JPH03503121A

JPH03503121A - テオフィリンの酵素での定量

Info

Publication number: JPH03503121A
Application number: JP1502409A
Authority: JP
Inventors: デカストロ，アウロラ・フエルナンデス; グプタ，スレンドラ・クマル; アガルワル，アルン・クマル
Original assignee: ソシエテイ　ナショナル　バンク，インデイアナ
Priority date: 1988-02-12
Filing date: 1989-02-07
Publication date: 1991-07-18
Also published as: EP0402373A4; FI903958A0; EP0402373A1; AU3063689A; WO1989007653A1; FI903958A7

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】一オフィリンの　、での　量発明の背景テオフィリンは、喘息症状及びアレルギー症状の患者の治療に用いる気管支拡張薬及び呼吸刺激薬である。テオフィリンはまた、うつ血性心不全及び急性肺水腫の治療にも用いられる。この薬物を用いることの有益性も危険性も、該薬物の血清中濃度に直接関連する。テオフィリンが有効であるためには、その血中濃度を約１０〜２０ｍｇ／Ｌレベルに維持することが必要である。１０ｍｇ／Ｌより低いテオフィリンレベルは治療上無効であり、２０ｍｇ／Ｌより高いレベルでは患者に有毒となりかねない、この毒性は脳の損傷及び死をもたらす恐れが有る。テオフィリンが狭い濃度範囲内でのみ治療に有利であるので、また食事、他の処方薬や生理的差異に起因して、薬物排出量には患者間で大きな相違が存在するので、この薬物を用いる患者を監視することは重要である。

テオフィリンの測定は、５ｈａｈ、　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ　６３（８）、　１２８３（１９７４）がガスクロマトグラフィーで、またＤｅｓａＢｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ　Ｃｈｒｏｓａｔ　３３６（２）、　２８５　（１９８４）がガスクロマトグラフィーと質量選択検出機との組み合わせで行なっている。　Ｔｈｏｉ＊ｐ−５ｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｌａｂ　Ｃｌ１ｎ　Ｍｅｄ　８４（４）、　５８４　（１９７４）及びＮａ１ｓｈ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　八ｎｎ　　Ｃｌ１ｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ　　１６（５）、　　２５４　　（１９７９）はテオフィリンを高圧液体クロマトグラフィーで測定している。　５ｅｈａｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　９７．２８３　（１９４９）はテオフィリンの定量に紫外線分光光度法を用いた。しかし、これらの方法は厄介な抽出を必要とするので、今日行なわれるテオフィリン定量への臨床的アプローチの殆どは、試験試料中のテオフィリンの認識のために、抗体に依存する免疫学的方法を用いる。このようなテオフィリン定量系には、抗体が特異的結合タンパク質である競合的タンパク質結合が関与する。抗体との反応生起後、テオフィリンの定量は個々のアッセイに従って様々に行なわれる。即ちアッセイでの評価は、混濁が起こるか、放射能が発生するか、発色するかに従って濁度測定、比濁分析、放射能測定または比色分析によって行なわれ得る。この系の例を、Ｐａ１ｎｔｅｒ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ　Ｃ１１ｏ　Ｌｉｂ　Ａｕｔｏｓ　３（３）、　１７９　（１９８３）、Ｓａｍｏｓｚｕｋ、　ｅｔａｌ、、　　Ｔｈｅｒｐ　　Ｄｒｕｇ　　Ｍｏｎ　　５（１）、　　１１３　　（１９８３）、Ｏｐｈｅｉｍ、ｅｔ　　ａｌ、。

Ｃｌ１ｎ’Ｃｈｅｍ　　３０（１１）、　　１８７０　　（１９８４）、　Ｂｏｅｃｋｘ　　ａｎｄ　　Ｎｕｎｓｏｎ＋Ｔｈｅｒｐ　Ｄｒｕｇ　Ｎｏｎ　７（１）、　９５　（１９８５）、Ｃｏｏｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｒｅ５ＣｏＩｌｓ　　ｉｎ　　Ｃｈｅｗ　　Ｐａｔｈ　　＆　　Ｐｈａｒｍ　　１３（３）、　　４９７　　（１９７６）、　及びＬａｎｄｅｓａ＋ａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｗ　２９．１２３８　（１９８３）が報告している。

免疫学的系は、Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｗ　２７（１）、　２２　（１９８１）、Ｄａｖｉｓ　ａｎｄ　Ｍａｒｋｓ、　Ｔｈｅｒｐ　Ｄｒｕｇ　Ｍｏｎ　５（４）、　４７９　（１９８３）、Ｃｈａｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｗ　２８（２）、　３６１　（１９８２）、旧ｏ　ｄ　ｓ　＋ｅｔ　　ｉｆ、、　　Ｃ１１ｎ　　Ｃｈｅｗ　　３０（７）、　　１１７４　　（１９８４）、　Ｊｏｌｌｅｙ、　　ｅｔ　　ａｌ、。

Ｃｌ１ｎ　　Ｃｈｅｗ　　２７．　１５７５　　（１９８３）、　Ｎｏｒｒｉｓ、　　ｅｔ　　ｍｌ、、　　＾ｎａｌ　　Ｃｂｅｓｉ５３、６５８　（１９８１）、及びＴｙｈｉｃｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｗ　２７゜１４９９　（１９８１）も報告している。

更に、米国特許第３，８１７，８３７号に開示された酵素増幅アッセイで酵素が用いられている。この開示では、酵素をリガンドに化学結合させ、得られる酵素結合リガンドをす七ブタ−に結合させる。リガンドは薬物であり得る。リガンドがリセプターと特異的に反応することによって全体の反応が特異性を有する。一方、酵素活性は反応に関するマーカーとして用いられる。従って、用いられる酵素は薬物の酵素的認識を行なわない、このようなアプローチの適用は、テオフィリン認識のための抗体またはリガンドに替えて酵素を用いる本発明の方法とは総じて異なる。

１９８６年１月１５日付で出願されたヨーロッパ特許出願第ＥＰ８６３００２２６．７号、及びＣ１１ｎ　Ｃｈｅｗ　２５．１３７０　（１９７９）には、基質からホスフェート基を切断するべく作用するアルカリ性ホスファターゼの活性がテオフィリンによって阻害され得ることが報告されている。このアプローチにおいて、アルカリ性ホスファターゼの酵素的反応はホスフェート結合を切断する反応であり続けるが、この作用はテオフィリンの存在によって干渉される。この開示でも、行なわれるテオフィリン試験は、テオフィリンが酵素の反応において該酵素によって利用即ち改変されることのない試験である。これに対して、本発明は、液体中のテオフィリンの定量のために、テオフィリンを利用もしくは認識してこのテオフィリンを基質とする酵素を用いて試験系を実現し得ることを教示する。

これまでの先行技術において、テオフィリンを利用する酵素は入手可能でなかったし、開示されてもいなかった。

そのうえ、テオフィリンはキサンチン誘導体であるので市販のキサンチンオキシダーゼ及びキサンチンデヒドロゲナーゼ並びに関連酵素が、テオフィリンを利用する能力に関して試みられたが、それらの試みは不首尾に終わった。ヒトではテオフィリンは代謝されて主に１．３−ジメチル尿酸並びに１−メチル尿酸及び３ −メチルキサンチンとなることが知られている［Ｃｏｒｎｉｓｈ、　Ｈ，Ｈ，ａｎｄ　Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ、＾、八、。

Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　２２８．３１５　（１９５７）］が、テオフィリン利用酵素は単離も提示もされていなかった。しかし、最近３種のテオフィリン利用もしくは認識酵素がＧＤＳ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｅ、。

Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　４フ３．　Ｅｌｋｈａｒｔ、　Ｉｎｄｉａｎａ　４６５１５から入手可能となった。これらの酵素は、１．　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｔ−０９０，２，Ｅｎｚｙｍｅ　Ｔ−０６０及び３．　Ｅｎｚｙｅｘｅ　Ｔ−０４０として同定された。

本発明は上記酵素を、体液、食品抽出物、医薬化合物及び医薬組成物のような試料中のテオフィリンを酵素で定量する試験の開発及び実施に初めて用いた。酵素を用いる本発明によるアプローチが実現する試験は、迅速かつ簡便に行なえる。

酵素を用いるアプローチの利点は、１）試薬もしくは試験組成物の効力が一様であること、２）試薬もしくは試験組成物への試料の添加が１段階で行なえること、３）液体系を、機器読み取り装置との関連において処理し得ること、及び４）試薬もしくは試験組成物を固相マトリックスに容易に含有させ得ることである。

図面の簡単な説明図は、実施例３に後述するように、テオフィリンとの接触前後のテオフィリン利用酵素の吸光度曲線を示す。

ましい　　　の本発明は基本的に、テオフィリンを利用または認識する酵素（またはかかる酵素を含有する物質）を用い、任意に電子伝達体が使用されるテオフィリン定量系から成る０本発明によるテオフィリンの定量は、酵素とサンプル中に存在する任意のテオフィリンとの反応によって発生した信号を測定し、発生した信号の量をサンプル中のテオフィリンの存在量に変換または相関させることによって行なわれる。

ここで、テオフィリン利用酵素なる用語は、テオフィリンを認識または利用し、単独でまたはその他の試薬もしくは手段と併用されて、目視、計器またはその他の公知方法で測定できる信号を発生する酵素またはかかる酵素を含有する物質を意味する。

試験方法の原理は、酵素によるテオフィリンの利用に基づく、即ち、酵素はテオフィリンを基質として認識しこれを異なる化合物または産生物に変換する。この系は以下の図式で示される。

酵素テオフィリン→産生物本文及び請求の範囲に開示された本発明の方法は上述のごとく、テオフィリンとテオフィリン利用酵素との接触によって発生した信号の検出を含む、この信号は特異的酵素反応が行なわれたことを標示する０発生した信号を本文中に記載した種々の方法で測定する。この処理は、電子伝達体例えば電子受容体または電子供与体の添加の下または非添加の下に行なう、を子嚢容体の例は、酸素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＨＡＤ）、ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＦ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、メチレンブルー、シトクロム、フェリシアニド等である。を子供与体の例は、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）！＞、還元フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤＨ）等である。

この他に、テオフィリン利用酵素の活性に最適のｐｉ及び温度範囲を用いた常用の酵素的定量法で処理することも可能である。またかかる定量は、緩衝された環境で行なわれるのが好瀘しい。

原則として、テオフィリンの酵素的定量に使用され得るテオフィリン利用酵素のすべての変種が本発明の範囲に包含される。

被検サンプル中のテオフィリンを本発明方法で定量するために使用され得る種々の試験系を以下に示す。

（１）系のテオフィリン濃度の減少を測定する場合、この系では、テオフィリンが最大吸光度をもつ波長２７２ｎ＊での吸光度の減少を測定することによって基質テオフィリンの消滅を測定し得る。この系は、テオフィリン酵素Ｔ−０６０を使用した実施例１及びテオフィリン酵素Ｔ−０９０を使用した実施例２によって示される。濃度変化を、吸光度の逆数である反射率の測定によって検出してもよい。

（２）系の酸化−還元電位の変化を測定する場合、このために、２つの方法のいずれか、即ち、（ａ）酵素または酵素複合体系における変化を測定する方法、例えば実施例３のように酵素特性値の変化を波長４１０ｎｍ及び５５０ｎ−で生じる変化によって検出する方法を用いるか、または、（ｂ）例えばフェリシアニドからフェロシアニドへの還元のごとく系に付加された電子伝達体の変化を電気化学的に測定する方法を用いる。

実施例４は、テオフィリン酵素Ｔ−０９０の存在下に反応が生じてフェリシアニドがフェロシアニドに変化したときに４１０ｏ曽に生じる吸光度の変化を示す、この変化は、分光光度法または電気化学的方法でも測定できる。

（３）テオフィリンの酵素反応に関連する産生物の出現を測定する場合、この反応で産生ずる産生物は関与する酵素に従って多様である。＠えば、テオフィリン酵素は、酸化テオフィリン、脱水素テオフィリンまたは脱メチルテオフィリンと反応し得る。実施例５はテオフィリン酵素Ｔ−０４０を使用したときのホルムアルデヒドの形成及びその測定を示す、実施例６は、テオフィリン酵素Ｔ−０６０を使用したときの過酸化水素の形成及びその測定を示す。

産生物は以下の反応またはプロセスによって形成されると考えられる。

（ｉ＞酵素が、酸素を電子受容体として用いテオフィリンを酸化してテオフィリン（１，３ジメチルキサンチン）を１，３ジメチル尿酸に変換する場合、これは以下の図式で示される。

酵素テオフィリン十〇ｚ十ＨｚＯ→ １．３ジメチル尿酸士過酸化水素この系で産生された過酸化水素を滴定法、電位差測定法、ポーラログラフイー法、比色法及び酵素法で定量できる。

酵素法による過酸化水素の定量が好ましい、その理由は、酵素法が信頼できる特異的方法であり、同時に上記反応における過酸化水素を容易に発色させ得るからである０例えば、＾ｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１０５．３８９．　（１９８０）に記載のペルオキシダーゼ法を使用し得る。テオフィリン酵素Ｔ−０６０を使用し、た実施例６は、過酸化水素の形成がサンプル中のテオフィリン濃度に比例することを証明する。または、上記の一般反応式に基づき、例えばガスクロマトグラフィー法及び減極法（ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）によって酸素消費率を測定してもよい、　（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｒｕｓｅｎｔｓ、　Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇ、　０）１から入手できる）酸素電極を使用する減極法は公知であり、米国特許第３，８３８，０１１号及びＪ　Ａｐｐｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１８．１２４７（１９６３）にも記載されている。

（ｉｉ）酵素が、フェリシアニド、ＮＡＤ、シトクロムのごとき酸素以外の受容体を用いテオフィリンを酸化して１．３ジメチル尿酸と還元受容体とを産生ずる場合、これは次式で示される。

酵素テオフィリン＋酸化受容体→ １．３ジメチル尿酸十還元受容体この系で産生された１、３ジメチル尿酸をいくつかの方法で測定または定量し得る。実施例７は、テオフィリン酵素Ｔ−０９０を使用して２９Ｚｎ＋ｓでの吸光度を測定する方法を示す。

１．３ジメチル尿酸はこの波長で吸光度最大を示す、ここでも、吸光度の増加がサンプル中のテオフィリン濃度に比例することが知見された。

更に、この反応式を用い、使用後の電子受容体の酸化／還元状態を測定することによってサンプルのテオフィリン濃度を定量することもできる。実施例４及び８は、受容体としてフェリシアニドを使用しこれをテオフィリン酵素Ｔ−０９０によってフェロシアニドに還元する試験方法を示す。

波長４１０ｎ−でフェリシアニドは最大の吸光度を示し、この波長でフェロシアニドは吸光度を全く示さないので、実施例４では波長４１０ｎｓａでの吸光度の減少を測定することによってフェリシアニドの減量を測定する。ここでもまた、吸光度の減少がサンプル中のテオフィリン濃度に比例することが知見された。実施例８はフェロシアニドの別の測定方法を示す、この場合には、＾ｖａｎ、　Ｍ、　＆　５ｈａｖｉｔ　Ｎ、、＾ｎａｌｙＢｉｏｅｈｅｍ　６．５４９（１９６３）の方法を使用し、４．７ジフエニルー１．１０７エナントロリンスルホネートを用いてフェロシアニドの形成を化学的に測定する。Ａｖｏｎ法による発色を５３５ｎｓで測定した０発色はサンプル中のテオフィリン濃度に比例していた。

実施例９は、別の電子受容体であるフェリシトクロムＣの使用を示す。この実施例では、フェリシトクロムＣがフェロシトクロムＣに還元される。テオフィリン酵素Ｔ−０９０の存在下に波長５５０ｎ＋ａでの吸光度の増加を測定することによってフェロシトクロムＣの形成を測定する。ここでも波長５５０ｎ−での吸光度の変化がサンプル中のテオフィリン濃度に比例することが知見された。

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＨＡＤ）、２．６−シクロロフエノールインドフエノール（ＤＣＰＩＦ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）等のごとき他の公知の電子受容体も同様にして使用できる。

反射率は吸光度に反比例するので、上記のすべての実施例において反射率の変化を測定してもよい。

上述の反応において電子の移動によって生じた変化を測定する方法は分光光度法または反射率法に限定されない。

酸化−還元反応における電子の移動または変化を測定するために電位差測定法、蛍光法または電気化学的方法を使用できることは公知である０例えば、Ｒｅｅｄ及び■ａｗｋｒｅｃ１ｇｅは＾ｎａｌ　Ｃｈｅｗ　５９．２３３４（１９８７）において、銀電極におけるシトクロムＣの電子移動反応を開示したが、これは本発明において、シトクロムＣの変化を測定するために使用できる。

また、米国特許第４，５４５，３８２号に報告されている電気化学的方法では電子受容体としてフェロセンまたはフェロセン誘導体を使用している。これらの受容体を本発明の酵素的テオフィリン測定に使用し、変化を電気化学的に測定してもよい、また、＾ｎａｌ　Ｃｈｅｗ　３６．３４３＜１９６４）で証明且つ報告されているように白金電極を使用して電流変化を測定することによってフェリシアニドからフェロシアニドへの変化を定量してもよい。

（ｉｉｉ）酵素が一方または両方のメチル基を開裂することによってテオフィリンを脱メチル化する場合、一方のメチル基が開裂されたときは１−メチルキサンチンまたは３−メチルキサンチンと１モルのホルムアルデヒドとが産生される０両方のメチル基が開裂されたときはキサンチンと２モルのホルムアルデヒドとが産生される０反応は次式で示される。

酵素テオフィリン＋ＮＡＤＰＨ＋０２→ １メチｌレキサンチン＋ホルムアＪレデヒド十ＮＡＤＰ及び／または３メチルキサンチン＋ホルムアルデヒド＋ＮＡＤＰ及び／またはキサンチン＋ホルムアルデヒド＋ＮＡＤＰ上記反応においては電子供与体としてＮＡＤＰＨが使用されている。しかしながら、ＮＡＤＦＩまたはＦＡＤｆｌのごとき他の電子供与体の使用も可能である。公知の常用の化学的、酵素的または電気化学的方法によって反応産物であるホルムアルデヒドを測定し得る。実施例５はテオフィリン酵素Ｔ−０４０を使用したときのホルムアルデヒド測定方法の１つを示す。

該実施例で示されるように、産生されるホルムアルデヒドはサンプル中のテオフィリン濃度に比例する。

反応産物であるキサンチンまたはメチルキサンチンを以下の手順で測定してもよい。

キサンチン　　　　　　　　　キサンチンオキシダーゼ（またはメチルキサンチン〉＋０２尿酸（またはメチル尿酸）＋Ｈ，Ｏ。

形成された過酸化水素（８２ｏｚ＞を前述の種々の方法で測定でき、尿酸またはメチル尿酸を例えば波長２９２ｎ−における吸光度の増加の定量またはＣ１１ｎ　Ｃｈｅｗ　２６．２２７（１９８０）に記載された比色法によって測定できる。

ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの減少はまた、＾ｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１２．３５７（１９６５）に記載のごとき常用の方法によって分光光度的または蛍光測定的に測定できる。　ＦＡＤＨの減少は、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ２４６、２３７１（１９７１）で示すように波長４５０ｎｍでの吸光度減少を測定することによって測定できる。

（１マ）酵素によるテオフィリンの認識によって産生されたその他の産生物を分光光度法、電気化学的方法もしくはクロマトグラフィー法のごとき常法または実施例１のごとくテオフィリン濃度の減少によって測定する。

本文で開示された液体試験試薬（ｌｉｑｕｉｃｌ　ｔｅｓｔ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）に加えて、本発明の試験試薬組成物及びデバイスは反応に有利な従来の添加剤及びアジュバント、例えばバッファ、懸濁化剤、増粘剤、カラーエンハンサ− １界面活性剤を含有し得る。

更に、前述の液体試験試薬系以外に、本発明の組成物は固体担体またはマトリックスに混和されてもよい、かかる配合形！！！　（ｃｏｎｆ　ｉｇｕｒａｔｉｏｎ）即ちフォーマットを当業界ではドライゲミＩ・スリイまたは固層試験デバイスフォーマットと呼ぶ、最も普通のマトリックスは紙であるが、ポリマー、クレー、ゲルなどのその他の吸水性材料も使用できる。基本的には試薬組成物をマトリックスに混和または含浸させて乾燥する。使用の際にデバイスを被検サンプルに浸漬するかまたは接触させる。特にテオフィリン利用酵素を含有する試験組成物とテオフィリンとの反応によってデバイス中で発生した信号を当業界で公知の技術、例えばカラーチャートとの目視比較、反射率の分光光度測定によって検出し定量する。実施例１０はテオフィリン酵素Ｔ−０９０とシトクロムＣとをＰ紙に含浸させて得られたデバイスを示す、テオフィリン濃度の増加に伴う変色を視診によって半定量的に読取るかまたは既存の反射率測定器によって定量的に読取る。または固体マトリックス中の電子移動の変化を電気化学的に測定し得る。

要約すれば、上述及び後述のすべての実施例は、本発明によるテオフィリンの酵素的定量法によれば、液体系及び固体マトリックス試験デバイスの双方の形態の使い易く便利な試験フォーマットを製造できることを証明した。

天１」１以下の実施例は、本発明の例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。

以下に与えられる総ての実施例に於いて、酵素活性は温度３０℃での１分当たりに使用されるテオフィリンｌ　ｐｍｏｌとして定義する。

夾１ｊ１− 分析用混合物は、ｐＨ７，０のリン酸カリウムｗｉｆｒ液０．０５Ｍ及びテオフィリン酵素Ｔ−０６００，４ｕ／ｘｉを含んでいた０分析用混合物２ｍｌに、種々の濃度のテオフィリンを含むサンプル１００．１を別個のキュベツトに添加した。　Ｇｌｌｆｏｒｄ分光光度計中、３０℃で１０１光路のキュベツトで反応を行った。３０分後に２７２ｎｍに於ける光学密度の減少を観測すると、サンプル中のテオフィリン濃度と比例していた。

−フィ身ン゛　　　　　　１　　　の　ハ２７２ｎｍ４０ｘｔｉ／Ｌ　　　　　　　　　　　０．０６７２０ｘｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　０．０３３１０Ｍｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　Ｏ，０１７夾ＪｉｌＪＬＬ分析用混合物は１．ｌ１７．５のリン酸カリウム緩衝液５０ｕｍｏｌｅｓ／ｚ１、テオフィリン酵素Ｔ−０９０１，８ｕ／ｚ１及びシトクロムＣの２５ｎｍｏｌｅｓ／ｌｉ’を含んでいた。この分析用混合物０．５ｉ＋１に、以下の濃度のテオフィリンを含むサンプル２５．１を別個のキュベツト中に添加した。　Ｇｌｌｆｏｒｄ分光光度計中、３０℃で１０曽請光路のキュベツトで反応を行った。２０分後に、２７２ｎ−に於ける光学密度の減少を記録すると、サンプル中のテオフィリン濃度と比例していた。

−ライ１ン゛　　　　　　　　　　　の　′２７２ｎＩＩ）４０１１Ｆ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０６５２０ｍｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０３１１０ｍｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　０．０１５因ｍ本実施例では、テオフィリン酵素Ｔ−０９０を使用した１図に示されるように、曲線Ａは、ｐＨ７，５のリン酸カリウム緩衝液０．０５１４中のテオフィリン酵素Ｔ−０９０の１．８ｕ／ｍｌ濃度での吸光度スペクトルを示す０曲線Ｂは、同一条件下、テオフィリン濃度２ｉ＋ｙ／Ｌの存在下での同一酵素の吸光度スペクトルを示す。

図示されたように、テオフィリンは４１７．５及び５５０ｎ＠の波長での吸光度を増加させた。これらの吸光度に於ける変化を、サンプル中のテオフィリン濃度を検知するベースとして使用する。

１１１虹本実施例では、テオフィリン酵素Ｔ−０９０と受容体としてフェリシアン化カリウムを使用した。フェリシアン化カリウムは、テオフィリンを添加すると酵素の存在下でフェロシアン化物に変化する。フェロシアン化物の形成は、４１０ｎｍでの光学密度での減少を測定することによって測定し得る。

分析用混合物は、リン酸カリウムＭ衝液５０μｍｏｌｅｓ／ｍｌ、テオフィリン酵素り、８ｕ／ｘｉ及びフェリシアン化カリウム１．４３ｐｍｏｌｅ／ｘｊ！を含んでいた０分析用混合物０．３５ｚｊ！に、以下の濃度でテオフィリンを含むサンプル５０Ｉｊ！を別個のキュベツト中に添加した。　［；１ｌｆｏｒｄ分光光度計中、３０℃で１０ｍｍ光路のキュベツトで反応を行った。３０分後に、４１０ｎ−の波長に於ける光学密度の減少を観測すると、サンプル中のテオフィリン濃度と比例していた。

テオフィリンゝ　　　　　　　　　　　の　）ゝ（４１０ｎｍ）４０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１４１３０ｘｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　０．１０９２０ｍｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０７６１０胃ｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０４７犬ＪＬＬΣ 本実施例に於いては、テオフィリン酵素Ｔ−０４０を使用した。　ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下、この酵素はテオフィリンを脱メチル化して、キサンチン及び／または１−及び／または３−メチルキサンチン及びホルムアルデヒドを生成する。

ホルムアルデヒドは、Ｎａ５ｈによりＢｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　５５，４１＋１ｌ− ４２１（１９５３）に報告されているように既知の化学的方法によって測定した。ホルムアルデヒドの生成量は、サンプル中のテオフィリン濃度と比例した。

分析混合物は、ｐｔｉｓ、ｏのＴｒｉｓ−ＨＣ１ｔｌ＠液５０Ｈｏｌｅｓ／ｘｉ ’、ＮＡＤＰ旧Ｈｏ１ｅ／ｙｉ’及びセミカルバジド１０ｎｍｏｌｅｓ／ｉｌを含んでいた。試験管中の分析混合物２．Ｏｚｌに、テオフィリン酵素Ｔ−０４０２，５ユニツトを添加した１反応混合物を３０℃で１５分間振動した後、２ｏｚ硫酸亜鉛０．６ｍｌ、飽和水酸化バリウム０．６６ｍ１を添加して反応を終了させて、室温で１０分間放置した、試験管を８，０００ｇで１０分間、遠心分離した。上澄み液１．０ｚｌ！に、以下の添加物；　Ｎａ５ｈ試薬（酢酸アンモニウム１５０゜及びアセチルア七トン２ｚｊ含有脱イオン水５００ｚ１溶液）０．４１１＋１！を添加して、試験管を３０分間６０℃のウォーターバス中で培養した。　４１５ｎｍの波長での吸光度を即座に測定した。

−フイＩン′　　　　　　゛　　　の　ハ４１５ｎｍ１８０ｚｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　１．４８１４０＋ｙｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　Ｏ，２６９２０＋ｙｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　Ｏ，１４０１０瀧ｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　Ｏ，０７５え順九影Ａらｉ−′ｉｉ例では、チオフェリン酵素Ｔ−０６０を使用した。これはテオフィリンの存在下で１．３−ジメチル尿酸及び過酸化水素を生成する。過酸化水素は、ＦｏｓｓａｔｉらによってＣｌ　ｉｎＣｈｅｗ　２６．２２７　＜１９８０）に記載されている既知の変性Ｔｒｉｎｄｅｒ法によって測定した。

分析用混合物は、ｐＨ７，５のリン酸カリウム５０ｐｓｏｌｅｓ／ｚＮ、３．５ −ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホネート塩酸塩（ＤＨＢＳ）　５Ｌｍｏ１ｅ／ｉ１．４−アミノアンチピリジンｌｕｍｏｌｅ／ｚｆ、セイヨウワサビベルオキシターゼ５　、Ｏｕ／ｍｌ及びテオフィリン酵素Ｔ−０６００，７ｕ／ｚ１を含んでいた０分析用混合物０．７ｍｌに、テオフィリンを含む以下の濃度のサンプル５０μｒを、別個のキュベツト中に添加した。　Ｃ１１ｆｏｒｄ分光光度計中、３７℃で１０ｍｍ光路のキュベツトで反応を行った。２０分後に、５１０ｎ−に於ける吸光度の増加を測定した。

−ソイ１ン゛　　　　　　　　　　　の　　　５１０ｎｍ４０ｉｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１７２２０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０８９１０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０４５夾１」１Ｌ本実施例では、テオフィリン酵素Ｔ−０９０とシトクロムＣを使用した。テオフィリンの存在下では、反応から１，３−ジメチル尿酸が生成する。この生成物を、１．３−ジメチル尿酸の最大吸光度の波長である２９２ｎａで測定した。

分析用混合物は、９Ｈ７，５のリン酸カリウムＭｔｌｌ液５０Ｈｏｌｅｓ／ｄ、テオフィリン酵素Ｔ−０９０１，８ｕ／ｚＩｌ及びシトクロムｃ　２５ｍｍｏｌｅｓ／ｉ１を含む０分析用混合物０．５ｍｊ！に、以下の濃度でテオフィリンを含むサンプル２５ハを別個のキュベツト中に添加した。　Ｇｌｌｆｏｒｄ分光光度計中、３０℃で１０ｍ−光路のキュベツトで反応を行った。２０分後に、２９２ｎｓ＋に於ける光学密度の増加を測定すると、これはサンプル中のテオフィリン濃度と比例していた。

−フ　　１　ン′　　　　　　　　　　　　　　　　　　　の　　　　　２９２ｎｍ４０ｚｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１６２３０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１２５２０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０８７１０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０３６因Ｊ應ｍ本実施例では、テオフィリン酵素Ｔ−０９０と受容体としてフェリシアン化カリウムを使用した。これは、テオフィリンの存在下でフェロシアン化カリウムを生成する。生成したフェロシアン化物を、＾ｖａｎ及び５ｈａｖｉｔによって＾ｒ＋ａＩＢｉｏｃｈｅｍ　８，５４９　（１９６３）に記載されている４、７−ジフェニル−１゜１０−フェナントロリンスルホン酸塩を使用して化学的に測定する。

分析用混合物は、ｐＨ７，５のリン酸カリウム緩衝液５゜Ｈｏ１ｅｓ／ｉ＋１、テオフィリン酵素Ｔ−０９０１，８ｕ／ｉ１及びフェリシアンカリウムｔ、４３ｐｍｏｌｅｓ／ｚ１を含む１分析用混合物０．３５ｍ１に、以下の濃度のテオフィリンを含むサンプル５０ｕｌを添加した。　Ｇｌｌｆｏｒｄ分光光度計中、３０’Ｃｒ　３０分間、１０ｍｍ光路のキュベツトで反応を行った。上記より、分析用混合物５０ｕｌを脱イオン水３５μｌ及び色生成試薬１５ｈｆと混合した０色生成試薬は酢酸０．ＩＨ中に、酢酸ナトリウムＩＭ、クエン酸０．０６６Ｍ、塩化第二鉄０．０００５５Ｎ及び４．７−ジフェニル−１，１０−７エナントロリン８３．３ｕＩＦを含む、６分後に５３５ｎｍの波長での吸光度を測定した。

吸光度はテオフィリン濃度と比例していた。

−フィＩン′　　　　　　　　　　　の　　　５３５ｎｍ４０ｍｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，３１９３０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，２４１２０凝ｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１７１１０ｚｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０８Ｇ５１９／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０４５叉ｌｊＬ乳本実施例では、テオフィリン酵素Ｔ−０９０と受容体としてフェリシトクロムＣを使用した。これは、テオフィリンの存在下で１．３−ジメチル尿酸及びフェロシトクロムＣを生成する。フェロシトクロムＣの生成は、５５０ｎ−の波長に於ける吸光度での増加によって測定する。

分析用混合物は、ＤＢ７．５の硫酸カリウム緩衝液５０ｕｍｏｌｅｓ／ｚＬテオフィリン酵素Ｔ−０９０５Ｌ／ｍｌ及びウマ　フェリシトロクロムｅ　０．２５ｎ躊ｏ１ｅｓ／ｘ１を含んでいた０分析用混合物０．５ｘ１に、以下の濃度のテオフィリンを含むサンプル２５ｕ１を別個のキュベツトに添加した。　Ｇｌｌｆｏｒｄ分光光度計中、３０℃でＩｏｎｓ光路のキュベツトで反応を行った。１５分後に反応が完了すると、光学密度に於ける増加を測定した。

他の実施例と同様に、吸光度とサンプル中のテオフィリン濃度とには直ＩＩ関係がある。

−フ　　　１　ン゛　　　　　　　の　　　　　５５０ｎｍ４０ｘｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，４５４３０ｘｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，３６１２０ｚｇ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，２８４１０ｘｙ／Ｌ　　　　　　　　　　　　０．１１０９５ｘ／Ｌ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０５５え１匠追１０ｓ＋ａ四方の濾紙に、テオフィリン酵素Ｔ−０９０５０ｕ含有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ［Ｉ７．５）などの種々の濃度のテオフィリン酵素Ｔ−０９０を含む溶液を染み込ませた。この溶液は、フェリシトクロムｃ　ｌｐｍｏｌｅ／ｘｌも含んでいた。濾紙を上記の溶液に浸けて、風乾した。異なる濃度のテオフィリン５〜４０ｍｙ／’Ｌ、を含む血清５０ｕ１を濾紙に添加すると、テオフィリン濃度が増加するにつれて桃色の濃い影がはっきりと現れた。

桃色の濃淡から、異なるテオフィリン濃度が検定できる。

浄書（内容に変更なし）ナノメーク− 手続補正書（方式）％式％２、発明の名称　　テオフィリンの酵素での定量３、補正をする者事件との関係　特許出願人名　称　　　ジー・ディー・ニス會テクノロジ・インコーホレイテッド４、代　理　人　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令の日付　　　平成３年４月１６日６、補正により増加する請求項の数　　な　し７、補正の対象　　図面翻訳文８、補正の内容（１）図面の翻訳文の浄書を別紙の通り補充する。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．テオフィリンの存在下で測定可能信号を提供するテオフィリン利用酵素と試料とを接触させ、発生した信号の量を測定し、この量を試料中のテオフィリンの濃度に相関させることからなることを特徴とする試料中のテオフィリンの測定方法。
２．体液、食物抽出物及び医療用組成物からなるグループの中から前記試料を選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。
３．酵素と接触した試料中に存在するテオフィリンが減少すると、信号が発生することを特徴とする請求項１に記載の方法。
４．約２６０ｎｍ〜約２８０ｎｍの波長での試料の光学密度の変化を観察して信号を測定することを特徴とする請求項３に記載の方法。
５．信号が、試料中に存在するテオフィリンと接触した酵素の変化の結果であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
６．約４１１ｎｍ〜約５５０ｎｍの範囲の波長での試料の光学密度の増加が変化であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
７．電子伝達体が存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
８．酵素と接触した試料中に存在するテオフィリンが減少すると、信号が発生することを特徴とする請求項７に記載の方法。
９．約２６０ｎｍ〜約２８０ｎｍの波長での試料の光学密度の変化を観察して信号を測定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
１０．信号が、試料中に存在するテオフィリンと接触した酵素の変化の結果であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
１１．約４１０ｎｍ〜約５５０ｎｍの範囲の波長での試料の光学密度の増加が変化であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
１２．前記変化を電気化学的に測定することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
１３．電子伝達体が電子供与体であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
１４．還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート及び還元型フラビンアデニンジヌクレオチドからなるグループの中から電子供与体を選択することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
１５．電子伝達体が電子受容体であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
１６．電子受容体が酸素であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
１７．シトクロム、フェリシアニド、ジクロロフェノールインドフェノール、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フェナジンメトサルフェート及びメチレンブルーからなるグループの中から電子受容体を選択することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
１８．テオフィリン利用酵素と、試料中に存在するテオフィリンとの相互作用により生じる反応生成物が測定可能信号を発生することを特徴とする請求項１に記載の方法。
１９．反応生成物が１．３−ジメチル尿酸であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
２０．約２８５ｎｍ〜約３０５ｎｍの範囲の波長での試料の光学密度の増加を測定して、１．３−ジメチル尿酸を定量することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
２１．過酸化水素が反応生成物として発生し、また測定可能信号であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
２２．過酸化水素の存在下で変色し得る色生成試薬から本質的になる系で過酸化水素を測定することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
２３．電子伝達体が変化すると、測定可能信号が生じることを特徴とする請求項７に記載の方法。
２４．電子伝達体がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであって、測定可能信号であるＨＡＤＨを発生することを特徴とする請求項７に記載の方法。
２５．電子伝達体がフェリシトクロムｃであり、またフェロシトクロムＣが測定可能信号として発生することを特徴とする請求項７に記載の方法。
２６．電子伝達体が、測定可能信号としてフェロシアン化カリウムを発生するフェリシアン化カリウムであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
２７．電子伝達体が還元されると測定可能信号を発生するフラビンアデニンヌクレオチドであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
２８．電子伝達体が還元されると測定可能信号を発生する２，６ジクロロフェノールインドフェノールであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
２９．テオフィリン利用酵素が、キサンチン及びキサンチン誘導体からなるグループの中から選択される反応生成物にテオフィリンを変化させ得ることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
３０．キサンチンオキシダーゼの存在下で適酸化水素を生じさせて反応生成物を測定することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
３１．キサンチンデヒドロゲナーゼ及び電子受容体の存在下で反応生成物を測定することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
３２．ホルムアルデヒドが反応生成物として生じ、また測定可能信号であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
３３．テオフィリンの存在下で測定可能信号を発生し得るテオフィリン利用酵素と、該信号を測定して、試料中に存在するテオフィリンの量に相関させる手段とからなることを特徴とする試料中のテオフィリンを測定するための検査用組成物。
３４．酵素と接触した試料中に存在するテオフィリンが減少すると、信号が発生することを特徴とする請求項３３に記載の検査用組成物。
３５．約２６０ｎｍ〜約２８０ｎｍの波長での試料の光学密度の変化を観察して信号を測定することを特徴とする請求項３４に記載の検査用組成物。
３６．信号が、試料中に存在するテオフィリンと接触した酵素の変化の結果であることを特徴とする請求項３３に記載の検査用組成物。
３７．約４１０ｎｍ〜約５５０ｎｍの範囲の波長での試料の光学密度の増加が変化であることを特徴とする請求項３６に記載の検査用組成物。
３８．電子伝達体が存在することを特徴とする請求項３３に記載の検査用組成物。
３９．酵素と接触した試料中に存在するテオフィリンが減少すると、信号が発生することを特徴とする請求項３８に記載の検査用組成物。
４０．約２６０ｎｍ〜約２８０ｎｍの範囲の波長での試料の光学密度の変化を観察して信号を測定することを特徴とする請求項３９に記載の検査用組成物。
４１．信号が、試料中に存在するテオフィリンと接触した酵素の変化の結果であることを特徴とする請求項３８に記載の検査用組成物。
４２．約４１０ｎｍ〜約５５０ｎｍの範囲の波長での試料の光学密度の増加が変化であることを特徴とする請求項４１に記載の検査用組成物。
４３．変化を電気化学的に測定することを特徴とする請求項４１に記載の検査用組成物。
４４．電子伝達体が電子供与体であることを特徴とする請求項３８に記載の検査用組成物。
４５．還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート及び還元型フラビンアデニンジヌクレオチドからなるグループの中から電子供与体を選択することを特徴とする請求項４４に記載の検査用組成物。
４６．電子伝達体が電子受容体であることを特徴とする請求項３８に記載の検査用組成物。
４７．電子受容体が酸素であることを特徴とする請求項４６に記載の検査用組成物。
４８．シトクロム、フェリシアニド、ジクロロフェノールインドフェノール、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フェナジンメトサルフェート及びメチレンブルーからなるグルーブの中から電子受容体を選択することを特徴とする請求項４６に記載の検査用組成物。
４９．前記手段が、テオフィリン利用酵素とテオフィリンとの反応生成物の存在に対して反応する試薬であることを特徴とする請求項３３に記載の検査用組成物。
５０．反応生成物が過酸化水素であることを特徴とする請求項４９に記載の検査用組成物。
５１．試薬が、キサンチン及びキサンチン誘導体からなるグループの中から選択された反応生成物に反応することを特徴とする請求項４９に記載の検査用組成物。
５２．試薬がキサンチンオキシダーゼを含んでいることを特徴とする請求項５１に記載の検査用組成物。
５３．試薬が更に、ペルオキシダーゼと、酸化還元指示薬とを含んでいることを特徴とする請求項５０に記載の検査用組成物。
５４．試薬がホルムアルデヒドに反応することを特徴とする請求項４９に記載の検査用組成物。
５５．試薬が１，３−ジメチル尿酸に反応することを特徴とする請求項４９に記載の検査用組成物。
５６．分光測光法、電気化学的方法、蛍光法、反射率法及び分極法からなるグループの中から選択した手段を使用して、信号を測定することを特徴とする請求項３３に記載の検査用組成物。
５７．テオフィリンの存在下で測定可能信号を発生し得るテオフィリン利用酵素から本質的になる組成物の残留物と混合した固体マトリックスを含んでいることを特徴とする試料中のテオフィリンを測定するための検査用装置。
５８．組成物が更に電子伝達体を含んでいることを特徴とする請求項５７に記載の検査用装置。
５９．電子伝達体が電子供与体であることを特徴とする請求項５８に記載の検査用装置。
６０．還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート及び還元型フラビンアデニンジヌクレオチドからなるグループの中から電子供与体を選択することを特徴とする請求項５９に記載の検査用装置。
６１．電子伝達体が電子受容体であることを特徴とする請求項５８に記載の検査用装置。
６２．電子受容体が酸素であることを特徴とする請求項６１に記載の検査用装置。
６３．シトクロム、フェリシアニド、ジクロロフェノールインドフェノール、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フェナジンメトサルフェート及びメチレンブルーからなるグループの中から電子受容体を選択することを特徴とする請求項６１に記載の検査用装置。
６４．テオフィリン利用酵素が、存在するテオフィリンへ作用して生じる反応生成物に組成物が反応することを特徴とする請求項５７に記載の検査用装置。
６５．酵素の変化を測定することを特徴とする請求項５７に記載の検査用装置。
６６．存在するテオフィリンの減少を測定することを特徴とする請求項５７に記載の検査用装置。
６７．固体マトリックスが紙であることを特徴とする請求項５７に記載の検査用装置。
６８．固体マトリックスがポリマーであることを特徴とする請求項５７に記載の検査用装置。
６９．固体マトリックスが紙であることを特徴とする請求項５８に記載の検査用装置。
７０．固体マトリックスがポリマーであることを特徴とする請求項５８に記載の検査用装置。