JPH03503597A - レチノイン酸レセプターの構成および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ）（Ｂ）第二の受容体の配列のリガンド結合ドメインの作用性部位に連結し な、（Ａ）第一の受容体の配列のＤＮＡ結合ドメインの作用性部位からなるキメ ラＤＮＡ配列（Ｃ）、および （ｂ）第一の受容体の配列のＤＮＡ結合ドメインの作用性部位が、レポーター配 列に機能的に連結したホルモン応答エレメントに機能的に結合し、かつ活性化す ることができるところの、作用性ホルモン応答エレメントに機能的に連結したレ ポーター核酸配列を含み、少なくとも１種の候補となるリガンドで細胞に対して 試験を行い、レポーター配列の発現産物の量における変化によりレポーター核酸 配列や誘導をモニターすることを含む、細胞内の受容体タンパク質に対する機能 するリガンドを同定する方法。 ２６、　　該細胞がＣＯ５細胞であるところの請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７、　　レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ（ＣＡＴ　）遺伝子およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子からなるグループ から選択されるところの請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８．　　ホルモン応答性エレメントが、野生型、遺伝子操作あるいは合成の（ １）グルココルチコイド応答性、（２）チロイド応答性エレメント、（３）ミネ ラロコルチコイド応答性エレメント、（４）エストロゲン関連応答エレメント、 （５）レチノイン酸応答性エレメントおよび（６）ビタミンＤ、応答性エレメン トからなるグループから選択されるところの、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２９、　　グルココルチコイド応答性エレメントが、乳腺肉腫ウィルスの長末端 反復配列（ＭＴＶ　ＬＴＲ）の一部であり、チロイド応答エレメントが成長ホル モンのプロモーター配列であるところの、請求の範囲第２９項記載の方法。 浄書（内容に変更なし） 明　　　　細　　　　書 し　ツイン　レセス　−の　　お　び 本発明は国立衛生研究所の研究助成金のもとて政府の本発明は、一般的には、リ ガンド反応性調節タンパク質およびそれらをコードする遺伝子に関するものであ る。 より詳細には、本発明はレチノイド関連調節タンパク質およびそれらをコードす る遺伝子、組み換えＤＮＡなどの遺伝子工学技術によって上記およびその他の調 節タンパク質および遺伝子を修飾したもの、および修飾されていないものと修飾 されたものの双方を含むレチノイド関連調節タンパク質および遺伝子の使用に関 するものである。 さらに、本発明は、リガンド反応性タンパク質に対する機能的リガンドを同定す るための新しい方法に関するものである６本方法は、新しく発見された受容体タ ンパク質に対する機能的リガンドを同定する場合に特に有用である。ビタミンＡ 関連モルフォゲン、レチノイン酸が、新しく発見されたレチノイン酸受容体タン パク質に対する機能的リガンドであることを示すことによって本方法は一部例示 される。 １１ゑ１１ 真核生物における中心的な問題は、ホルモンや成長因子などの外来性誘導因子に 反応して特異的な遺伝子制御を媒介する分子および機構の説明を行うことであり 続けている。各機構の特異性に関してはまた学ばねばならないことが多く残され てはいるものの、ホルモンなどの外来性因子は細胞内受容体およびホルモン反応 性エレメントすなわちＨＲＥとして知られる個々のＤＮＡを含む細胞内要素と協 調して働くことによって遺伝子の転写を調節することが知られている。 さらに具体的には、グルココルチコイドおよびチロイドホルモンのようなホルモ ンは促進された拡散に°よって細胞に入ることが知られている。ホルモンが次に 特異的な受容体タンパク質に結合し、それによってホルモン／受容体複合体を作 ることも知られている。ホルモンの受容体への結合により、受容体タンパク質の アロステリック変化が開始されると考えられている。この変化の結果として、ホ ルモン／受容体複合体がクロマチンのＤＮＡ上の特異的部位に高親和性で結合で きると考えられている。 うな部位は、本分野では様々な名前で呼ばれているが、近くの標的遺伝子のプロ モーターの発現（ＲＮＡの転写）を調節している。 ホルモンなどの外来性誘導因子による遺伝子制御の特異性をさらに理解するため の主要な障害は、タンパク質の適切な解析を行うために十分な量および純度の受 容体タンパク質が入手できないことであった。この欠乏のために、多様な体液や 組織中の外来性誘導因子（例えばホルモン）の存在を決定するための診断用アッ セイにおける受容体の使用、およびキメラ受容体タンパク質アナログを操作する ための“プロトタイプ”としての受容体の使用が妨げられて来た。 受容体タンパク質が入手困難であることを克服する努力がなされ、本出願の譲受 人であるソーク生物学研究所（ｔｈｅ　５ｉｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ）が受託された、共に審査中の出願υ 、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　１０８，４７１号により、グルココルチコイド−、チロイド− 、ミネラロコルチコイドー、および新しいステロイド関連受容体を含む多様な受 容体タンパク質のクローン化された遺伝子が開示されている。υ、Ｓ、Ｓ、８１ ０８，４７１号はさらに、これらの分子の詳細な生化学的解析を行い、別々のＤ ＮＡ結合領域およびリガンド結合領域を受容体タンパク質が含むことを示した。 　　（Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ　１０８，４７１号の一部は出版されている；グルココル チコイド受容体のクローニングとこの分子の各領域に分ける解析に関する部分に ついては、ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）他、（１９８５）、およびギ ゲレ（Ｇｉｇｕｅｒｅ）他、（１９８Ｂ）　、受容体に間するその他の研究に関 しては、ホレンバーグ（Ｉｌｏｌ　Ｉｅｎｂｅｒｇ）他、（１９８））、グリー ン（Ｇｒｅｅｎ）他、（１９８６）、グリーンとシャンボン（Ｃｈａｍｂｏｎ） 　、（１９８７）、クマ−（Ｋｕｍａｒ）他、（１９８７）、ミースフェルド（ Ｍｉｅｓｆｅｌｄ）他、（１９８７）、およびエバンス（１９８８）を参照のこ と）。 受容体の生化学的解析に関し°てはさらに、ヒトグルココルチコイド受容体遺伝 子の配列解析により、トリ赤芽球症ウィルス（＾ＥＶ）のガン遺伝子であるｖ− ｅｒｂ−Ａの産物と相同性があることが示された（ワインバーガー（ｉｌｅｉｎ ｂｅｒｇｅｒ）他、（１９８５）参照）、このグループおよび別のグループは続 いて、ｖ−ｅｒｂ−Ａの細胞内相同体がβチロイドホルモン受容体であることを 示した（ワインバーガー（Ｍｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）他、（１９８６）、およびサ ップ（Ｓａｐ）他、（１９８６）参照）。 ステロイドホルモン受容体とチロイドホルモン受容体のＤＮＡ結合領域が非常に よく保存されていることから、関連しているリガンド誘導性転写制御因子に関し てこの領域が特徴的なのだろうかという疑問が出された。また、これらの領域を コードするＤＮＡ配列を、関連しているが新しいリガンド反応性受容体に関して ゲノムを検索するハイブリダイゼーション用プローブとして使用可能だろうかと いう疑問も出された。この手法により、ソーク研究所の我々のグループは、幾つ かの新しい遺伝子産物を同定した。υ、Ｓ、Ｓ、Ｎ　１０８，４７１号に示され ているように、一つはヒトアルドステロン受容体（ｈＭＲ，＾ＴＣＣ第６７２０ １号）（Ｕ、Ｓ。 Ｓ、Ｎ、　１０８，４７１号のこの部分の出版物としては、アリザ（＾ｒｒｉｚ ａ）他、（１９８７）参照）；二番目は、ラット中枢神経系で高レベルで発現さ れている新しいチロイドホルモン受容体である（ｒＴＲα、＾ＴＣＣ第６７２８ １号）（ｔｌ、ｓ、ｓ、Ｎ、　１０８，４７１号のこの部分の出版物としては、 トンプソン（Ｔｈｏ雪ｐｓｏｎ）他、（１９８７）参照）。 本開示は、ステロイドおよびチロイドホルモン受容体のＤＮＡ結合領域およびリ ガンド結合領域と相同性のある新しいレチノイド受容体タンパク質をコードする 、クローニングされた全長のｅＤＮ＾の分離と解析を示している。 さらに、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、チロイド、エストロゲン 関連、およびレチノイン酸受容体の間の機能領域を交換（”ｓｗａｐｐｉｎｇ” ）することによって作成されたキメラ受容体の構築と解析についても述べている 。これらのキメラ受容体は、キメラ中に取り込丈れた“親の”ＤＮＡ結合領域お よびリガンド結合領域の“起源”に基づいたハイブリッド機能特性を有する０例 えば、キメラ受容体のＤＮＡ結合領域がレチノイン酸受容体のＤＮＡ結合領域で あれば（すなわち野生型レチノイン酸受容体から得られたものであるか、レチノ イン酸ＤＮ＾結合領域の機能的要素を含む変異体である場合）、キメラはレチノ イン酸受容体のＤＮＡ結合特性を有することになる。リガンド結合領域に関して も同様である。キメラ受容体中のリガンド結合領域がチロイドホルモンに結合す る場合には、キメラはチロイドホルモン受容体の持つリガンド結合特性を有する ことになる。 本開示はまた、リガンド反応性受容体タンパク質に対する機能的リガンドを同定 するための新しい方法を示すものである。本方法は、（１）レチノイド、レチノ イン酸およびその代謝前駆体、レチノールが新しく発見された受容体タンパク質 に対する機能的リガンドであること、（２＞　ＤＮＡ結合領域およびリガンド結 合領域がキメラ受容体の機能特性を決定すること、を示すことにより例示される 。 図面の簡単な説明 以下に図面の簡単な説明を示す、より詳細な説明は、“図面の簡単な説明”と題 した部分で述べる。 第１図（ＡおよびＢ）はｐｈＲＡＲａのＤＮＡヌクレオチド配列および一次タン パク質配列を示す図である。第１Ａ図はｐｈＲＡＲａの成分構造を制限酵素切断 部位と並べて示した線状図である。第１Ｂ−１図、第１Ｂ−２図、第１Ｂ−３図 はｐｈＲＡＲａの全長のヌクレオチド配列およびその一次アミノ酸配列を示して いる。 第２図（ＡおよびＢ）は図とプロットから成っている。 第２Ａ図はキメラ受容体ｈＲｃＲの構造の模式図である。第２Ｂ図はレチノイン 酸による里活性の誘導を示すプロットである。 第３図（ＡおよびＢ）は二つのグラフから構成されている。第３Ａ図はレチノイ ドに対する使用量依存性を示すグラフである。第３Ｂ図はトランスフェクトされ たＣＯ５−１細胞の細胞質抽出液に対するレチノイン酸結合を示す棒グラフであ る。 第４図（ＡおよびＢ）はヒトゲノムＤＮＡのサザンプロット分析を示している。 第４Ａ図は厳しい条件下でハイブリダイズさせた、消化されたヒト胎盤ＤＮＡを 示している；第４Ｂ図は同じＤＮＡを厳しくない条件下でハイブリダイズさせた ものを示している。 第５図はラットおよびヒト組織中のレチノイン酸受容体−ＲＮＡのノザンプロッ ト分析を示している。 第６図は、ｈにＲ，ｈＲＲｌおよびｈＴ、Ｒβの比較を示す模式第７図は一般化 したステロイド／チロイド／レチノイン酸受容体遺伝子の模式図である。 第８図はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに含まれるもののアミノ 酸比較を示す模式図である。 第９図はキメラチロイド／グルココルチコイド受容体の構造および活性を示す模 式図である。 本明細書および請求の範囲において、ここで用いるために以下のように特に定義 される技術用語が参照される。 ここで用いる場合、一般的な語゛″レチノイド”はレチノイン酸、ビタミンＡ（ レチノール）および、多様な系で発生と分化に重要な影響を及ぼすことのできる 一連の天然および合成誘導体を含む化合物群を意味する。 ここで用いる場合、生物種は以下のように同定される：ｈ、ヒト；ｒ、ラット； 醜、マウス；Ｃ，ニワトリ；およびｄ、ドロソフィラ（ショウジヨウバエ）。 ここで用いる場合、“ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー”とは、グ ルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、プロゲステロン、ニステロゲン、ニ ステロゲン関連、ビタミンＤ１、チロイド、Ｖ−ｅｒｂ−Ａ、レチノイン酸、お よびＥ７５（ショウジヨウバエ）受容体からなる関連した受容体群を意味するも のである。エバンス（１９８８）、およびそこで引用されている参考文献参照。 ここで用いる場合、ＲＲおよびＲＡＲはともにレチノイン酸受容体を意味する。 かしら文字、ｈＲＲおよびｈＲＡＲは、ヒトレチノイン酸受容体を意味する。ｐ ｈＲＡＲａと呼ばれるＤＮＡはヒトレチノイン酸受容体αをコードする。ｈＲＡ Ｒαは＾ＴＣＣ第４０３９２号として寄託されているｐｈＲＡＲｌによってコー ドされている。　ｈＲＡＲβと呼ばれるＤＮＡはヒトレチノイン酸受容体βをコ ードする。ブランド（Ｂｒａｎｄ）他（１９８８）参照、ここで用いる場合、Ｇ Ｒはグルココルチコイド受容体を意味する。ｈＧＲと呼ばれるＤＮＡはヒトグル ココルチコイド受容体ＧＲをコードする。ｈＧＲは＾ＴＣＣ第６７２００号とし て寄託されているｐＲＳｈＧＲによってコードされている。 ここで用いる場合、ＭＲはミネラロコルチコイド受容体を意味する。ｈＮＲと呼 ばれるＤＮＡはヒトミネラロコルチコイド受容体ＭＲをコードする。　ｈＭＲは ＡＴＣＣ第６７２０１号として寄託されているｐＲｓｈＭＲによってコードされ ている。 ここで用いる場合、ＴＲはチロイド受容体を意味する。 ＴＲαおよびＴＲβはチロイド受容体のα型およびβ型を意味する。　ｅ−ｅｒ ｂ−＾、　ｈｅｒｂ−Δ８，７、ｐｅ＾１０１、ｒｂｅ＾１２、およびｈＦ＾８ と呼ばれるＤＮＡはすべてチロイド受容体をコードするものである。プラスミド ｐｈφ−へ８．７はｈＴＲαをコードする；これは特許目的のために寄託され、 ＡＴＣＣ第４０３７４号として登録されている。プラスミドｐｅ＾１０１はｈＴ Ｒβをコードしている；これは特許目的のために寄託され、ＡＴＣＣ第６７２４ ４号として登録されている。プラスミドｒｂｅ＾１２はｒＴＲαをコードする； これは特許目的のために寄託され、ＡＴＣＣ第６７２８１号として登録されてい る。プラスミドｐｈＦ＾８はクローンの”リガンド結合”領域に欠失をもつ、ｈ ＴＲαの部分的クローン（すなわち、受容体タンパク質のカルボキシ末端をコー ドするＤＮＡ）をコードしている。プラスミドｐｈＦへ８はＡＴＣＣ第４０３７ ２号として登録されている。 ここで用いる場合、ＥＲＲはエストロゲン関連受容体を意味する。ｈＥＲＲｌお よびｈＥＲＲ２の頭文字は、ヒトエストロゲン関連受容体１および２であること を意味する。これらの受容体はチロイド受容体よりもステロイド受容体により近 いが、既知のステロイドホルモンのどの主要なりラスにも結合しない（ギゲレ（ Ｇｉｇｕｅｒｅ）他、１９８８）。ｈＥＲＲｌはプラスミドｐＥ４およびｐＨＫ ＾にコードされており、これはそれぞれＡＴＣＣ第６７３０９号および第６７３ １０号として寄託されている。（ｐＥ４もｐＨＫ＾も完全なりローンではない； 　ｈＥＲＲｌは両方のクローン由来の断片を結合して構築された）、ｂＥＲＲ２ はプラスミドｐｈＨ３にコートさレテオ’）　、ＡＴＣＣ第４０３７３号として 寄託されている。 ここで用いる場合、ＶＤＲはビタミンＤ、受容体を意味する。 ここで用いる場合、ＭＴＶは乳癌ウィルスを意味する；ＨＨＴＶはマウス乳癌ウ ィルスを意味する。 ここで用いる場合、ＲＳＶはラウス肉腫ウィルスを意味する；Ｓｖはサルウィル スを意味する。 ここで用いる場合、■はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意 味する。 ここで用いる場合、ルシフェラーゼはホタルのルシフェラーゼを意味する。　　 １．Ｒ，デ・ウェット（ｄｅ　Ｍｅｔ）、Ｋ、Ｖ、ウッド（Ｗｏｏｄ）、鮪、デ ル力（ＤｅＬｕｅａ）、Ｄ、Ｒ，ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）、およびＳ、 スプラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）、Ｍｏｌ　、Ｃｅｌ　Ｉ　、Ｂｉｏｌ　。 ７：７２５−７３７　（１９８７）参照。 ここで用いる場合、ＣＯ８はＴ抗原（Ｔａｇ）を発現しているサル腎臓細胞を意 味する。グルラマン（Ｇｌｕｚ曽ｉｎ）、Ｃｅ１ｌ。 ２３：１７５　（１９８１）参照、　ＣＯＳ細胞は受容体欠損細胞であり、本発 明の機能的リガンド同定アッセイに有用なものである。 ここで用いる場合、ＣＶ−１は“’ＣＶ−１”と呼ばれる細胞系由来のマウス腎 臓細胞を意味する。　ｃｖ−ｉはＣＯ８の親糸である。　ＳＶ４０　Ｔ抗原（Ｔ ａｇ）を発現するように形質転換されているＣＯＳ細胞とは異なり、ＣＶ−１細 胞はＴ抗原を発現しない。 ＣＶ−１ｇ胞は、本発明の機能的リガンド同定アッセイにも有用な受容体欠損細 胞である。 ここで用いる場合、“ホルモン反応性要素”または“ＨＲＥ”、゛転写調節ユニ ット”、“ホルモン反応性プロモーター／エンハンサ−要素”、“エンハンサ一 様ＤＮＡ配列”、および“転写剰激を媒介するＤＮ＾配列”などの一般的な技術 用語は、すべて同一物を意味しており、すなわち、転写のホルモン（またはリガ ンド）による活性化に必要な由に働く配列（約２０塩基対）である、これらの要 素をホルモン非反応性遺伝子に接続することにより、その遺伝子がホルモン反応 性となる。これらの配列はホルモン反応性要素またはＦＩＲＥとして最もよく呼 ばれており、位置および向きに関係無く機能する。他のエンハンサ−とは異なり 」ＲＥの活性はリガンドの存在の有無に依存する。（エバンス（１９８Ｂ）およ びそこで引用されている参考文献９照、）本明細書および請求の範囲においては 、“ホルモン反応性要素”という語を、これらの配列を記述するために本分野で 用いられるすべての語によって示唆される機能的特性を意味し、具体化するため に一般的な意味で用いられる。 ここで用いる場合、合成）ＩＲＥとは、自動ヌクレオチド合成機を用いて順岨工 凹で合成されたＯＲＥを意味する。ＨＲＥはわずか約２０ｂｐなので、この方法 で容易に合成することができる。操作された、あるいは合成の野生型ＯＲＥがホ ルモン非反応性プロモーターに連結されると、これらのプロモーターはホルモン 反応性となる。エバンス（１９８８）およびそこで引用されている文献参照。 ここで用いる場合、頭文字ＧＲＥはグルココルチコイド受容体反応性要素を、Ｔ ＲＥはチロイド受容体反応性要素を意味する。　ＣＲＥはＧＲとの相互作用によ るグルココルチコイド反応性を与えるホルモン反応性要素である。ペイバー（Ｐ ａｙｖａｒ）他、Ｃｅ１１．　：（５：３８１　（１９８３）、およびシープラ イト（Ｓｃｈｉｅｄｅｒｅｉｔ）他、Ｎａｔｕｒｅ、　３０４ニア４９　（１９ ８３）参照。 ＧＲＥは、ＤＮＡ結合領域がＣＲＥと機能的に結合できる（すなわち、活性化で きる）ものであるいかなる野生型またはキメラ受容体とも使用可能である０例え ば、ＧＲ，ＨＲｌおよびＰＲ受容体は全てＧＲＥを活性化することができ、　Ｇ Ｒ，ＭＲｌまたはＰＲ型のＤＮＡ結合領域を有するいかなる野生型またはキメラ 受容体ともＧＲＥを使用することができる。ＴＲＥは、ＴＲとの相互作用による チロイドホルモン反応性を与えることを除いては、ＣＲＥと同様である。ＴＲＥ は、ＤＮＡ結合領域が機能的にＴＨＥと結合できる（すなわち活性化できる）よ うないかなる野生型またはキメラ受容体とも使用可能である。　ＴＲおよびＲＲ 受容体はＴＲＥを活性化することができ、したがって、ＴＲまたはＲＲ型のＤＮ Ａ結合領域を有するいかなる受容体ともＴＨＥを使用可能である。 ここで用いる場合、リガンドとはホルモンまたは成長物質などの誘導因子を意味 する。細胞内で、リガンドは受容体タンパク質に結合し、それによってリガンド ／受容体複合体を形成し、それが適当なホルモン反応性要素に結合することがで きる。単一のリガンドが複数の受容体を持つこともある。Ｔ、Ｒ，およびＴＪ＃ はいずれもＴ、などのチロイドホルモンと結合する。 ここで用いる場合、°“リガンド反応性プロモーターおよび有効なレポーター遺 伝子に機能的に連結している有効なホルモン反応性要素”という語句中の“有効 な”という語は、それぞれのＤＮＡ配列（“ホルモン反応性要素゛、“リガンド 反応性プロモーター”、および“レポーター遺伝子”という語で表される）が作 用可能である、すなわち、ホルモン反応性要素が受容体タンパク質（野生型また はキメラ）のＤＮＡ結合領域と結合可能であること、リガンド反応性プロモータ ーがレポーター遺伝子の転写調節を行えること（ＩＩＲＥ／受容体タ受容体タン パクン／リガンド複合体当な活性化による）、およびレポーター遺伝子が宿主細 胞で発現され得ることを意味する。゛機能的に連結する”という語句は、ＤＮＡ 断片が連結された場合に適当な活性化によってレポーター遺伝子（例えば毘また はルシフェラーゼ）が発現されることを意味する。この発現は、“リガンド反応 性プロモーター”（ホルモン反応性要素の下流であり、適当なリガンド／受容体 タンパク質複合体にＨＲＥが結合すると゛″活性化”され、その結果レポーター 遺伝子の転写を“調節”する）が“オンの状態となる”、あるいは、ホルモン反 応性要素にリガンド／受容体タンパク質複合体が結合した結果として活性化され たものである。 ここで用いる場合、受容体の゛ＤＮ＾ＤＮＡ結合領域う語バク質（グルココルチ コイド受容体、チロイド受容体、ミネラロコルチコイド受容体、ニステロゲン関 連受容体、およびレチノイン酸受容体）のその部分を呼ぶものである。 これらのＤＮＡ結合領域に対する結合は、ステロイドホルモンスーパーファミリ ーに関して同定され、解析された。 第８図、およびギゲレ他（１９８６）：ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ） 他、（１９８７）　、グリーンとシャンボン（１９８７）　；およびミースフイ ールド（Ｍｉｅｓｆｉｅｌｄ）他（１９８７）、エバンス（１９８８）参照。 多様なステロイドホルモンスーパーファミリー受容体に間するＤＮＡ結合領域に 対する結合を第８図に示す；結合は以下に示すものである・ −ｈＧＲ（ｐＲＳｈＧＲ）：　　ヌクレｙ’ｒチト１３９３〜１５９０アミノ酸 ４２１〜４８６ （＾ＴＣＣ＃６７２００参照） −ｈＴＲｂ　（ｐｅＡｌｏｌ）：　ヌクレオ＋　トロ０４〜８０７アミノ酸１０ ２〜１６９ （＾ＴＣＣ＃６７２４４参照） −ｈＴＲａ　（ｐｈφ−八８．７）：ヌクレオチド１６８〜３７２アミノ酸５０ 〜１１７ （＾ＴＣＣ＃４０３７４参照） アミノ１２９１〜３５８ （＾ＴＣＣ＃６７２８１参照） −ＥＲＲＩ　（ｐＥ４　＆　ｐＨＫ＾）ニアミノ酸１７６〜２４１（＾ＴＣＣ＃ ６７３０９　＆　＃８７３１０参照）−ＥＲＲ２（ｐｈ＋＋３）：　　　アミノ 酸１０３〜１６８（＾ＴＣＣ＃４０３７３参照） −ｈＭＲ（ｐＲｓｈＭＲ）：　　ヌクレオチド２０２９〜２２２６アミノ酸６０ ３〜６６８ （＾ＴＣＣ＃６７２０１参照） −ｈＲＡＲａ　（ｐｈＲＡＲｌ）：ヌクレオチド３８４〜５６１アミノ酸８８〜 １５３ （＾ＴＣＣ＃４０３９２参照） 受容体のステロイドホルモンスーパーファミリーのＤＮＡ結合領域は６６から６ ８アミノ酸のアミン断片からなる。 この断片は９個のシスティン残基を含み、そのうちの一つが断片の最初のアミノ 酸である。この最初のＣｙｓ残基からＣｙｓ−Ｘｔ−Ｃｙｓ−Ｘ＋ｓ−＋５−Ｃ ｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ　（ここでＸはいかなるアミノ酸残基でもよい）と記述され るモチーフが開始される。ＤＮＡ結合領域は常にアミノ酸Ｇｌｙ−Ｎｅｔで終わ る。 クローニング法の簡便のために、ＤＮＡ結合領域の前および／または後の１〜６ アミノ酸をＤＮＡ結合領域とともに転換することも可能である。 ここで用いる場合、受容体の”リガンド結合領域”という語句は成長因子または ホルモンなどのリガンドに結合する、受容体タンパク質の部分に関するものであ る。ステロイド受容体スーパーファミリーに対するリガンド結合領域のこれらの 結合が同定され、解析された。第８図およびエバンス（１９８８）参照。 多様な受容体のリガンド結合領域が第８図に示されている；該領域の幾つかを以 下に示すニ ーｈＧＲ（ｐＲＳｈＧＲン：　アミノ酸５２８〜７７７（＾ＴＣＣ＃６７２００ 参照） −ｈＴＲｂ　（ｐｅ＾１０１）：　アミノ酸２３２〜４５６（＾ＴＣＣ＃６７２ ４４参照） −ｈＴＲａ　（ｐｈｅｒｂ−Ａ８．７）ニアミノ１１８３〜４１０（＾ＴＣＣ＃ ４０３７４参照） −ｒＴＲ（ｒｂｅ＾１２）：　　アミノ酸４２１〜６３９（＾ＴＣＣ＃６７２８ １参照） −ＥＲＲＩ　（ｐＥ４　＆　ｐ）ＩＫＡ）ニアミノ酸２９５〜５２１（＾ＴＣＣ ＃６７３０９参照） −ＥＲＲ２（ｐｈｔ１３）：　　アミノ酸２１２〜４３３（＾ＴＣＣ＃４０３７ ３参照） −ｈＨＲ（ｐＲｓｈＭＲ）：　　アミノＷ！１７３４〜９８４（＾ＴＣＣ＃６７ ２０１参照） −ｈＲＡＲａ　（ｐｈＲＡＲｌ）ニアミノ酸１９８〜４６２（＾ＴＣＣ＃４０３ ９２参照） 受容体間の機能的領域の交換を可能にするために、受容体ｃＤＮ＾ＤＮＡンに共 通の制限エンドヌクレアーゼ部位を導入しなければならない。第８図に示した多 様な受容体のいずれにおいても、　ＤＮＡ結合領域の直前に第一の共通部位を導 入し、直後に第二の共通部位を導入することが可能である。（例えば、第８図に 示した受容体のステロイドホルモンスーパーファミリーのいずれにおいても、Ｄ ＮＡ結合領域の直前に単独のＮｏｔ１部位を導入し、直後に単独のＸｈｏＩ部位 を導入することが出来る。これにより受容体は３つの機能的領域または“カセッ ト”に分割される；（１）Ｎ末端カセット、（２）ＤＮＡ結合領域カセット、（ ３）リガンド結合領域カセット。どの受容体由来の３つの領域またはカセットは 別の受容体由来のカセットと組み合わせて多様なキメラ受容体を作成することが できる。 ここで用いる場合、キメラ受容体を同定するために用いた命名法は以下のようで ある二可変性機能領域（Ｎ末端、ＤＮＡ結合領域、およびリガンド結合領域）は 、それらの元となった“親”受容体によって同定される。例えば、ＧＲ由来の領 域は“Ｇ”領域である。　ＴＲ領域は“°Ｔ”領域である（そうでなければさら に°゛Ｔ、”または“Ｔ５”領域として特定される）、ＭＲ領領域″Ｈ”領域で ある。　ＲＡＲ領域は°゛Ｒ”領域である（もしくは、さらに“Ｒ１”または“ Ｒゎ”として特定される）：また、ＥＲＲ領域は“Ｅ″領域ある（もしくは、さ らに“Ｅｌ”または“Ｅ２″領域として特定される）、この表記法によれば、特 定しない限り、“Ｔ”は一般的にＴ、Ｒ，またはＴ、Ｒ，受容体のどちらかを意 味する；“Ｅ”はｈＥＲＲｌまたはｈＥＲＲ２のどちらかを意味する：また、′ Ｒ″はＲＡＲａまたはＲＡＲβ受容体のどちらかを意味する。野生型受容体はい かなる交換領域も含まないので、この表記系にしたがうと、Ｃ−Ｃ−Ｃ＜または ＣＣＣ）、Ｔ、−Ｔ、−７，（またはＴ、Ｔ、Ｔ、）、Ｔ、−Ｔ、−７，（また はＴ。 Ｔ、Ｔ、）、トドＭ（または８８Ｍ）、Ｒ，−Ｒ，−Ｒ，（またはＲ，Ｒ，Ｒ， ）、Ｒ，−Ｒｂ−Ｒｂ（またはＲｂＲ，Ｒ，）、Ｅ、−Ｅ、−Ｅ、またはＥ、− Ｅ、−Ｅ、として同定され、ここで最初に示される領域はＮ末端領域、中央の領 域はＤＮＡ結合領域、および最後の領域はリガンド結合領域である。いかなるキ メラ受容体も少なくとも二つの野生型または親受容体由来の機能領域を持つこと になる０例えば、キメラ受容体１１１：Ｒ，はグルココルチコイド受容体由来の Ｎ末端およびＤＮＡ結合領域を持ち、グルココルチコイド受容体由来のＤＮＡ結 合領域、およびαレチノイン酸受容体由来のリガンド結合領域を有する。　ＧＴ 、Ｒゎはグルココルチコイド受容体由来のＮ末端、チロイド受容体α由来のＤＮ Ａ結合領域、および、レチノイン酸受容体β由来のリガンド結合領域を有する。 ここで用いる場合、ｈＧＲ，、、ｈＴＲＪ、、、およびｈＲＲ，、は、受容体の ＤＮＡ結合領域の境界に隣接してＮｏｔｌとＸｈｏｌの単一の切断部位を含むよ うに操作したｈ［；Ｒ，ｈＴＲａ、およびｈａｔＲ受容体を意味する。これらの 変異受容体は、ｈｃＲ，ｈＭＲ。 ｈＥＲＲｌ、　ｈＥＲＲ２，ｈＴＲａ、　ｈＴＲａ、　ｒＴｈ、　ｒＲＡＲａ、 　ｒＲＡＲ＃由来のアミノ末端、ＤＮＡ結合領域、およびリガンド結合領域のす べての可能な組み合わせから成るハイブリッド受容体の構築を例示するものであ る。 ここで用いる場合、サザンプロット分析は、変性させたＤＮＡをアガロースゲル から、相補的な核酸とハイブリダイズさせることができるニトロセルロースフィ ルターに転移させる方法を意味する。 ここで用いる場合、ノザンプロット分析とは、ＲＮＡをアガロースゲルから、相 補的なりＮＡにハイブリダイズさせることができるニトロセルロースフィルター に転移させる方法を意味する。 ここで用いる場合、本発明の“変異体”ＤＮＡとは、“野生型”あるいは操作し ていない配列とは異なるように遺伝学的に操作したＤＮＡを意味する。このよう な遺伝子操作には、野生型配列への新しいヌクレオチドの挿入、野生型配列から のヌクレオチドの削除、野生型配列中のヌクレオチドの置換、または受容体間の 機能的領域の“交換（ｓｅａｐｐｉｎｇ）”が含まれる０機能的領域をある受容 体から別の受容体のものに交換することによって操作された受容体もキメラ受容 体あるいはハイブリッド受容体と呼ばれる。 キメラ受容体はさらに、新しいヌクレオチド、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチ ドの置換などを含む。 本明細書および請求の範囲における“実質的な配列相同性“という語の使用は、 ここで開示され、請求される実際の配列と比較してわずかな、重大でない配列の 変化しか起こっていないＤＮＡ、ＲＮＡ、またはアミノ酸配列が、添付された請 求の範囲に含まれることを意図していることを示す、この語句の中で、“わずか な、重大でない”配列変化とは、相同な配列がここで開示し、請求する核酸およ びアミノ酸構造と実質的に同様に機能して実質的に同じ構造を産生ずることを意 味する。 ここで用いる場合、“組み換え的に産生される”という語句は、単に天然物から 生成されたのではなく、遺伝子組み換え技術を用いて作成されたことを意味する 。 ここに現れる多様なアミノ酸配列を構成するアミノ酸は、以下に示す３文字また は１文字略号によって同定される。 ′ＬＬＬＭ　　　　　　　　　七ｑ唯漫　　　じごＬ１漫Ｌ−アラニン　　　　 　　　　　　＾ＩＪＬ　　　　　　　　＾Ｌ−アルギニン　　　　　　　　＾ｒ ｇ　　　　　　　ＲＬ−アスパラギン　　　　　　　＾Ｓｎ　　　　　　　ＮＬ −アスパラギン酸　　　　　　＾ｓｐ　　　　　　　ＤＬ−システィン　　　　 　　　　Ｃｙｓ　　　　　　　ＣＬ−グルタミン　　　　　　　　Ｇｌｎ　　　 　　　　　ＱＬ−グルタミン酸　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　　　　ＥＬ−ヒ スチジン　　　　　　　　Ｈｉｓ　　　　　　　ＨＬ−インロイシン　　　　　 　　Ｉｌｅ　　　　　　　ＩＬ−メチオニン　　　　　　　　Ｍｅｔ　　　　　 　　ＭＬ−フェニルアラニン　　　　　Ｐｈｅ　　　　　　　ＦＬ−プロリン　 　　　　　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　　　ＰＬ−セリン　　　　　　　　　　 　Ｓｅｒ　　　　　　　　ＳＬ−スレオニン　　　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　 　　ＴＬ−）リプトファン　　　　　　Ｔｒｐ　　　　　　　ＭＬ−チロシン　 　　　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　　ＹＬ−バリン　　　　　　　　　　　Ｖ ａｌ　　　　　　　　Ｖここに現れる多様な核酸配列を構成するヌクレオチドは 、本分野で通常用いられている１文字略号（＾、Ｇ、Ｔ、Ｃ，またはＵ）を有す る。 ここで用いる場合、ｂｐとは塩基対を、ｋｂはキロ塩基対を意味する。 本明細書および請求の範囲において、ギリシャ文字アルファ（α）、ベータ（β ）などは、しばしばａ、ｂなどと示される。 ■ プラスミドｐＲＳｈＧＲ（ｈＧＲ）、　ｐＲｓｈＭＲ（ｈＭＲ）、　ｐｅ＾１０ １　（ｈＴ、β）およびＧＭＣＡＴは、すべて大腸菌１８１０１株に入っており 、また、ｒｅｂ＾１２　（ｒＴＲα）、　ｐＥ４およびｐｈＫ＾（ともにｈＥＲ Ｒｌをコードする）、ｐｈ［３（ｈＥＲＲ２）、　ｐｈｅｒｂ−Ａ　８．７　（ ｈＴＲａ）、　ｐｈＦ＾８　（ｈＴＲａの部分的クローン）、およびプラスミド ｐｈＲＡＲ１は、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（＾ＴＣＣ）に、特許技術目的の微生物寄託の国際認識に関 するプダベスト条約および本条約の下に公布されている条例に基づいて寄託され ている。 該条約および条例、もしくは米国および本出願または本出願の優先権を請求する 出願が提出されるか、このような出願が認められるいかなる特許も認められるそ のほかの国や国際組織の特許法および条例にしたがって、プラスミド試料は法的 に受は取る資格がある産業所有権局などの者が入手することができる。 ＾ＴＣＣ寄託番号および寄託年月日を以下に示す：ｐＲｓｈｃＲ（ｈＧＲ）　　 　　　　６７２００　　　　１９Ｂ６．９．９ｐＲｓｈＭＲ（ｈＭＲ）　　　　 　　６７２０１　　　　１９８６．９．９ｐＥ４　（ｈＥＲＲ１＊）　　　　　 　６７３０９　　　　１９８７．１．３０ｐｈＨＫ＾　（ｈＥＲＲｌ車）　　　 　　　　　　　６７３１０　　　　　　　　１９８７．１．３０ｐｈＨ３（ｈＥ ＲＲ２）　　　　　　４０３７３　　　　１９８７．９．２９ＧＨＣＡＴ　（レ ポーター）　　　６７２８２　　　　１９８６．１２．１８ｐｈｅｒｂ−八８． ７　（ｈＴＲａ）　　　４０３７４　　　　１９８７．９．２７ｐｈＦ八　８　 　（ｈＴＲａ車）　　　　　　　　　　４０３７２　　　　　　　　１９８７． ９．２７ｐｅ＾１０１　（ｈＴＲｂ）　　　　　　６７２４４　　　　１９８６ ．１０．２２ｐｒｂｅ＾１２　（ｒＴＲａ）　　　　　６７２８１　　　　１９ ８６．１２．１８ｐｈＲＡＲａ　（ｈＲＡＲａ）　　　　　４０３９２　　　　 １９Ｂ７．１１．２０（＊は部分的クローンを意味する） （ｐＥＡ　＆　ｐｈＨＫ八はともに完全なｈＥＲＲｌをコードする）丸肌座員Ｉ 一つの局面においては、本発明は、ここではヒトレチノイン酸受容体タンパク質 と呼ぶレチノイド受容体タンパク質に特徴的なリガンド結合能およびＤＮ八へ合 能（または転写活性化能）を有するタンパク質の一次配列をコードするトリプレ ットの配列、断片のプラス鎖またはセンス鎖が含んでいるような二本ＭＤＮＡを 含むものである。本発明のこの局面によれば、二本鎖ＤＮＡ断片は、レチノイン 酸受容体タンパク質を発現できるものである。 別の局面においては、本発明は、レチノイン酸受容体タンパク質をコードする二 本鎖ＤＮ＾のセンス鎖である一本鎖ＤＮＡ、およびこの二本鎖ＤＮへの転写によ って産生されるＲＮＡを含むものである。 別の局面においては、本発明は、本発明のレチノイン酸受容体タンパク質（ＲＡ Ｒα）をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐｈＲＡＲ１を含む。このプラスミ ドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに特許目的のために寄託さ れている；これは＾ＴＣＣＮｏ、　４０３９２として登録されている。 さらに別の局面においては、本発明はレチノイン酸受容体タンパク質をコードす るＤＮＡでトランスフオームした細胞、望ましくは哺乳動物細胞を含む０本発明 の本局面によれば、トランスフオームするＤＮＡは細胞内で発現されることが可 能であり、それによってこのＤＮＡにコードされているレチノイン酸受容体の細 胞内の量を増加させる。 本発明はさらに、レチノイン酸受容体をコードするＤＮＡの発現によって産生ま たはこのようなレチノイン酸受容体をコードするＤＮＡから転写されたｍＲＮ＾ の翻訳によって゛産生された新しいレチノイン酸受容体を含む。本発明の本局面 によれば、レチノイン酸受容体は、“修飾されていない”レチノイン酸受容体を コードするＤＮＡおよび−ＲＮ＾のタンパク質産物である、が、受容体ＤＮＡ配 列中に導入された変異の結果として、対応する天然の“野生型”レチノイン酸受 容体タンパク質とひとつ以上のアミノ酸配列中の違いを有するものである、修飾 された、あるいは遺伝子操作されたレチノイン酸受容体タンパク質産物である。 これらのレチノイン酸受容体は、“修飾されていない”が“操作されている”か にかかわらず、対応する天然レチノイン酸受容体の少なくとも約５％のレチノイ ン酸結合活性および／または少なくとも約５％のＤＮＡ結合または転写活性化活 性を有することが望ましい。 本発明はさらに、別の型の機能的領域を持つひとつの受容体の機能的領域を交換 することによって作成されたキメラ受容体を含む。このように産生されたキメラ ＤＮ＾はそれらのそれぞれＤＮＡ結合領域およびリガンド結合領域の“元”に基 づく機能的特性を有するキメラ受容体タンパク質をコードする。本発明のキメラ 受容体は、キメラ受容体をコードする二本ＭＤＮＡ、および二本ｌ；ＩＤＮ＾の センス鎖である一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖ＤＮへの転写によって産生されたー ＲＮ八を含む。本発明はまた、本発明のキメラ受容体をコードするＤＮＡで形質 転換された細胞、真核細胞および原核細胞を含む、を含むものである。 本発明のキメラ受容体の局面によれば、キメラＤＮＡ融合を行うために、３つの 機能的領域に受容体ＤＮ＾を分けるために、ＤＮＡ結合領域の中または近傍の各 受容体ｃＤＮへの相同な位置に二つの制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。 （例えば、単一の四部値をＤＮＡ結合領域の直前に導入し、単一の狭斜部位をＤ ＮＡ結合領域の直後に導入することができる。これにより受容体は３つの機能的 領域すなわち゛″カセツトに分けられる；　（１）　Ｎ末端カセット、（２）　 ［ｌＮΔ結合領域カセット、および（３）リガンド結合領域カセントである。ど の受容体由来の３つの領域またはカセットでも別の受容体由来のカセットと結合 させて多様なキメラ受容体を作成することが可能である。本発明のこの局面は、 明細書の゛発明の詳細な説明”と題した部分で例示される。） 本明細書および請求の範囲においては、キメラ受容体（キメラまたはハイブリ・ ・Ｉドとも呼ばれる）は、多様な領域の由来を示す文字によって命名される。ｈ ｃＲ由来の領域は“Ｃ”領域と呼ばれ、ｈＴＲ由来の領域は”Ｔ”領域と呼ばれ 、ｈＥＲＲ由来の領域は“Ｅ”、ｈＲＲ由来の領域は“Ｒ″領域呼ばれる。 例えば、キメラ受容体“ＲＧＲ”はｈＲＲのアミン末端およびカルボキシル末端 を持ち、ｈＧＲのＤＮＡ結合領域を有する；キメラ受容体“ＴＣＧ”はｈＴＲ由 来のアミノ末端、ｈＧＲ由来のＤＮＡ結合領域およびカルボキシル末端を有する 。（第７図に示した図においては、受容体のアミン末端は領域＾／Ｂとして示さ れ、カルボキシル末端は領域Ｅとして示されている。）本明細書および請求の範 囲で用いた命名法によれば、特に述べない限り、“Ｔ”は一般にＴ、Ｒ，または Ｔ、Ｒ，受容体のいずれかを意味する：“Ｅ”はｈＥＲＲｌまたはｈＥＲＲ２を 意味する；また、“Ｒ”はＲＡＲαｔたはＲＡＲβ受容体のいずれがを意味する 。 本発明のキメラ受容体は、（１）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ，、ｈＥＲＲ２，ｒ ＴＲａ、ｈＴ、α、ｈＴ、β、ｈＲＡＲα、およびｈＲＡＲβからなる野生型受 容体群から選択されたＮ末端領域、（２）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ，、ｈＥＲ Ｒ２、ｒＴＲａ、ｈＴ＊　ａ　、ｈＴｙβ、ｈＲＡＲａ、およびｈＲＡＲβから なる野生型受容体群から選択されたＤＮＡ結合領域、（３）ｈＧＲ，ｈＭｌ？。 ｈＥＲＲ＋　、ｈＥＲＲｚ　、ｒＴＲａ　、ｈＴｘ　ａ　、ｈ、Ｔｓβ、ｈＲＡ Ｒａ、およびｈＲＡＲβからなる野生型受容体群から選択されたリガンド結合領 域を有するキメラを含み、それにおいて、どのキメラ受容体も少なくとも２つの 異なる″野生型受容体”源に由来するＮ末端領域、ＤＮＡ結合領域、およびリガ ンド結合領域を有する。 本発明の望ましいキメラ受容体ＤＮ＾としては、ＧＲＲ，ＧＲに。 （：（：Ｒ、ＲＧＧ　、ＲＧＲ、ＲＲｔ、　、ＧＴＴ　、　［：ＴＧ　、　［、 にＴ　、ＴＣ［、、ＴＧＴ　、ＴＴＣ、ＴＴＲ、ＴＲＴ、Ｔq Ｒ，ＲＴＴ、ＲＴＲ，ＲＲＴ、（、ＴＴ、ＧＴに、ＣＣＴ、Ｔｌ；Ｇ、ＴＧＴ、 およびＴＴＧ受容体ＤＮＡが含まれ、およびこのようなキメラ受容体をコードす るＤＮＡから転写されたｍＲＮ＾の翻訳による本発明のキメラＤＮ＾の発現によ って産生されるキメラハイブリッド受容体タンパク質が含まれる。これらのキメ ラ受容体は、与えられた細胞内で外因性のバックグラウンド結合または転写活性 化活性を越える活性を有すること、または、対応する天然の受容体のＤＮＡ結合 領域のＤＮＡ結合活性または転写活性化活性の少なくとも約５ｚを持つことおよ び／または対応する天然のリガンド結合領域の約５πのリガンド結合活性を有す ることが望ましい。 本発明はまた、受容体タンパク質に対する機能的リガンドを同定するための方法 を含む０本方法によれば、受容体タンパク質をコードし、少なくとも機能するリ ガンド結合領域およびＤＮＡ結合領域を有するＤＮＡ配列（ここでは試料配列と 呼ぶ）を同定することができる。（本分野の技術に熟達したものには理解される ように、機能的であるためにはリガンド結合領域のＤＮＡ配列のすべてが必要な わけではない、働き得る配列、すなわち、その領域がリガンドに結合する場合に なければならない配列はその領域の欠失解析によって同定される。）試料ＤＮＡ 配列が単離されると、別の受容体タンパク質、例えば、グルココルチコイド受容 体タンパク質、チロイド受容体タンパク質、ミネラロコルチコイド受容体タンパ ク質、またはレチノイン酸受容体タンパク質などをコードするＤＮＡ配列由来の ＤＮＡ結合領域と試料ＤＮＡ配列中のＤＮＡ結合領域とを置換することによって キメラ遺伝子を作成することができる。次に、適当な受容体欠損宿主細胞を、（ １）発現プラスミドに載っていることが望ましい、キメラ受容体遺伝子、および （２）ｑ汀遺伝子やホタルのルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子であ って、これもプラスミドに載っていることが望ましく　、Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　１ ８０，４７１においてレポータープラスミドと呼ばれているものである。どの場 合においても、レポーター遺伝子は機能的に働き得るホルモン反応性要素（ＯＲ Ｅ）　（野生型または操作したもの）に連結しており、それにおいてはホルモン 反応性要素はキメラ受容体遺伝子の作成に使用するＤＮＡ結合領域によって活性 化され得るものである。（例えば、キメラ受容体遺伝子がグルココルチコイド受 容体をコードするＤＮＡ由来のＤＮＡ結合領域を含む場合、ＩＩＲＥは野生型、 または合成ＧＲＥ　、すなわちグルココルチコイド受容体タンパク質のＤＮＡ結 合領域の機能的部分によって活性化されるものである。チロイド受容体ＤＮＡ結 合領域を用いる場合には、野生型あるいは操作されたＨＲＥはチロイド（または レチノイン酸）受容体タンパク質などに反応性であるべきである。）次に、トラ ンスフェクトされた細胞を、キメラ遺伝子によってコードされているキメラタン パク質のリガンド結合領域と結合できる可能性のあるリガンド候補群で試してみ る。これらのうち、どのリガンドと機能的にキメラ受容体遺伝子を複合体を形成 するかを決定するために、受容体遺伝子の誘導を、レポーター遺伝子によってコ ードされるタンパク質のレベルを追跡する。（例えば、ルシフェラーゼがレポー ター遺伝子である場合には、ルシフェラーゼの産生はレポーター制御による遺伝 子転写を示唆する。）最後に、レポーター遺伝子の転写を誘導できるリガンドが 見つかった際には、このリガンドが最初の試料ＤＮＡによってコードされている 受容体タンパク質に結合すると結論づけられる。この結論は、レポーター遺伝子 の発現を誘導するリガンドと対応させて、最初の試料ＤＮＡ配列にコードされて いる受容体タンパク質の結合能を試験することによって、さらに証明することが できる。 本分野の技術に熟達したものが理解するように、細胞が既に、（ａ）　（１）第 一の受容体配列（すなわち第一の配列）のＤＮＡ結合領域の機能領域が、（２） 第二の受容体配列（すなわち第二の配列）のリガンド結合領域の機能領域と連結 されているものからなるキメラ配列（Ｃ）、および（ｂ）レポーター核酸配列が 機能的に働き得るホルモン反応性要素と連結しており、それにおいて第一の受容 体配列のＤＮＡ結合領域の機能領域がレポーター配列に機能的に連結されを含ん でいる場合には、受容体タンパク質の機能的リガンドを同定するための方法は、 少なくとも一つの候補リガンドで細胞を処理し、レポーター配列の発現産物の量 における変化によってレポーター配列の誘導を追跡することからなる。 新しい機能的リガンド同定アッセイにより、多数の潜在的なリガンドまたはいか なる与えられた受容体も、受容体が野生型であるかキメラであるかどうかにかか わらず、スクリーニングすることが可能になる。 機能的リガンド同定法は、ここでは（１）レチノイド、レチノイン酸、およびそ の代謝前駆体、レチノールがｐｈＲＡＲ１ＤＮ八によってコードされる受容体の 機能的リガンドであること、および、（２）ＤＮＡ結合領域およびリガンド結合 領域がキメラ受容体の機能特性を決定すること、を示すことにより例示される。 新しい機能アッセイ、および新しいレチノイン酸受容体、および新しいキメラ受 容体について、以下でさらに詳細に述べる。 １哩些１亙１１ｊ し　ツイン　　０ ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーを研究する努力が続けられている なかで、ステロイドホルモン受容体のＤＮＡ結合領域に関する原著な相同性を持 つ新しいゲノム配列を偶発的に同定することが利用されてきた（デジーン（Ｄｅ ｊｅａｎ）他、１９８６参照）、この配列は、ヒト肝臓細胞ガン由来のＢ型肝炎 ウィルス（ＨＢＶ）の内在化配列にまでわたる。 この遺伝子がこれまでに知られていなかった受容体をコードするという仮説を追 及するために、この配列由来のオリゴヌクレオチドを標識し、多数のヒトｃＤＮ ＾ライブラリーのプローブとして用いた。５つのポジティブなりローンが最初に 精巣ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーから単離された。 これらのクローンの一つの挿入断片＜１ｈＴＩＲ）を用いて、λｇｔｌｏ腎臓ｅ ＤＮ＾ライブラリーからさらなるｃＤＮ＾ＤＮＡンを単離した。最大のクローン （ｐｈＲＡＲｌ）の制限酵素地図を第１八図に示す。第１Ｂ−１図に示すように 、ヌクレオチド配列解析により、ヌクレオチド１０３−１０５に対応する仮定的 な開始メチオニンコドンから始まる４６２アミノ酸の長いオープン・リーディン グ・フし・−ムが見いだされた。この＾ＴＧ周辺の配列は、翻訳開始部位に関す るコザック（Ｋｏｚａｋ）　（１９８７）によって示されたコンセンサス配列と 一致する。ＡＴＣの上流は、インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のターミネータ −であり、開始メチオニンであることを支持する。３０コドン下流に見られる別 のＡＴＣはコンセンサスには適合せず、イニシエーターではなさそうである。１ ４８９−１４９１のターミネータ−コドンに続いて、ポリアデニル化領域の２０ ヌクレオチド上流にポリアデニル化シグナルのコンセンサス配列（＾＾Ｔ＾＾Ａ ）（ブラウトフット（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ）他、１９７６参照）を持っ３゛−非 翻訳領域が存在する。 相対分子量５０，７７２ｃｌ（５１ｋｄ）のポリペプチドが、翻訳されるオーブ ン′・リーディング・フレーム内にコードされている。ｐｈＲＡＲｌの挿入断片 にコードされているタンパク質の大きさは、この断片由来のＲＮＡのｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ翻訳（クリーブ（Ｋｒｉｅｇ）他、（１９８４）り照）によって確認され 、５４ｋｄの推定分子量に対応することが見いだされたくデータは示さない）。 このタンパク質のアミノ酸配列を、グルココルチコイドおよびチロイドホルモン 受容体と比較した。もっとも高い相同性は、残基８８から始まる６６アミノ酸の システィンが豊富な配列に見いだされた。われわれのグループはすでに、ｈｃＲ のこの領域がこの受容体のＤＮＡ結合領域であることを示している。ギグレ（Ｇ ｉｇｕｅｒｅ）他、（１９８７）およびホレンバーグ他、（１９８７）参照。さ らに、ミュータジェネシスおよび発現実験により、グルココルチコイド反応性要 素（ＧＲＥ）を有する遺伝子の転写活性化の役割を果たしている直接の証拠と示 しな。ギグレ他、（１９８７）およびホレンバーグ他、（１９８７）参照。 Δ基３コニナング　−　パ ｐｈＲＡＲｌの遺伝子産物に対するリガンドが知られていないので、リガンドを 同定するための迅速で感度のよいアッセイを開発することが望まれた。これまで の研究からヒトグルココルチコイドおよびエストロゲン受容体のＤＮＡ結合領域 は交換可能であり、機能するハイブリッド受容体が得られることが示されている 。このキメラはＭＭＴＶ−ＬＴＲのグルココルチコイド反応性要素を認識するが 、エストロゲンに依存して転写を刺激する（グリーン他、（１９８７）参照）、 このことにより、新し５いホルモン受容体のリガンド結合能の同定に一般的な領 域交換ストラテジーを利用できるのではないかと我々は考えた。このアプローチ を確かめるために、まずｐｈＲＡＲｌのＤＮＡ結合領域をよく研究され。 ているｈＧＲ由来のＤＮＡ結合領域と置換した（第２Ａ図）、（このキメラ構造 は、適当な宿主細胞内で発現されると、そのリガンド結合領域が、リガンド／受 容体複合体がＧＲＥに結合する前に機能的な外来のリガンドと結合するようなハ イブリッド受容体タンパク質を産生じ、それによってグルココルチコイド誘導性 プロモーターを活性化する。）機能的リガンドの存在をアッセイするために、キ メラ受容体遺伝子を適当なＧＲＥ連結レポーター遺伝子とともに、適当な宿主細 胞にトランスフェクトした。ＣＶ−１＃ｉｌ胞をアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクションに特許目的のために寄託されている；本明細書の゛寄託”の項 参照。 本分野の技術に熟達したものには理解されるように、ハイブリッドチロイド受容 体タンパク質、すなわちチロイド受容体タンパク質のＤＮＡ結合領域を有するハ イブリッドタンパク質をアッセイするための適当なレポータープラスミドは、プ ラスミドにＭ−ＣＡＴ上のＧＲＥをチロイドホルモン反応性転写要素と置換する ことによって構築することができる。たとえば、成長ホルモンプロモーターは最 近の里遺伝子に機能的に連結することができる。成長ホルモンプロモーターはチ ロイド反応性転写要素を含んでいるので、このようなプラスミドはハイブリッド チロイド受容体タンパク質のアッセイに用いることができる。 本明細書中の小見出し“レポーターおよび発現プラスミドの構築”の項参照、（ ミネラロコルチコイド受容体はＣＲＥを活性化できるので、（、Ｍ−ＣＡＴなど のレポータープラスミドをハイブリッドミネラロコルチコイド受容体タンパク質 のアッセイに使用することができる。）機能的リガンド同定アッセイに戻ると、 トランスフェクトした細胞をつぎに、一群のりガント候補で体系的に処理し、人 情性の変化によって誘導を追跡した。 そのホルモン様活性のため、レチノール（ビタミン八）およびレチノイン酸を含 むレチノイドは、潜在的なインデューサーとして評価されていた。注目すべきな のは、レチノイン酸はハイブリッド受容体の天の劇的な増加を引き起こしたく第 ２Ｂ図）。親のベクターｐＲ５ｈＲＲ＊ｘ、またはここではヒトレチノイン酸受 容体（ｈＲＡＲａ）と呼ぶｐｈＲＡＲ１由来の野生型遺伝子産物を用いた場合に は工活性には何も影響がないことを我々は示した。期待されたように、ハイブリ ッド受容体はグルココルチコイドでは誘導されず、ｈＣＲはレチノイン酸によっ ては誘導されない。 第３Δ図に示すように、レチノイン酸はハイブリッド受容体によって誘導された ア活性に関して、８−１０−１°ＭのＥ［１ｓｏ値を示し、これは多様な生物学 的アッセイにおけるレチノイン酸に対して観測されたＥＤ５゜値と一致するもの である（スポーク（Ｓｐｏｒｎ）とロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）　１９８４参照 ）。 レチノールは１１００ｎ以上のＥｅｌ、、値で弱いアゴニストとして機能する。 レチニル酢酸およびレチニルパルミチン酸は弱いインデューサーとしてさえ８１ 能する。テストステロン、ジヒドロテストステロン、エストロゲン、デキサメタ シン、コルチゾール、アルドステロン、プロゲステロン、Ｔ、　、Ｔ４、ビタミ ンＤ２、および２５−０Ｈ−コレステロールを含む多数の天然および合成リガン ドは人活性を誘導することができなかった。 ｐｈＲＡＲ１遺伝子産物がレチノイン酸受容体であることを確認するために、発 現産物の結合特性を以下のＣＯ５−１細胞のトランスフェクションによって評価 した。第３Ｂ図に示したように、トランスフェクションした細胞はｓＨ−レチノ イン酸に特異的に結合する能力が増大していることが示された。この増加は、細 胞性レチノイド結合タンパク質の存在および、ま著な非特異的結合の結果と考え られる内在性のバックグラウンドを超えておこっている。活性化の研究と一致し て、結合はレチノイン酸によって完全に競合されるが、レチノールによっては部 分的にしか競合されない。チロイドホルモン、デキサメタシン、およびビタミン Ｄ３は、レチノイン酸の結合と競合しなかった。 テ　ファミ瞥− 新しいレチノイン酸遺伝子が特異的なものであるかどうかを決定するために、ま た潜在的に関連した遺伝子を同定するために、ヒトＤＮＡをサザンプロット分析 で調べた。 制限酵素で切断したヒトＤＮＡをｈＲＲ遺伝子のコード領域由来の標識したＩＩ Ｎ＾断片とハイブリダイゼーションさせた結果、単一のハイブリダイズする遺伝 子座位とすべての切断で一致する３本のバンドが見られた（第４八図）。このハ イブリダイゼーションパターンはデジーン他（１９８６）がＨＢＶ前挿入部位に 関して記載した制限酵素地図とは関連がないものである。しかし、ハイブリダイ ゼーション条件を緩くすると、各酵素消化産物でさらに６本のバンドが見いださ れた（第４Ｂ図）、これらの観察により、ヒトゲノム中に少なくともさらに１カ 所、あるいはそれ以上レチノイン酸受容体に関連する座位が存在することが示唆 された。現在ＲＡＲβが発見された。ブランド（Ｂｒａｎｄ）他、（１９８８） 参照。 ｈＲＲ−Ｏ１ル レチノイン酸は多数の異なる細胞型に影響を与えることが知られているので、我 々はｈＲＲ遺伝子の発現を調べた。 多様なラットおよびヒト組織から単離された全細胞質ＲＮ八へサイズで分離し、 ニトロセルロースフィルターに転移させた。ｐｈＲＡＲ１由来の６００ｂｐ制限 断片とのハイブリダイゼーションにより、海馬、副腎、小脳、視床下部、および 精巣で最も高レベルに、３，２００ヌクレオチドの主要なＲＮＡが見られた（第 ５図）。長い感光により、肝臓などのいくつかの組織では検出されなかったが、 はとんどの組織で少量の３゜２ｋｂ転写産物が見られた。 レ　ツイン　−〇　−一タ　・ ここで示したデータは、ｐｈＲＡＲｌの遺伝子産物を３つの基準に基づいてヒト レチノイン酸受容体として同定するものである。第１に、ｈＲＲのステロイドお よびチロイドホルモン受容体に対する全体的な構造上の相同性（第６図）は、ｈ ＲＲがリガンド反応性調節タンパク質であることを示唆している。第２に、ｈｃ ＲのＤＮＡ結合領域とｈＲＲの予想されるリガンド結合領域からなる、発現され たキメラ受容体は、レチノイン酸の存在する場合にのみ、グルココルチコイド誘 導性レポーター遺伝子の転写制御因子として働く、この誘導は生理学的レベルで 起こる。第３に、トランスフェクトされた細胞中のｈＲＲの候補の発現が選択的 に、これらの細胞がレチノイン酸に結合する能力を増大させる。 丸支上左之Ｌ レチノイドは、広範な系においてい発生と分化に難解な効果を表わす、レチノイ ン酸、レチノール（ビタミンＡ）および一連の天然ならびに合成誘導体からなる 化合物のグループからなるものである。スポーン（５ｐｏｒｎ　）とロバーツ（ Ｒｏｂｅｒｔｓ）　、　　（１９８３）　；マンデル（Ｍａｎｄｅｌ　＞とコー エン（Ｃｏｈｅｎ）　、　　（１９８５）　；つオフレバツク（１’１ｏｌｂａ ｃｋ）とホウ（Ｈｏｍｅ）　、　　（１９２５）　；ロタン（Ｌｏｔａｎ）　、 　　（１９８０）　：フックス（Ｆｕｅｈｓ　）とグリーン（Ｇｒｅｅｎ）　、 　　（１９８０）を参照のこと、初期の研究が上皮の成長および分化に対するレ チノイドの効果に焦点を当てたにもかかわらず、それらの作用がはじめに考えら れていたよりもさらに広範にわたるものであることが示された。最近の多くの研 究により、神経芽細胞腫（ハウスレー（Ｈａｕｓｌｅｒ）ら、　　（１９８３） を参照）、黒色ＩＩＩ（ロタンら、　　（１９８３）を参照）および線維芽細［ １（シュローダ−（５ｈｒｏｄｅｒ　）ら。 （１９８２）を参照）を含む種々の培養細胞系列に対するこれらの分子の効果が 示されている。ヒト前骨芽細胞性白面細胞（ＨＬ−６０）において、し千ツイン 酸は、側内肝葉の分化および後期マウス胚盤胞の特徴を誘導する（ストリックラ ンド（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ）とマーダビ（Ｍａｈｄａｖｉ　）　。 （１９７８）　；ジェッテン（Ｊｅｔｔｅｎ　）ら、　　（１９７９）　；ワン プ（Ｈａｎｇ　）ら、　　（１９８５）を参照）。レチノイン酸は発生において 同様に強力な効果を示すことが明らかにされている０例えば、レチノイン酸は、 発生途上のニワトリの肢芽において前後軸が確立する際に、極性領域の作用を代 用できるのである（テイツクル（Ｔｉｅｋｌｅ）とアイヒール（Ｅｉｅｈｅｌｅ ）　、　　（１９８５）を参照）。レチノイン酸の投与を調節することにより、 新奇なパターンをもつ肢構造を作ることが可能である。レチノイン酸は、主には モルフオゲン（ｓｏｒｐｈｏｇｅｎ　）であると考えられるにもかかわらず。 ノザンプロット分析によって、成体におけるその機能についての再評価が示唆さ れている。ヒトにおいて、レチノールの欠損は種々のガンの驚くべき増加と関連 している（ムーン（Ｍｏｏｎ　）とイトリ（、Ｉｔｒｉ）　、　（１９８４）を 参照）。 レチノイドは、動物において腫瘍の成長を阻害し、釦ｙｉｔｒｏでの腫瘍促進因 子の作用を妨害することも示されている。これと関連して、ｈＲＲは、ガン化の 負の制御因子であると考えられる。 −のスーパーファミリー ２つの驚くべき結果がここに示した研究から明らかとなった。まず第一は、レチ ノイン酸受容体関連遺伝子ファミリーの発見であり、これは、密接に関連した性 質をもつ複数のタンパク質の存在を予言するものである（例えば、ブランド（Ｂ ｒａｎｄ　）ら、　　（１９８８）により記述されたＲ＾Ｒβ）、生理学的研究 から、レチノイン酸はレチノール（ビタミンＡ）と同様に、細胞の分化に強力な 効果を発揮し、これらの効果はしばしば関連しないものであることが示されてい る。したがって、少なくともひとつの関連遺伝子産物が、特異的なレチノール受 容体あるいはレチノイドファミリーのもうひとつのメンバーに対する受容体であ るということがありそうである。これらの結果から得られる第二の驚くべき観察 は、レチノイド受容体とチロイドホルモン受容体との密接な類縁関係である。 （われわれが以下に示すように、レチノイン酸受容体はチロイド応答エレメント またはＴＲＥを活性化できる；「レチノイン酸とチロイドホルモンは共通の応答 エレメントを介して遺伝子発現を誘導する」と分類された明細書の節を参照のこ と。）この関係は、チロイドホルモンとレチノイドの構造的相違性から、ある程 度驚きである。チロイドホルモンは２つのチロシン分子の縮合から生ずる一方、 レチノイドは、メバロン酸から誘導される。化学的に異なる分子が共通の構造を もつ受容体と相互作用するという観察はもっばら、それらがその個々の調節効果 を引き出すところの作用様式の共通性を反映しているように見える。この頚椎に 基づいて、細胞内受容体とレチノイドの相互作用が、ホルモン／受容体複合体に よる特定の遺伝子群の活性化を引き起こす調節カスケードを誘導するという考え を現在われわれは提出している。動物　。 は、その発生と生理状態を調節するために種々の方法をとっているが、レチノイ ン酸受容体がステロイド受容体スーパーファミリーの一部であるという証拠は、 形態形成および恒常性をつかさどる機構がはじめに考えられていたよりもさらに 一般的であることを示唆している。 メラＰＬ０　の　　と、　　・番 キメラ受容体遺伝子の構築は、上述の「定義」、「発明の要約」および「ドメイ ンの切り替えおよび転写活性化」に分類される明細書の項目で論議されている。 それに続く項目において、キメラ受容体の構築と特徴付けは、（：Ｒ／ＴＲハイ ブリッドの構築と特徴付けを示すことにより説明される。 彬且ｉ去遣 ４　Ｐ　とトランスフェクト　ン Ｃシー１細胞は、キメラＲＲ／ＴＲ受容体を持つ発現プラスミドおよび、ＣＡＴ レポーター遺伝子を持つレポータープラスミドでトランスフェクトする受容体欠 損宿主細胞として用いられた。ＣＬＩ　（アフリカミドリザルの腎臓）細胞の生 育およびトランスフェクションの条件は、リン酸カルシウム沈澱を細胞の上に４ −８時間おき、このとき、培地を５％のＴ、フリーのウシ血清（スカンチボディ ーズ）なし、あるいは１０−’ＭのＴ３（シグマ）を含んだＤＭＥＭにかえるこ とを除いては、以前に述べられたもの（ギギュア−（Ｇｉｇｕｅｒｅ）ら、　　 （１９８６）　）と同様だった。■、の添加３６時間後に細胞を集め、ゴーマン （Ｃｏｒｍａｎ　）ら、　　（１９８２）によって述べられているようにしてＣ ＡＴアッセイを行っ２　　た０代表的なものは、５ｕｇのレポーターと１ａｔｓ の発現ベクターをコトランスフェクションし、これとともに２．５゜ｇのＲＳＶ −βＨａｌをトランスフェクション効率の対照として用いるものである。アッセ イ化および非アセチル化型のＥ　１４ｃコクロラムフエニコールを薄層クロマト グラフィーにより分離し、切り出し、５％ＤＭＳＯを含むエコノフルアー（デュ ポン社）中で液体シンチレーションカウンターを用いてカウントを測定すること により定量した。 β−ガラクトシダーゼのア・ンセイはハーボメｌしく　Ｈｅｒｂｏｍｅｌ）ら、 　　（１９８４）により記載されたようにして行った。 ＣＡＴ活性は、β−ガラクトシダーゼ活性によって割った転換率により表わされ る。 レボ−−お　び　　ブースミドの ラット成長ホルモン遺伝子の−１６９から−２００に相当する合成オリゴヌクレ オチドを、−１９０／−１８１の位置にＢｉｎｄ■サイトを有するＭＴＶ−ＣＡ Ｔのリンカ−精査型変異体（ビュティ（Ｂｕｅｔｔｉ　）とクーネル（Ｋｕｈｎ ｅｌ　）　、　　（１９８６）　）に組み込んだ。発現ベクターは、ｐｈｅ＾１ ２（ｈＴＲβ、ワインバーガー（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ　）ら、（１９８６）を 参照）およびｒｂｅ＾１２（ｈＴＲ（２、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　）ら 、（１９８７）を参照）の全長のｃＤＮ＾を、ｐＲｓベクター（ギギュアーら、 （１９８６）および（１９８７）　）のＫｐｎ　ＩとＢａｍＨＴサイトの間に挿 入することによりチロイドホルモン受容体に対して構築した。 キメラ声”　の　築 ｈＧＲ，、の構築法は既に記載がある（ギギュアーら、（１９８７）　）　、　 ｈＧＲ，ｘを構築するために、ｐｈｅ＾１２（ｈＴＲβ、ワインバーガー（Ｗｅ ｉｎｂｅ＋６Ｂｅｒ　）ら、（１９８５）と（１９８６）を参照）のｃＤＮ＾Ｄ ＮＡ片をＭ１３ｍｐ１９のＫｐｎ　ｌとＢａｗｌ　Ｉサイトの間にサブクローニ ングし、クンケル（１９８５）の方法により変異を生起させた。Ｎｏｔｌサイト を生ずるために用いたオリゴヌクレオチドは３つのアミノ酸、すなわち＾５ｐ９ ７を＾ｒｇへ、Ｌｙｓ９８をＰｒｏへ、＾５ｐ９９をＰｒｏへと変化させた。 Ｘｈｏ　１サイトを生ずるために用いたオリゴヌクレオチドは２つのアミノ酸、 すなわちＴｈｒ１７１をＬｅｕへ、＾５ｐ１７２をＣ１ｙへと変化させた９次に 変異型受容体ｃＤＮ＾を発現ベクターｐＲＳ（ギギュアーら、＜１９８６）およ び（１９８７）　）に移しな；この複合体は、ＲＳｈＣＲ，ｙとＲＳｈＴＲβ、 ８の間のＫｐｎ　ｌ　−Ｎｏｔ　１．Ｋｐｎ　ｌ　−Ｘｈｏ　ｌおよびＮｏｔ　 Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ制限酵素断片を交換することにより構築された。ＲＳｈＧＲ， 、は、野生型に対し約７５％のＤＮＡ結合活性を有し、ＲＳｈＴＲβ、は野生型 の約６０％のＤＮＡ結合活性を有している。 Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ　　　　”ンドロ　アッセイｃｉｓ／Ｔｒａｎｓ機能リガン ド同定のためのコトランスフェクションアノセイは、グルココルチコイド、およ びチロイドならびにレチノイン酸受容体の間でドメインを交換することにより構 築したキメラ受容体を研究するために用いられた。（当業者には理解されるよう に、ｅｉｓ／ＴｒａｎＳコトランスフェクションアッセイは、野生型あるいは遺 伝的に操作された受容体のあるドメインにおける、機能的な交換によって作製さ れたキメラ受容体を研究するために用いることが可能である。ｃｉｓ／Ｔｒａｎ ｓアッセイにおいて、２種のプラスミドを受容体受容細胞系列にトランスフェク ションする事が好ましい。第一のプラスミドは受容体タシバク質（野生型かある いはキメラまたは遺伝的に操作を加えたもの）を発現するために使われる。 第二のプラスミドは、リガンドあるいはホルモン応答性プロモーターからの転写 をモニターするために用いられる。チロイドホルモン受容体アッセイの場合、発 現プラスミドは、チロイドホルモン受容体をコードするｃＤＮ＾を発現に向かわ せるラウス肉腫ウィルスの長い終末反復配列（ＲＳＶ−ＬＴＲ）カらなル、ｈ（ ：Ｒ，１７）場合、’ｙポーターｙ−ｙスミドは、細菌のタロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を配合したマウス乳腺腫瘍ウィル ス（７）長い終末反復配列（ＭＴＶ−ＬＴＲ）　テある。　ＭＴＲ−ＣＡＴをチ ロイドホルモン応答性レポーターに変換するために、チロイドホルモン応答性エ レメント（ＴＨＥ　）を含むオリゴヌクレオチドをＭＴＶ−ＬＴＲの−１９１の 位置に挿入した。この配列、すなわちラット成長ホルモン（ｒＧＨ）遺伝子の− １６９から−２００は、チロイドホルモン受容体に特異的に結合し異種プロモー ターにＴ、応答性を付与する（グラス（（，１ａｓｓ）ら、（１９８７）　）　 、発現およびレポータープラスミドはＣＶ−１細胞にコトランスフエクションし 、ＣＡＴ活性はＴ３存在、非存在下で測定した。このアッセイにより、αおよび βチロイドホルモン受容体のどちらも、■、存在、非存在下でＭＴＲ−ＣＡＴか らの転写を活性化しないことが示された（データは示さない）、シかし、ＴＨＥ をつけることにより、チロイドホルモン応答性のＭＴＶプロモーターが作られる 。ＣＡＴ活性の誘導は、機能的なαあるいはβチロイドホルモン受容体のコトラ ンスフェクションとＴ、の添加に依存的である。■、存在下でα受容体（ｒＴＲ α）はＣＡＴ活性を約１５倍まで誘導するが、一方β受容体（）ＩＴＲβ）は約 ５倍まで活性を誘導する。 複合チロイドホルモン、／グルココルチコイド受容体は、チロイドおよびグルコ コルチコイドホルモン受容体の機能的性質を比較するために構築された。キメラ 複合受容体の構築を促進するために、Ｎ０１ＩとＸｈｏ　ｌの制限酵素に対する 唯一の切断点をｈＧＲとｈＴＲβのＤＮＡ結合ドメインに隣接して挿入した。こ れらの変異型受容体は、ｈｃＲ，ｙとｈＴＲβ□と呼ばれ、これらの受容体に対 するアミノ末端、ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメインの全ての可能な組 合せにおける複合体を作るために用いることができる。（当業者には理解される ように、共通点を有するプラスミド、例えばｐＲＡＲα□あるいはｐＭＲ−は、 ステロイドホルモン受容体のスーパーファミリーにおける種々の受容体から、全 ての機能ドメインの全ての可能な組合せにおけるキメラ受容体を作るために用い ることが可能である。受容体と種々の機能ドメインの位置は第８図に示されてい る。〉複合体およびその新型の受容体は、Ｔ、あるいは合成グルココルチコイド デキサメタシンの存在、非存在下で、チロイドホルモンおよびグルココルチコイ ド応答性プロモーター両者を用いてアッセイが可能である。 複合チロイド／グルココルチコイド受容体の構造および活性は第９図に示されて いる。受容体は３つの部分に分けられ、複合体はドメインの「起点」を表わす文 字で名付けられており、例えばｒＴ−Ｇ−ＴＪはｈＴＲβのアミノ末端およびカ ルボキシ末端を持ち（Ｔ−、−Ｔ）　、ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメイン（−に−） を持っている。推定上のｈＴＲβのＤＮＡ結合ドメイン（ＴＴに、　ＧＴＴ、　 ＣＴＣ）との複合体は、ＴＲＥ−ＣＡＴからの転写を活性化するが、一方ｈＧＲ の［ＩＮ八へ合ドメイン（ＧＧＴ、　Ｔにに、　ＴＣＴ）との複合体はにＲＥ− ＣＡＴからの転写を活性化した、これはｈＴＲβのこの領域がｈｃＲのＤＮＡ結 合ドメインに類似しており、プロモーターの認識に関与していることを示してい る。ｈＴＲβカルボキシ末端との複合受容体はＴ、により活性化されるが、一方 ｈＣＲのカルボキシ末端との複合受容体はデキサメタシンにより活性化された。 これは、カルボキシ末端がホルモンの結合および活性化の特異性を負っている受 容体の一部であるとする認識と一致するものである。これとあわせて、これらの 複合体の機能的性質は、ｈＴＲβのＤＮＡおよびリガンド結合ドメインの帰属を 支持するものである。 レチノイン　およびチロイドホルモンは丑通の応″”　エレメントを　して　− を；　　している 機能的なレチノイン酸応答性エレメント（ＲＡＲＥ　＞の同定はし千ツイン酸受 容体が遺伝子発現を活性化し、細胞の分化を制御する機構をわれわれが理解する 上で決定的なものである。こうした研究のひとつの障害は、その転写がレチノイ ン酸受容体−ホルモン複合体に直接依存している遺伝子が全く同定されていない ことである。ＲＡＲＥの局在を探るそのほかの手段は、クローン化したｃＤＮ＾ から生産されるレチノイン酸受容体を用いて既知のホルモン応答性プロモーター の誘導性を体系的に調べていくものである。（ｒ　Ｃｉｓ／Ｔｒａｎｓアッセイ 」という見出しで述べたように、この系において、ＯＲＥを含むプロモーターか らの転写活性化は、ＣＶ−１といった受容体欠損細胞においてコトランスフェク ションした発現プラスミドからの機能的な受容体の発現に依存性を示す、）レチ ノイン酸およびチロイドホルモン受容体のＤＮＡ結合ドメインは高い関連性を持 つ（アミノ酸配列において６２％の一致、第６図を参照）ため、レチノイド受容 体がＴＲＥを介して遺伝子発現を活性化する可能性が検討された。 ＴＲＥは、例えばグラスら（１９８７）を参照すると、チロイドホルモン（３， ５，３°−トリヨード−Ｌ−チロニン、Ｔ３）調節に必須な、ラット成長ホルモ ン５′隣接ゲノム配列におけるｃｉｓ−作用エレメントであるという議論により 知られている。 ＴＨＥがＲＡＲＥとして効果的に機能できるかを調べるために、新奇なＴ、応答 性プロモーターを、マウス乳腺肉腫ライスル長終結反復配列（ＭＴＶ−ＬＴＲ） 中に存在するグルココルチコイド応答性エレメントを、天然のＴＲＥ、、をコー ドするオリゴヌクレオチドと置換することにより構築した。次に、このプロモー ターレポータープラスミドΔＭＴＶ−ＴＲＥａ、−ＣＡＴを作製するために、細 菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ　）遺伝子と融 合した。ＣＶ−１６胞Ｉ＼短期間のトランスフェクションを行った後、このプロ モーターの誘導性をＣＡＴ活性を測定することにより決定した。ｃｖ−１ｓ胞を 、ヒトチロイドホルモン受容体β（ｐＲＳｈＴ、Ｒβ）を含む発現ベクターおよ びレポータープラスミドΔＭＴＶ−ＴＲＥｃ、−ＣＡＴでコトランスフエクショ ンした場合、Ｃ＾■活性の誘導はＴ、の存在下で測定する。これとは対照的に、 ヒトグルココルチコイド受容体（ｐＲ５ｈＧＲα）をコードする発現ベクターと 同じレポータープラスミドをコトランスフエクションすると、合成グルココルチ コイドデキサメタシンに応答してこのプロモーターからのＣＲＴ活性を活性化し なかった。これらの結果は、野生型のＭＴＶ−ＬＴＲが応答性でないことがら（ データは示さない）　、ＲＡＲαによるＣＡＴ活性の誘導がＴＨＥによるもので あることを明らかに示している。これらの結果はまた、ｈＲＡＲαがＴＲＥを含 むプロモーターからの遺伝子発現を特異的に誘導できることを示している。 ＲＡＲとＧＲの　メラμ′ 上で議論したように、ステロイドホルモン受容体のモジュラ−構造は、ある受容 体から他の受容体へ機能的ドメインを交換して機能的なキメラ受容体舎作製する ことを可能としている。この戦略は、ＲＡＲのＤＮＡ結合ドメインとＧＲのリガ ンド結合ドメインを持つｈＧＲ／ｈＲＡＲαキメラを作製するために用いられた 。ＣＶ−１＃ｌｌ胞をｈｌ、ＲＧをコードする発現プラスミドとレポーターΔＭ ＴＶ−ＴＲＥ、、１−ＣＡＴでコトランスフエクションすると、デキサメタシン は特異的にＣＡＴ活性を誘導した（データは示さない）。この実験は、ｈＲＡＲ αのＤＮＡ結合ドメインが標的遺伝子の活性化の特異性を決定するという直接的 証拠を与えた。 ｌ民α１星ｌ五泗 第１１２１．　ｐｈＲＡＲｌのＤＮＡおよび主要なアミノ酸配列。Δ、ｐｈＲＡ Ｒ１クローンの模式的な説明と制限酸素地図。点を打ったボックスは推定される 遺伝子の読み枠を示す、旦、（Ｂ−１、Ｂ−２，Ｂ−３として示されている）　 ｐｈＲＡＲｌの完全なヌクレオチド配列が長い読み枠の上にアミノ酸配列ととも に示されている、ヌクレオチド８５−８７の上流域にあるインフレームの終止コ ドンおよびポリアデニル化シグナルは下線を施しである。 第１図の方法、デジイン（Ｄｅｊｅａｎ）ら、（１９８６）によって発表されて いるゲノムはう列のヌクレオチド４０８−４７７に相当する６３−ｍｅｒのオリ ゴヌクレオチドは、ヒト精巣λ８ｔ１０ライブラリーを検索するためのハイブリ ダイゼーションプローブとして用いられた。ハイブリダイゼーション混合液は、 ３５πホルムアミド、１×デンハルト、５ｘＳＳＰＥ、０．１ｚドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＯＳ）　、１００μｓ　ｍｌ−’ノ変性すケ精子ＤＮ＾および１０ εｃ、ｐ、ｍ　ｍｌ−’のコ２　ｐ−標識オリゴヌクレオチドを含んでいた。２ 重にしたニトロセルロースフィルターを４２°Ｃで１６時間ハイブリダイゼーシ ョンし、２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ　（１ｘＳＳＣ”　１５０ＩＩＭＮａＣＩ 、　１５ｍＭクエン酸ナトリウム）で２０分間、５５℃で３回洗い、増感紙を用 いて一７０℃でオートラジオグラフにかけた。この検索により得られたクローン １　ｈＴＩＲは、部分的に性質を調べた後、ヒト腎臓ωｇｔｌｏ　ｅＤＮ＾ＤＮ Ａラリーを検索するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いた（ベル （Ｂｅｌｌ）　、（１９８６）を参照）。この検索のために、洗いは６８℃で１ 〉、ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳという条件に変えた。 いくつかのｃＤＮ＾ＤＮＡンが単離され、そのうち最も長いクローンであるｐｈ ＲＡＲｌを多種の制限酵素で切断し、得られた断片をＭ１３シーゲンシングベク ターｍｐ１８ならびに＋ｍｐ１９に、両向きにサブクローニングし、ジデオキシ 法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）ら、＜１９７７）　）で塩基配列を決定した。 ＤＮＡ配列を編集し、デヴエルクス（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　）ら、（１９８４）お よびシュターデン（５ｔａｄｅｎ　）　、　　（１９８２）のプログラムによっ て分析した。 第２図、へ、キメラ受容体ｈＲ（、Ｒの構築。種々の構築のドメイン構造は、模 式的に示されており、番号は各々のドメインのアミノ酸の位置に対応している。 ＤＮＡ結合ドメインはｒＤＮ＾」で表わされており、リガンド結合ドメインは各 々の誘導物質により表わされている。受容体間のＤＮＡ結合ドメインの交換を可 能とするために、部位標的突然変異導入法により作られたＮｏｔ　ＩおよびＸｈ ｏ　Ｉ部位が示されている。且、レチノイン酸によるＣＡＴ活性の誘導。 発現ベクターはレポータープラスミドＭＴＶＣＡＴとともにＣｖ−１細胞にコト ランスフェクションし、１００ｎＨのデキサメタシン（ＤＥＸ　）あるいはレチ ノイン酸（Ｒ八）の存在、非存在下で２日間培養した０発現ベクターに挿入され た受容体は：　ｐＲｓｈＲＧＲではヒトグルココチコイド受容体、　ｐＲＳｈＲ Ｒではヒト・レチノイン酸受容体；　ｐＲｓｈＲＲ，、ではＮｏｔ　１とＸｈｏ 　１部位を有する変異型ヒト・レチノイン酸受容体、　ｐｆｔｓｈＦｔＧＲでは 、ＤＮＡ結合ドメインがヒト・グルココルチコイド受容体のＤＮＡ結合ドメイン によって置換された、ヒト・レチノイン酸受容体キメラ受容体である。 第２図の方法、へ、ｐｈ　Ｒ，Ａ　Ｒと）１［；Ｒ（ホレンバーグ（）Ｉｏｌｌ ｅｎｂｅｒｇ　）ら、　　＜１９８５）を参照）のｅＤＮ＾ＤＮＡ片の制限酸素 断片を、ｍｐ１９ベクターのｋｐｎ　ｌとＢａｗｌ　１部位にサブクローニング し、クンケル（１９８５）の方法にしたがい変異誘起処理した。　ｈＧＲおよび ｈＲＲ内にＮｏｔ　１部位を作製するために用いたオリゴヌクレオチドは各々２ ８と３１ヌクレオチドであるが、一方ｈＣＲとｈＲＲｆ、：　Ｘｈｏ　Ｉを作る ために用いたオリゴヌクレオチドは２４と２３ヌクレオチドであった。 Ｎｏｔ　ｌが生起した結果、ｈ（：Ｒ，、ではｐｒｏ４１　Ｇから＾ｒｇへの変 異が、またｈＲＲ，ｘではｌ１ｅ８４およびＴｙｒ８５がＰｒｏへと変異した。 ＸｈｏＴ部位の導入によりｈｌ；Ｒ，ウアミノ酸配列は変化しないが、ｈＲＲ〜 ではＬｙｓ１５５がＬｅυ残基へ変異した。変異型受容体は次に、発現ベクター ｐＲＳ（ギギュアーら、　　（１９８６）を参照）に移され、ｈＧＲＤＮ＾結合 ドメインを含むｐＲｓｈＧＲｙｘのＮｏｔ　ｌ　／Ｘｈｏ　Ｉ制限酵素断片を、 ｐＲｓｈＲｘｘのＮｏｔ　ＩとＸｈｏ　１部位の間に導入してｐＲＳｈＲＧＲを 生ずる。旦、細胞のトランスフェクションとＣＡＴアッセイ、組換え体ＤＮＡ構 築物（各り５１１ｇ）はリン酸力ルシクム共沈法（ウィグラー（Ｗｉｌｌｅｒ） ら、　　（１９７９）　）によってＣＬＩ細胞に導入された。次に、ｍ胞は誘導 物質の存在、非存在下で、ニュートリドーマ（ベーリンガー・マンハイム社）を 補った無血清培地内で２日間培養した。ＣＶ−１細胞は、次にゴーマンら。 （１９８２）によって記載されたようにしてＣＡＴアッセイのために調製し、２ ５ＩＩｇのタンパク抽出物を用いて３時間行った。レチノールを用いた全ての実 験は、緩光下で行った。 第３図、Δ、レチノイドの投与量に対する応答。ｐＲＳｈＲＣＲおよびｐＭＴＶ ｃＡＴでトランスフェクションしたＣＶ−１細胞に、レチノイドの濃度を上昇さ せるあるいはテストステロン、ジしドロテストステロン、エストロゲン、コルチ ゾル、アルドステロン、プロゲステロン、トリョードチロニン′（Ｔ、）　、チ ロキシン（Ｔ、）　、ジヒドロキシービタミ７０ｓ（ＶＤ＞）オよび２５−０Ｈ −］　Ｌ／　ス−ｊ−ｏ−ルなど（１’）　１　ｕＭｌｃおける単独投与（＊） 処理を行った。ＣＡＴ活性のレベルは、この実験において観察された最大応答に 対するパーセントとしてプロットされた。旦、トランスフェクションしたＣＯ５ −１細胞の細胞質抽出物に対するレチノイン酸の結合、棒は、１０００倍過剰量 の種々の競合物質非存在（黒色の棒）、存在下（白ぬきの棒）で決定された、結 合した３Ｈ−レチノイン酸量を表わしている。値は、４連の測定を平均したもの を示している。競合物質は、レチノインＷ！ｉ（Ｒ＾）、レチノール（Ｒ）、Ｔ ４、デキサメタシフ（ＤＥＸ）およびビタミンＤ３（ＶＤりである。 第３図の方法、Δ、ＣＬＩ細胞のコトランスフェクションとＣＡＴアッセイは第 ２図で述べたようにして行った。 レチノイン酸は最少限のジメチルスルフオキシドに溶解し、エタノールで希釈し た。他の全ての産物はエタノールで希釈し、対照の培養には培地に０．１％の溶 媒（Ｖ／Ｖ　）を与えた。レチノイド処理の投与量一応答の曲線は二連で行った 。旦、準密集状態のｃｏｓ−ｉ細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法（ディーンズ （Ｄｅａｎｓ　）ら、（１９８４）を参照）によりディツシュ当り１０し８の対 照プラスミド（ｐＲＳ　）あるいはＰＲ５ｈＲＲでトランスフェクションした。 細胞を５％の活性炭処理した仔ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に２日問おき、次 にＴＮＥ　（４０ｍＭ　）リス−ＨＣＬ　ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ。 １ｍＭ　ＥＤＴ＾）中で集め、低張緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　ｐｉ（ ７，４，０，１＋Ｍ　ＥＤＴ＾、　５ｍＭジチオスレイトール、　１０ｍＭ　Ｎ ａＭｏＯ４゜１０％グリセロール、　０．５ｍＭフェニルメチルスルフォニル・ フルオライド）中で、ドウンス・ホモジナイゼーションを用いて融解し、細胞質 画分を得るために１００．ＯＯＯｘｇで３０分間遠心した。イキュベーションは 、総量２００μｍ中で、細胞質画分からの１５０ｇｇのタンパク質および２Ｘ１ ０−＠Ｈの２Ｈ−レチノインＰｉ　（ＮＥＮ、５２．５Ｃｉ／ｓｍｏｔｅ）とと も（こ、低張緩衝液中で行った。特異的結合は２　Ｘ　１０−５Ｍの競合物質を 添加することにより測定した１反応は４℃で１６時間行った。結合した３Ｈ−レ チノイン酸はＤＥ−８１フイルターを用いて定量した。反応液をフィルター上に １分間おいた後、洗浄緩衝液（５０輸Ｈトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４，０，１ｍ Ｍ　ＥＤＴ＾、０．１％　トライトンＸ−１００）でリンスした。フィルターを 乾燥させ、液体シンチレーション分光法によりカウントを測定した。 第４図、ヒト・ゲノムＤＮ＾のサザンプロット分析、Δ、ヒト胎盤ＤＮＡを表示 した制限酵素で切断した。切断したＤＮＡを０．８％のアガロースゲル（レーン 当り１０ＩＩＩＢ）で分離し、ニトロセルロースフィルターに転写した（サザン （５ｏｕｔｈｅｒｒ＋）　、　　（１９７５）　）後、プロットは、ｈＲＲのＤ ＮＡ結合ドメインを含むｐｈＲＡＲｌ　（約６００塩基対）由来のＥｃｏＲＩ　 Ｘ　Ｐｖｕ　ｆＪ断片と、高度に厳しい条件（５０％フォルムアミド、５ｘＳＳ ＰＥ、　ｌｘデンハルト、０．１％ＳＤＳ、　１１００ｕ　ｍｌ−’サケ精子Ｄ ＮＡ）下でハイブリダイゼーションした。このフィルターを０．１　ｘ　５ＳＣ １０，１％ＳＤＳ中、６５℃で洗った。λ　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　ＤＮ＾マーカー（ サイズはＫｂで表示）はオートラジオグラムの左にならべである。旦、ゆるい条 件下でのへと同様なプローブを用いたヒト胎盤ＤＮＡの分析。同一の試料を含む 平行なプロットは、３５％のフォルムアミドを用いた以外は、Δと同様にしてハ イブリダイゼーションした。 このフィルターは２　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中、５５℃で洗った。 第５図、ラットおよびヒトの組織におけるレチノイン酸受容体ｍＲＮ＾の、イザ ンプロット分析。 第５図の方法、全ＲＮ＾は、グアニジンチオシアネートを用いて種々の組織から 単離され（チャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、　（１９８０））　−１％ アガロース−フォルムアルデヒドゲルで分離し、ニトロセルロースに転写した後 、第４図で述べられたプローブを用いて、厳しい条件下でハイブリダイゼーショ ンした。全てのレーンにおいて２０．Ｈの全ＲＮ＾が用いられた。リポソームＲ Ｎ＾（２８Ｓと１８３）の移動度はサイズマーカーに対して示されている。ニト ロセルロースフィルターは増悪紙を用い、−７０℃で１週間オートラジオグラフ ィーを行った。 第６図、　ｈＧＲ，ｈＲＲおよびｈＴ、Ｒβ構造の模式的なアミノ酸の比較、ア ミノ酸配列は点線にはさまれる領域におけるアミノ酸の一致の割合とともに、模 式的に並べられている。 第７図は、−最北したステロイド＼チロイド＼レチノイン酸受容体遺伝子を模式 的に図示したものであり、遺伝子の区分を領域Ａ＼Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅとして示して いる。 Ａ＼Ｂの領域の機能は、解明が始まったばかりであり；Ｃ領域は、ＤＮＡ結合ド メインをコードし；Ｄ領域はちょうつがいの領域であり；Ｅ領域はリガンド結合 ドメインである。 第８図は、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーについてア ミノ酸配列を比較した模式図を示している。−次アミノ酸配列は最もアミノ酸の 類似性が高い領域に基づいて並べられており、ｈ（：Ｒ（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ ）ら、　　（１９８５）を参照）に関連した各々の位置に対してアミノ酸の同一 性をパーセントで表示している。 示されているドメインは二　「最大活性」に必要とされるＮＯ３−末端のドメイ ン、　６６−６８アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインコア（ｒＤＮ＾」）；および２ ５０アミノ酸のリガンド結合（あるいはホルモン結合ドメイン）（「ホルモン」 ）である。 各々のドメインの境界にあるアミノ酸の位１が示されている。全ての受容体に対 するアミノ酸の番号は、ｖ−ｅｒｂ−＾およびＥ７５（セグレイブス（Ｓｅｇｒ ａｖｅｒｓ　）　、　１９８８　）を除いてヒト型を示している０機能の帰属は 、グルココルチコイドおよびエストロゲン受容体の性質を調べることにより決定 された６名称は以下の通りである二ＣＲはグルココルチコイド受容体、ＭＲはミ ネラロコルチコイド受容体：ＰＲはプロゲステロン受容体、ＥＲはエストロゲン 受容体；ＥＲＲ１あるいはＥＲＲ２はエストロゲン関連体１または２．ＶＤＲビ タミンＤ、受容体；およびＴ３ＲβとＴ３Ｒαはチロイドホルモン受容体である 。（＋）あるいは（−）とは、特定の性質がクローン化した受容体ＤＮＡの産物 あるいは精製された受容体について示されるかを表わしている。　ＨＲＥはホル モン応答性エレメントである。これは、結合部位が構造的に同定されているか、 またはこれがその促進性が遺伝子転移を行った研究によって示されるかに関連し ている。ＰＲについては、ＤＮＡ結合性は無傷の精製された受容体についてのみ 示されている。’　ｉｎ　ｖｉｔｒｏホルモン結合性」は、その性質がウサギの 網状赤血球溶解物の系（ホレンバーグら、　　（１９８５）　）で翻訳すること により示されるかどうかを示している。「クロモソーム」は、ヒトのクロモソー ムの位置を示している。種は、ｈ、ヒト；ｒ、ラット；ｍ１マウス；Ｃ，ニワト リ；ｄ１ショウジヨウバエである。 第９図、キメラチロイド／グルココルチコイド受容体の構造と活性。 第９図の方法。複合型受容体を構築するために、ｈＧＲとｈＴＲβのＤＮＡ結合 ドメインに隣接して唯一のＮｏｔｌおよびＸｈｏ　１部位が挿入された。複合体 は、受容体ｃＤＮ＾の適当な部分を交換することにより作製された。ｒＤＮ＾」 はＤＮＡ結合ドメインを表わし：　’　Ｔ３／Ｔ４　Ｊおよび「コルチゾル」は それぞれｈＴＲβとｈＧＲのリガンド結合ドメインを示している０箱の上の数字 はアミノ酸残基を表わしている。 複合体はドメインの起点に関連した文字によりつけられている；例えば、ｒＴＧ ＴＪはｈＴＲβのアミノおよびカルボキシ末端、ならびにｈＧＲのＤＮＡ結合ド メインを持っている。 全ての受容体に関し、■、および合成グルココルチコイド・デキサメタシン（ｒ ｄｅＸＪ）の非存在あるいは存在下で、ＴＲＥ−ＭＣＡＴおよびＧＲＥ−ＭＣＡ Ｔにおけるアッセイを行った。示されている全ての組合せは、バックグラウンド 以上に活性化を与えた。 １１叉１ 本明細書は以下の出版物を引用しており、その各々はこの参考文献によって明確 に取り入れられている。 １、＾ｒｒｉｚａ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：２８ ８−２７５　（１９８７）。 ２、　Ｂｅ１ｌ、　Ｇ、１．、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　 Ｒｅｓ、　１４：８４２７−８４４６　（１９８６）。 ３、　Ｂｒｅｉｔｍａｎ、　Ｔ、、　５ｅｌｏｎｉｃｋ、　Ｓ、　＆　Ｃｏｆｆ １ｎｓ、　ＳＪ、。 Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳ＾７７：２９３６−２９ ４０（１９８０）　。 ４、　Ｂｕｅｔｔｉ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｋｕｈｎｅｌ、　Ｂ、、　Ｊ、　Ｍｏ１ ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　１９０＋３７９−３８９　　（１９８Ｂ）。 ５．　　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　　Ｊ、Ｍ、　　Ｐｒｚｙｂｙｌａ、　　＾、Ｆ、 、　　ＭｃＤｏｎａｌｄ、　　Ｒ，Ｊ。 ＆　　ＲｕＬｔｅｒ、　　Ｍ、Ｆ、、　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　１８： ５２９４−５２９９（１９８０）。 ６、　　Ｃｏ１ａｎｔｕｏｎｉ、　　Ｖ、、　　Ｃｏｒｔｅｓｅ、　　Ｒ，、Ｎ ｉ１ｓｓｏｎ、　　Ｍ、。 Ｌｕｎｄｖａｌｌ、　　Ｊ、、　　Ｂａｖｉｋ、　Ｃ，、Ｅｒ１ｋｓｓｏｎ、　 　１１．。 Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　　Ｐ、＾、　　＆　５ｕｎｄｅｌｉｎ、　　Ｊ、、　　Ｂ ｉｏｅｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、　　１３０：４３１−４３９ 　　（１９８５）。 ７、Ｄｅａｎｓ、Ｒ，Ｊ、、ｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　　＾ｃａ ｄ、Ｓｃｉ、。 ｔｌｓ＾　８１：１２９２１２９６　　（１９８４）。 ８、Ｄｅｊｅａｎ、　　＾、、Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ、Ｌ、、（：ｒｚｅｓｃ ｈｉｋ、に、−ＩＩ。 ＆　　Ｔｉｏｌｌａｉｓ、Ｐ、、Ｎａｔｕｒｅ　　３２２ニア０−７２　　（１ ９８６）。 ９、　　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　　Ｊ、、　　Ｒａｅｂｅｒｌｉ、　　Ｐ、　　＆ 　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ、　　Ｏ，。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１２：３８７−３９５　　＜１９８４） 。 １０、Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ、Ｎ、Ｌ、、　　＾ｐｒｉｌｅｔｔｉ、Ｊ、Ｗ、、Ｂ ａｘｔｅｒ、Ｊ、Ｂ、。 ｉｎ　　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌ　　＾ｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　　Ｈｏｒｍｏｎｅ ｓ、Ｃｒ、Ｌｉｔｗａｃｋ。 Ｅｄ、　　Ｖｏｌ、　　７．　　ｐｐ、　　３１１−３９４．　　＾ｃａｄｅｓ ｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　ＮｅｍＹｏｒｋ、＜１９８０）。 １１、Ｅｖｎｎｓ、Ｒ，，５ｃｉｅｎｃｅ　　２４０：８８９−８９５　　（１ ９８８）。 １２、Ｆｕｅｈｓ、Ｅ、＆　　Ｇｒｅｅｎ、Ｈ，、Ｃｅ１ｌ　　２５：６１７− ６２５　　（１９８０）。 １３、Ｇｒｇｕｅｒｅ、Ｖ、、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ｍ、、Ｒｏｓｅｎｆ ｅｌｄ、Ｍ、Ｇ。 ＆　　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｃｅ１ｌ　　４６：６４５−６５２　　（１９８ ６）。 １４、Ｇｉｇｕｅｒｅ、Ｖ、、Ｏｎｇ、Ｅ、Ｓ、、Ｓｅｇｕｉ、Ｐ、、ａｎｄ　 Ｅｖａｎｓ。 Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ　　３３０，６２４−６２９　　（１９８７）１５、Ｇ ｉｇｕｅｒｅ、Ｖ、、Ｙａｎｇ、Ｎ、、Ｓｅｇｕｉ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｅｖａｎｓ 、Ｒ。 Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ　　３３１，９１−　　（１９８８）−１Ｂ、Ｇｌａｓｓ、 Ｃ，に、、Ｆｒａｎｃｏ、Ｒ，、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，。 Ａ！ｂｅｒｔ、Ｖ、Ｒ，、Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、ａｎｄ　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ 、Ｍ、Ｇ、。 Ｎａｔｕｒｅ　　３２９ニア３８−７４１　　（１９８７）。 １７、（：ｌ１ｓｓ、Ｃ，に、、ｌ（ｏｌｌｏｗａｙ、Ｊ、Ｍ、、Ｄｅｖａｒｙ 、ＯＪ、、ａｎｄＲｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｍ、Ｇ、、Ｃｅ１ｌ　　５４：３１３− ３２３　　（１９８Ｂ）。 １８、Ｃｏｒｍａｎ、Ｃ，Ｍ、、Ｍｏｆｆａｔ、Ｌ、Ｆ、＆　　Ｈｏｗｉｒｄ、 Ｂ、Ｈ，、Ｍｏｌ。 Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２：　　１０４４４０５１　　（１９８２）。 １９、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、＆　Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｐ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２５ニア ５−７８（１９８７）。 ２０、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、ｅｔ　　ａ！、、Ｎａｔｕｒｅ　　３２０：１３４− １３９　　（１９８６）。 ２１、Ｈａｕｓｌｅｒ、Ｍ、、５ｉｄｅｌｌ、Ｎ、、Ｋｅｌｌｙ、Ｍ、、Ｄｏｎ ａｌｄｓｏｎ。 Ｃ１，＾ｌｔａ＋ａｎ、　　＾、＆　　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ｍ、、＆Ｍ ａｎＢｅｌｓｄｏｒｆ、　　Ｄ、、　　Ｐｒｏｅ、　　Ｎａｔｌ、　　八ｅａｄ 、　　Ｓｃｉ、、　　ＵＳ＾８０：５５２５−５５２９　　（１９８３）。 ２２、）ｌｏｌｌｅｎｂｅｒＢ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　　３１８：６ ３５−６４１　　（１９８５）。 ２３、　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ｍ、、　Ｇｉｇｕｅｒｅ、　Ｖ、、　Ｓ ｅｇｕｉ、　Ｐ、　＆Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｃｅ１ｌ　　４９：３９　　（１ ９８７）−２４、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　Ｓ、Ｍ、ａｎｄ　　Ｅｖａｎｓ、Ｒ， Ｍ、、ｉｎ　　Ｐｒｅｓｓ。 ２５、ＩｚｕＩＩｏ、Ｓ、ａｎｄ　　Ｍａｈｄａｖｉ、Ｖ、、Ｎａｔｕｒｅ　　 ３３４，５３９−５４２（１９８８）。 ２６、Ｊｅｔｔｅｎ、　　八、、Ｊｅｔｔｅｎ、Ｍ、＆　　Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｍ 、、Ｅｘｐ。 Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｓ、１２４：３８１−３９２　　（１９７９）。 ２７、Ｋｏｅｎｉｇ、ＲＪ、、Ｂｒｅｎｔ、Ｇ、＾、、Ｗｉｒｎｅ、Ｒ，Ｌ、、 Ｌａｒｓｅｎ。 Ｐ、Ｒ，、ａｎｄ　　Ｍｏｏｒｅ、Ｄ、Ｄ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　　＾ｃａ ｄ、Ｓｃｉ、。 ＵＳ＾　８４・５６７０−５６７４　　（１９８７）。 ２８、　　ＫｏｅｎｉＨ，Ｒ，Ｊ、、　　Ｗａｒｎｅ、　　Ｒ，Ｌ、、　　Ｂｒ ｅｎｔ、　　Ｇ、八、、　　Ｈａｒｎｅｙ。 ＪＪ、、Ｌａｒｓｅｎ、Ｐ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｍｏｏｒｅ、Ｄ、Ｄ、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳ＾　８５：５０３１−５０３５　　（１９８８）。 ２９、　　Ｋｏｚａｋ、　　Ｍ、、　　Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｅｉｄ　Ｒｅｓ、　 　１２．　８５７−８７２（１９８４）。 ３０、　　Ｋｏｚａｋ、　　Ｍ、、　　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　 　１６：８１２５−８１４８（１９８７）。 ３１、　Ｋｒｉｅｇ、　　Ｐ、＾、　＆　Ｍｅｌｔｏｎ　Ｄ、＾、、　Ｎｕｃ！ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。 １２ニア０５７−７０７０　　（１９８４）。 ３２、　Ｋｕｍａｒ、　　Ｖ、、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｓ、、　５ｔａｒｋ、　Ｇ、 、　　Ｂｅｒｒｙ、　Ｍ、。 Ｊｉｎ、　　Ｊ、−Ｒ，＆　　Ｃｈａｍｂｏｎ、　　Ｐ、、　　Ｃｅ１ｌ　　５ １：９４１−９５１（１９８７）、３３．　　Ｋｕｎｋｅｌ、　　Ｔ、Ａ、、　 　Ｐｒｏｅ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ　。 Ｓｃｉ、、ＵＳ＾　８２：４８８−４９２　　（１９８５）。 ３４、　　Ｌｏｔａｎ、　　Ｒ，、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　　Ｂｉｐｈｙｓ、　　＾ ｅｔａ　６０５：２３−９１（１９８０）。 ３５、　　Ｌｏｔａｎ、　Ｒ，、５ｔｏｌａｒｓｋｙ、　Ｔ、　　＆　Ｌｏｔａ ｎ、　　Ｄ、、　　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、４３：２８６８−２８７５　　＜１９ ８３）。 ３６、　　Ｍａｎｄｅｌ、　　Ｇ、　＆　Ｃｏｈｅｎ、Ｖ、、　　ｉｎ　Ｔｈｅ 　Ｐｈａｒ＋＊ａｃｏｌｏｇｉｅａｌＢａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ ｅｓ　　（ｅｃｌｓ、　　Ｃｉｌｍａｎ、　　＾、、（＋ｏｏｄ＋ａａｎ。 Ｌ、、　Ｒａ１ｌ、　　Ｔ、、　　Ｍｕｒａｌ、　　Ｆ、）　　１５７３−１５ ９１　　（Ｍａｃｍｉｌｌｉｎ。 ＮｅｖＩ　Ｙｏｒｋ、１９８５）。 ”　　３７．　Ｍａｎｇｅｌｓｃｌｏｒｆ、　Ｄ、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳ＾８０：５５２５−５５２９　　（１９８３）。 ３８、　　Ｍｉｅｓｆｅｌｄ、　　Ｒ，、Ｇｏｄｏｗｓｋｉ、　　Ｐ、Ｊ、、　 　Ｍａｌｅｒ、　　Ｂ、、　　＆Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｋ、Ｒ，、５ｃｉｅｎｃｅ 　２３６：４２３−４２７　　（１９８７）。 ３９、　　Ｍｉｌｌｅｒ、　　Ｊ、、　　ＭｅＬａｃｈｌａｎ、　　＾、、　　 ＆　Ｋｌｕｇ、　　＾、、　ＥＭＢＯＪ。 ４：１６０９　　（１９８５）。 ４０、　　Ｍｏｏｎ、　　Ｒ，Ｃ，＆　　Ｉｔｒｉ、　　Ｌ、Ｍ、、　　ｉｎ　 Ｔｈｅ　Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ（ｅｄｓ。 ＳｐｏｒｎｌＭ、Ｂ、、　　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　　＾、Ｂ、、　　Ｃｏｏｄｍａ ｎ、　　Ｄ、Ｓ、）　　３２７−３７１　　（＾ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、１９８４）。 ４１、　　Ｍｕｎｏｚ、　　＾、、　　Ｚｅｎｋｅ、　　Ｍ、、　　Ｇｅｈｒｉ ｎｇ、　　υ、、　　Ｓａｐ、　　Ｊ、。 Ｂｅｕｇ、Ｈ，。 ａｎｄ　Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍ、　　Ｂ、、　　ＥＭＢＯＪ、　　７．　１５５− １５９　　＜１９８８）。 ４２、　　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、　　Ｎ、Ｊ、　　＆　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、　　 Ｇ、Ｇ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　２６３：２１１−２１４　　（１９７６）。 ４３、　５ａｎ６：ｅｒ、　　Ｆ、、　　Ｎ１ｅｋｌｅｎ、　　Ｓ、　　＆　Ｃ ｏｕｌｓｏｎ、　　＾、Ｒ，，Ｐｒｏｅ。 Ｎａｔｌ、　　＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳ＾　７４：５４６３−５４６７　　（ １９７７）。 ４４、　　Ｓａｐ、　　Ｊ、　　Ｍｕｎｏｚ、　　＾、、　　Ｄａｍｓ、　　Ｋ 、、　　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　　Ｙ、。 Ｃｒｈｙｓｄａｅｌ、Ｊ、、　　　　Ｌｅｕｔｚ、　　八、、Ｂｅｕｇ、Ｈ，＆ Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍ、Ｂ、、Ｎａｔｕｒｅ　　３２４：６３５−６４０　　（１ ９８６）。 ４５、　　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　　Ｆｌ、Ｌ、、　　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　ＴｈｙｒｏｉｄＨｏｒｗ＋ｏｎｅ　Ａｃｔｉｏｎ、　　Ｊ 、Ｈ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ　ａｎｄ　Ｈ，ＦＩ、Ｓａｍｕｅｌｓ、　　Ｅｄ ｓ、　　ｐｐ、　　４１３−　　　４４４　＾ｃａｄｅｍｉｅ　　Ｐｒｅｓｓ。 Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、（１９８３）。 ４６、Ｓｅｇｒａｖｅｓ、Ｗ、、ｔｈｅｓｉｓ、５Ｌａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ。 （１９８８）　。 ４７．５ｈｒｏｄｅｒ、Ｅ、、Ｒａｐａｐｏｒｔ、Ｅ、、Ｋａｂｅｅｎｅｌｌ、 に、＆Ｂｌａｃｋ、Ｐ、Ｈ，，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　　＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、 ＵＳ＾７９：１５４９−１５５２　　（１９８２）。 ４８、　５１ｇ１ｅｒ、　　Ｐ、Ｂ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　３３３：　　２１０ −２１２　　（１９８８）。 ４９．５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ、Ｍ、、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、９８：５０３ −５１７（１９７５）。 ５０．５ｐｏｒｎ、Ｍ、　　＆　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　　＾、Ｂ、、Ｃａｎｃｅｒ 　　Ｒｅｓ、４３：３０３４５１、　　ＳｐｏｒｎｌＭ、Ｂ、　　＆　Ｒｏｂｅ ｒｔｓ、　　＾、Ｂ、、　　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ。 ｖｏｌ、　　１　　（ｅｄｓ、　　５ｐｏｒｎ、　　Ｍ、Ｂ、、　　Ｒｏｂｅｒ ｔｓ、　　＾、Ｂ、。 Ｇｏｏｄ＋ｓａｎ、　　Ｄ、Ｓ、）　　２３５−２７９　　　　　（＾ｃａｄｅ ｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　　ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８４）。 ５２．５ｔｒａｈｌｅ、Ｕ、、Ｋｌｏｃｋ、に、、ａｎｄ　　５ｃｈｕｔｚ、に 、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　　＾ｃａｄ、　　　　Ｓｃｉ、、Ｌ！Ｓ＾　８４ニア８７１−７８ ７５　　（１９８７）５３、　５ｔｒｉｅｋｌａｎｄ、　　Ｓ、　　＆　　Ｍａ ｈｄａｖｉ、　　Ｖ、、　　Ｃｅ１ｌ　　１５：３９３−４０３＜１９７８）　 。 ５４．５ｔａｄｅｎ、Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ　　Ｒｅｓ、１０：２ ９５１４９６１（１９８２）。 ５５、Ｔｏｒａ、Ｌ、、Ｃｒｏｎｅｍｅｙｅｒ、Ｈ，、Ｔｕｒｃｏｔｔｅ、Ｂ、 、Ｇａｕｂ。 Ｍ−Ｐ、、　ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、　Ｐ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３３３：１８ ５−１８８（１９８８）。 ５６、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，、、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｃ，、Ｉｅｂｏ 、Ｒ，＆Ｅｖａｎｓ、　　Ｒ，Ｍ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７：１６１０− １６１４　　（１９８７）。 ５７、　　Ｔｉｃｋｌｅ、　　Ｃ，、Ｌｅｅ、　　Ｊ、　　＆　Ｅｉｃｈｅｌｅ 、　　Ｇ、、　　Ｄｅｖｅｌ、　　Ｂｉｏｌ。 １０９：８２−９５　　（１９８５）。 ５８、Ｉｊｍｅｓｏｎｏ、に、、ＧｉＨｕｅｒｅ、Ｖ、、Ｇｌａｓｓ、Ｃ，、Ｒ ｏｓｅｎｆｅｌｄ。 Ｍ、、＆ Ｅｖａｎｓ、Ｒ，、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：２６２−２６５　　（１９８８）。 ５９、　　Ｈａｎｇ、　　Ｓ、−Ｙ、、　　ＬａＲｏｓａ、　　に、　　＆　Ｇ ｕｄａｓ、　　Ｌ、Ｊ、、　　Ｄｅｖ。 Ｂｉｏｌ、１０７：７５　−８６　　（１９８５）。 ６０、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｎ、、Ｇｒｅｅｎ、Ｓ、、Ｊｉｎ、Ｊ、Ｒ，、ａｎｄ　 Ｃｈａｍｂｏｎ。 Ｐ、、Ｃｅ１ｌ　　５４，１９９−２０７　　（１９８８）。 ６１、　　Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、　　Ｃ，、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、　　Ｓ、 Ｍ、、　　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、　　Ｍ。 ［；、　＆　Ｅｖａｎｓ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１８：６７０−６７ ２　（１９８５）。 ６２、ＷｅｉｎｂｅｒＨｅｒ、Ｃ，、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｃ，Ｃ，、Ｏｎｇ、Ｅ 、Ｓ、。 Ｌｅｂｏ、Ｒ，、Ｇｒｕｏｌ、Ｄ、Ｊ、＆　　Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕ ｒｅ３２４：６４１−６４６　（１９８６）、６３．　Ｗｅｉｎｂｅ＋６；ｅｒ 、仁。 Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　　Ｃ，Ｃ，、Ｏｔ＋ｇ、　　Ｅ、Ｓ、、　　Ｌｅｂｏ、　 　Ｒ，。 Ｇｒｕｏｌ、Ｄ、Ｊ、、Ｅｖａｎｓ、Ｒ，Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２４，６４１ −６４６（１９８６）。 ６４、　　Ｍｉｇｌｅｒ、　　Ｍ、、　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｃｅ１ｌ　　１６ ：７７７−７８５　　（１９７９）。 ６５、Ｎｏ１ｂａｅｋ、Ｓ、Ｂ、＆　Ｈｏｍｅ、Ｐ、Ｒ，、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ 。 ６２　：　７５３−７７７　　（１９２５）。 門　　　　　　　　　　Ｃ・υ　　Ｏ＜　　ψＣ↑ご（内容（こ変更なし） ＦＩＧ、　２Ａ ＦＩＧ、　２Ｂ 浄書（内容に変更なし） モッ７　　　　　　ｐＲ５ｈＲＲ ＦＩＧ、　４ 暢 ０，５− 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、　５ 浄書（内容に変更なＬ） ＦＩＧ、　８−２ 平成　３年字月；３日 特許庁長官　　　植　松　　　敏　　殿１、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４２８４ ２、発明の名称 レチノイン酸レセプターの構成および方法新大手町ビル　２０６区 ５、補１Ｅ命令の日付　　平成　３年　３月１２日　（発送日）６、補正の対象 （＋＞出願人の代表音名を記載した国内書面国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．センスストランドがレチノイン酸受容体タンパク質のリガンド結合および転 写活性化という特徴を有するタンパク質の一次配列をコードするトリプレットの 配列を持つ断片からなり、該２本ストランドＤＮＡ断片が該レチノイン酸受容体 タンパク質に発現可能であるところの、実質的に純粋な２本ストランドのＤＮＡ 。 ２．該断片中のトリプレット配列が第１Ｂ−１図、第１Ｂ−２図および第１Ｂ− ３図に示されるアミノ酸配列と実質的な相同性を有するタンパク質の一次配列を コードするところの、請求の範囲第１項記載の、実質的に純粋な２本ストランド ランドのＤＮＡ。 ３．第１Ｂ−１図、第１Ｂ−２図および第１Ｂ−３図に示されるＤＮＡ配列と実 質的に配列の相同性を有する、実質的に純秤なＤＮＡ配列。 ４．断片中のトリプレットの配列が、ヒト・レチノイン酸受容体タンパク質のリ ガンド結合および転写活性化の特徴を有するタンパク質の一次配列をコードする ところの、請求の範囲第１項による実質的に純粋なＤＮＡ配列。 ５．プラスミドｐｈＲＡＲ１（ＡＴＣＣ第４０３９２号）。 ６．プラスミドｐｈＲＡＲ１（ＡＴＣＣ第４０３９２号）のＤＮＡと実質的に配 列の相同性を有する、実質的に純粋なＤＮＡ配列。 ７．（ａ）翻訳開始コドンと一致した読み枠にあり、かつ該開始コドントリプレ ットの下流にある翻訳終結コドンに対応するひとつのトリプレットおよび、（ｂ 、）最長のタンパク質の読み枠としてレチノイン酸受容体タンパク質の一次配列 をコードするトリプレットの配列を持つ実質的に純粋な断片を持つところの、実 質的に純粋なＤＮＡ断片。 ８．ヒト・レチノイン酸受容体をコードする実質的に純粋なＤＮＡ。 ９．請求の範囲第１項から第８項の全てにおいて請求されているＤＮＡのいずれ とも実質的な配列の相同性を有する、突質的に純粋なＤＮＡ。 １０．請求の範囲第１項から第８項の全てにおいて請求されているＤＮＡに関す る全ての変異体。 １１．請求の範囲第１項から第８項の全てにおいて請求されている、実質的に純 粋なＤＮＡ配列の全てから転写されるところの、実質的に純秤なｍＲＮＡ。 １２．タンパク質のアミノ酸配列が、第１Ｂ−１図、第１Ｂ−２図および第１Ｂ −３図に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％のアミノ酸の相同性を有す るところの、実質的に純粋なタンパク質。 １３．請求の範囲第１項から第８項の全てにおいて請求されている、実質的に純 秤なＤＮＡ配列の全てによってコードされる実質的に純粋なタンパク質。 １４．請求の範囲第１項から第８項の全てにおいて請求されている、実質的に純 粋なＤＮＡ配列の全てによって形質転換された細胞。 １５．Ｎ−末端ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、リガンド結合ドメインがＣＲ， ＭＲ，ＴＲ，ＥＲＲおよびＲＲからなる親型受容体の属群から選択された既知の 受容体から由来し、このキメラが（１）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ ２，ｒＴＲα，ｈＴ３α，ｈＴ３β，ｈＲＡＲαおよびｈＲＡＲβからなる親型 受容体のグルーブから選択されたＮ−末端ドメイン、（２）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈ ＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｒＴＲα，ｈＴ３α，ｈＴ３β，ｈＲＡＲαおよびｈＲ ＡＲβからなる親型受容体のグループから選択されたＤＮＡ結合ドメインおよび 、（３）ｈＧＲ，ｈＭＲ，ｈＥＲＲ１，ｈＥＲＲ２，ｒＴＲα，ｈＴ３α，ｈＴ ３β，ｈＲＡＲαおよびｈＲＡＲβからなる親型受容体のグループから選択され たリガンド結合ドメインを有し、また、いずれのキメラ受容体が、少なくとも２ つの異なる「親型」から由来するＮ−末端ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび リガンド結合ドメインをもち、そのためいずれの野生型受容体とも同一ではない ところの、Ｎ−末端ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメイ ンを有するキメラ受容体。 １６．ＧＲＲ，ＣＲＧ，ＧＧＲ，ＲＧＧ，ＲＧＲ，ＲＲＧ，ＴＴＧ，ＣＴＴ，Ｇ ＴＧ，ＧＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴ，ＴＴＲ，ＴＲＴ，ＴＲＲ，ＲＴＴ，ＲＴＲ，Ｒ ＲＴ，ＧＴＴ，ＧＴＧ，ＧＧＴ，ＴＧＧ，ＴＧＴおよびＴＴＣからなるグループ から選択されたキメラ受容体をコードするＤＮＡ配列。 １７．該キメラ受容体が与えられたいずれの細胞においても、外来のバックグラ ウンドの結合あるいは転写活性化のレベルをしのぐ活性を有するか、あるいは天 然に存在する受容体のＤＮＡ結合ドメインに対応するＤＮＡ結合または転写活性 化活性の少なくとも約５％または、対応する天然に存在するリガンド結合ドメイ ンのリガンド結合活性の約５％を有するところの、本発明のキメラＤＮＡの発現 あるいは、キメラ受容体をコードするＤＮＡ等から転写されるｍＲＮＡの翻訳に よって作られるキメラ受容体タンパク質。 １８．（ａ）推定上のリガンド結合ドメインおよび推定上のＤＮＡ結合ドメイン を有するＤＮＡ配列を単離し；（ｂ）段階（ａ）のＤＮＡ前列のＤＮＡ結合ドメ イン領域を、既知のリガンド応答性受容体タンパク質からのＤＮＡ結合ドメイン 領域と質換することによりキメラ遺伝子を構築し； （ｃ）適当な、受容体を欠損した宿主細胞を（１）段階（ｂ）からのキメラ遺伝 子および、 （２）ホルモン応答性エレメントが、段階（ｂ）のキメラ遺伝子によって コードされる受容体タンパク質の ＤＮＡ結合ドメイン領域により活性 化され得るところの、操作可能な ホルモン応答性エレメントに対し、 機能的に連結したレポーター遺伝 子 によってトランスフェクションし； （ｄ）段階（ｃ）で得られたトランスフェクションした宿主細胞を、段階（ｂ） のキメラ遺伝子によってコードされるキメラ受容体タンパク質のリガンド結合ド メイン領域に強力に結合することができる、一連のリガンドの可能性のある候補 を用いて検定し；（ｅ）レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質のタ ンパク質レベルに関する変化によってレポーター遺伝子の誘導をモニターし； （ｆ）機能的リガンドとして、レポーター遺伝子のタンパク質産物の生産を誘導 できるリガンドを選択する、 受容体タンパク質に対する機能的なリガンドを同定する方法。 １９．既知のリガンド応答性受容体タンパク質が、グルココルチコイド受容体、 ミネラロコルチコイド受容体、ヒト・チロイド受容体αおよびβ、ラット・チロ イド受容体α、エストロゲン関連受容体ＨＥＲＲ１およびｈＥＲＲ２、ならびに レチノイン酸受容体αおよびβからなるグループから選択されるところの、請求 の範囲第１８（ｂ）項記載の方法。 ２０．宿主細胞がＣＯＳ細胞であるところの、請求の範囲第１８（Ｃ）項記載の 方法。 ２１．レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラー ゼ（ＣＡＴ）遺伝子およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子からなるグループから 選択されるところの請求の範囲第１８（ｃ）（２）項記載の方法。 ２２．ホルモン応答性エレメントが、野生型、遺伝子操作あるいは合成の（１） グルココルチコイド応答性、（２）チロイド応答性エレメント、（３）ミネラロ コルチコイド応答性エレメント、（４）エストロゲン関連応答エレメント、（５ ）レチノイン酸応答性エレメントおよび（６）ビタミンＤ３応答性エレメントか らなるグループから選択されるところの、請求の範囲第１８（ｃ）（２）項記載 の方法。 ２３．グルココルチコイド応答性エレメントが、乳腺肉腫ウイルスの長末端反復 配列（ＭＴＶ　ＬＴＲ）の一部であり、チロイド応答エレメントが成長ホルモン のプロモーター配列であるところの、請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．段階（ｆ）で同定されたリガンドが、段階（ａ）のＤＮＡ配列の発現産物 と段階（ｆ）で同定されたリガンドの結合特性を評価することにより確証される ところの、請求の範囲第１８項記載の方法。 ２５．該細胞が、 （ａ）（Ｂ）第二の受容体の配列のリガンド結合ドメインの作用性部位に連結し た、（Ａ）第一の受容体の配列のＤＮＡ結合ドメインの作用性部位からなるキメ ラＤＮＡ配列（Ｃ）、および （ｂ）第一の受容体の配列のＤＮＡ結合ドメインの作用性部位が、レポーター配 列に機能的に連結したホルモン応答エレメントに機能的に結合し、かつ活性化す ることができるところの、作用性ホルモン応答エレメントに機能的に連結したレ ポーター核酸配列を含み、少なくとも１種の候補となるリガンドで細胞に対して 試験を行い、レポーター配列の発現産物の量における変化によりレポーター核酸 配列や誘導をモニターすることを含む、細胞内の受容体タンパク質に対する機能 するリガンドを同定する方法。 ２６．該細胞がＣＯＳ細胞であるところの請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラー ゼ（ｃＡＴ）遺伝子およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子からなるグループから 選択されるところの請求の範囲第２５項記載の方法。 ２８．ホルモン応答性エレメントが、野生型、遺伝子操作あるいは合成の（１） グルココルチコイド応答性、（２）チロイド応答性エレメント、（３）ミネラロ コルチコイド応答性エレメント、（４）エストロゲン関連応答エレメント、（５ ）レチノイン酸応答性エレメントおよび（６）ビタミンＤ３応答性エレメントか らなるグループから選択されるところの、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２９．グルココルチコイド応答性エレメントが、乳腺肉腫ウイルスの長末端反復 配列（ＭＴＶ　ＬＴＲ）の一部であり、チロイド応答エレメントが成長ホルモン のプロモーター配列であるところの、請求の範囲第２９項記載の方法。