を形質転換させることが可能であり、請求項１から１２のいずれか一項に 記載のヌクレオチド配列を該宿主細胞中で該フラグメントを発現させることが可 能な調節成分の制御下に含むベクター。
14. １４．１９８８年８月１６日付けでＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託番号Ｉ−７９５で寄 託された大腸菌株Ｓ１７−１により担持されるプラスミドｐＩＬ５９０。
15. １５．請求項１３もしくは１４に記載の少なくとも１つのベクター、又は請求項 １から１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列により形質転換された微生 物株。
16. １６．汎用遺伝暗号に従い請求項１から１２のいずれか一項に記載のヌクレオチ ド配列対応する、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉで発現される型のウレアーゼ活性を有するタ ンパク質及びそのペアチドフラグメント。
17. １７．請求項１３又は１４に記載の組換体ベクターにより宿主細胞を形質転換さ せ、形質転換した宿主細胞を適当な培地で培養し、これらの細胞から又は直接培 地からウレアーゼを回収することにより得られるような、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉで発 現される型のウレアーゼ活性を有するタンパク質。
18. １８．請求項１６又は１７に記載のタンパク質の全部又は一部又はそのフラグメ ントに特異的であることを特徴とするポリクローナル又はモノクローナル抗体。
19. １９．請求項１２に記載の配列ＶＩＩＩの２０６及び３３８位に位置するアミノ 酸により画定される配列の全部又は一部に特異的であることを特徴とするポリク ローナル又はモノクローナル抗体。
20. ２０．請求項１から１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド連鎖の全部又は一 部を含むことを特徴とする検出用プローブ。
21. ２１．Ｃ．ｐｙｌｏｒｉを含有し得る試料中に場合により存在するＣ．ｐｙｌｏ ｒｉｉｎｖｉｔｒｏ検出方法であって、請求項１から１２のいずれか一項に記載 のヌクレオチド配列の一方の鎖の５′末端と、該ヌクレオチド配列の他方の鎖の ３′末端とに夫々結合することが可能なプライマーにより、試料中に含まれ得る 該ヌクレオチド配列の量を場合により予め増幅する段階と、請求項２０に記載の ヌクレオチドプーブと該ヌクレオチド配列との間で形成されるハイブリダイゼー ション複合体を産生し得る条件下で、該生物学的試料を該ヌクレオチドプローブ に接触させる段階と、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階とを含む ことを特徴とする前記方法。
22. ２２．Ｃ．ｐｙｌｏｒｉを含有し得る生物学的試料中に場合により存在するＣ． ｐｙｌｏｒｉｉｎｖｉｔｒｏ検出方法であって、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉにより産生さ れるウレアーゼ活性を有するタンパク質の全部又は一部と請求項１８又は１９に 記載の抗体との間で形成される免疫複合体を産生し得る条件下で、試料を該抗体 に接触させる段階と、免疫複合体を検出する段階とを含むことを特徴とする前記 方法。
23. ２３．試料中に場合により存在するＣ．ｐｙｌｏｒｉｉｎｖｉｔｒｏ検出方法を 実施するためのキットであって、所定量の請求項２０に記載のヌクレオチドプロ ーブと、有利な要素として、検出すべき配列と該プローブとの間のハイブリダイ ゼーション反応の形成に適当な媒質と、有利な要素として、ハイブリダイゼーシ ョン反応時にヌクレオチド配列とプローブとの間で形成されるハイブリダイゼー ション複合体の検出を可能にする試薬とを含むことを特徴とする前記キット。
24. ２４．試料中に場合により存在するＣ．ｐｙｌｏｒｉのｉｎｖｉｔｒｏ検出方法 を実施するためのキットであって、所定量の請求項１８又は１９に記載の抗体と 、有利な要素として、Ｃ．ｐｙｌｏｒｉ株により産生されるウレアーゼ活性を有 するタンパク質の少なくとも一部と抗体との間の免疫反応の形成に適当な媒質と 、有利な要素として、免疫反応時にウレアーゼタンパク質の少なくとも一部と抗 体との間で形成される免疫複合体の検出を可能にする試薬とを含むことを特徴と する前記キット。
25. ２５．請求項１から１２のいずれか一項に記載の配列の１つに含まれる少なくと も約２０ヌクレオチドから成り、相互に約２００〜２５０ヌクレオチドの間隔で 配置され、一方の配列が増幅すべき配列の一方の鎖の５′末端、他方の配列が地 方の鎖の３′末端に結合することが可能な２つのヌクレオチド配列の、ＰＣＲ型 ＤＮＡ増幅法におけるプライマーとしての使用。
26. ２６．請求項１８又は１９に記載の抗体を医薬上許容可能なビヒクルと組み合わ せて含むことを特徴とする医薬組成物。
27. ２７．請求項１６又は１７に記載のタンパク質の全部又は一部を医薬上許容可能 なビヒクルと組み合わせて含むことを特徴とする免疫組成物。
28. ２８．請求項１２に記載の配列ＶＩＩＩの２０６及び３３８位に位置するアミノ 酸により画定される配列の全部又は一部を含むことを特徴とする請求項２７に記 載の組成物。