JPH03502203A

JPH03502203A - 酵素洗剤

Info

Publication number: JPH03502203A
Application number: JP1501510A
Authority: JP
Inventors: ニールセン，ルビー　イオネ; アースリング，ドリット　アニタ; イェンセン，ゲオルグ　ビルヘルム; シュネイダー，パレ
Original assignee: ノボ‐ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1988-01-07
Filing date: 1989-01-06
Publication date: 1991-05-23
Anticipated expiration: 2012-06-25
Also published as: DK144990A; DE68924654D1; DK163434C; DE68924654T2; EP0394352A1; WO1989006270A1; JP2624859B2; EP0394352B1; DK163434B; EP0471265A1; JPH08308566A; JP2693141B2; EP0471265B1; ATE129523T1; DK144990D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵　　素　　洗　　剤技術分野本発明は、プロテアーゼ含有洗剤組成物および該組成物中で用いられるタンパク分解洗剤添加剤に関する。

背景技術プロテアーゼは、タンパク質のよごれに対する洗浄力を改善するため商業的洗剤中で成分として広く用いられている。

この点に関する別の情報は、文献’Ｈｏｗ　Ｅｎｚｙｎ＋ｅｓ　ｇｏｔ　ｉｎｔ。

ＤｅｔｅｒｇｅｎＬＳ″Ｖｏｌ−１２＋　Ｄｅｖｅｌｏｐｏ＋ｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ（ザ　ソサイエティ　フォー　インダストリアル　マイクロバイオロジー出版、ワシントン；Ｄ、Ｃ，１９７１年、タラウス　ダムマン、ボールバーム、ビレーセンセンおよびモゲンス　ヒルマー　ニルセンによる）中において並びにＰ、Ｎ、クリステンセン、に、トムセンおよびＳ、プランナーによる’Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ　Ｅｎｚｙｍｅｓ」（スイス国、モントルー市で開催された洗剤に関する第２回国際会議で１９８６年１０月９日に発表された論文）において見出される。

これらの論文で示されるように、トリプシン製剤は、すでに洗剤中に用いられているが、１９６０年代よりアルカリ性バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、この目的に対し殆ど独占的に用いられており、この期間洗浄力が改善された微生物プロテアーゼの開発の努力がなされてきている。

一方、純粋なトリプシンは与えられたタンパク質中の少数のプベチド結合のみ極めて特異的に加水分解することが知られている。商業的に使用されるバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼは、広い特異性を有し、従って与えられた物質中の多くの結合を加水分解する。

改良されたプロテアーゼの器素において、このようなプロテアーゼは最も広い基質特異性を有することが仮定されてきており、すなわち、該プロテアーゼは、タンパク質のよごれ中の多くの結合を可能な限り加水分解するであろう。かくして、Ｍ、宮永（大阪重文大学、生活化学部版、２３巻、６５〜７４頁）は、その６８頁で「タンパク質のよごれの除去において使用に適したタイプのプロテアーゼは、ペプチド結合を無作別に分解しうる広範囲の基質特異性を有さなければならない」と述べている。

発明の開示驚くべきことに、本発明者らは、今やアミノ酸−特異性プロテアーゼが秀れた洗浄力を示すことを見出し更に非特異的プロテアーゼの存在は洗浄力を減少させることを見出した。

かくして本発明者らは、プロテアーゼの混合物を含む製剤を唯一の特異性プロテアーゼを含むように精製すると著しくより良い挙動を観察した。

本発明者らは更に、精製された特異性プロテアーゼが今日洗剤中で用いられる非特異性プロテアーゼよりも秀れていることを見出した。

種々の量の他のプロテアーゼを有する、特異性プロテアーゼトリプシンの商業的製剤は、洗剤中で用いられているが、洗剤中での本質的に純粋なトリプシンの使用は新規である。

本質的に他のプロテアーゼを含まない微生物特異性プロテアーゼはまた公知であるが、それらの洗剤中でのそれらの使用は公知である。

我々の研究の仮説は、以下の内容である。すなわち、洗浄力の改善は大きなペプチドフラグメントが洗浄中により効率的に除去されるという事実に由る。これはまた、種々の量の他のプロテアーゼを有する商業的トリプシン製剤が、何故今日洗剤中に用いられる非特異性バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼよりも秀れているとは考えられていなかったということをも説明するものである。

従って、本発明の第１の面はプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物であって、洗浄力を支えるプロテアーゼ活性が、わずかに１個または２個の特定のアミノ酸に隣接したペプチド結合に対する特異性を有するプロテアーゼによって本質的に付与されていることを特徴とする、該洗剤組成物を提供する。

本発明の第２の面は、非ダスト顆粒、安定化液体もしくは保護された酵素の形態にあるプロテアーゼ（前記の如く特徴づけられる）を含んでなる洗剤添加剤を提供する。

発明の詳細な説明アミノ　−　　　ブローアーゼ本発明において使用されるプロテアーゼの種類は、大きなペプチドフラグメントを生じせしめながら１個または２個のアミノ酸に隣接したペプチド結合を優先的に切断することによりタンパク質を加水分解するエンドプロテアーゼ（エンドペプチダーゼ）である。多くのそのようなプロテアーゼは公知であり、特に動物および微生物起源のものは公知である。

Ｋ、Ｍｏｒｉｈａｒａ　：　ｒ″Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＭｆｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｔｅｔｎａｓｅｓ”　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｒｅ１ａｔ、　Ａｒｅａｓ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ−＋　４Ｌ１７９〜２４３　（１９７４）Ｊを参照のこと。

特異性は、１個又は２個の特異的アミノ酸のアミノもしくはカルボキシル部位に関する結合に対するものである。より詳しくは、プロテアーゼはトリプシン一様特異性にあり、更にこれはトリプシンもしくは微生物、トリプシン様プロテアーゼである。

プロテアーゼは、セリン、チオール、金属もしくはアスパラテートの形のものである。

コードし次いで発現し、更に好ましくは特異性プロテアーゼをも生産する遺伝子を含有する微生物を得るために組換え体ＤＮＡ技術を、用いることができる。この生物は、本発明において培養されて使用可能なプロテアーゼを与える。

本発明で使用される好ましい特異性プロテアーゼは、ｐＨ６〜１２、特にｐＨ７〜１０．５において活性であり、最も好ましくは至適ｐＨはこれらのｐＨ範囲のいずれかにある。

本発明の製剤は、好ましくは本質的には他のプロテアーゼを有しない。典型的には特異性プロテアーゼ（前記の如く定義）は、重量基準もしくは活性基準で（例えば以下に述べるＣＰＵで測定）、存在する全プロテアーゼの９０％以上、特に９５％以上を構成する。

通常、特異性プロテアーゼ活性は、単一の特異性プロテアーゼにより本質的に与えられるであろう、しかし、二種（又はそれ以上）の特異性プロテアーゼの混合物も、使用できるが、但し、混合物が一定の特異性を示す場合であり、例えばプロテアーゼの混合物が同じ特異性を有する場合である。

１種の特定の好ましいプロテアーゼは、本発明者らにより見出されかつ以下に述べられる新規なフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕａ＋）である。

なフサチウムブローアーゼ新規なプロテアーゼを、微生物菌株から単離され、この菌株はブダペスト条約に基づきドイツチェ　ザン　ムルグ　フォノ　ミクロオルガニズメン（グッチゲン）に１９８３年６月６日に寄託され寄託番号ＤＳＭ　２６７２を付与された。これはフサリウムオキシスボラム（Ｆｕｓａｒｔｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕ＋ｓ）に帰属するものとして分類された。

フサ！ウムオキシスポーム本発明のプロテアーゼを含有するブロスは、公知の技術、例えば米国特許３，６５２．３９９（タケダ）又はこの特許の明細書の例に従って該菌株を培養することによって得られる。

培養ブロスは、少なくとも２種のプロテアーゼ（■および■、■は本発明のプロテアーゼである）並びに他のプロテアーゼを有する。分離は、バシトラシン−セファロースカラムを用いたアフイニティクロマトグラフィーにより行うことができる。しかし、大豆トリプシン阻害剤−セファロース（ＳＴＩ−セファロース）は、より良い性能を有していることが見出された。

プロテアーゼＩおよび■は、緩衝液として０．０５Ｍのホウ酸（ｐＨ６，５）を用いると結合するであろう、一方他のプロテアーゼは溶出する。未所望のプロテアーゼＩは、同じ緩衝液中０．２５ＭのＮａＣｌにより、０．１ＭのＮａＣｊ！により又は０．０５Ｍのホウ酸によりｐＨ４〜５又はこれ以下のｐＨで溶出できる。プロテアーゼ■（本発明のプロテアーゼ）は、最後に０．０５Ｍの酢酸（ｐＨ２，８）により溶出されうる。

マーカータンパク質の存在中、５ＯＳ−ＰＡＧＥおよび等電点分離法（ＩＥＰ）は、それぞれ分子量（ＭＷ）および等電点（ｐＩ）測定用の常法である。これらの方法に従い、本発明のプロテアーゼは、約２７ＫＤのＭＷおよび９〜１０のｐＩを有する。プロテアーゼＩ　（上述の如き）は約３０ＨＤのＭＷおよびｐ１９〜１０を有する。一方、米国特許３，６５２．３９９による菌株Ｓ−１９−５の培養によって得られる従来のフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ鵬）プロテアーゼは、前記方法により約３２ＫＯのＭＷを有する単一成分を有する。

活性のＰＨおよび温度依存性を第２図および第３図に示すが、一方プロチアーゼＩはまた比較のため示される。曲線は、ＣＰＵ法（以下に記載）に基づく、但し、温度又はｐｉは変化する。図面に示されるように、本発明のプロテアーゼは４５℃付近に至適温度を有しくｐＨ９，５で３０分反応）、更にｐｔｉｓ、５〜１１．０に至適ｐｎを有しく２５℃で３０分反応）、このｐＨ範囲にはり一定の活性を有する。

ｐＨおよび温度曲線は、ビルダー入り液体洗剤の溶液および過ホウ酸塩およびＴＡＥＤ　（漂白活性剤）を有する粉末洗剤の溶液中で測定された。これらの曲線は、第２図および第３図に示された洗剤なしの曲線とはり同じである。

プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、例えばＰＭＳＦに対し特異的阻害剤によって阻害される。

特異性を実証するため、ウシインシュリンの酸化Ｂ−鎖をプロテアーゼにより水解しく１．３８　ＣＰｔ１／ｆ、１５分）、次いで加水分解生成物を、逆相液体クロマトグラフィーにより分校した（炭素数１８の炭化水素でコートした５ミクロンのシリカ、勾配溶出）。第４図は、本発明のプロテアーゼに関する結果を示し、第５図はＤＳＭ　２６７２由来の成分に関する結果を示す。

第６〜７図は米国特許３．６５２．３９９による従来技術のフサリウムブロテアーゼ（それぞれＦｕｓａｒｉｕｓ　ｓｐ、　Ｓ−１９−５およびＰ。

ｏｘｙｓｐｏｒｔｕｗ　ｆ、ｂａｔａｔａｓ　ＩＦＯ４４６８）に関する結果を示す。

クロマトグラムは著しい相違を示している０本発明のプロテアーゼのクロマトグラムは、わずか２本の主ピークを示し更に２個のペプチド結合（Ａｒｇ（２２） −Ｇｌｙ（２３）およびＣｙｓ　（２９）　−＾１　ａ　（３０）　）を水解することが知られている、トリプシンにより得られたクロマトグラムと１（ＩＩＩしているように思われる。一方、他のフサリウムブロテアーゼは、この基質中で多くの結合を水解し、相当の大きさのピーク１０個以上を与える。

基質特異性は、また２個の合成基質に関する作用によって示される。本発明のプロテアーゼは、Ｂｚ−Ａｒｇ−ｐＮＡを水解するが、５ｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡは水解しない、一方、プロテアーゼＩは後者のみ水解する。

精製プロテアーゼに対するモノ特異性抗血清は、例えばＮ、アクレセン等によって記載された処方（マニュアル　オブ　クオンティティチブ　イムノエレクトロ　フオレシス（ブラックウェル　サイエンティフィク発行）　、１９７３年、２３章中）に従って家兎を免疫化することによって上昇しうる。

精製イムノグロブリンは、抗血清より、例えば塩沈殿（（ＮＨ４）ｚｓＯａ）、次いで透析および例えばＤＥＡＥ−セファデックスを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより得ることができる。

タンパク質の免疫化学的特性化は、オウキタロニー二重拡散分析（０，オウキタロニー：ハンドブック　オブ　エクスベリメンタル　イムノロジー（Ｄ、Ｍ、Ｗｅｉｒ出版）、ブラックウェル　サイエンティフィク出版、１９６７年６５５〜７０６頁）、又はロケット免疫電気泳動（Ｎ、アクセルセン等、上記、第２章）のいずれかによって行うことができる。

本発明のプロテアーゼは、ＤＳＭ　２６７２由来のプロテアーゼＩ並びに従来技術のフサリウムプロテアーゼＳ−１９−５に対して免疫化学的特性化性を示す。

迭五旦虞隻本発明の洗剤組成物は、アニオン性、カチオン性、非イオン性もしくは両性タイプの界面性又はこれらの混合物を含んでなる。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキルベンスルホネート（ＬＡＳ）、α−オレフィンスルホネー）　（ＡＯＳ）、アルコールエトキシスルホネー）　（ＡＥＳ）およびアルカリ金属の天然石けんである。

本発明に係る洗剤は、当業者に公知の他の洗剤成分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活性剤、抗腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、抗よごれ再付着剤、香料、酵素および漂白剤用安定剤等を含有できる。

本発明の洗剤組成物は、粉末、液体等の通常の形態に製剤化できる。プロテアーゼは例えば上記の如（酵素安定剤を含ましめることによって液体洗剤中で安定化されうる。

洗剤は、通常液中ｐＨ７〜１２、特に８〜１０．５を有する。このｐＨで活性を有する特異的プロテアーゼが好ましい。

本発明の洗剤は、本発明のプロテアーゼに加えて、１種以上の他の酵素を含有しうる。例えば、リパーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼである。洗剤中地の酵素とプロテアーゼを組合わせると、他の酵素は洗剤中プロテアーゼにより分解および失活しやすくなる（例えば、ＥＰ　２０５．２０８　（ユニリバーノ参照）。

この点に関し、本発明のプロテアーゼの高基質特異性により他の酵素とよりよく調和しうる。二種（又はそれ以上）の酵素は別個に又は−緒にした添加物の形態で添加されうる。

跣五添加剋本発明の洗剤添加剤は、非ダスト顆粒、安定化液体もしくは保護された酵素の形態にある。

非ダスト顆粒は、例えばオランダ特許１６７．９９３（ノボ）、米国特許４．１０６．９９１　（ノボ）又は米国特許４，６６１．４５２（ノボ）に従って調製され更に所望により公知の手法によってコートされる。

液体プロテアーゼ製剤は、例えばプロピレングリコール、他のポリオール、糖、糖アルコール、乳酸、ホウ酸を添加することにより安定化されうる。他の酵素安定剤は公知である。

保護された酵素はヨーロッパ特許２３８．２１６（ノボ、アルブライトおよびウィルソン）に従って調製できる。

本発明の洗剤添加剤は、１種以上の洗剤用酵素、例えばリパーゼ、セルロースもしくはアミラーゼを含有しろる。顆粒の場合、顆粒は造粒前もしくは造粒後に混合されうる。

プロテアーゼ：（ＣＰＵ）タンパク分解活性を、基質としてのカゼインを用いて測定する。１力ゼインプロテアーゼ単位（ＣＰＵ）は、標準条件、すなわち２５℃でかつｐＨ９，５で３０分間インキュベーションすることにより、１分光たり１ミリモルの第１７ミノ基（セリン標準と比較して測定）を放出する酵素の量として定義される。

２％（Ｗ／Ｖ）のカゼイン溶液（ハマーステン、メルクＡ、Ｇ、　（西ドイツ）により供給）を、ブリトンおよびロビンソンにより記載されたユニバーサル緩衝液（ｐＨ９，５に調整）を用いて調製する。

２ｄの基質溶液を、水溶中１０分間２５℃で予備インキュベートする。プリトンーロビンソン緩衝液（ｐＨ９，５）の約０．２〜０．３　ＣＰＵ／ｄに相当するｂｇ／ｄの酵素製剤を含む１−の酵素溶液を添加する。２５℃で３０分間インキュベーシッン後、停止剤（三塩化酢酸（１７，９ｇ）、酢酸ナトリウム（２９，９ｇ　）および酢酸（１９，８ｇ）を有し、脱イオン水で５００＋ｄとした溶液の５ｍ）を添加して反応を停止させる。テスト溶液と同様の方法でブランクを調製する：但し、停止剤は酵素溶液の前に添加する。反応混合物を水浴中、２０分間保持し、その後、ｖｒｈａ　ｔｔｓａｎ　＠４２のろ紙でろ過する。

第一アミノ基を、０−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）を用いてそれらの色変化により測定する。

四ホウ酸ニナトリウム１０′・ｆｌｔＯ（７，６２ｇ）およびドデシル硫酸Ｎａ（２，０ｇ　）を１５０ｍの水に溶解する。４ｍのエタノールに溶解したＯＰＡ　（１６０■）を、４００Ｊｌｌのβ−メルカプトメタノールと共に添加し、しかる復水を用いて溶液を２００ａｄとする。

ＯＰＡ試剤（３ｄ）に、４００１１１の上記ろ液を混合しながら添加する。光学濃度（ＯＤ）を、約５分後３４０ｎｍで測定する。

ＯＰＡテストを、１００ｄのブリトンーロビンソン緩衝液（ｐ）１９．５）中に１０■のセリンを有するセリン標準液を用いて行う、緩衝液はブランクとして用いる。

プロテアーゼ活性は、以下の式によって光学濃度測定から計算する：酵素製剤１．ｇ当たりのＣＰ　Ｕ＝　ＣＰＵ／ｄ　：　ｂト溶液、ブランク、セリン標準液および緩衝液の光学濃度であり、Ｃ□、は標準液中■／ｄ単位のセリンの濃度であり、肚、。、はセリンの分子量である。Ｑは、酵素溶液に対する希釈因子（この場合８に等しい）であり、１．はインキエベーション時間（分）である。

図面の簡単な説明第１図は、５ＴＩ−セファロースカラムを用い菌株ＤＳＭ　２６７２由来の培養ブロスの溶出クロマトグラムを示す。詳細は例２に示す。

第２図および第３図は、それぞれ、ＤＳＭ　２６７２由来の２種のプロテアーゼ、すなわちプロテアーゼ■（本発明のプロテアーゼ）および比較のためのプロテアーゼ■に関するｐｉ−活性および温度活性曲線を示す。

第４図〜第７図は、フサリウムブロテアーゼを用いた牛インシュリンの酸化Ｂ鎖の氷解生成物の逆相クロマトグラムを示す。

第４図は、本発明のプロテアーゼを用いた加水分解を示し、第５図はＤＳＭ　２６７２由来のプロテアーゼを用いた加水分解を示し、第６図はＳ−１９−５由来のプロテアーゼを用いた加水分解を示し、更に第７図はＦ、オキシスポラム　ｆ、バタタス（Ｆ、ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ、ｂａｔａｔａｓ（ＩＦｏ　４４６８））由来のプロテアーゼを用いた加水分解を示し、後者の三者は米国特許３，６５２，３９９に従って調製される。

示す。

実施例例ＩＦ　オキシスームＤＳＭ　２６７２の　・以下の媒質を有する種発酵槽にＤＳＭ　２６７２を接種し次いで３０〜３５時間通気しながら発酵させた。次いでこれを、同じ媒質を有する１０倍大きなより大型の主発酵槽に接種するために用い更に通気しながらかつ更に基質を連続的に供給しながら発酵させた。

媒質組成（Ｗ／Ｖ％）：Ｓｏｙ　　ｍｅａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｑｌｕｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　５．０ＫＨｚＰＯａ　　　　　　　　　　　　　　　２．０に、ＨＰＯ４２，０ＣａＣｌ　ｔ　・２Ｈｚ０　　　　　　　　　　０．０２Ｍｇ５Ｏａ・７８ｚＯＯ，０２大豆油　　　　　　　　　　　　　０．５プルロニツタ”　（ｄ／ｊり　　　　　　０．０３３供給基質＝４５％Ｗ／Ｖグルコース供給速度：０．２８％ｖｏｌ／ｖｏｌ／時間ブロスのプロテアーゼ活性は、２．８４ＡＵ＃！であった（ＡＵはアンソン単位のプロテアーゼ活性を示す、米国特許３．７２３．２５０第８欄参照）。

粗製プロテアーゼを、硫酸アンモニウムを添加しく塩析）、ろ過し、フィルターケークの再溶解し、イオン交換により次いでベントナイトにより精製し次いで最終的に乾燥することにより培養プロスから回収した。

例２ブローアーゼの例１における如く得られた粗製プロテアーゼを、緩衝液（０，０５Ｍホウ酸、ｐＨ６，５）に溶解した。　ＤＥＡＥ！−セファデックスに吸着せしめて脱色後、ＯＤは２８０ｎｍで１．２であった。１８■の全タンパク賞含量を有するこの溶液１５ｄ（ＯＤから計算２８０ｎｍ）を、アフィニティクロマトグラフィーにより分離した。

ゲルは、大豆トリプシン阻害剤−アガロース（ＳＴ　Ｉ−アガロース）であった、床置は１０ｍであり、カラムの直径は２．５ＣＩｌであった。上記緩衝液を用い、流速は０．５ｄ／分であり、各々４．５　ｄの分画を集めた。各分画に対し、ＯＤ　（２８０ｎ園）を測定し、同様にＢｚ−ＤＬ−Ａｒｇ−ｐＮＡおよび５ｕｅ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性を測定した。溶出クロマトグラムを第１図に示す、各工程で用いた溶離剤はまた咳図に示す。

第１図に示すように、未吸着物質が最初に緩衝液で溶出し、次いでプロテアーゼのピーク（Ｉと称する）を０．２５ＭのＮａＣｉｔ緩衝液により溶出させる０図面から理解される′ように、０．０５ＭのＮａＣｊ！に増加させ次いで０．１　Ｍのアセテート（ｐＨ４，０）の適用によっては物質は更に溶出しなかった。第二のプロテアーゼのピーク（■と称する）は、０．０５Ｍの酢酸（ｐＨ２，８）により溶出した。

タンパク質の分布：注　　入　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８■溶　　出吸着なし　　　　　７．４５■（４１％）成分１　　　　　　６．５５■（３６％）成分ＩＩ　　　　　　　４．０３■（２２％）合計　　　　　　１８■ ＤＥＡＨによる最初の精製後、約６４％のタンパク質が溶液中に存在しており、従ってプロテアーゼ濃度に関するタンパク質の回収は次の如くであった：成分１　２３％のタンパク質（６２％のプロテアーゼ）成分Ｉ［１４％のタンパク質（３８％のプロテアーゼ）例３〜８迭企跋脹次の洗剤溶液（ｇ／！単位）を用いた。番号Ｉ〜■は、粉末洗剤を示し、番号■ は液体ビルダー人り洗剤を示す。

土　　工　　１ＬＡＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，４０，４０，４Ａ　Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１５０，１５０，１５石けん　　　　　　　　　　　０．１５　　０．１５　　０．１５トリポリリン酸ナトリウム　　　１．７５　　−　　１．７５ケイ酸ナトリウム　　　　　　　０．４　　０．４　　０．４カルボキシメチルセルロース　　０．０５　　０．０５　　０．０５Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０１０，０１０，０１硫酸ナトリウム　　　　　　　　２．１　　２．１　　２．１過ホウ酸ナトリウム　　　　　　　−一１．０ＴＡＥＤ　　　　　　　　　　　　　−−０，１ゼオライトＡ　　　　　　　　　　　−１，２５−ＮＴＡ　　　　　　　　　　　　　　− ０，５−炭酸ナトリウム　　　　　　　　　−０，５−ｐＨ（ＮａＯＨを用いて ”）：　　　　　　９．５　　１０．０　　９．５ｌＡ　　Ｅ　Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２３Ａ　　Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，２３オレイン酸　　　　　　　　　　　　　　　０．０７５トリエタノールアミン　　　　　　　　　　０．１５エタノール　　　　　　　　　　　　　　０．０３プロピレングリコール　　　　　　　　　０．１５Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，００Ｂクエン酸ニナトリウム・２Ｈｚ０　　　　　　０．１７ＣａＣＩｌ　ｔ　・２Ｈｚ０　　　　　　　　　　　　　０．０１５ｐＨ（Ｎａｉｌを用いて＞　　：　　　　　　　　　　Ｓ、０ＬＡＳは直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ナンサ８０３、アルブライト　アンド　ウィルソン社（英国）製品）であり、ＡＥはアルコール　エトキシレート（ベロール０６５、ベロール　ケミ−ＡＢ（スウェーデン国）製品）であり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸であり、ＮＴＡはニトリロトリ酢酸であり、ＡＥＳはアルコール　エトキシ　スルフェート（ドパノール２５−３３．シェルケミカル社製品）であり、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ−酢酸トリーナトリウム七ノーカルシウム塩である。

はうれん草で汚染されたスワッチを、マチイス洗浄および乾燥ユニット（ウルナーマテイス社、スイス国）を用いて連続的に製造し、この際綿織物にほうれん草のジュース内を通し次いで二本ロール間で絞り更に３０°Ｃの空気（温度設定）で風乾した。スワッチを２０℃で３週間保存し、次いで使用するまで一１８°Ｃに保持した。

綿を下記混合物中に浸漬して、ロール間で絞り、乾燥し次いで２０℃の空気中で２日間保存することによりよごれと混合したスワッチを作製した。

オリーブ油　　　　　　　１４．４　　重量％ステアリン酸　　　　　　ｊ、８　−　−モノグリセリド　　　　　１．８　−　−ゼラチン　　　　　　　　０．９　−　−脱イオン水　　　　　　７９．３　−　−カーボンブラック　　　　０．２　−　−白　　　土　　　　　　　　　　　　　１．４　　−　　−インディアインキ　　　　　０．２　−　−７個のスワッチ（７Ｘ７Ｃ１１）と各ビーカー中の７００ＩＩ１１！の洗剤溶液を用い、トルク−〇−トメーターで洗浄試験を行った（Ｊａｙ　Ｃ，ハリス：　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｃｙ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　、インター　サイエンス　バブリッシャーズ社（１９５４）　６０−６１頁）。

条件は、２５℃、１０分、１００ｒｐ■であった。水洗し次いで乾燥させ、４６０ｎｍでのスワッチの反射率（Ｒ）を測定した。洗浄性能をデルタＲ−Ｒ−Ｒ，（ここでＲｏは酵素なしでの測定値である）として表わす。

本発明のプロテアーゼ（例２における如く調製）を、成分■（例２における如く調製）並びにサビナーゼ＠（アルカリ性プロテアーゼ、ノボインダストリーＡ／Ｓ　（デンマーク国製品）と比較した。

結果をＲｏおよびデルタＲとして、プロテアーゼのタイプおよび用量（ＣＰＵ／　ｌ　）に対して示す、以下の結果はまた図面にも示される。

猶Ｊ二ｍ口」Ｌ洗剤■、はうれん草のよごれ例Ｊｌすｌ洗剤■、はうれん草のよごれ側ｉｆｆ用Ｅ１ｍ洗剤■、はうれん草のよごれ務Ｊ−１ｕ月匿と洗剤！、混合よごれｔｍ里■皿と洗剤■、はうれん草のよごれ洗剤■、混合よごれ試験した洗剤の配合は、ｐＨ８〜ｌＯ１種々のビルグー（リン酸塩および無リン酸塩）と共に、過ホウ酸塩と共におよびそれなしで更にアニオンおよび非イオン界面活性剤を包含する。

従って、液体および粉末洗剤用の広範囲の典型的配合がカバーされている。全てのこれらの条件で、本発明のプロテアーゼはＣＰＵ活性を基準として秀れた洗浄効果を示した。

例９プロテアーゼ゛ム　　　いたパ− 例３〜８の洗剤■を用いた。スワッチおよび洗浄条件は、例３〜８におけると同じであった。本発明のプロテアーゼ、成分Ｉおよびこれらの種々の混合物を合計用量０．１０　ＣＰＵ／Ｉｌまで添加した。

特異性プロテアーゼの純度の増加は、洗浄性能の増加をもたらすようである。

例１０Ａｓ−Ｎ−・　ブローアーゼ　　いた−次の洗剤配合を用いた：ＬＡＳ　　　　　　　　　０．４０ｇ＃！ＡＥ　　　　　　　　　　０．１５ｇ／ｊ！５ｏａｐ　　　　　　　　　０．１５　ｇ　／　ｊ！ＮａｔＳＯａ　　　　　　　２．００　ｇ　／　ｊ！例３〜８において記載した薬剤と同じ薬剤を用いた。

洗剤ヲ、９”ＧＨ水カラ調製したＩＯＩＩＭ（Ｄ　ＮＨＪＣＯｓニ溶解し、ｐＨを８．０に調節した。

はうれん草でよごしたスヮッチを例３〜８におけると同様に調製した。

６個のスワッチ（各々２．２Ｘ２．２ｃｍ）および各ビーカー中６０ｄの洗剤溶液を用い、恒温水中１５０Ｍ１のガラスビーカー内で電磁撹拌しながら洗浄テストを行った。条件は、３５℃、９０分であった。

他の例の特異性プロテアーゼとして、ベーリンガー社から商業的に入手可能な特異性プロテアーゼＡｓｐ−Ｎエンドプロテアーゼ（カタログ番号１０５４５８９）を、非特異性アルカラーゼ０プロテアーゼ、ノボインダストリーＡ／Ｓ　（デンマーク国）製品）と比較する。

プロテアーゼは、同量の酵素タンパク賞、０．６および１．２■／ｌで用いられる。

水洗し乾燥後、スヮッチの反射率（Ｒ：％）を例３〜８に従って測定した。

例１１この実施例は、ヘモグロビンの加水分解産物の綿に対する吸着がヘモグロビンを加水分解するために用いられたプロテアーゼのタイプと共にいかに変化するかを実証している。特異的プロテアーゼにより形成された加水分解産物は、非特異性プロテアーゼ（ズブチリシン　カルスベルク）を用いて得られた産物よりもはるかに少なく吸着される。

方法は以下の如くであったニブリドンおよびロビンソンＩｌｌ衝液（ｐＨ９，０）に溶解したヘモグロビンの０．０５％（Ｗ／Ｖ）溶液を、０．３　ＣＰＵ／Ｚのプロテアーゼにより加水分解する。２５℃で３０分後、綿スヮッチ（円形、直径５Ｃ１１）を、反応混合物内に装入し次いで１０分間煮沸する０次いでスヮッチを取出し、流水で水洗し、脱イオン水で３０分間浸漬し次いで再び流水で水洗した。風乾後、４６０ｎｓ＋でのスワッチの反射率（Ｒ）を測定する。吸着炭をデルタＲ＝Ｒ−Ｒｅ（ここで、Ｒ・は酵素なしで得られた反射率である、すなわち未加水分解ヘモグロビンに関する）をして表わす。

特異性プロテアーゼトリプシンおよび非特異性プロテアーゼズブチリシンカールスベルクを別々におよび組合わせて試験した。結果を次表に示す。

デルタＲのより大きな負の値は、より暗色のスワッチ、すなわち崩壊度のより大きい吸着製品である。

結果は以下の内容を示している。すなわち、非特異性プロテアーゼは否定的作用を有し、すなわちより容易に吸着される崩壊産物をもたらす、一方、特異性プロテアーゼはこのような作用は本質的に有しない、また以下の内容が認められる。

すなわち、非特異性プロテアーゼの少量割合の配合でさえも、純粋な特異性プロテアーゼを用いるよりもより著しい吸着結果を導く。

国際出願番号　ＰＣＴｌ００２８０　Ｎｉ＋Ｆｌｌｌｉ、　１６　　　７　　　８　　　９　　　　℃　　　　ｔｌｐＨ□　■ １）２０　　　　３）　　　　　ｊ、ｏ　　　　　５０　　　　６０’Ｃ−−− −ｎデルタ　Ｒテ゛ルタ　Ｒデ°ルタ　Ｒデルタ　Ｒテ゛ルタ　日補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成２年７月６日特許庁長官　植　松　　　敏　殿１　特許出願の表示ＰＣＴ／ＤＫ８９１００００１、発明の名称酵素洗剤３　特許出願人住所　　デンマーク国、デーコー−２８８０バグスバエルト。

ノボ　アレ（番地なし）名　称　ノボ−ノルディスク　アクティーゼルスカブ明　　　細　　　書酵　　素　　洗　　剤技術分野本発明は、プロテアーゼ含有洗剤組成物および該組成物中で用いられるタンパク分解洗剤添加剤に関する。

この点に関する別の情報は、文献ｒＨｏｗ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｇｏｔ　ｉｎｔ。

Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｏ”　Ｖｏｌ−１２＋　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ（ザ　ソサイエティ　フォー　インダストリアル　マイクロバイオロジー出版、ワシントン；Ｄ、Ｃ，１９７１年、タラウス　ダムマン、ボールバーム、ビレーセンセンおよびモゲンス　ヒルマー　ニルセンによる）中において並びにＰ、Ｎ、クリステンセン、に、トムセンおよびＳ、プランナーによるｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ　Ｅｎｚｙｖａｅｓ」（スイス国、モントルー市で開催された洗剤に関する第２回国際会議で１９８６年１０月９日に発表された論文）において見出される。

これらの論文で示されるように、トリプシン製剤は、すでに洗剤中に用いられているが、１９６０年代よりアルカリ性バシラス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ　）プロテアーゼは、この目的に対し殆ど独占的に用いられており、この期間洗浄力が改善された微生物プロテアーゼの開発の努力がなされてきている。

アルカリ性バシラスプロテアーゼを含有する洗剤組成物は、例えば英国特許１，３４２．７８４および英国特許１，３５６，１３０に開示されている。

従って、本発明の第１の面は１個又は２個のアミノ酸に隣接したペプチド結合を優先的に分解することによってタンパク質を加水分解するエンドプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物であって、洗浄力に影響しない他のプロテアーゼが存在しないことを特徴とする該洗剤組成物を提供することにある。

本発明の第２の面は、非ダスト顆粒、安定化液体もしくは保護酵素の形態にあるプロテアーゼを含んでなる洗剤添加剤であって、１個又は２個のアミノ酸に隣接したペプチド結合を優先的に分解することによってタンパク質を加水分解するエンドプロテアーゼを含んでなり、さらに洗浄力に影響しない他のプロテアーゼが存在しないことを特徴とする該洗剤添加剤を提供することにある。

発明の詳細な説明アミノ　−　　　プローアーゼ本発明において使用されるプロテアーゼの種類は、大きなペプチドフラグメントを生じせしめながら１個または２個のアミノ酸に隣接したペプチド結合を優先的に切断することによりタンパク質を加水分解するエンドプロテアーゼ（エンドペプチダーゼ）である。多（のそのようなプロテアーゼは公知であり、特に動物および微生物起源のものは公知である。

Ｋ、Ｍｏｒｉｈａｒａ　：　ｒ”ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ”　　Ａｄｖ、　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　Ｒｅ１ａｔ、　　八ｒｅａｓ　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、＋　　４Ｌ１７９〜２４３　（１９７４）Ｊを参照のこと。

請求の範囲１．１個又は２個のアミノ酸に隣接したペプチド結合を優先的に分解することによってタンパク質を加水分解するエンドプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物であって、洗浄力に影響しない他のプロテアーゼが存在しないことを特徴とする該洗剤組成物。

２、前記プロテアーゼが、動物プロテアーゼもしくは微生物プロテアーゼであるか、または動物プロテアーゼもしくは微生物プロテアーゼに対してコードしかつこれらを発現する遺伝子を有する、形質転換宿主生物を培養することによって得られる請求の範囲第１項記載の洗剤組成物。

３、前記プロテアーゼがトリプシン様特異性を有する、請求の範囲第１項又は第２項に記載の洗剤組成物。

４、前記プロテアーゼがトリプシンである、請求の範囲第３項記載の洗剤組成物。

５、前記プロテアーゼが、ａ）セリンプロテアーゼであり、ｂ）クロマトグラムが２個のみの加水分解生成物を示すようなウシインシュリンの酸化Ｂ−鎖を加水分解する能力、Ｃ）フサリアム、硅旦η工暉岬Σ扛よりＳＭ　２６７２を培養して得られるプロテアーゼに対する免疫化学的同一性を示し、ｄ）等電点が約９〜１０であり、ｅ　）　Ｂｚ−Ａｒｇ−ｐＮＡの加水分解能があり、ｆ）本質的に５ｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを加水分解しない、ｇ）ｐＨ９およびｐＨ１１でカゼインに対して本質的に同じ活性を示す、請求の範囲第３項記載の洗剤組成物。

６、非ダスト顆粒、安定化液体もしくは保護酵素の形態にあるプロテアーゼを含んでなる洗剤添加剤であって、１個又は２個のアミノ酸に隣接したペプチド結合を優先的に分解することによってタンパク質を加水分解するエンドプロテアーゼを含んでなり、さらに洗浄力に影響しない他のプロテアーゼが存在しないことを特徴とする該洗剤添加剤。

７、前記プロテアーゼが、動物プロテアーゼもしくは微生物プロテアーゼであるか、または動物プロテアーゼもしくは微生物プロテアーゼに対してコードしかつこれらを発現する遺伝子を有する、形質転換宿主生物を培養することによって得られる請求の範囲第６項記載の洗剤添加剤。

８、前記プロテアーゼがトリプシン様特異性を有する、請求の範囲第６項又は第７項に記載の洗剤添加剤。

９、前記プロテアーゼがトリプシンである、請求の範囲第８項記載の洗剤添加剤。

１０、前記プロテアーゼが、ａ）セリンプロテアーゼであり、ｂ）クロマトグラムが２個のみの加水分解生成物を示すようなウシインシュリンの酸化Ｂ−鎖を加水分解する能力、ｃ）７サリアムμ）シ狂違唄暉」工［ＩＳＭ　２６７２を培養して得られるプロテアーゼに対する免疫化学的同一性を示し、ｄ）等電点が約９〜１０であり、ｄ　）　Ｂｚ−Ａｒｇ−ｐＮＡの加水分解能があり、ｅ）本質的に５ｕｅ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡを加水分解しない、ｆ）ｐＨ９およびｐＨｎでカゼインに対して本質的に同じ活性を示す、請求の範囲第８項記載の洗剤添加剤。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロテアーゼを含んでなる洗剤組成物であって、洗浄力を与えるプロテアーゼ活性が、わずかに１個または２個の特定のアミノ酸に隣接したペプチド結合に対する特異性を有するプロテアーゼによって本質的に付与されていることを特徴とする前記洗剤組成物。
２．本質的に他のプロテアーゼを含有しない、請求の範囲第１項記載の洗剤組成物。
３．前記プロテアーゼが、動物プロテアーゼもしくは微生物プロテアーゼであるか、または動物プロテアーゼもしくは微生物プロテアーゼに対してコードしかつこれらを発現する遺伝子を有する、形質転換宿主生物を培養することによって得られる請求の範囲第１又は２項記載の洗剤組成物。
４．前記プロテアーゼがトリプシン様特異性を有する、請求の範囲第１〜第３項のいずれかに記載の洗剤組成物。
５．前記プロテアーゼがトリプシンである、請求の範囲第４項記載の洗剤組成物。
６．前記プロテアーゼが、ａ）セリンプロテアーゼであり、ｂ）クロマトグラムが２個のみの加水分解生成物を示すようなウシインシュリンの醇化Ｂ−鎖を加水分解する能力、ｃ）フサリアム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ｓｐ．ＤＳＭ２６７２を培養して得られるプロテアーゼに対する免疫化学的同一性を示し、ｄ）等電点が約９〜１０であり、４）Ｂｚ−Ａｒｇ−ｐＮＡの加水分解能があり、ｅ）本質的にＳｕｃ−ＡＡＰＦ −ｐＮＡを加水分解しない、ｆ）ｐＨ９およびｐＨ１１でカゼインに対して本質的に同じ活性を示す、請求の範囲第４項記載の洗剤組成物。
７．請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の如く特徴づけられる、非ダスト顆粒、安定化液体もしくはプロテアーゼ酵素の形態にあるプロテアーゼを含んでなる洗剤添加剤。