JPH03504333A - 合成植物遺伝子と調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 □ 本発明は遺伝子工学およびさらに特定すれば、植物が外来遺伝子を発現するよう に形式転換されるところの植物の形質転換に関する。 除草剤耐性酵素およびウィルス外被タンパク質のような外来遺伝子を発現するト ランスジェニック植物に関して、大きな進展が近年なされたが、植物における外 来遺伝子の発現に影響する主たる因子については殆ど知られていない。いくつか の潜在因子が特定のコーディング配列からのタン六り質の発現レベルの程度を変 化させる原因であると思われる。細胞内の特定のｍＲＮＡのレベルは確かに重大 な要因である。 コーディング配列の性質のため、ｍＲＮＡの低定常状態レベルの潜在的原因は多 い。第１に、全長にわたるＲＮＡ合或は、高頻度では起きない。例えば、これは 転写の間にＲＮ＾の早熟な停止を引き起こすことにより、あるいは転写の間の予 想されない５ＲＮＡのプロセシングが原因となる。 第２に、全長にわたるＲＮＡはつくられるが、その後機能をもたないｗＲＮＡを つくる様式で、核内で加工（スプライシング、ポリＡ付加）される。ＲＮＡが正 確に合成され、停止し、ポリアデニレートすると、翻訳のために細胞質へ移動で きる。細胞質では、ｍＲＮＡはその配列およびｍＲＮＡが発現する細胞の型によ り決定される明かな半減期をもつ。あるＲＮＡは非常に短い寿命であり、あるも のは非常に長い寿命をもつ。加えて、その大きさは不確定であるが、ｍＲＮＡの 半減期に対する翻訳頻度の効果がある。さらに、どの＋１ｌＲＮＡ分子もその配 列により決定される特定の構造あるいは、おそらく一群の構造に折り畳まれてい る。 ＲＮＡの特定の構造が細胞質中のより大きなまたはより小さな安定性を導き出す 、構造それ自体は、おそらく核内とに、試験管内あるいは生体内でのＲＮＡ（ｔ ＲＮ＾を除（）の構造を予想することは不可能であり、殆ど決定できない。 しかし、ＲＮＡの配列を劇的に変えることが、その折り畳み構造に対して大きな 効果をもつことはありそうなことである。構造それ自体または特定の構造の性質 もまたＲＮＡの安定性を決定する役割をもつらしい。 １２ＮＡの安定性に対して特異的な効果をもつ潜在性のあるいくつかの特定の配 列および信号がＲＮＡ中に同定された。この節ではこれらの配列および信号につ いて知られていることについて要約している。これらの同定された配列はしばし ばＡ＋Ｔに冨んでおり、Ｂ、ｔ、遺伝子のようなＡ＋Ｔに冨んでいるコーディン グ配列により多く生じるように思われる。配列の特色であるＡＴＴＴＡ　（ある いは、ＲＮＡではＡＵＵＵＡ）は、哺乳動物細胞１ｅＲＮＡでは安定性のない配 列を意味する（Ｓｈａ−とＫａｍｅｎ、　１９８６）　、植物におけるこの配列 の機能の解析は行なわれていない。多くの短命なｍＲＮＡは、へ＋丁に冨んだ３ °未翻訳領域をもち、これらの領域はしばしば、多重コピーとして、または多量 体（例えば、ＡＴＴＴＡＴＴＴＡ、、、）として存在するＡＴＴＴＡ配列をもつ 。ＳｈａｗとＫａｍｅｎは、不安定なｍＲＮＡの３′端の安定なＲＮＡ　（グロ ビンまたはＶＡＩ）への移行が安定なＲＮＡの半減期を劇的に減少させることを 示した。彼らはさらに、ＡＴＴＴＡの５量体が安定なメツセージに対して十分な 不安定化させる効果をもち、この信号が３”端か、コーディング配列内かで、そ の効果が発揮されることを示した。しかし、多くのＡＴＴＴＡ配列および／また はそれらが生じる配列の環境もまたそれらが不安定化させる配列として機能して いるかどうかを決定するのに重要と思われる。５ｈａ−とＸａｗｅｙｌは、ＡＴ ＴＴＡの３１体がｍＲＮＡの安定性について５量体よりも非常に効果が少なく、 ２量体および単量体では安定性に効果がないことを示した（Ｓｈａ−とＫａｍｅ ｎ　、１９Ｂ？）　、　５量体のようなＡＴＴＴＡの多量体は自動的にＡ＋Ｔに 冨んだ領域をつくりだすことに注目しなさい、これは細胞質の効果であり、核の 効果ではないことを示している。他の不安定なｍＲＮＡでは、ＡＴＴＴＡ配列は たった１個のコピーで存在しているが、しばしば＾＋丁に冨んだ領域に含まれる 。現在までに集められた動物細胞のデータから、ＡＴＴＴＡは、少なくともある 環境まで安定性に重要であるが、ＡＴＴＴ＾のどの出現が因子を不安定化し、あ るいはこれらの効果のどれかが植物に見られるかどうかを予測することはまだ可 能ではない。 動物細胞におけるｍＲＮ八分への研究もまた、ＲＮＡ分解が、ある場合には、Ａ ＋Ｔに冨んだ領域で核酸分解の攻撃をうけて始まることを示している。これらの 切断がＡＴＴＴＡ配列のところで起きるかは明らかでない、　ｍＲＮＡが発現す る細胞の型または発現する細胞周期の段階に依存した異なる安定性をもつｍＲＮ Ａ０例がある。例えば、ヒストンのｍＲＮＡはＤＮＡ合成の間は安定であるが、 ＤＮＡ合成を止めると不安定である。いくつかのヒストンｍＲＮＡの３′端は、 この効果の原因であると思われる＊　　（ＰａｎｄｅｙとＭａｒｚｌｕｆｆ。 １９８７）、これはＡＴＴＴＡにより仲介されているとは思われず、またこのｍ ＲＮＡの異なる安定性を支配しているものも明らかではない、別の例にはＢ細胞 成熟過程でのＢリンパ球のＬｇＧのｍＲＮＡの異なる安定性がある（Ｇｅｎｏｖ ｅｓｅとＭｉ　１ｃａｒｅｋ、１９８Ｂ）　、最後の例は、変異したβ−サラセ ミアのグロビンｍＲＮＡの不安定性である。この遺伝子が通常発現する骨髄細胞 では、野生型−ＲＮＡは安定であるが、変異ｍＲＮＡは不安定である。試験管内 において、この変異遺伝子がＨｅＬａまたはＬ細胞で発現されると、変異ｍＲＮ Ａは不安定性を示さない（Ｌｉｅら、１９８Ｂ）　、これらの例はすべて、ｍＲ ＮＡの安定性が細胞の型または細胞周期特異的な因子により仲介されている証拠 を提供している。さらに、この型の不安定性はまだ特異的な配列と関連づけられ ていない。これらの不確定性から、どのＲＮＡが与えられた細胞で不安定である かを予想することは不可能である。さらに、ＡＴＴＴＡでさえＩ？ＮＡが存在す る細胞の性質に依存して、異なって作用するｈ　５ｈａ１１とＫａｍｅｎ　（１ ９８７）はプロティンキナーゼＣの活性化はＡＴＴＴＡにより仲介される分解を 阻害できることを報告した。 ポリアデニル酸の列の３゛端への付加は植物と動物の両方のほとんどの真核生物 のｍＲＮＡに共通である。ポリＡ付加についての現在受は入れられている見方は 、発生しようとしている転写物が成熟３′端の後ろに伸長するというものである 。ポリアゾニレ−ジョンと正しい３“端の形成の信号がこの転写物に含まれる。 ３゛端でのこのプロセシングはｍＲＮＡの切断と成熟３”端へのポリＡの付加を 含む。 植物および動物両者のｍＲＮＡのポリＡ領域近傍のコンセンサス配列を探すこと により、ポリＡ付加と３′端の切断に明らかに含まれるコンセンサス配列を同定 することが可能である。同一のコンセンサス配列がこれらの過程の両方に重要で あると思われる。これらの信号は、代表的には配列ＡＡＴＡＡＡの変種である。 動物細胞において２１機能的なこの配列の変種が同定された１植物細胞では、広 範囲の機能的な配列があるように思われる（Ｗｉｃｋｅｎｓ　（！：　５ｔｅｐ ｈｅｎｓｏｎ、１９８４　ＨＤｅａｎら、１９８６）　、これらのコンセンサス 配列全てがＡＡＴＡＡＡの変種であるので、これらは全てＡ＋Ｔに冨んだ配列で ある。この配列は代表的には成熟ｍＲＮＡのボＩＪ　Ａ領域の１５か、ら２０塩 基対前に見いだされる。動物細胞での実験は、この配列がポリＡ付加と３”成熟 の両者に含まれることを示している。この配列に対する部位特異的突然変異は、 これらの機能を破壊することができる（Ｃ。 ｎｗａｙと一１ｃｋｅｎｓ、　１９８８　；　Ｗｉｃｋｅｎｓら、１９８７）　 、　　しかし、推定されるポリＡ信号に対する５０から１００塩基対３′の配列 もまた必要であることも観察された；即ち、正常のＡＡＴＡＡＡをもつが下流が 置換されているあるいは破壊されている遺伝子は、正しくポリアゾニレ−ジョン しない（ＧｉｌとＰｒｏｕｄｆｏｏｔ　　、１９８４　；　５ａｄｏｆｓｋｙと 八１＋ｎ１ｎｅ、１９８４　；　ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９８４）　、つまり、 ポリ八自身だけでは完全で正しいプロセシングにとって十分ではない、どの特異 的な下流の配列がポリＡへの付加に必要であるか、あるいはこの機能をもつ特異 的な配列があるかどうかはまだ知られていない。それ故、配列分析により潜在的 なポリＡ信号が同定できるだけである。 正常にポリアゾニレ−ジョンされる天然に生ずるｗＲＮＡで、ｍＲＮＡ中のポリ Ａ信号または他の配列を一部変えることによるこの過程の破壊、十分な効果が機 能をもつａ＋ＲＮＡレベルで得られることが観察された。このことはある程度ま で遺伝子特異的であるという結果を伴って、いくつかの天然に生ずるｍＲＮＡで 観察されている。これらの天然の遺伝子の変異の研究から誘導される一般的法則 はなく、外来遺伝子に応用される法則もない。以下は４個の例である： １、グロビン遺伝子で、適正なポリＡ部位が欠けていることにより、不適当な転 写の停止が起きる。証明されていないが、不適当に停止したＲＮＡは機能せず、 不安定であるらしい（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、１９８７）。 ２．グロビン遺伝子で、機能するポリＡ信号がないと、ｍＲＮＡ蓄積のレベルが １００倍減少する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、１９８７）　。 ３、グロビン遺伝子ポリＡ部位が２つの異なるヒストン遺伝子の３′端に置かれ た。ヒストン遺伝子はその３′端近傍に２次構造（シュテムループ）を含んでい る。これらのキメラからつくられる適当にポリアゾニレ−ジョンされているルー プとポリＡ部位の間の距離が増加するにつれて減少した。また、２個のヒストン 遺伝子は非常に異なるレベルの適当にポリアゾニレ−ジョンされている＋ＲＮＡ を生産した。このことは、１ＲＮＡの蓄積を調節するｍＲＮＡ上のポリＡ部位お よび他の配列の間の相互作用について示唆する（ＰａｎｄｙとＭａｒｔｌｕｆｆ 、　１９８Ｄ。 ４、大豆レグヘモグロビン遺伝子がＨｅＬａ細胞にクローニングされ、この植物 遺伝子が動物細胞で活性はあるが、植物細胞では利用されない“神秘的な”ポリ アゾニレ−ジョン信号を含むことが決定された。これは機能しない新しいポリア ゾニレ−ジョンされたｍＲＮＡの生産を導き出す、このことはさらに、ある細胞 型中の遺伝子解析では別の細胞型中のその行動を予想することができないことを 示している（ＷｉＢｂａｕｅｒら、１９８Ｂ）。 これらの実験から、天然のｍＲＮＡでは適正なポリアゾニレ−ジョンがｄＮＡの 蓄積に重要であり、この過程の破壊はｍＲＮＡレベルに顕著な影響を及ぼすこと が明らかである。 しかし、正常遺伝子の変化の影響を予測するには、存在特表平３−５０４３３３ 　（’１２） する知識が不十分である。推定されているポリＡ部位（コンセンサス配列）が機 能するかどうかわからない外来遺伝子では、結果を予想することさえ困難である 。しかし、同定された推定される部位が無機能である可能性はある。つまり、こ れらの部位は適当なポリ八部位として作用するのではなく、代わりに不安定なｍ ＲＮＡを生じる異常な部位として機能する。 動物細胞系では、ＡＡＴＡＡＡがポリＡ上流の！ｌｌＲＮＡに同定される最も普 通の信号であるが、少なくとも４種の変種も発見されている（Ｗｉｃｋｅｎｓと ５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ、１９８４）　、植物では、最近までそれほど解析が行な われていなかったが、ＡＡＴＡＡＡに類似した多数の配列が使用されていること が明らかである。主要あるいは重要でないと呼ばれる以下の植物の部位はたった ３種の植物遺伝子を解析したＤｅａｎらの研究（１９８６）に参照されているだ けである。ポリアゾニレ−ジョン部位の主要または重要でないという命名は、解 析された天然に生ずる遺伝子中に機能部位としてそれらが生ずる頻度だけによる ものである。植物の場合、これは非常に限定されたデータベースである。主要な あるいは重要でないと命名された部位が、Ｂ、　ｔ、のような外来遺伝子に見い だされると、多かれ、少なかれ、部分的あるいは完全に機能するであろうと確定 的に予測することは困難である。 ＰＡ　　　　ＡＡＴＡＡＡ　　　　　主要なコンセンサス部位ＰＩＡ　　　ＡＡ ＴＡＡＡＴ　　　　主要な植物の部位Ｐ２Ａ　　　ＡＡＣＣＡＡ　　　　　重要 でない植物の部位Ｐ３Ａ　　　ＡＴＡＴＡＡ　　　　　　　　　〃Ｐ４Ａ　　　 ＡＡＴＣＡＡ Ｐ５＾　　ＡＴＡＣＴＡ　　　　　　　　　。 Ｐ６Ａ　　　ＡＴＡＡＡＡ　　　　　　　　　ＮＰ７Ａ　　　ＡＴＧＡＡＡ　　 　　　　　　　＃ＰｓＡ　　　ＡＡＧＣＡＴ　　　　　　　　　’Ｐ９Ａ　　　 ＡＴＴＡＡＴ　　　　　　　　　’ＰＩＯＡ　　　ＡＴＡＣＡＴ　　　　　　　 　　〃ＰＩＩＡ　　　ＡＡＡＡＴＡ　　　　　　　　　＃Ｐ１２Ａ　　　ＡＴＴ ＡＡＡ　　　　　重要でない動物の部位Ｐ１３Ａ　　　ＡＡＴＴＡＡ　　　　　 　　　　〃Ｐ１４Ａ　　　ＡＡＴＡＣＡ　　　　　　　　　ＮＰ１５Ａ　　　Ｃ ＡＴＡＡＡ　　　　　　　　　＃核内で起きる別の型のＲＮＡプロセシングはイ ントロン・スプライシングである。イントロン・スプライシングについてのほぼ 全ての研究が動物細胞で行われたが、いくつかのデータは植物から得られる。イ ントロン・プロセシングは、適正な５′および３′のスプライスの連結部分の配 列に依存している。これらの連結部のコンセンサス配列は、動物および植物のｍ ＲＮＡに由来するが、はんの数ヌクレオチドが変化しないことが知られている。 それ故、単に配列解析にだけ基づいて、推定されるスプライス連結部分が機能す る、または部分的に機能するかどうかを確実に予想することは困難である。特に 、変化しないヌクレオチドはイントロンの５′端でＧＴ、イントロンの３゛端で ＡＧだけである。植物では、それぞれの近傍の位置、イントロン内部あるいはイ ントロンに隣接したエクソンで、ある位置ではあるヌクレオチドへの片寄りを示 すが、４個全てのヌクレオチドが見いだされる（Ｂｒｏｗｎ　、　１９８６　； Ｈａｎｌｅｙと５ｃｈｕｌｅｒＳ１９８８）。 植物イントロンが、パタチン遺伝子からＧＵＳ遺伝子へ移された。これを行うた めに、新しい制限酵素部位を導入するように部位指示的突然変異が行われ、この 突然変異により、ＧＴおよび八Ｇに隣接するイントロンおよびエクソンの配列中 のいくつかのヌクレオチドが変化した。このイントロンはなお正しく機能し、こ れはＧＴおよびＡＣの重要性と他のヌクレオチドの位置での柔軟性を示している 。もちろん、イントロンのスプライス連結部位として機能しないＧＴおよびＡＧ が全ての遺伝子に多く存在し、そのことがらスプライス連結部位と同定される他 の配列または構造の特徴があるにちがいない。植物では、ひとつのそのような特 徴が、塩基組成自体であると思われる。 Ｗｉｅｂａｕｅｒら（１９８８）およびＧｏｏｄａｌｌら（１９８８）は、植物 のイントロンとエクソンを解析し、エクソンが〜５０％のＡＣＴを、イントロン が〜７０％のＡＣＴをもつことを見いだした。Ｇｏｏｄａ　ｌ　ｌら（１９８８ ）はまた、コンセンサス５′および３”スプライス連結部位と任意のＡＣＴに冨 んだ内在配列をもつ人工的な植物イントロンを作製した。このイントロンは植物 中で正確にスプライスされた。内部の断片をＧ＋Ｃに冨んだ配列に置き換えると 、スプライシングの効率は劇的に減少した。これらの２例は植物におけるイント ロンの認識は、非常に一般的な性質−一多くの配列の多様性をもつスプライス連 結部位とイントロンそれ自身がＡ＋Ｔに冨んでいることに依存していることを示 している。もちろんこのことは、配列だけから、ある特定の配列がＲＮＡプロセ シングに対して、活性のある、あるいは部分的に活性のあるイントロンとして機 能するかどうかを予想することを困難にしている。 Ａ＋Ｔに冨んでいるＢ、　ｔ、遺伝子は、７０％あるいはそれ以上のＡ＋Ｔをも つ各種の長さの非常に多くの広がりを含む。 配列解析により同定されたそのような多くの広がりは調べられた配列の長さに依 存している。 上述のポリアゾニレ−ジョンに関して、どのような配列が与えられた遺伝子でス プライス部位として使われるのかを予想することは複雑である。まず、多くの天 然にある遺伝子は、最終的な１ＲＮＡ中に代替のエクソンの組合わせを作り出す 代替のスプライシングの経路をもつ（Ｇａｌｌｅｇａ　とＮａｄａｌＧｉｎａｒ ｄ　、　１９８８　；　）Ｉｅｌｆｍａｎ　とＲ４ｃｃｉ　。 １９８Ｂ　ｉ　ＴｓｕｒｕｓｈｉｔａとＫｏｒｎ、　１９８９）　、つまり、い くつかのスプライス連結部位は明らかにある環境下で、あるいはある細胞の型で 認識され、他では認識されない。これを支配する法則はわかっていない。さらに 、特定のポリアゾニレ−ジョン部位の使用が逆にスプライス部位近傍でのスプラ イシングを阻害できるようなプロセシング経路同士の相互作用がある（Ａｄａｍ ｉとＮｅｖｉｎｓ、１９８８　；　ＢｒａｄｙとＭｏ１ｄ、　１９８８　；　Ｍ ａｒｚｌｕｆｆとＰａｎｄｅｙ、　１９８８）　、さらに予言的な法則も得られ ていない。また、遺伝子の配列の変化は特定のスプライス連結部位の使用を劇的 に変化させることができる。例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子で、イントロンの 数百塩基下流のエクソンの小さな欠損によりイントロンのスプライシングの効率 が９５％以上から２％以下に低下する（本質的に無機能）。しかし他の欠損は本 質的に効果がない（ＨａｍｐｓｏｎとＲｏｔｔｍａｎ　、　１９８８）　、最後 に、各種の試験管内および生体内の実験は、正常のスプライシングを破壊する突 然変異が、核内のＲＮＡの急速な分解を導くことを示している。スプライシング は核内の多段階にわたる過程で、正常のスプライシングの突然変異は各種段階で の過程の妨害を導く。これらの妨害から異常で、不安定なＲＮＡが生じる。正常 にプロセスされる（ポリアゾニレ−ジョンおよびスプライシング）遺伝子の変異 体の研究は、Ｂ、　ｔ、のような外来遺伝子の研究に関連する。Ｂ、　ｔ、遺伝 子は、異常な機能しないｍＲＮＡの生産を導く機能信号を含み、これらのｗｌ？ ＮＡは不安定なようである。 しかしＢ、　ｔ、遺伝子はおそら（、天然遺伝子中の変異体の信号に類似の信号 をも含んでいるようである。上に示されているように、これらの変異体の信号は 、不安定な＋＊ＲＮＡを生産するという結果となるプロセシングの経路に欠損を もたらすようである。 植物または動物細胞で、何がＲＮＡ転写停止の信号なのかは確実には知られてい ない。Ｔに冨んだ配列の伸張が、試験管内で仔ウシ胸腺ＲＮＡポリメラーゼＨに よる停止を引き起こすことを動物遺伝子でのいくつかの研究が示している。試験 管内での転写終結物の３゛端がしばしば、Ｔ５、Ｔ６またはＴ７のようなＴの連 続の中にあることをこれらの研究は示した。他の同定された部位はＴだけから構 成されるのではなく、さらに１個あるいはそれ以上の他のヌクレオチドをもって し）た。ＴＡＴＴＴＴＴＴ、　Ａ丁子ＣＴＣ，ＴＴＣＴＴという配列の中で停止 することが発見された（Ｄｅｄｒｉｃｋら、１９８７　；　Ｒｅ１ｎｅｓら、１ ９８７）　、これら後者の２つの場合、配列が見いだされた前後はやはりＣＡＴ に冨んでいた。このことが必須であるかは知られていない。潜在的な転写終結因 子としてＡの伸張が他の研究で示唆された。　ＳＶ４０のおもしろい例は配列だ けに基づく終結因子の定義の不確定性を示している。　ＳＶ４０でひとつの潜在 的な終結因子として、Ａに冨んでおり、Ａに富んだ繰り返しの５”に２回転対称 の領域（潜在的なシュテムーループ）をもつ部位が同定された。しかし、同一遺 伝子の下流に実験的に同定された第２の終結因子はＡに冨んでいないもので、潜 在的な２次構造も含んでいなかったＣＫｅｓｓ　Ｉｅｒら、１９８８）。 もちろん、Ｂ、　ｔ、遺伝子は、その＾＋Ｔ含量のために、終結因子として作用 するＡまたはＴの連続に冨んでいる。 ｍＲＮＡの安定性に対する停止の重要性は、上述のグロビン遺伝子の例に示され ている。正常なポリＡ部位を欠損していると、適正な停止ができず、その結果− ＲＮＡが減少する。 ｗ＋ＲＮＡの翻訳に対するｍＲＮＡ安定性の効果もまた存在する。 ヒトのトリオースリン酸イソメラーゼの未成熟な翻訳の停止は、ｍＲＮＡを不安 定にする（Ｄａａｒら、１９８８）　、もう一つの例は、骨髄細胞で特異的に不 安定な上述のβ−サラセミアのグロビンｍＲＮＡである（ＬｉＩＩら、１９８Ｂ ）。この変異遺伝子の欠損は、６０番目のコドンで翻訳の停止（ナンセンスコド ン）をさせる４４番目のコドンの１塩基対の欠損である。正しく翻訳された正常 なグロビンｍＲＮＡに比較して、この変異ＲＮＡは非常に不安定である。酵母で の他の研究は、適正ではあるが低レベルの翻訳力＜ｍＲＮＡレベルに効果をもつ ことを示している。外来遺伝子はあるコドンをより酵母に適したコドンに変換す るために修飾された。 タンパク質住産が全体で１０倍増加したが、ｔｓＲＮＡでは約３倍増加した（Ｈ ｏｅｋｅｍａら、１９Ｂ？）　、これは、より効率的な翻訳によりｍＲＮＡがよ り安定となり、翻訳レベル同様ＲＮＡレベルでコドン使用の効果があることを示 している。とのコドンが翻訳を低くさせる、あるいはどのようにしてこれが＋ｗ ＲＮＡの安定性に関連するかは、コドン使用の研究からは明らかではない。 それ故、野生型遺伝子に比較して、相対的に高レベルでそれぞれのタンパク質を 発現する合成植物遺伝子を調製する方法を提供する二七が本発明の目的である。 さらに、相対的に高レベルで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ の結晶タンパク質毒素を発現する合成植物遺伝子を提供することが本発明のもう 一つの目的である。 図面の簡単な説明 第１図は、植物での発現効率を増加させるために野生型遺伝子を修飾するのに用 いた段階を示す。 第２図は、結晶タンパク質素を暗号化するＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１の野生型の配 列（上列）に対する例１の修飾されたＢ。 ｔ、に、　ＨＤ−１の配列（下列）の変化の比較を示す。 第３図は、結晶タンパク質素を暗号化するＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１の野生型の配 列（上列）に対する例２の合成り、ｔ、に、　ＨＤ−１の配列（下列）の変化の 比較を示す。 第４図は、Ｂ、ｔ、に、　）１０−７３の野生型の配列（上列）に対する例３の 合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３の配列（下列）の変化の比較を示す。 第５図は、中間体植物形質転換ベクターカセットｐＭＯＮ８９３のプラスミド地 図を表す。 第６図は、中間体植物形質転換ベクターカセッ）　ｐＭＯＮ９００のプラスミド 地図を表す。 第７図は、Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＡＣＯの無力化されたＴ−ＤＮＡの地 図を表す。 第８図は、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３の野生型の配列（上列）に対する例３の合 成され、切り詰められたＢ、ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝子（Ｎ末端のＭｅｔ−＾ １ａをもつアミノ酸２９−６１５）　　（下列）の変化の比較を示す。 第９図は、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３の野生型の全長の配列（上列）に対する例 ３の合成／野生型の全長のＢ、ｔ、に、　ＨＤ−７３配列（下列）の変化の比較 を示す。 第１θ図は、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３の野生型の全長の配列（上列）に対する 例３の合成／修飾型の全長のＢ、ｔ、に、　）１０−７３配列（下列）の変化の 比較を示す。 第１１図は、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３の野生型の全長の配列（上列）に対する 例３の完全に合成された全長のＢ、ｔ、に、　ＨＤ−７３配列（下列）の変化の 比較を示す。 第１２図は、結晶タンパク質毒素を暗号化するＢ、　ｔ、　ｔ、の野生型の配列 （上列）に対する例５の合成り、　ｔ、　ｔ、の配列（下列）の変化の比較を示 す。 第１３図は、Ｐ２タンパク質毒素を暗号化するＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１の野生型 の配列（上列）に対する例６の合成り、ｔ、　Ｐ２の配列（下列）の変化の比較 を示す。 第１４図は、Ｂｔｅｎｔタンパク質毒素を暗号化するＢ、ｔ。 ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓの野生型の配列（上列）に対する例７の合成り、ｔ、ｅ ｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓの配列（下列）の変化の比較を示す。 第１５図は、植物発現カセットベクターｐＭＯＮ７４４のプラスミド地図を示す 。 第１６図は、ＰＬＲＶの野生型外被タンパク質配列（上列）に対する例９の合成 されたジャガイモの葉のロールウィルス（ＰＬＲＶ）の外被タンパク質配列（下 列）の変化の比較を示している。 発明の詳細 な説明は、これまでに植物の形質転換に通常用いられてきた野生型の遺伝子より もかなり高レベルで遺伝子がそのタンパク質産物を発現する合成植物遺伝子を調 製する方法を提供する。別の面では、本発明はまた、非植物タンパク質を暗号化 する新規合成植物遺伝子を提供する。 簡潔および明確な記述のために、本発明は最初に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　（Ｂ、ｔ、）の結晶タンパク質素を暗号化する合成植物遺 伝子の調製に関して述べられる。 限定されないが、適当なり、　ｔ、亜種には、Ｂ、ｔ、　ｋｕｒｓｔａｋｉＨＯ −１、Ｂ、ｔ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ−７３、Ｂ、ｔ、　５ｏｔｔｏ、　Ｂ 、ｔ、　ｂｅｒｌｉＢ、ｔ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、　Ｂ、ｔ、　ｔｏ ｌｗｏｒｔｈｉ。 Ｂ、ｔ、ｄｅｎｄｒｏｌｉ＊ｕｓ、Ｂ、ｔ、　ａｌｅｓｔｉ。 Ｂ、ｔ、　ｇａｌｌｅｒｉａｅ、　Ｂ、ｔ、　ａｉｚａｅｅａｉ。 Ｂ、ｔ、　５ｕｂｔｏｘｉｃｕｓ　、　Ｂ、ｔ、　ｅｎｔｏ＋＊ｏｃｉｄｕｓ。 Ｂ、ｔ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよびＢ、ｔ、　ｓａｎ　ｄｉｅｇｏが含ま れる。しかし、植物タンパク質同様Ｂ、ｔ、の結晶タンパク質素とは別の非植物 タンパク質を暗号化する合成植物遺伝子を調製するために、本方法が使用される ことを当業者は認識し、理解するであろう（例えば、例９を見よ）。 植物におけるＢ、　ｔ、遺伝子の発現は問題である。植物中でのＢ、　ｔ、遺伝 子の殺虫剤レベルでの発現は報告されているが、この遂行はまっすぐではなかっ た。特に、鱗し口枠異的な、全長のＢ、【、遺伝子（Ｂ、ｔ、に、の分離培養か らのＤＮＡを含む）の発現では、ある植物種での殺虫剤レベルの発現がうまく得 られないことが報告されている（Ｖａｅｃｋら（１９８７）とＢ−ａｒｔｏｎら （１９８７））。 Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１の全長の遺伝子の発現はトマトでは検出できるが、切り 詰められた遺伝子では、全体的により高レベルで発現する殺虫効果のある植物を 高頻度で導き出すことが報告された。Ｂ、ｔ、　ｂｅｒｌｉｎｅｒの切り詰めら れた遺伝子は、タバコにおいて殺虫効果のある植物の頻度をより高くした（Ｖａ ｅｃｋら、１９８７）。一方、殺虫効果のある植物は、全長の遺伝子を用いてレ タスの形質転換体から供給された。 Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３の全長の遺伝子がタバコである程度の殺虫効果を与え ることも報告された（Ａｄａｎｇら、１９Ｂ？）　、　ｊ。 かじ、これらの植物で検出されたＢ、　ｔ、のｍＲＮＡは予想された３、７ｋｂ と比較すると、はんの１．７ｋｂで、このことは不適正な遺伝子の発現を示して いた。この切り詰められたｍＲＮ＾は短すぎて、機能する毒素を暗号化できない ことが示唆されたが、ある植物で低レベルの長いｍＲＮＡが存在する、あるいは 殺虫活性は観察されなかった。他のグループが、ある出版物の中で、切り詰めら れたＢ、ｔ、に、遺伝子の予想されたｄＮＡよりも短いものを多量に観察したこ とを報告したが、予想された大きさの＋ｍＲＮＡもまた観察された。事実、全長 の遺伝子の発現がタバコのカルスに対して毒性があることが示唆された（Ｂａｒ ｔｏｎら、１９８７）。上記のことは、鱗し口型のＢ、ｔ、遺伝子が、同じプロ モーター・カセットから以前に発現された他のキメラ遺伝子に比較して、植物で は不完全に発現されることを示している。 トマトおよびジャガイモでのＢ、ｔ、ｔ、の発現は、Ｂ、ｔ、ｋ。 の発現と同様のレベルである（即ち、低レベル）。Ｂ、　ｔ。 ｔ、およびＢ、ｔ、に、遺伝子は限られた配列相同性しかもたないが、塩基組成 および特定のＡ＋Ｔに冨んだ因子に関しては多くの共通した性質を有している。 この分野の全ての報告は、植物におけるＢ、　ｔ、遺伝子の予想よりも少ない発 現に注目している。一般に殺虫剤の効力は、スズメガの幼虫のようなり、　ｔ、 毒素に対して非常に感受性の昆虫を用いて測定される。スズメガの幼虫に対して 全体的に保護される植物を得ることは可能だが、スズメガの幼虫が、シロイチモ ンジョトウガの幼虫のような農業経済的に重要な害虫よりもＢ、ｔ、毒素に対し て５００倍はど感受性であることに注目することは重要である。それ故、全ての 重要な鱗り目の害虫に対して（あるいはＢ、ｔ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの場 合は、コロラドハムシに対して）保護されるトランスジェニック植物を得ること 、さらに効力のある保護レベルに加えて、付加的な余裕のある安全性を提供する Ｂ、　ｔ、の発現レベルをもつことは興味深いことである１種から種へ再生的に 機能する植物遺伝子を案出することも重要であり、それで昆虫に耐性の植物が予 言できる様式で得られるようになる。 これらの目標を達成するために、植物におけるＢ、ｔ、遺伝子の予想よりも少な い発現の性質を理解することは重要である。植物での安定なり、　ｔ、のａ＋Ｒ ＮＡのレベルは、予想よりも非常に少ない。つまり、同じプロモーターにより動 かされる他のコーディング配列と比較して、ノーザン分析またはヌクレアーゼ保 護実験により測定されたＢ、　ｔ。 のｍＲＮＡのレベルは非常に低い０例えば、トマト植物３３７（Ｆｉｓｃｈｈｏ ｆｆら、１９８７　）が、ＣａＭν３５Ｓプロモーターにより動（Ｂ、ｔ、に、 　ＨＤ−１のＫｐｎｌ断片とＮ０３−ＮＰＴ　Ｉ　Ｉ　−ＮＯＳ選択マーカー遺 伝子を含むｐＭＯＮ９７１１をもつ最高の発現をする植物として選択された。こ の植物のＢ、　ｔ、のｍＲＮＡのレベルは、３５ＳプロモーターがＮＯＳプロモ ーターよりも約５０倍強いにもかかわらず、ＮＰＴＩＩＯ■ＲＮＡのレベルの１ ００から１０００倍低い（Ｓａｎｄｅｒｓら、１９８７）　。 植物で検出されるＢ、　ｔ、毒素タンパク質のレベルは、Ｂ、　ｔ、のｍＲＮＡ の低レベルと一致する。さらに、トランスジェニック植物の殺虫効果はＢ、　ｔ 、タンパク質のレベルと関係し、これは植物で生産される毒素タンパク質が生物 学的に活性があることを示している。それ故、Ｂ、　ｔ、毒素の発現が低レベル であることは、Ｂ、ｔ、の−ＲＮＡが低レベルである結果である。 ｍＲＮＡのレベルは合成と分解の速度により決定される。 これら２つのバランスがｍＲＮＡの定常状態のレベルを決定する０強力な、構成 的に植物で発現できるプロモーターであるＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの使用 により、合成速度は最大となる。ツバリン合成酵素（ＮＯＳ）、マンノピン合成 酵素（ＭＡＳ）およびリブロース−２リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット （Ｒ（ＩＢＩＳＣＯ）のような他の植物のプロモーターの使用は、Ｂ、　ｔ、　 ＠素タンパク質の発現レベルに劇的な変化はもたらさず、これはＢ、　ｔ、毒素 タンパク質レベルを決定する効果プロモーターに依存していないことを示す、　 Ｂ、ｔ、毒素タンパク質を暗号化するＤＮＡ遺伝子のコーディング配列が低発現 レベルにいくらか原因し、この効果が低レベルの蓄積された安定なｍＲＮＡによ りあられれることを、これらのデータは意味している。 鞘し類に特異的なり、ｔ、　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの遺伝子同様、４種の異な る鱗し目に特異的な遺伝子（Ｂ、ｔ、に、　）１０−１から２個；　Ｂ、　ｔ、 　　ｂｅｒｌｉｎｅｒおよびＢ、ｔ、に、　ＨＤ−７３）で、予想よりも低レベ ルのｍＲＮＡが観察された。鱗し口型のＢ、　ｔ、遺伝子では、これらの効果は 切り詰められたコーディング配列の場合よりも全長のコーディング配列の場合に より強くあられれると思われる。これらの効果は、その程度がタバコのようなあ る植物種でより大きいと思われるが、植物種全体に観察される。 Ｂ、　ｔ、遺伝子のコーディング配列の性質は、植物で発現される他の多くの外 来遺伝子同様植物遺伝子とは異なる。 特に、６．ｔ、遺伝子はアデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）に非常に冨んでいる が（〜６２％）、植物遺伝子および植物で発現されるほとんどの細面遺伝子は４ ５から５５％程度の＾＋丁である。ある生物のゲノム（したがって、遺伝子）の Ａ＋Ｔ含量は、その生物の特徴であり、その進化の歴史を反映する。ある一つの 生物の中では、遺伝子は類偵のＡ＋Ｔ含量をもつ一方で、Ａ＋Ｔ含量は生物から 生物へ甚だしく変化する。例えば、あるバチルス属では最も多くＡ＋Ｔに冨んだ ゲノムをもち、あるストレプトマイセス属は最も少ないＡ＋Ｔのゲノムをもつ（ ３０から３５％のＡ＋Ｔ）。 遺伝子コードの縮重とあるアミノ酸に対する限られた数のコドンの選択のために 、いくつかのバチルス属の構造コーディング配列のほとんどの“過剰なゝ　Ａ＋ Ｔは、コドンの３番目の位置に見いだされる。つまり、数種のバチルスの遺伝子 は、多くのコドンで３番目のヌクレオチドとしてＡまたはＴをもつ、それ故、Ａ ＋Ｔ含量は一部分コトン使用の偏りを決定することができる。さらに、遺伝子が その中で進化する生物中で最大機能を発達させるように進化することは明らかで ある。ある生物の遺伝子に見いだされる、アミノ酸の特定の連続をコードする以 外何の役割もない特定のヌクレオチド配列が、（転写プロモーターまたは終結因 子、ポリＡ付加部位、イントロン・スプライス部位または特異的ｍＲＮＡ分解信 号のような）遺伝子のコントロール因子として別の生物で認識される可能性をも つことをこれは意味する。そのような読み違えられた信号は外来遺伝子の発現の 共通の特徴ではなく、多くの生物の相対的に均一なＡ＋Ｔ含量（〜５０％）によ り部分的に説明されることは多分驚くべきことである。遺伝子コードの性質に加 えてこのＡ＋Ｔ含量が、ある特定のオリゴヌクレオチド配列の発生の見込みに明 らかな制限を加える。それ故、５０％の＾十Ｔ含量の大腸菌遺伝子が特定のＡ＋ Ｔに冨んだ断片を含むことは、Ｂ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ遺伝子よりも ほとんどありそうもない。 上述のように、植物におけるＢ、【、毒素タンパク質の発現には問題が多い。上 述の他の系で得られた観察は、植物におけるＢ、　ｔ、毒素タンパク質の発現レ ベルを上昇させる手段の希望を与えるが、本方法により得られる成功はまったく 予想に反するものである。実際に、全長のＢ、　ｔ。 ｋ、毒素タンパク質のタバコにおける発現がカルス組織を壊死性にするという報 告が最近されたので（Ｂａｒｔｏｎら、１９８７）　、報告された毒性効果のた めに、Ｂ、　ｔ、毒素タンパク質の高レベルの発現は達成されないと予想するの が正当であろう。 その最も厳密な応用で、本発明の方法は構造遺伝子を含むＤＮＡの部位特異的突 然変異によりＡＴＴＴＡ配列と、推定されるポリアゾニレ−ジョン信号を除去し た特定のタンパク質をコードする存在する構造コーディング配列（“構造遺伝子 ′）の修飾を含んでいる。上記の同定された配列のいずれかを部分的にだけ除去 することにより、発現レベルが強められることか観察されるのだが、本質的には 全てのポリアゾニレ−ジョン信号およびＡＴＴＴＡ配列が除去されることが最も 好ましい。そうでなく、目的のタンパク質の発現をコードする合成遺伝子が調製 されると、コドンはＡＴＴＴ＾配列と、推定されるポリアゾニレ−ジョン信号を 避けるように選択される。本発明の目的のために、必ずしも限定はされないが、 推定されるポリアデニシーションイ言号は、ＡＡＴＡＡＡ、＾ＡＴＡＡＴ、　Ａ ＡＣＣＡＡ、ＡＴＡＴＡＡ、　ＡＡＴＣＡＡ、　ＡＴＡＣＴＡ、　ＡＴＡＡ＾、 ＡＴＧＡＡＡ、　ＡＡＧＣＡＴ。 ＡＴＴＡＡＴＳ　ＡＴＡＣＡＴ、　　ＡＡＡＡＴ＾、　ＡＴＴＡＡＡ、　　へＡ 丁ＴＡＡ、　　ＡＡＴＡＣＡおよびＣＡＴＡＡＡを含む。ＡＴＴＴＡ配列および ポリアゾニレ−ジョン信号に代えて、植物ゲノムではほとんど見いだせないコド ンを避けたコドンが好んで使用される。 第１図の流れ図に表されている本発明の別の具体化は、存在する構造遺伝子の修 飾方法または最初に述べられた方法よりもやや厳密でない、構造遺伝子の新たな 合成の方法を使用する。第１図によれば、４個より多い連続したアデニン（Ａ） またはチミン（Ｔ）ヌクレオチドをもつ領域を同定するために、選択されたＤＮ Ａ配列が調べられる。　　Ａ＋Ｔｉ１Ｉ域が潜在的な植物のポリアゾニレ−ジョ ン信号について調べられる。５個あるいはそれ以上の連続したＡまたはＴヌクレ オチドがないことは、はとんどの植物ポリアゾニレ−ジョン信号を消去するのだ が、それぞれのヌクレオチドの中に同定される１個以上の重要でないポリアゾニ レ−ジョン信号があるとすると、この領域のヌクレオチドは、元来の暗号化され たアミノ酸配列を維持したまま、これらの信号を除去するために変えられるのが 好ましい。 段階１で同定されたＡ＋Ｔに冨んだ領域周辺の１５から３０ヌクレオチドの領域 を考えることが第２段階である。周辺領域のＡ＋Ｔ含量が８０％未満であれば、 その領域はポリアゾニレ−ジョン信号について調べられる。ポリアゾニレ−ジョ ン信号に基づく領域の改変は、（１）存在するポリアゾニレ−ジョン信号の数お よび（２）重要なポリアデニシーシジン信号の存在に依存する。 拡張された領域で植物のポリアゾニレ−ジョン信号の存在が調べられた。ポリア ゾニレ−ジョン信号はＤＮＡ配列の部位特異的突然変異により除去される。拡張 された領域ではまた、突然変異によりこれもまた除去される＾ＴＴＴＡ配列の多 重コピーが調べられる。 多くの連続したＡ＋Ｔ塩基またはＧ＋Ｔ塩基からなる領域は、自己相補性のため にヘアピン構造をより形成しやすくなると予想されるので、破壊されるのが望ま しい。それ故、不均一な塩基対を挿入することにより、ある生物で転写および／ あるいは翻訳を阻害することが知られている自己相補的な２次構造形成の見込み が減少する。はとんどの場合、５個以上の連続した＾＋ＴまたはＧ＋Ｃを含まな い配列を用いることにより、逆効果を最小にすることができる。 突然変異のための合成オリゴヌクレオチド突然変異に用いられるオリゴヌクレオ チドは、正しいアミノ酸配列と読みとり枠を維持し、修飾された遺伝子に、Ｂｇ ｌｌｌ＋　Ｈｉｎｄｌｌｌ、　５ａｃｌ、　Ｋｐｎｌ、　Ｅｃｏｒｉ、　Ｎｃｏ Ｉ、　Ｐｓｔｌおよび５ａｉｌのような通常の制限酵素部位をむしろ導入しない ように計画される。これらの制限酵素部位は、プラスミドｐＵｃ１１８およびｐ ＭＯＮ７２５８のようなりローニングベクターのマルチリンカ−挿入部位に見い だされる。もちろん、新しいポリアゾニレ−ジョン信号、ＡＴＴＴＡ配列あるい は連続した５個以上のＡ＋ＴまたはＧ＋Ｃの導入も避けられる。好ましいオリゴ ヌクレオチドの大きさはおよそ４０から５０塩基であるが、１８から１００塩基 の範囲の断片が使用される。はとんどの場合、合成された断片の両端の鋳型ＤＮ Ａに相同な最少の５から８塩基対が、鋳型へのプライマーの正しいハイブリダイ ゼーシヨンを保証するために維持される。オリゴヌクレオチドは５塩基対のＡ＋ ＴまたはＧ＋Ｃよりも長い配列を避ける。野生型コドンに代わって使用されるコ ドンは、可能ならばＴＡまたはＣＧの重複は避けるのが望ましい。植物ゲノムで はほとんど見いだせないコドンを避けるように、（下記の表１のような）植物で よく用いられるコドン表からコドンは選択され、Ｇ＋Ｃ含量を約５０％に調節す るためにコドンを選択する努力がなされている。 表１ におしる　　しいコ゛ン 表Ｉ（続き） に番　　士　いコ′ン ＧＣＵ　　　　　　４１ 表１（続き） にお番る　　しいコ′ン ＭＥＴ　　　　　ＡＵＧ　　　　　　１００ＴＲＰ　　　　　ＵＧＧ　　　　　 　１００多くの連続的なＡＣＴ塩基またはＧ＋Ｃ塩基をもつ領域が、自己相補性 に起因してヘアピン構造を形成する見込みがかなりあると予想されている。不均 一な塩基対を挿入することによりこれらの領域を破壊することは望ましく、ある 生物では転写（転写終結因子）および翻訳（アテニュエーター）を阻害すること が知られているヘアピンのような自己相補的な２次構造形成の見込みを減少させ るべきである。しかし、潜在的なヘアピン形成領域の生物学的効果を予想するこ とは困難である。 野生型遺伝子ＤＮＡ配列の修飾について上の記述には書かれているが、本方法は 与えられたアミノ酸配列に対する完全に合成の遺伝子を構築するために使用され ることは技術者には明らかである。５個またはそれ以上の連続したＡ＋Ｔあるい はＧ＋Ｃヌクレオチドをもつ６Ｉ域は避けられるべきである。コドンはその中に できるだけＴＡおよびＣＧの重複があることを避けるように選択される。コドン 使用は（表１のような）植物で好まれるコドン使用表に対して標準化され、Ｇ＋ Ｃ含量が約５０％に調節されるのが望ましい、得られた配列は、最少の推定され る植物ポリアゾニレ−ジョン信号とＡＴＴＴＡ配列があることを保証するために 調べられる。通常使用されるクローニングベクターに見いだされる制限酵素部位 はまた避けるのが望ましい、しかし、遺伝子の中にいくつかの独特の制限酵素部 位があることは、遺伝子発現の解析あるいは遺伝子変異株の構築に役立つ。 植物遺伝子の構築 二重鎖ＤＮＡの形態で存在する植物遺伝子の発現は、ＤＮＡの一方の鎖からのＩ ？ＮＡポリメラーゼ酵素による伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ　）への転写およびそれに 次ぐ核内での■Ｉ？ＮＡ　３次転写物のプロセシングを含む。このプロセシング はＩ？ＮＡの３゛端にポリアデニル酸ヌクレオチドを付加する３″未翻訳領域を 含む、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、通常“プロモーター”と呼ばれる。　ＤＮ Ａの領域により調節される。プロモーター領域はＤＮＡと結合し、相当するＲＮ Ａ鎖をつくるために鋳型としてＤＮＡＩ（の一方を用いて、ｍＲＮＡの転写を開 始するようにＲＮＡポリメラーゼに信号を送る塩基配列を含む。 植物細胞中で活性のある多くのプロモーターが文献に述べられている。これらに は、（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ−ａｃｋｅｎｓの腫瘍誘導プラ スミドにある）ツバリン合成酵素（ＮＯＳ）およびオクトバイン合成酵素（ＯＣ ３）のプロモーター、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）　１９５およ び３５Ｓプロモーター、リブロース−２リン酸カルボキシラーゼの小サブユニッ ト（ｓｓＲＵＢＩｓｃＯ１非常に豊富な植物ポリペプチド）の光誘導プロモータ ーおよびマンノビン合成酵素（ＭＡＳ）プロモーターが含まれる（Ｖｅｌｔｅｎ ら、１９８４；Ｖｅｌｔｅｎと５ｃｈｅｌ　１．１９８５）　、これら全てのプ ロモーターは、植物で発現される各種のＤＮＡ構築物を作製するのに使用される （例えば、ＰＣＴ公開−０８４１０２９１３（Ｒｏｇｅｒら、Ｍｏ−ｎ５ａｎ　 ｔｏ）を見よ）。 植物細胞でＲＮＡの転写を引き起こすことが知られている、または見いだされて いるプロモーターが、本発明に使用される。そのようなプロモーターは植物また は植物ウィルスから得られ、限定はされないが、ＣａＭν３５Ｓプロモーターお よび５ｓＲＵＢＩｓｃｏ遺伝子のような植物遺伝子から単離されたプロモーター を含む、以下に述べるように、選択された特定のプロモーターが効果的な量のタ ンパク質を生産するように十分に発現できることが望ましい。 本発明のＤＮＡ構築物（即ち、キメラ植物遺伝子）に使用されるプロモーターは 、望むならば、そ゛の調節特性に影響を及ぼすように修飾される０例えば、Ｃａ ＭＶ３５Ｓブロモーターは、根ではなく葉で活性があるプロモーターを作製する ために、光がない状態で５ｓＲ１ｌＢＩｓｃＯの発現を抑制する５ｓＲＵＢＩｓ ｃＯの一部と連結される。得られたキメラプロモーターはこの中で述べられてい るように使用される。本記述の目的のために、“ＣａＭＶ３５Ｓ”プロモーター は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの変種、例えば、オペレーター領域と連結する ことにより、任意のまたはコントロールされた突然変異を引きだしプロモーター 等を含む。さらに、遺伝子発現を上昇させる助けとするために、多重の“エンハ ンサ−配列″を含むようにプロモーターは改変される。 本発明のＤＮＡ構築物により生産されるＲＮＡはまた５゛未翻訳リ一ダー配列を 含む、この配列は、遺伝子を発現するために選択したプロモーターに由来し、ｍ ＲＮＡの翻訳を増加するように特異的に修飾される。５°未翻訳領域はまた、ウ ィルスＲＮＡ、適当な真核生物遺伝子あるいは合成遺伝子配列から得られる０本 発明は次の例に表されるように、構築物に限定されない。むしろ未翻訳り−・− ジー配列は、ウィルス外被タンパク質のコーディング配列の未翻訳領域の５”端 の一部、あるいはプロモーター配列の一部であるか、または無関係なプロモータ ーあるいはコーディング配列に由来する。どのような場合でも、開始部位に隣接 する配列は、Ｋｏｚａｋにより報告（１９８４）された強化された翻訳開始のた めの翻訳コンセンサス配列の規則に従うことが望ましい。 本発明のＤＮＡ構築物はまた、植物中での遺伝子の実行を強化するように変えら れた、修飾された、または完全に合成された構造コーディング配列を含む。本発 明の特定の具体化で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶毒 素タンパク質を暗号化する修飾され、完全に合成された遺伝子を計画するために 、強化された方法が応用された。本発明の構造遺伝子は、随意に、アミノ末端ク ロロプラスト移行ペプチドまたは分泌信号配列を含む融合タンパク質を暗号化す る（例えば、例１０および１１を見よ）。 ＤＮＡ構築物はまた３゛未翻訳領域を含む。３“未翻訳領域はウィルスＲＮＡの ３′端にポリアデニル酸ヌクレオチドを付加させるように植物で機能するポリア ゾニレ−ジョン信号を含む。適当な３゛領域の例は、（１）ツバリン合成酵素（ ＮＯＳ）遺伝子のようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラス ミド遺伝子のポリアゾニレ−ジョン信号を含む３′の転写されるが、翻訳されな い領域、および（２）大豆貯蔵タンパク質（７Ｓ）遺伝子およびＲｕＢＰカルボ キシラーゼの小すプユニッ）　（Ｈ９）遺伝子のような植物遺伝子である。好ま しい３′領域の例は、以下の例により詳細に述べられている７Ｓ遺伝子からのも のである。 植物形質転換 本発明の構造コーディング配列を含むキメラの植物遺伝子は、適当な方法で植物 ゲノム中に挿入される。本発明の実施の際に、使用に適している植物には、限定 はされないが、大豆、綿、アルファルファ、ナタネ、亜麻、トマト、テンサイ、 ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、米および小麦が含まれる。ａ当 な植物形質転換ベクターには、例えば、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ（１ ９８３）。 Ｂｅｖａｎ（１９８３）、　Ｋｌｅｅ（１９８５）およびＥＰＯ公開１２０．５ １６　（Ｓｃｈ−ｉｌｐｅｒｏｏｒｔら）により発表されたものと同様に、Ａｇ ｒｏｂ−ａｃｔｅｒｉｕ＋ｗ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来 するものが含まれる。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓのＴｉまたは根誘導（Ｈ４ン 　プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、植物細胞中への本発明のＤ ＮＡ構築物を挿入するために代替の方法が使用された。そのような方法には、例 えば、リポソーム、電気穿孔法、遊ＭＤＮＡの取り込みを増加する薬剤、ミクロ プロジェクションによる遊離ＤＮＡの放出およびウィルスまたは花粉を用いた形 質転換の使用が含まれる。 双子葉植物の形質転換に特に役立つＴｉプラスミド・カセットベクターが図５に 示されている。第５図によれば、発現カセットｐＭＯＮ８９３は強化されたＣａ ＭＶ３５Ｓプロモーター（ＥＮ　３５Ｓ）　　とβ−コングリシニンのα゛〜〜 サブユニツト号化する大豆の遺伝子のポリアゾニレ−ジョン信号をふくむ３“端 からなる。これら２つの因子の間に、遺伝子を挿入するための複数の制限酵素部 位を含むマルチリンカ−がある。 強化ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは次のように構築された。 −３４３から＋９の間のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの断片が、以前に０ｄｅ１ １らにより、ｐＵｃｌＢに構築された（１９８５）　、この断片は、ＣａＭＶ３ ５Ｓプロモーターの最大の発現に必要なものとして、０ｄｅｌｌらにより同定（ １９８５）された領域を含む。 Ｃ１ａｌ−Ｈ５ｎｄｌｌｌＦｇｒ片として切り出され、１）ＮＡポリメラーゼ１ 　（Ｋｌｅｎｏ−断片）で平滑末端にされ、ｐ［Ｉｃ１８のＨ４ｎｄｌＩ部位に 挿入された。この３５Ｓプロモーターの上流領域がＨｉｎｄｌｌＴ−ＥｃｏＲＶ 断片（−３４３から−９０の範囲）としてこのプラスミドから切り出され、同じ プラスミドのＨｉｎｄ１１１部位とＰｓｔＩ部位の間に挿入された。強化ＣａＭ Ｖ３５Ｓプロモーターはそれ故、−３４３と−９０の間の配列を重複して含む（ Ｋａｙら、１９８７）。 ７Ｓ遺伝子の３゛端は１７．１と命名されたクローンに含まれる７Ｓ遺伝子に由 来する（Ｓｃｈｕｌｅｒら、１９８２）。ポリアゾニレ−ジョン信号を含む３° 末末端片は、クローン１７．１のβ−コングリシニン遺伝子の停止コドンの約３ ０塩基対上流に位置するＡｖａｉ１部位からこの停止コドンの約４５０塩基対下 流のＥｃｏＲＩ部位まで広がっている。 ｐＭＯＮ８９３の残りの部分は、大腸菌における複製開始点および（以下に述べ られている）ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｔｕＩＡＣＯ株の無毒化されたＴ−ＤＮＡと 相同的組換えをする領域を準備するｐＢＲ３２２の断片；広い宿主域をもつプラ スミドＲＫＩのｏ　ｒ　ｉ　Ｖ　ｅＩ域；　　Ｔｉ７のストレプトマイシン／ス ベクチノマイシン耐性遺伝子および形質転換された植物細胞をカナマイシン耐性 にするように、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとツバリン合成酵素（Ｎ０３）の３ ′端を含むキメラのＮＰＴＩＩ遺伝子を有している。 第６図によれば、形質転換ベクタープラスミドｐＭＯＮ９００は、ｐＭＯＮ８９ ３の誘導体である。ｐＭＯＮ８９３の強化ＣａＭν３５Ｓプロモーターが１．５ ｋｂのマンノビン合成酵素（ＭＡＳ）プロモーターに置き換えられている（νｅ 　１　ｔｅｎら、１９８４）　、他の断片はプラスミドｐＭＯＮ８９３と同一で ある。プラスミドベクターｐＭＯＮ８９３またはｐＭＯＮ９００へのＤＮＡ構築 物の取り込みの後、中間体ベクターは、無毒化されたＴｉプラスミドを含むＡ、 ｔｕ■ｅｆａｃｉｅｎｓ　ＡＣＯ株に導入される。共に導入されたＴｉプラスミ ドベクターが選択され、双子葉植物を形質転換するために使用される。 第７図によれば、＾、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＡＣＯはＦｒａｌｅｙらにより 述べられた（１９８５）　ｐＴｉ８６ＳＥに類似の無毒化された株である。　　 ＡＣＯの構築のために、最初の＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株は、ツバリン型の Ｔｉプラスミドをもつ１２０８株であった。Ｔｉプラスミドは、本質的に全ての もともとのＴ−ＤＮＡが左の境目および左の境目の中のＴ−ＤＮ＾の数百塩基対 を除外して取り除くことにより、Ｆｒａｌｅｙらにより述べられた（１９８５） のと類似の方法で無力化された。右の境目のすぐ後まで広がるＴ−ＤＮＡの残り の部分は、（右から左まで）　ｐＢＲ３２２の断片、プラスミドＲＫ２のｏｒｉ Ｖｇｉ域およびＴｎ６０１のカナマイシン耐性遺伝子を含む新規ＤＮ＾断片と置 き換えられた。 ｐＢＲ３２２とｏｒｉＶの断片は、ｐＭＯＮ８９３における断片に類似しており 、コインテグレート形成に相同な領域を準備する。 以下の例は、本発明の実施をより良（説明しており、本発明の眺望を限定するよ うには解釈されない。本発明の精神と眺望から離れることなく、各種の修飾およ び短縮がここの述べられている方法および遺伝子になされることを、当業者は認 識するだろう。 例１−−修飾Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子第２図によれば、野生型Ｂ、ｔ、に 、　ＨＤ−１遺伝子は、植物中で全長の遺伝子として、あるいは切り詰められた 遺伝子として不完全に発現されることが知られている。Ｂ、　ｔ。 ｋ、遺伝子のＧ＋Ｃ含量は低く（３７％）、多くのＡ＋Ｔに冨んだ領域、潜在的 なポリアゾニレ−ジョン部位（１８部位；表■の配列のリストを見よ）および非 常に多くのＡＴＴＴＡ配列を含む。 表■ 潜在的ボリアデニシーシッン信号の配列リストＡＡＴＡＡＡ”　　　　　　　Ａ ＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴ”　　　　　　　ＡＴＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡ　　　　　 　　　ＡＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＡ　　　　　　　　ＡＡＡＡＴ＾＾ＡＴＣＡＡ　 　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＴＡＡＡ”ＡＴＡＣＴＡ　　　　　　　　Ａ ＡＴＴＡＡ”＾ＴＡＡＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　ＡＡＴＡＣＡ”ＡＴ ＧＡＡＡ　　　　　　　　ＣＡＴＡＡＡ”表■にはＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝 子の部位特異的突然変異のために設計され、合成された合成オリゴヌクレオチド をあげている。 表ｍ 」」」−助」」−伝　の”炊・　葎　ブーイマーブライマー　　長さくｂｐ）　 　　　　　　　配列ＢＴＫ１８５　　　　　１８　　　　　　ＴＣＣＣＣＡＧＡ ＴＡ　ＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＴＴＣ ＣＡＭＴＣＴＣＴ Ｂ、ｔ、に、　）１０−１遺伝子（Ｎ−末端にＭｅｔ−Ａｌａをもつアミノ酸２ ９から６０７を照号化するｐＭＯＮ９９２１のＢｇｌＩＩ断片）は、ｐＭＯＮ７ ２５８　（マルチリンカ−・クローニング領域にＢｇｌＴＩ部位を含むｐＵｃ１ １８誘導体）のＢｇｌ１１部位にクローンされ、ｐＭＯＮ５３４２が得られた。 Ｂ、　ｔ、に、遺伝子の方向性は、反対側の鎖（負の鎖）が突然変異誘発のため に繊維状ファージ粒子中で合成されるように選択された。　Ｋｕｎｋｌｅの方法 （１９８５）が、開始材料としてプラスミドｐＭＯＮ５３４２を用いた突然変異 誘発に使用された。・ 突然変異の領域は次のように選択された。５個あるいはそれ以上の連続したＡま たはＴの塩基対を含む８．ｔ、ｋ。 遺伝子のＤＮＡ配列の全ての領域が同定された。これらは、２０から３０塩基対 を越える領域の周囲の配列中のＡ＋Ｔの長さと高パーセントに関して分類された 。ポリアゾニレ−ジョン部位（上記の表■を見よ）またはＡＴＴＴＡ配列を含む 領域についてＤＮＡが解析された。１またはそれ以上のポリアゾニレ−ジョン部 位あるいはＡＴＴＴＡ配列を含むＡ＋Ｔの連続した領域の除去を最大にするオリ ゴヌクレオチドが設計された。２個の潜在的な植物ポリアゾニレ−ジョン部位が 、公表された報告に基づいて、より厳密に評価された（表■を見よ）。Ｇ＋Ｃ含 量を増加し、修飾遺伝子のクローニングと組立に役立つ制限酵素部位（Ｂａ−旧 。 Ｂｇｌｌｌ、　５ａｃｌ＋　Ｎｃｏｌ、　ＥｃｏＲＶ）をつくらず、植物のコド ンにたまに見いだされることが報告されているＴＡまたはＧＣの重複を含まない コドンが選択された。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１８塩基対、１００塩 基対までの長さで、部位特異的突然変異誘発反応の効率的なハイブリダイゼーシ ョンとプライミングのために、断片の末端に負の配列と直接的な相同性をもつ少 なくとも５から８塩基対を含んでいた。第２図では、野生型Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ −１遺伝子配列を部位特異的突然変異による修飾の結果得られた配列と比較して いる。 これらの変化の最終的な結果は、Ｂ、ｔ、に、遺伝子のＧ＋Ｃ含量が３７％から ４１％に増加し、一方潜在的植物ボリアデニシーション部位は１８から７に、Ａ ＴＴＴＡｅＪｉ域は１３から７に減少した。特に、アミノ（５゛）末端からカル ボキシ（３′）末端への突然変異誘発の変化は以下のようである二ＢＴＫ１８５ は、ＡＣＴの９塩基対領域の中で植物のボリアデニシーシジン部位を除去するの に使用された１８−ｓｅｒである。 ＢＴＫ２４０は４８−ｍｅｒである。３個の潜在的なポリアゾニレ−ジョン部位 （２個のＡＡＣＣＡＭ、　　１個のＡＡＴＴＡＡ）を除去するために、７塩基対 がこのオリゴヌクレオチドにより変えられた。３１２番目の塩基対に始まる、Ｂ ＴＫ２４０により変えられた領域に近い別の領域は、高い＾＋丁含量（１５塩基 対のうち１３）と＾ＴＴＴＡＳＩ域をもつ。しかし、潜在的ポリアゾニレ−ジョ ン部位を含まず、連続した最も長いＡＣＴは７塩基対であった。 ＢＴＫ４６２は１３塩基対の変化が導入された５４−ｗｅｒである。 最初の６個の変化は、野生型コドンをＣＧの重複は避けているが、ＧおよびＣを 含むコト′ンに置き換えることにより、遺伝子がＡＣＴに冨んでいるのを減少さ せている。ＢＴＸ４６２による次の７個の変化は、２個のＡＴＴＴ＾領域を含む ＡＣＴに富んだ領域（１４塩基対のうち１３がＡまたはＴ）を除去するために使 用された。 ＢＴに６６９は９個の別々の塩基対の変化に、３個の潜在的ポリアゾニレ−ジョ ン部位（ＡＴＡＴＡＡ、　ＡＡＴＣＡＡおよびへへＴＴＡＡ）と１個のＡＴＴＴ Ａ部位を除去させる４８−ｍａｒである。 ＢＴＫ９３０はＧ＋Ｃ含量を増加し、潜在的ポリアゾニレ−ジョン部位（ＡＡＴ ＡＡＴ−重要な部位）を除去するように設計された３９−Ｉｌｅｒである。この 領域は、連続したＡＣＴ配列の９塩基対領域を含む。塩基対変化のひとつは、こ の位置のＧがＧ＋Ｃに冨んだ領域（ＣＣＧＧ　（Ｇ）　Ｃ）をつくってしまうで あろうから、ＧからＡであった。シーフェンシングの反応がＧ＋Ｃの連続した塩 基の配列を生じさせるのが困難であることを示しているので、それらが試験管内 だけで問題が多いものであっても、潜在的に問題の多い領域を生じさせることを 避けることが賢明であると考えられた。 ＢＴＫＩＩＩＯは野生型遺伝子に５個の変化を導入するように設計された３２− １ｌｅｒである。１個の潜在的な部位（ＩＩＡＴＡＡＴ−重要な部位）がＡＣＴ に冨んだ領域（２２塩基対のうち１９）の中から除去された。 ＢＴＫ１３８０ＡおよびＢＴＫ１３８０Ｔは、１４の個々の塩基対変化に責任が ある。第１の領域（１３８０Ａ）は１７の連続したＡＣＴの塩基対をもつ、この 領域にはＡＴＴＴ＾と潜在的ボリアデニシーシジン部位（ＡＡＴＡＡＴ）がある 。１００−ｓｅｒ　（１３８０Ｔ）は１３ＢＯＡにより指図された全ての変化を 含む。大きなサイズのこのブライマーは、部分的には、突然変異に（６０塩基以 上の長さの）大きなオリゴヌクレオチドを使用できるかを決定するための実験で あった。第２の考慮点は１３８０Ａにより以前に突然変異を誘発されていた鋳型 を変異させるのに１００−ｓｅｔが使用されたことであった。１３８０Δの下流 および近傍の領域を変異させるよう指示されたもとのブライマーは、ブライマー を用いて明らかな配列が得られないことにより示されるように、望みの部位に効 率的にアニールしなかった。１３８０Ｔの大きな領域の相同性は適正なアニーリ ングを確実なものにする。１３８０Ｔの拡張された大きさは、必要というよりは むしろより便利なものであった。１３８０Ｔによりカバーされる１３ＢＯＡ近傍 の第２の領域は、高Ａ＋Ｔ含量をもつ（２９塩基のうち２２がＡまたはＴ）。 ＢＴＫ１６００は５個の別々の塩基対の変化に関与する２７−ｍａｒである。Ａ ＴＴＴＡＳＩ域と植物ポリアデニシーシゴン部位が同定され、適当な変化が施さ れた。 全部で６２塩基が部位特異的突然変異により変えられた。 Ｇ＋Ｃ含量は５５塩基対により増加し、潜在的ポリアデニシーシジン部位は１８ から７へ、ＡＴＴＴＡ配列は１３から７へ減少した。　　ＤＮＡ配列の変化は、 ｐＭＯＮ５３４２の切り詰められたＢ、ｔ、に、遺伝子の５７９コドンのうちの ５５に変化をもたらした（約９．５％）。 表■によれば、上記の修飾全て（ｐ？ｌ０Ｎ５３７０）または個々の修飾の種々 の部分を含む修飾されたｓ、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子が構築された。これらの 遺伝子は、植物の形質転換のためにｐＭＯＮ８９３に挿入され、これらの遺伝子 を含むタバコ植物が解析された。個々の修飾をもつタバコ植物の解析が、いくつ かの理由で着手された。タバコにおける野生型の切り詰められた遺伝子の発現は 非常に弱く、結果としてＴＨ−に対する植物毒素の稀な同定を生じた。毒性はス ズメガの新生幼虫の損傷率が１以下（スケールはＯから４；Ｏは全部が保護され るのと等価、４で全て損傷）での少なくとも６０％の死亡率として、リーフフィ ーディング・アッセイにより定義される。修飾されたＨＤ−１遺伝子（ｐＭＯＮ ５３７０）は、タバコで発現の大きな増加（約１００倍と評価される一表■を見 よ）を示す。それ故、個々の修飾のため、野生型遺伝子の発現の増加は、毒性タ バコ植物の頻度および検出できるＢ、ｔ、に、タンパク質の存在に明らかな大き な増加となる。結果は次表に示されている：１反 ｌ己ユ１５立土し子　の６　、　　　の　　・　げ構築物　　　　修飾位置　　 植物の敞　毒性植物の数２月０Ｎ５３７０　１８５，２４０，６６９，９３０． 　　３８　　　　２２１１１０、１３８０ａ＋ｂ、　１６００ｐＭＯＮ１０７０ ７　１Ｂ５，２４０，４６２．６６９　　４８　　　　１９ｐＭＯＮ１０５３９ 　１８５　　　　　　　　５５　　　　　２ｐＭＯＮ１０５３７　２４０　　　 　　　　　５７　　　　１７ｐＭＯＮ１０５４０　１８５．２４０　　　　　　 ８８　　　　２３ｐＭＯＮ１０７０５　４６２　　　　　　　　４７　　　　　 １発現に対するそれぞれのオリゴヌクレオチドの変化の効果は、いくつかの全体 的な傾向を示した。鍵となる領域を同定するために設計された６個の異なる構築 物がつくられた。９個の異なるオリゴヌクレオチドは、遺伝子上の位置により半 分に分けられた。Ｎ−末端側の半分の変化は、ｐＭＯＮ１０７０７に取り込まれ た（１８５．２４０．４６２．６６９）。 Ｃ−末端側の半分の変化は、ｐＭＯＮ１０７０６に取り込まれた（９３０．１１ １０．１．３８０ａ＋ｂ、　１６００）。これら２個の構築物をもつ植物の解析 結果は、ｐＭＯＮ１０７０７は本質的に多くの毒性のある植物を生産する（４８ のうち１９）ことを示している。 これらの植物のタンパク質は、ＥＬＩＳＡ分析により検出される。ｐＭＯＮ１０ ７０６植物は、殺虫効果のある植物としてめったに同定されず（４３のうち］） 、そしてＢ、ｔ、に、のレベルは、免疫学的分析によりほとんど検出されなかっ た。 より詳細なＮ−末端の変化についての研究が４個のｐＭＯＮ構築物；　１０５３ ９　（１８５だけ）　、１０５３７　（２４０だけ）　、１０５４０（１８５お よび２４０）および１０７０５　（４６２だけ）を用いて行われた。２４０にお ける変化の存在が、本質的に多くの毒素をもつ植物を生ずるのに必要とされる（ ｐ？１ＯＮ１０５４０で、８８のうち２３　；　　ｐＭＯＮ１０５３７で、５７ のうち１７）ことを結果が示している。２４０の変化がないと、野生型遺伝子の 結果と同じく、低レベルＢ、　ｔ、に、タンパク質の低頻度の毒性植物しか生じ なかった。これらの結果は、２４０における変化が、タバコにおける類似の野生 型構築物以上のＢ、　ｔ、に、発現レベルの実質的な増加の原因であることを示 している。２４０と共に別の領域（１８５，４６２，６６９）の変化が、Ｂ、　 ｔ、に、発現の増加をもたらす（〉２倍）、シかし、遺伝子のＮ−末端部分の２ ４０領域での変化は、発現の劇的な増加をもたらす。 修飾遺伝子の発現における２４０領域の変化が重要であるにもかかわらず、発現 の増加は他の領域の変化により達成される。　Ｂ、ｔ、に、発現レベルに対する 合成遺伝子断片の効果を決定するために、一部野生型、一部合成の雑種遺伝子が つくられた。合成Ｎ−末端１／３（図２の１番目から５９０番目までの塩基対： 　Ｘｂａ１部位まで）および野生型Ｂ。 ｔ、に、　ＨＤ−１（ｐＭＯＮ５３７８）　Ｃ−末端をもつ雑種遺伝子がつくら れた。このベクターで形質転換された植物は、修飾ＨＤ−１遺伝子（ｐＭＯＮ５ ３７０）で形質転換された植物と同じ毒性であった。これは、２４０領域の変化 と一致する。しかし、野生型のＮ−末端１／３（第２のＸｂａ　１部位まで、最 初の６００塩基対をもつ野生型遺伝子）および合成Ｃ−末端２／３（図３の５９ ０番から１８４５番までの塩基対）をもつ雑種のｐＭＯＮ１０５３Ｂは、タバコ を形質転換するのに使用され、発現の劇的な増加を得た。発現レベルは、合成遺 伝子で見られるものと同様とは思われず、修飾された遺伝子レベルに匹敵する。 これらの結果は、ｐＭＯＮ１０５３８が完全な２４０領域をもつので、２４０断 片の修飾が発現の増加に必須でないことを示している。はとんどの場合、完全に 合成した遺伝子が、Ｂ、ｔ、に、発現レベルには優れている（例２を見よ）。 例２−−完全合成のＢ、ｔ、に、　）ＩＤ−１遺伝子以下の表■にあげられた植 物で好まれるコドンを用いて、合成り、ｔ、に、　）１０−１遺伝子が設計され た。表■は、コドンおよび野生型Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子（アミノ酸１か ら６１５）と本例の合成遺伝子におけるコドンの使用頻度を比較した、双子葉植 物遺伝子における使用頻度についてあげている。遺伝子のこの断片でのそれぞれ のアミノ酸の合計数が、アミノ酸の下の括弧にあげられている。 表Ｖ 合成り、Ｌ、に、　ＨＤ−１遺伝子のコドン使用表Ｖ（続き） 合成り、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子のコドン使用表Ｖ（続き） 合成り、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子のコドン使用アミノ酸　　コドン　　植物／ Ｗｔ　Ｂ、Ｌ、に、　／合成における使用パーセント ＡＴＴＴＡ配列を欠く得られた合成遺伝子は１個の潜在的ポリアゾニレ−ジョン 部位を含み、４８．５％のＧ＋Ｃ含量をもつ。第３図は、野生型ＨＤ−工配列配 列成遺伝子配列とのアミノＭ１から６１５までの比較である。合成遺伝子と野生 型遺伝子の間には約７７％のＤＮＡ相同性があり、６１５のうちの３５６個のコ ドン（約６０％）が変化していた。 例３−−合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝子Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３の結晶 タンパク質素は、いくつかの重要な農業害虫に対して高単位の活性を示す。ＨＤ −１およびＨＤ−７３の毒素タンパク質は、Ｎ−末端の４５０アミノ酸が実質的 に相同（〜９０％）であるが、４５１から６１５番の領域のアミノ酸では実質的 に異なる。　ＨＤ−１の１から４５０番のアミノ酸とＨＤ−７３の４５１から６ １５番のアミノ酸からなる融合タンパク質は、野生型ＨＤ−７３の殺虫性を示す 。合成ＨＤ−１Ｄ−子の５″の２７３（最初の１３５０塩基、５ａｃ１部位まで ）を用い、合成ＨＤ−１Ｄ−子を設計するのに用いたアルゴリズムと同じ方法で 、ＨＤ−７３の最後の５９０塩基（６４５番のアミノ酸まで）を劇的に修飾する ことが用いられた手法であった。下の表■は、５゛から３”の方向へ遺伝子に用 いられた順にＨＤ−７３遺伝子を修飾するのに使用したオリゴヌクレオチドをあ げている。９個のオリゴヌクレオチドが５９０塩基対領域に使用され、それぞれ のヌクレオチドは３３から６０塩基の範囲の大きさであった。変えられていない 領域は、ＡまたはＴ塩基の長い連続した列（６個以上）がない領域であった。全 てのポリアゾニレ−ジョン部位およびＡＴＴＴＡ部位は除去された。 表■ Ｂ、ｔ、に、　Ｎ［＋−７３の突然変異誘発プライマープライマー　　長さくｂ ｐ）　　　　　　　　配列ＣＧＧＴＧＴＡＴＣＣＡ ＡＡＴＣＣＴＧＧ 得られた遺伝子は、２個の潜在的なポリアゾニレ−ジョン部位（野生型では１８ 個に対応）をもち、ＡＴＴＴＡ配列はなかった（野生型では１２）。Ｇ十Ｃ含量 は３７％から４８％に増加した。合計５９の別々の塩基対の変化が表■のプライ マーを用いて行われた。全般的に、部位特異的突然変異により修飾されたＨＤ− ７３遺伝子の領域と、ＨＤ−７３に類似した領域の野生型配列の間には、９０％ のＤＮＡの相同性がある。合成ＨＤ−７３は、合成ＨＤ−１の最初の１３６０塩 基と次の５９０塩基または修飾されたＨＤ−７３配列との雑種である。 第４図は、上述の合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３と１から６４５番のアミノ酸を 暗号化する野生型Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３との比較である。 ＨＤ−７３遺伝子の修飾された領域で、表■に見られるオリゴヌクレオチドから 得られる部位特異的突然変異による変化の結果として、１７０コドンのうち４４ 　（２５％）が変化した。全般的に、合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３の約５０％ のコドンが、野生型およびＨＤ−１３遺伝子の類似断片とは異なる。 合成ＨＤ−７３Ｄ−子の中で、１８９０８９０塩基対での３°端をシーフェンシ ングしているうちに、１塩基対の欠損が検出された。これは、６４０番のアミノ 酸に未成熟な停止コドンをもつ（ｐＭＯＮ５３７９）、６２５番のアミノ酸にフ レームシフト変異の結果である。下記の表■では、４５１から６４５番のアミノ 酸に関しての本例の合成遺伝子に対するＢ、ｔ、に、　）１０−７３の野生型の 遺伝子のコドン使用および双子葉植物の天然に生じる遺伝子のコドン使用を比較 している。遺伝子のこの断片に暗号化されるそれぞれのアミノ酸の合計数は、ア ミノ酸の記号の下の括弧に見られる。 表■ 合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝子のコドン使用アミノ酸　　コドン　　植物 ／Ｗｔ　Ｂ、ｔ、に、　／合成における使用バーセント 表■（続き） 合成り、ｔ、に、　ｌＩＤ−７３遺伝子のコドン使用別の切り詰められた合成） １０−７３遺伝子が構築された。 この合成ＨＤ−７３遺伝子の配列は、上記の合成ＨＤ−７３遺伝子と重複してい る領域（２９から６１５番のアミノ酸）で同一で、Ｎ−末端でＮｅｔ−Ａｌａを 暗号化している。第８図は野生型ＨＤ−７３遺伝子に対するＮ−末端にＭｅｔ− Ａｌａをもつ、この切り詰められた合成ＨＤ−７３遺伝子の比較を示している。 前の例では、切り詰められたＢ、ｔ、に、タンパク質を暗号化する合成、修飾遺 伝子の調製について指示されていたが、全長の毒素タンパク質を暗号化する合成 または修飾された遺伝子もまた調製される。 全長のＢ、ｔ、に、遺伝子は、第４図の合成ＨＤ−７３配列の１から１８４５番 のヌクレオチドと天然のタンパク質の６１６番目のアミノ酸からＣ−末端を暗号 化する野生型ＨＤ−７３配列からなる。第９図は、野生型全長のＨＤ−７３遺伝 子に対するこの合成／野生型全長の１１０−７３遺伝子の比較を示している。 別の全長のＢ、　ｔ、　ｋ、遺伝子は、第４図の１から１８４５番のヌクレオチ ドの合成ＨＤ−７３配列と、天然のタンパク質の６１６番目のアミノ酸からＣ− 末端までを暗号化する修飾されたＨＤ−７３配列からなる。Ｃ−末端部分は、第 １図のアルゴリズムに従って、推定されるポリアゾニレ−ジョン信号とＡＴＴＴ Ａ配列を除去するために、部位特異的突然変異により修飾された。第１０図は、 野生型全長のＨＤ−７３遺伝子に対するこの合成／修飾された全長のＨＤ−７３ 遺伝子の比較を示している。 また別の全長のＢ、ｔ、に、遺伝子は、完全合成ＨＤ−７３配列からなり、これ は第４図の１から１８４５番のヌクレオチドの合成）ＩＤ−７３配列と、天然の タンパク質の６１６番目のアミノ酸からＣ−末端までを暗号化する合成配列を含 む。Ｃ−末端の合成部分は、推定されたポリアゾニレ−ジョン信号およびＡＴＴ ＴＡ配列を除去し、植物に好ましいコドンを含ませるために設計された。第１１ 図は、この完全合成全長ＨＤ−１３遺伝子と野生型全長ＨＤ−７３遺伝子の比較 を示している。 代わりになるものとして、別の全長のＢ、ｔ、に、遺伝子は、Ｂ、ｔ、に、　） ＩＱ−１（第３図）の１から１８３０番の塩基対とＢ、ｔ、ｋ、ＨＤ−７３（第 １１図）の１８３４から３５３４番の塩基対を含む完全に合成の配列からなる。 例４−−修飾された合成り、ｔ、に、　ＨＤ−１および合成ＨＤ−７３の発現 Ｂ、ｔ、に、遺伝子を発現させるための多くの植物形質転換ベクターが、前述の 遺伝子の構造コーディング配列を植物形質転換カセットベクターｐＭＯＮ８９３ に取り込むことにより構築された。さらに、それぞれの中間体形質転換ベクター は、八、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＡＣＯ（前掲）のような適当に無毒化された Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋ベクターに挿入される０組織外植片は無毒化され たＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｍベクターとともに培養され、既知の手順：タバ コ（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５）　　ｉトマト（ＭｃＣｏｒｍｉｃｌｅら、１９ ８６）　　；綿（Ｔｒｏｌｉｎｄｅｒら、１９８７）　を用いて、カナマイシン 耐性の選択のもとで植物を再生した。 ａ）タバコ ｐＭＯＮ９９２１　（野生短縮型）　、ｌ）ＭＯＮ５３７０　（修飾ＨＤ−１、 例１、第２図）、およびｐＭＯＮ５３７７　（合成＋１０−１、例２、第３図） をもつトランスジェニック・タバコ植物中のＢ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−１タンパク質のレベルが、ウェスタン分析により解析された。葉組織が液 体窒素で凍結され、微粉末にすりつぶされ、さらに１：２（重量：容量）の５Ｏ ３−ＰＡＧＥ試料緩衝液中ですりつぶされた。試料はドライアイスで凍結され、 沸騰水溶中で１０分間インキュベートされた後、１０分間遠心された。上清のタ ンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｔ　７２：２４８−２５４）により定量された。レーンあたりタン パク質５０ｕｇが９％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動後、ニトロセルロースに移さ れ、Ｂ、　ｔ、に、ＨＤ−１タンパク質は製造業者（Ｐｒｏｓｅｇａ、　Ｍａｄ ｉｓｏｎ、　ＷＩ）により述べられているように、１次抗体としてＢ、ｔ、に、 　）１０−１タンパク質に対して生産された抗体とアルカリホスファターゼを連 結した２次抗体を用いて視覚化された。精製１（Ｄ−１のトリプシン分解断片が 対照として使用された。　ｐＭＯＮ９９２１をもつタバコ植物のＢ、ｔ、に、タ ンパク質は検出レベル以下であったが、修飾（ｐＭＯＮ５３７０）および合成（ ｐＭＯＮ５３７７　）遺伝子をもつ植物のＢ、ｔＪ、タンパク質は容易に検出さ れた。　ｐＭＯＮ９９２１をもつ植物のＢ、ｔ、に、タンパク質は１０倍長いイ ンキュベーションの場合さえ、検出されないままであった。これらの植物のＢ、 ｔ、に、　ＨＤ−１タンパク質の相対的レベルは表■に評価されている。　ｐＭ ＯＮ９９２１をもつ植物のタンパク質は観察されないので、これらの植物のタン パク質レベルは相対的なｍＲＮＡレベルから評価された（以下を見よ）。修飾さ れた遺伝子（ｐＭＯＮ５３７０　）をもつ植物は、野生型遺伝子（ｐＭＯＮ９９ ２１　）をもつ植物の約１００倍のＢ、ｔ、に、タンパク質を発現した。完全に 合成したＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子（ｐ？１ＯＮ５３７７）をもつ植物は、 修飾された遺伝子をもつ植物の約５倍のタンパク質を発現した。修飾された遺伝 子が、観察されるＢ、ｔ、に、発現の増加の主たる原因となる０以上のデータを つくるのに使用した植物は、スズメガの幼虫を用いたバイオアッセイあるいは前 のウェスタン分析のデータのいずれかに基づく、それぞれの構築物からの最も代 表的なものである。 表■ トランスジェニックタバコにおける Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１タンパク質の発現野生型　　　ｐＭＯＮ９９２１　　　 　　１０　　　　　　１修飾　　　　ｐＭＯＮ５３７０　　　　１０００　　　 　　１００合成　　　　ｐＭＯＮ５３７７　　　　５０００　　　　　５００ウ 工スタン分析により観察されるタンノ（り質の増加量は、相当する生物活性を増 加させるかを定量するために、これらの遺伝子を含む植物の生物活性が試験され た。表！のウェスタン分析のデータに用いたのと同じ植物の葉が、２種の昆虫に ついて生物活性を試験された。分離した葉のバイオアッセイが最初に極めて感受 性の鱗し目昆虫であるスズメガの幼虫を用いて行われた。３種全てのトランスジ ェニック・タバコ植物の葉は全て保護され、スズメガの幼虫が１００％死ぬこと が観察された（以下の表■を見よ）。はとんど感受性のない昆虫である、シロイ チモンジョトウガの幼虫が次いで別の分離した葉のバイオアッセイに用いられた 。シロイチモンジョトウガの幼虫は、スズメガの幼虫よりも約５００倍Ｂ、ｔ、 に、　ＨＤ−１タンパク質に対して感受性が低い。これら２種の昆虫の感受性の 違いが、精製）１０−１タンパク賞を用いて、食餌の取り込みアッセイで定量さ れた（以下を見よ）。野生型遺伝子（ｐＭＯＮ９９２１）をもつ植物はシロイチ モンジョトウガの幼虫に対して最小の保護を示したが、一方修飾された遺伝子を もつ植物はほとんど完全な保護を示し、完全に合成の遺伝子をもつ植物はシロイ チモンジョトウガの幼虫の損傷に対して全く保護された。これらのバイオアッセ イの結果は、ウェスタン分析で観察されるＢ、ｔ、に、　ｌＩＤ−１発現レベル を確認し、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１タンパク質の増加レベルが殺虫活性の増加と 関係することを示している。 表■ なし　　　　　なし　　　　　ＮＬ　　　　　　ＮＬ表■（続き） 野生型　　　　ｐＭＯＮ９９２１　　　　０　　　　　３修飾　　　　　ｐＭＯ Ｎ５３７０　　　　０　　　　　１合成　　　　　ｐＭＯＮ５３７７　　　　０ 　　　　　０これらのトランスジェニック植物により生産されるＢ、ｔ、に、　 ）１０−１タンパク質の生物活性がさらに、より正確に相対的活性を定量するた めに調べられた。野生型、修飾された、および合成の遺伝子をもつタバコ植物の 葉の組織が、１：２（重量：容量）の比率で１００１１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ１ｏ）中ですりつぶされた。微粒子物質は遠心により除去された。上清は Ｍａｒｒｏｎｅらにより述べられた（１９８５）のと類似の合成飼料に混合され た。２０％水成分の代わりに混合された植物抽出溶液をもつ飼料メディアは試験 当日に調製された。飼料１１１！！、が９６穴プレートに分注された。 飼料を乾燥後、１匹のオオタバコガの新生幼虫がそれぞれの穴に添加された。１ ６匹の昆虫がそれぞれの植物試料について試験された。植物は２７°Ｃでインキ ュベートされた。７日後、それぞれの処理をした幼虫が合わせられ、分析用天秤 で重量が計られた。昆虫あたりの平均重量が計算され、幼虫の平均重量に対する Ｂ、　ｔ、に、タンパク質濃度の標準曲線に比較された。昆虫重量はＢ、ｔ、に 、タンパク質濃度の相対的増加に対して、（対数で）逆比例した。 幼虫の生育阻害の程度に基づ（Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１タンパク質量はそれぞれ ３種の遺伝子をもつ２種の異なる植物で定量された。比活性〔植物タンパク質」 ■あたりのＢ、　ｔ、ｋ。 ＨＤ−１のｎｇ）がそれぞれの植物で定量された。修飾されたＨＤ−１遺伝子（ ｐＭＯＮ５３７０）をもつ植物は、平均して、植物抽出タンパク質１■あたり約 １４００ｎｇ　（１２００から１６００ｎｇ）のＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１を含ん でいた。この値は、ウェスタン分析により定量されたように（表ＩＬ植物抽出タ ンパク質」■あたりＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１タンパク質１１０００ｎにしっかり 匹敵する。合成ＨＤ−１遺伝子をもつ植物のＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１濃度は、平 均して植物抽出タンパク質１■あたり約８２００１ｇ（７２００から９２００ｎ ｇ　）のＢ、ｔ、に、　ＲＯ−１タンパク質を含んでいた。この数字は、ウェス タン分析により推定された植物抽出タンパク質１ｇあたり５０００ｎｇのＨＤ− １タンパク質に十分匹敵する。同様に、合成遺伝子をもつ植物はこれらのバイオ アッセイで、修飾された遺伝子をもつそれに相当する植物の約６倍の比活性を示 した。ウェスタン分析では、その比率は約１０倍で、さらに両者がよく一致した 。 野生型ＨＤ−１遺伝子（ｐＨ０Ｎ９９２１）をもつ植物のＢ、ｔ、に、タンパク 質レベルは、幼虫の重量を顕著に減少させるにはあまりに低く、それ故このアッ セイで定量できるレベル以下であった。結論として、バイオアッセイおよびウエ スタン分析の両者により定量された、修飾された、および合成の遺伝子をもつこ れらの植物でのＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１タンパク質レベルは、これらの植物によ り生産されるＢ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−１タンパク質が生物学的に活性があることを示すことにおいて一致する。 ｍＲＮＡレベルは野生型Ｂ、ｔ、に、　Ｈｌｌ−１遺伝子（＋）ＭＯＮ９９２１ 　）および修飾された遺伝子（ｐＭＯＮ５３７０）をもつ植物で、タンパク質生 産の増加レベルは増加した転写または翻訳に由来するかどうかを確立するために 定量された。野生型および修飾された遺伝子を用いているので、コーディング配 列に非常に多くの変化があるために、合成遺伝子をもつ植物のｍＲＮＡは直接的 に同しＤＮＡプローブを用いて解析することはできなかった。ｍＲＮＡは単離さ れ、野生型または修飾された遺伝子コーディング配列の５°端の約９０塩基対に 相同な単鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイズされた。 ハイプリントはＳ１ヌクレアーゼで消化され、保護されたプローブ断片はゲル電 気泳動により解析された。大過剰のプローブと長時間のハイブリダイゼーション を手順として用いたので、保護されるプローブ量は試料中に存在するＢ、　ｔ、 に、ｍＲＮＡの量に比例する。修飾された遺伝子（ｐＭＯＮ５３７０）を発現す る２種の植物は、野生型遺伝子（ｐＭＯＮ９９２１　）を発現する植物の１０倍 まで多くのＲＮＡを生産することが発見された。 修飾された遺伝子の増加したｍＲＮＡレベルは、この遺伝子に導入された修飾か ら予測される結果と一致する。しかし、野生型遺伝子に比較して修飾された遺伝 子でのｍＲＮＡのこの１０倍の増加は、タバコ植物中のこれらの遺伝子のＢ、ｔ 、に、タンパク質の１００倍の増加に対比される。２つのｍＲＮＡが同様に十分 翻訳されるならば、安定なｍＲＮＡの１０倍の増加からタンパク質の１０倍の回 収の増加が予想される。タンパク質がより高く増加することは、修飾された遺伝 子のｔａ　ＲＮ　Ａが野生型よりも約１０倍の高効率で翻訳されることを示して いる。それ故、遺伝子発現の全効果の約半分はｍＲＮＡレベルの変化により説明 され、半分は翻訳効率の変化により説明される。この翻訳効率の増加が、はんの 約９．５％のコドンが修飾された遺伝子中で変化したことに鑑み、衝撃的である 一つまり、この効果は明らかに大規模なコドン使用の変化のためではない。増加 した翻訳効率は、翻訳に影響を及ぼすｍＲＮＡ　２次構造中の変化あるいは変化 した特異的なコドンのための特異的翻訳阻害の除去のためであろう。 合成ＨＤ−１遺伝子で見られる発現の増加はまた、タバコの合成ＨＤ−７３遺伝 子でも観察された。　Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３は野生型の短縮型ＨＤ−７３遺 伝子（ｐＭＯＮ５３６７）をもつタバコ植物の抽出物では検出されず、一方Ｂ、 ｔ、に、　ＨＤ−７３タンパク質は第４図の合成）１０−７３遺伝子（ｐＭＯＮ ５３８３）をもつタバコ植物の抽出物に容易に検出された。Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ −７３タンパク質約１１０００ｎが、全可溶性植物タンパク質１■について検出 された。 上記例３に述べられているように、ｐＭＯＮ５３８３に暗号化されるＢ、ｔ、に 、　）Ｉｎ−７３タンパク質は、野生型ＨＤ−７３タンパク質では暗号化されな いアミノ酸の小さなＣ−末端の拡張部分をもつ。これらの特別なアミノ酸は昆虫 毒性あるいは植物の発現の増加に対して、何の効果もなかった。第２の合成ＨＤ −７３遺伝子が例３（第８図）に述べられているように構築され、タバコを形質 転換するために使用された（　ｐＭＯＮ５３９０　）。ｐｌ’１ＯＮ５３９０を もつ植物の分析は、この遺伝子がｐＭＯＮ５３８３に匹敵するレベルで発現し、 これらの植物が類似の殺虫効果をもつことを示した。 タバコ植物で、合成ＨＤ−１遺伝子は合成ＨＤ−７３遺伝子の約５倍高レベルで 発現された。しかし、この合成ＨＤ−７３遺伝子は野生型ＨＤ−７３遺伝子より もなお少なくとも１００倍よく発現された。　　ＨＤ−７３タンパク質はＨ［ｌ −１タンパク質よりも、多（の害虫に対して約５倍多い毒性があり、それで、合 成ＨＤ−１およびＨＤ−７３遺伝子の両者はタバコでおおよそ匹敵できる殺虫効 果を与える。 例３で述べられている全長のＢ、ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝子はまた、植物形質 転換ベクターｐＭＯＮ８９３に取り込まれ、さらにそれらはＥｎ　３５Ｓプロモ ーターから発現される。図９の合成の／野生型全長のＨＤ−７３遺伝子は、ｐＭ ＯＮ１０５０５を作製するためにｐＭＯＮ８９３に取り込まれた。図１０の合成 の／修飾された全長の）ＩＤ−７３遺伝子は、ｐＭＯＮ１０５２６を作製するた めにｐＭＯＮ８９３に取り込まれた。図１１の完全に合成されたＨＤ−７３遺伝 子は、ｐＭＯＮ１０５１Ｂを作製するためにｐＭＯＮ８９３に取り込まれた。こ れらのベクターは、形質転換されたタバコ植物を得るために使用され、植物はウ ェスタンプロットまたはＥＬＩＳＡイムノアッセイにより、殺虫効果およびＢ、 ｔ、に、　ＨＤ−７３タンパク質レベルについて解析された。 これらの全長のＢ、ｔ、に、遺伝子の３種全てをもつタバコ植物は、検出できる Ｂ、　ｔ、に、タンパク質を生産し、スズメガの幼虫が１００％死亡を示した。 この結果は、トランスジェニック植物で全長のＢ、　ｔ、に、遺伝子を発現させ る以前に報告された試みに照らして考えると驚（べきことである、　　Ｖａｅｃ ｋらは（１９８７）　、我々のＨＤ−１遺伝子に類似の全長のＢ、ｔ、に、　ｂ ｅｒｌｉｎｅｒ遺伝子が、タバコ中で検出できるほど発現されなかったことを報 告した。Ｂａｒｔｏｎらは（１９８７）、Ｂ、Ｌ、に、　ＨＤ−１の別の全長の 遺伝子（いわゆる４、５ｋｂ遺伝子）で同様の結果を報告し、さらにこの遺伝子 をもつタバコのカルスが壊死になることを示し、このことは全長の遺伝子産物が 植物細胞にとって有毒であることを示していた。 Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆらは（１９８７）　、全長のＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子 はトマトでは短縮型遺伝子に比べて、はとんど発現せず、スズメガの幼虫に対し て完全に毒性のある植物は回収されなかったことを報告した。上記３種の報告全 ては、それぞれのＢ、ｔ、に、遺伝子が切り詰められていると、より高レベルの 発現と毒性植物の回収があることを示していた。 Ａｄａｎｇらは、全長のＨＤ−７３遺伝子から、スズメガの幼虫に対していくら か生物学的活性をもつく高度な毒性のものはなかった）いくつかのタバコ植物お よびわずかに検出できるＢ、ｔ、に、タンパク質を得たことを報告した。これら の植物の主要なり、　ｔ、　ｋ、ｍＲＮＡが、機能的な毒素を暗号化していない 短縮型１．７ｋｂＯものであったこともまた彼らにより注目された。これは、タ バコで遺伝子が不適当に発現していることを示していた。これらの報告全てと対 照的に、とりわけ述べられている３種の全長のＢ、　ｔ、に、ＨＤ−７３遺伝子 は相対的に高レベルのタンパク質と高レベルの昆虫毒性という結果を導き出す。 タバコ植物におけるＢ、　ｔ、に、タンパク質およびｍＲＮＡレベルが、これら の３種のベクターについて表Ｘに示されている０表から見られるように、合成／ 野生型遺伝子（ｐＭＯＮ１０５０６）はＢ、ｔ、に、タンパク質を全可溶性タン パク質の約０．０１％生産する；合成／修飾遺伝子はＢ、ｔ、に、を全可溶性タ ンパク質の約０．０２％生産し；完全に合成された遺伝子はＢ、　ｔ、に、を全 可溶性タンパク質の約０．２％生産する。Ｂ。 ｔ、に、ｍＲＮＡはこれらの植物で、ノーザンプロット分析により、プローブと して合成の、通常の遺伝子の５゛側の半分を用いて解析された０表Ｘに示されて いるように、タンパク質の増加レベルは主としてｍＲＮＡの増加レベルに起因す る。短縮型修飾および合成遺伝子と比較すると、これは、翻訳効率の増加の主た る要因は遺伝子の５′側の半分にあり、遺伝子の３′側半分は５ＲＮＡの安定性 の主要な因子を含んでいることを示している。タンパク質の増加レベルはまた、 合成または修飾された全長の遺伝子量が増加することはＢ、ｔ、に、タンパク質 レベルを増加することを示シテイル。短縮型合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝 子（ｐＭＯＮ５３８３またはＩ］ＭＯＮ５３９０）　ニ比較して、完全合成遺伝 子（ｐＭＯＮ１０５１８）はかなりあるいは、わずかに多（Ｂ、ｔ、に、タンパ ク質を生産し、このことは、全長の遺伝子が植物中で高レベルで発現されること を示している。高レベルの全長のＨＤ−７３タンパク質をもつこれらのタバコ植 物は、異常性の証拠を示さず、完全に結実能をもつ。これらの植物のＢ、ｔ、ｋ 。 タンパク質レベルはまた、シロイチモンジョトウガの幼虫を用いた食餠の研究ま たはスズメガの幼虫を用いた植物抽出物の飼料への取り込みアッセイに基づく予 想されたレベルの昆虫毒性を生産する。これらのタバコ植物でウェスタンプロッ ト分析により検出される８、　ｔ、に、タンパク質は、明らかに全長のタンパク 質のタンパク分解断片である約８０ｋＤａの異なる量のタンパク質をしばしば含 む。 全長のタンパク質のＣ−末端側半分はタンパク分解酵素に感受性であることが知 られており、類似のタンパク分解断片が大腸菌およびＢ、　ｔ、自身の全長の遺 伝子に見られる。 これらの断片は完全に殺虫効果をもつ、ノーザン分析は、本質的にこれら全長の 遺伝子のｍＲＮＡの全てが予想された全長の大きさであることを示した。　　８ ０ｋＤａタンパク質断片を生じさせることができる短縮型＋１ｌＲＮＡの証拠は ない。 さらに、断片が完全な植物細胞中に存在せず、単にイムノアッセイのための抽出 の間のタンパク分解によるという可能性もある。 表Ｘ 合成／野生型　ｐＭＯＮ１０５０６　　　＞１００　　　　０．５合成／修飾　 　ｐＭＯＮ１０５２６　　４００　　　　　１完全合成　　　ｐＭＯＮ１０５１ ８　　　＞２０００　　　　４０従って、植物中で合成遺伝子から高レベルのＢ 、　ｔ、ｋ。 ＨＤ−７３タンパク質を生産するための重大な障害はなく、これはＢ、ｔ、に、 　ＨＤ−１またはＢ、ｔ、　ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓのような他の全長の鱗し目 の活性のある遺伝子でも真実であると予想される０例３の完全に合成したＢ、ｔ 、、に、　ＨＤ−１遺伝子は、ｐＭＯＮ８９３のような植物形質転換ベクターに 集められた。 １）？１ＯＮ１０５１８の完全に合成の遺伝子はまた別の植物ベクターで使用さ れ、タバコ植物で解析された。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは一般的にほとんど の植物組織で高レベルの構成的プロモーターであるが、ＣａＦＩＶ３５Ｓプロモ ーターを動かす遺伝子の発現レベルは、葉組織で見られるレベルに比べ花組織で は低い、ある昆虫により損傷を受ける経済的に重要な標的は花の部分あるいは花 部分に由来する（例えば、開いていない綿花およびボール、タバコのつぼみ、ト マトのつぼみおよび果実）ので、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで得られる以上に これらの組織でＢ、　ｔ、タンパク質の発現を増加するのに有利である。 ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）の３５ＳプロモーターはＣａＭＶ３５ Ｓプロモーターに類似している。このプロモーターはｊＩ＃され、ｐＭＯＮ８９ ３に類似の植物形質転換ベクターに工作された。ＣａＭＶプロモーターに比べ、 ＦＭＶ３５Ｓプロモーターは花組織で高度に発現され、その一方で葉のような他 の組織においても、類似した高レベルの遺伝子発現をする。植物形質転換ベクタ ーであるｐＭＯＮ１０５１７が構築され、その中で、第１１図の全長の合成り、 ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝子がＦＭＶ　３５Ｓプロモーターにより動かされた。 このベクターは、ＦＭＶプロモーターがＣａＭＶプロモーターと置き換えられて いることを除いて、例３のｐＭＯＮ１０５１８と同一である。ｐＭＯＮ１０５１ ７およびｐＭＯＮ１０５１Ｂで形質転換されたタバコ植物が得られ、ウェスタン プロットまたはＥＬＩＳＡイムノアッセイにより、葉および花組織でのＢ、　ｔ 。 ｋ、タンパク質の発現が比較された。この分析は、ＦＭＶプロモーターをもつｐ ？１ＯＮ１０５１７がＣａＭＶプロモーターをもつｐＭＯＮ１０５１８よりも花 組織で、より高レベルで全長のＨＤ−７３タンパク質を発現することを示した。 葉組織におけるｐＭＯＮ１０５１７の全長のＢ、ｔ、に、　Ｈ［１−７３タンパ ク質の発現は、ｐＭＯＮ１０５１８をもつ最高に発現する植物で見られるものに 匹敵する。しかし花組織を分析したところ、葉組織で高レベルのＢ、　ｔ、に、 タンパク質をもつｐＭＯＮ１０５１８をもつタバコ植物では、花の中に検出でき るＢ、ｔ、に、タンパク質は持っていなかった。一方、ｐＭＯＮ１０５１７をも つタバコ植物の花は、葉とほぼ同程度の、全可溶性タンパク質の約０．０５％の Ｂ、ｔ、に、タンパク質レベルを有していた。この分析は、ＦＭＶプロモーター がＣａＦジブロモ−ターに比べ花組織で、比較的高レベルのＢ、ｔ、に、タンパ ク質を生産するのに使用できることを示した。 ｂ）トマト タバコで試験された野生型、修飾および合成のＢ、ｔ、ｋ。 １（Ｄ−１遺伝子が、本発明の広範囲の有用性を示すために、他の植物に導入さ れた。これら３種の遺伝子をもつトランスジェニックトマトが作出された。タバ コで修飾および合成遺伝子を用いて観察された発現の増加がまたトマトにも広げ られることをデータは示している。Ｂ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−１タンパク質は野生型ＨＤ−１遺伝子（ｐＭＯＮ９９２１　）を持つ植物 ではほんの僅かだけ検出されるが、修飾（ｐｎｏＮ５３７０）または合成（ｐＭ ｏＮ５３７７　）遺伝子をもつ植物では、Ｂ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−１は容易に検出され、定量されるレベルであった。野生型、修飾および合 成ＨＤ−１遺伝子をもつ植物の発現レベルは全植物抽出物１■あたり約１０．１ ００および５００ｎｇであった（以下の表ＸＩを見よ）。修飾遺伝子でのＢ、　 ｔ、に、１（Ｄ−１タンパク質の増加により、観察される増加の大部分が説明さ れた；野生型遺伝子をもつ植物の１０倍高く、合成遺伝子をもつ植物のさらに５ 倍の増加であった。さらに修飾遺伝子でつくられる部位特異的な変化はＢ、ｔ、 に、　ＨＤ−１の発現を増加させる主たる要因である。 表ＸＩ Ｂ、　ｔ、に、　　　　Ｂ、　ｔ、に、発現遺伝子の種類　ベクター　タンパク 質濃度”　の増加倍率野生型　　　　ｐＭＯＮ９９２１　　　１０　　　　　　 １修飾　　　　　ｐＭＯＮ５３７０　　　１００　　　　　１０合成　　　　　 ｐＭＯＮ５３７７　　　５００　　　　　５０Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１発現にお けるこれらの違いは、スズメガの幼虫およびシロイチモンジョトウガの幼虫に対 するバイオアッセイで確定された。これらの遺伝子のそれぞれをもつトマト植物 の葉がスズメガの幼虫の損傷をコントロールし、１００％死亡させた。シロイチ モンジョトウガの幼虫では、野生型ＨＤ−１遺伝子（ｐｑｏＮ９９２１　）をも つ植物の葉は著しい損傷を示し、修飾された遺伝子（＋）ＭＯＮ５３７０　）を もつ植物の葉は損傷が少なく、合成遺伝子（ｐＭＯＮ５３７７）をもつ植物の葉 は完全に保護された（以下の表ＸＩＩを見よ）。 表ＸＩＩ なし　　　　　なし　　　　　ＮＬ　　　　　　　ＮＬ野生型　　　　ｐＭＯＮ ９９２１　　　　０　　　　　　３表Ｘ１ｌ（続き） 修飾　　　　　ｐＭＯＮ５３７０　　　　０　　　　　　１合成　　　　　ｐＭ ＯＮ５３７７　　　　０　　　　　　０＊損傷は表ＩＸに示されているように評 価された。 合成遺伝子を用いるアプローチの一般性は合成り、ｔ、ｋ。 ）１０−７３遺伝子を用いたトマトに拡張された。 トマトでは、野生型の短縮型ＨＤ−７３遺伝子（ｐＭＯＮ５３６７　）をもつ植 物の抽出物は、検出可能なＨＤ−７３タンパク質を示さなかった。合成ＨＤ−７ ３遺伝子（、ＭＯＮ５３８３　）をもつ植物の抽出物は、高レベルのＢ、ｔ、に 、　ＨＤ−７３タンパク質を、植物抽出タンパク質１■あたり約２０００ｎｇ示 した。これらのデータは明らかに、合成ＨＤ−７３遺伝子につくられる変化がタ バコ同様トマトのＨＤ−７３タンパク質の発現に劇的な増加をもたらすことを示 している。 タバコとは対照的に、トマトの合成ＨＤ−７３遺伝子は合成ＨＤ−１遺伝子より 約４から５倍高レベルで発現される。 ８０−７３タンパク質はｆｌｅｌｉｏｔｈｉｓ種を含む多くの害虫に対してＨＤ −１タンパク質より約５倍活性が高いので、合成ＨＯ−１と比較して合成ＨＤ− ７３の発現の増加はトマトでは約２５倍増加した殺虫効果に相当する。 トマトにおける修飾および合成り、ｔ、に、　Ｈ［）−］遺伝子の発現の増加に 含まれる機構を決定するために、形質転換されたトマト植物のｍＲＮＡレベルの Ｓ１ヌクレア一ゼ分析が行われた。上に示したように、類似の分析がタバコ植物 で行われ、そしてこの分析は、修飾された遺伝子は野生型遺伝子より１０倍多く 　ｔａＲＮＡを生産することを示した。トマトの分析では、同一のプローブをも つ野生型（ｐＭＯＮ９９２１）、修飾（＋）？ｌ０Ｎ５３７０　）および合成（ ｐＭＯＮ５３７７）　１１０−１遺伝子の解析をさせる異なるＤＮＡプローブを 使用した。このプローブは、これらのベクター（ｐＭＯＮ９９２１、ｐＭＯＮ５ ３７０およびｐＭｏＮ５３７７）　３種全てに共通のｐＭＯＮ８９３のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの５″未翻訳領域に由来する。この３１分析は、修飾された 遺伝子のＢ、　ｔ、に、ｍＲＮＡレベルが野生型遺伝子より３から５倍高く、合 成遺伝子のｍＲＮＡレベルは修飾遺伝子よりもおよそ２から３倍高いことを示し た。３個の独立の形質転換体がそれぞれの遺伝子について解析された。 表ＸＩに示されたトマトにおけるこれらの遺伝子からのＢ。 ｔ、に、　ＨＤ−１タンパク質の増加倍率を比較すると、これらの■ＲＮへの増 加は、野生型および修飾された遺伝子についてタバコで見られたものの全タンパ ク質増加の約半分と説明できる。トマトでは、野生型から合成の全５ＲＮＡの増 加は、約５０倍のタンパク質増加に比べて約６から１５倍である。この結果は、 野生型および修飾された遺伝子を比較すると、タバコで見られるのと類似してお り、同様に合成遺伝子に拡張される。つまり、野生型から修飾された遺伝子への Ｂ、ｔ、に、タンパク質の増加の全倍率の約半分は、＠ＲＮＡの増加により、約 半分は強化された翻訳効率により説明される。修飾された遺伝子を合成遺伝子と 比較する場合もまた同様のことがいえる。　ＲＮＡ　レベルはさらに増加するが 、このｍＲＮＡの増加は全タンパク質の増加の約半分だけを説明できる。 上述の全長のＢ、　ｔ、に、遺伝子はまた、トマト植物を形質転換するために使 用され、これらの植物はＢ、ｔ、に、タンパク質と殺虫効果について分析された 。この分析の結果が表Ｘ１１１ニ示されティる０合成／野生型遺伝子（ｐＭＯＮ １０５０６）をもつ植物は、その全可溶性タンパク質の約０．０１％のレベルで Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−７３タンパク質を生産する０合成／修飾遺伝子（ｐ門０Ｎ １０５２６）をもつ植物は、約０．０４％のＢ、　ｔ、に、タンパク質を生産し 、完全合成された遺伝子（ｐＭＯＮ１０５１８）をもつ植物は、約０．２％Ｂ、 ｔ、に、タンパク質を生産する。 これらの結果は、同じ遺伝子でのタバコ植物の結果に非常に似ている。ノーザン プロット分析により評価されたトマトでのｍＲＮＡレベルはまた、タンパク質レ ベルの増加に平行して増加する。これら３種の遺伝子をもつタバコに関しては、 タンパク質の増加のほとんどはｍＲＮＡの増加に起因し、完全合成遺伝子で示さ れた翻訳効率増加が少し寄与する。最高レベルの（ｐＭＯＮ１０５１８の）全長 のＢ、ｔ、ｋ。 タンパク質は、短縮型１１０−７３遺伝子（ｐＭＯＮ５３８３およびｐＭＯＮ５ ３９０　）で観察された最高レベルに匹敵するか、または僅かに低い程度である 。これらの全長遺伝子を発現するトマト植物は、シロイチモンジョトウガの幼虫 を用いた食餌アッセイまたはスズメガの幼虫を用いた植物抽出物の飼料への取り 込みにより定量されたように、観察されたタンパク賞レベルから予想される殺虫 活性を有する。 表Ｘ１ｌ１ 合成／野生型　ｐＭＯＮ１０５０６　　１００　　　　　１合成／修飾　　ｐＭ ＯＮ１０５２６　　４００　　　　　２−４完全合成　　　ｐＭＯＮ１０５１８ 　　２０００　　　　１０Ｃ）綿 修飾および合成遺伝子の利用によるＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１およびＢ、ｔ、に、 　ＨＤ−７３の発現の増加の一般性は綿にまで拡張された。トランスジェニック カルスが生産され、これには野生型（ｐ）１ＯＮ９９２１　）および合成ＨＤ− １（ρＭＯＮ５３７７＞遺伝子が含まれていた。やはり、野生型遺伝子をもつカ ルスから生産されたＢ、　ｔ、に、ＦＩＤ−１タンパク質は検出されなかったが 、合成ＨＤ−１遺伝子をもつカルスは容易に検出できるレベルでＨＤ−１タンパ ク質を発現した。ＨＤ−１タンパク賞は植物カルス抽出タンパク質１■あたり約 １１０００ｎで生産された。さらに、トランスジェニックな綿のカルスにより生 産されたタンパク質が生物学的に活性があり、合成遺伝子を用いて観察された発 現の増加が生物学的活性を増加させるように翻訳されることを確実なものとする ために、綿カルスの抽出物が、できるだけ多くの水分を除去するために−ｈａｔ ｍａｎ濾祇の間でカルスが最初に乾燥されたことを除いて、タバコ植物で述べら れているのと類似の方法で調製された。乾燥カルスは液体窒素中で細かく破砕さ れ、さらに１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中ですりつぶされた。 この物質の約０　、５　ｍｌ溶液が絵筆でトマトの葉に塗布された。葉を乾燥さ せた後、５匹のスズメガの幼虫が２枚の葉の試料のそれぞれにのせられた。コン トロールのカルスの抽出物を塗布した葉は完全に破壊された。野生型ＨＤ−１遺 伝子（ｐＭＯＮ９９２１　）をもつカルスの抽出物を塗布した葉はひどい損傷を 示した。合成ＨＤ−］遺伝子（ｐＭＯＮ５３７７　）をもつカルスの抽出物を塗 布した葉は全く損傷を示さなかった（以下の表ＸＩＶを見よ）。 表ｘＩｖ 遺伝子の種類　　　ベクター　　スズメガによる損傷”コントロール　　　コン トロール　　　　ＮＬ　　　−野生型ＨＤ−１９Ｍ０Ｎ９９２１　　　　　　　 ３合成ＨＤ−１ｐＭＯＮ５３７７　　　　　　　０合成ＨＤ−７３　　　　　ｐ ＭＯＮ５３８３　　　　　　　０本損傷は表ＶＩＩＩに示されているように評価 されたＢ、ｔ、に、　）１０−７３を暗号化する別の合成遺伝子をもつ綿のカル スがまた作出された。この遺伝子の調製は例３に述べられている０合成ＨＤ−７ ３遺伝子をもつカルスは、合成ＨＤ−１遺伝子をもつカルスより高レベルで相当 する）１０−７３タンパク質を生産した。　　ＨＤ−７３合成遺伝子（ｐ？ｌ０ ８５３８３　）をもつカルスの抽出物は、上述の１（Ｄ−１タンパク質を含む抽 出物の場合のように、トマトの葉に塗布されると、スズメガの幼虫の完全なコン トロールを示した（表ＸＩＶを見よ）。 合成り、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子（ｐＭＯＮ５３７’？　）または合成り、　 ｔ、ｋ。 ＨＤ−７３遺伝子（ｐＭＯＮ５３８３）をもつトランスジェニック綿植物もまた 試験された。これらの植物は、同じ遺伝子をもつ綿カルスで見られるのに匹敵し 、これらの遺伝子をもつトマトおよびタバコ植物に匹敵するレベルで、ＨＤ−１ またはＨＤ−７３タンパク質を生産する。合成短縮型のＨＤ−１またはＨＤ−７ ３遺伝子の場合、全タンパク質１ｍ１ｇあたり１０００から２０００ｎｇ　（０ ，１から０．２％）のＢ、ｔ、に、タンパク質を発現する綿植物が高頻度で回収 された。昆虫食餌アッセイが合成ＨＤ−１またはＨＤ−７３遺伝子を発現する綿 植物の葉を用いて行われた。これらの葉はイラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃ−ｈｏ ｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）の幼虫で試験された場合損傷は示さす（率Ｏ）、シロイチ モンジョトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｊｇｕａ）の幼虫で試験された場 合はんの僅かの損傷を示した。損傷率は上記の表ＶＩＴＩに定義されているとお りである。このことは、カルス同様綿植物は高レベルで合成ＨＤ−１またはＨＤ −７３遺伝子を発現し、これらの植物は鱗し目昆虫の幼虫による損傷から保護さ れることを示した。 合成短縮型１１０−１遺伝子（ＰＭＯＮ５３７７　）あるいは合成短縮型ＨＤ− ７３遺伝子（ｐＭＯＮ５３８３　）のいずれかをもつトランスジェニック綿植物 はまた、温室内の全植物でのオオタ／ＮＪコガの幼虫に対する保護について評価 された。これはこれらの植物の、農業的に許容可能なレベルのコントロールを生 産する能力についてのより現実的な試験である。 オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ）は末端、開いていない綿花および ボールを壊すことにより経済的損傷を生み出す綿の主たる害虫で、葉の組織同様 、これらの子実体の保護は効果的な昆虫コントロールと適当な穀物保護にとって 重要であろう。全植物に与えられる保護を試験するために、高レベルのＢ、ｔ、 に、　ＨＤ−１（ｐＭＯＮ５３７７）またはＢ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−７３（ｐＭＯＮ５３８３）のいずれかを発現する綿植物のＲ１子孫が、そ れぞれの植物で、最高２０の開いていない綿花またはボールについて、ボールま たは開いていない綿花あたり１０から１５のオオタバコガの卵を置くことにより 試験された。少なくとも処理あたり１２の植物が分析された。卯のふ化率は約７ ０％であった。これは、代表的なフィールド条件下で見られる植物あたりの幼虫 数に比べると、非常に高い昆虫圧に相当する。これらの条件下で、コントロール の綿植物のボール１００％が昆虫による損傷で破壊された。トランスジェニック では、顕著なボール保護が観察された。ｐＭＯＮ５３７７　（ＨＤ−１）をもつ 植物では、７０から７５％のボールが、このアッセイの強い圧力を生き残る。 ｐＭＯＮ５３８３　（ＨＤ−７３）をもつ植物は８０から９０％のボール保護を もつ。これはＨＤ−１タンパク質に比ベオオタバコガに対して）１０−７３タン パク質がより高活性の結果らしい。トランスジェニック植物が昆虫により損傷さ れる場合、生き残った幼虫は少なくとも１齢その発生が遅れた。 それ故、修飾および合成遺伝子で得られた発現の増加はひとつの穀物に限定され ない；タバコ、トマトおよび綿カルスと綿植物は全て、修飾または合成遺伝子を もつ植物／カルスが作出されたとき、Ｂ、ｔ、に、発現に劇的な増加を示した。 同様に、修飾および合成り、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子を作出するためにつくら れた変化の利用は）１０−１遺伝子に限定されない。３種全ての合成）１０−７ ３遺伝子はまた、発現で劇的な増加示した。 要するに、以下のことを示した：（１）ＨＤ−１修飾遺伝子につくられた遺伝的 変化はＢ、ｔ、に、　ＨＤ−１の発現に非常に顕著な増加をもたらした。；　（ ２）全合成遺伝子の作出は、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１発現にさらに５倍の増加を もたらした；（３）ＨＤ−１遺伝子に取り込まれた変化は、合成遺伝子で観察さ れたＢ、ｔ、に、発現の増加の大部分を説明した；（４）発現の増加は３種の異 なる植物−一タバコ植物、トマト植物および綿カルスと綿植物で示された；（５ ）ウェスタン分析により観察された発現の増加もまた生物活性の類似の増加と関 連し、生産されたＢ、ｔ、に、　Ｈ’Ｄ−１タンパク質は同等に活性があること が示された；　（６）合成ＨＤ−１遺伝子を設計するのに用いた本発明の方法が 合成ＨＤ−７３遺伝子を設計するために使用されると、タバコ、トマトおよび綿 で、野生型の同等の遺伝子よりも非常に高レベルで発現され、その結果、生物活 性も増加した；（７）完全合成の全長のＢ、　ｔ、に、遺伝子は合成短縮型遺伝 子に匹敵するレベルで発現された。 例５−−タバコ、トマトおよびジャガイモでの合成り、　ｔ。 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ遺伝子 図１２によれば、鞘し目に活性のある毒素を暗号化する合成遺伝子が、Ｂ、ｔ、 　ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの野生型遺伝子に指示された変化をさせること、また は合成構造遺伝子の新たな合成により調製される。合成遺伝子はｐｎｏＮ８９３ のような中間体植物形質転換ベクターに挿入される：合成り、　ｔ。 ｔ、遺伝子をもつプラスミドｐＭＯＮ８９３はその後、Ａ、ｔｕｍｅｆａ−ｃｉ ｅｎｓ　ＡＣＯのような適当な、無毒化されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＊の株 に挿入される。 ジャガイモの形質転換および再生 Ｒｕ５ｓｅｔ　Ｂｕｒｂａｎｋの芽の無菌培養が１０Ｗ１のＰＭ培地（Ｍｕｒａ −ｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇ　（ＭＳ）無機塩、３０ｇ／ｌシｇ糖、０．１７ｇ／ Ｉ　ＮａＨｔｐｏａｎｚｏ、０．４ｍｇ／ｌチアミンー塩酸および１０（ｌａｇ ／ｌミオ−イノシトール、Ｉｇ／Ｉ　Ｇｅ１ｒｉｔｅで凝固、ｐＨ６，０）を含 むバイアルに保持される。芽が長さ約５ＣＩ１１に達したとき、７から１０１１ Ｉｌｌの茎節間断片が切り出され、切断端に４日の平板培養からの合成り、　ｔ 、　ｔ、遺伝子をもつ無毒化されたＡｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｓ　ｔｕａ＋ｅ ｆａｃｉｅｎｓベクターが塗布された。茎外植片は３日間２３℃で、１／１０　 Ｐ培地（Ｊａｒｒｅｔらに従い（１９８０）、カゼインを除いたｌ／１０濃度の ＭＳ無機塩および有機添加物、３０ｇ／ｌ　ショ糖および８．０ｇ／ｌ寒天）に 重層された１、５ｄのタバコ細胞フィーダ一層上に置いた、滅菌した濾紙上で共 培養される。共培養に続いて、外植片はカルス誘導のために、Ｊａｒｒｅｔらに 従い（１９８０）　、カゼイン、３．０＋ｗｇ／ｌベンジルアデニン（ＢＡ）お よび０．０１ｍｇ／２ナフタレン酢酸（Ｎ＾＾）を除いたＭＳ無機塩、有機添加 物からなる完全なＰ−１培地に移される（Ｊａｒｒｅｔら、１９８０）　、カル ベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）が細菌の生育を阻害するために含まれ、１１００ ｔａ／ｌカナマイシンが形質転換細胞を選択するために添加される。４週間後、 外植片は、芽形成を促進するために、ＢＡおよびＮＡＡＯ代わりに０．３Ｉ１ｇ ／ｌジベレリン酸（ＧＡ３）を含む同じ成分の培地（Ｊａｒｒｅｔら、１９８１ 　）に移される。芽誘導培地へ移してから約２週間後に、芽は発生し始める；こ れらは切り出され、根を出させるためにＰＭ培地のバイアルへ移される。酵素ネ オマイシン・ホスホトランスフェラーゼ■により付与されるカナマイシン耐性に 関して、形質転換細胞の選択のために、ＭＳ有機および無機塩、３０ｇ／ｌ　　 ショ糖、　２．２５ｍｇ／Ｉ　ＢＭ、　０．１８６ｍｇ／ＩＮＡＡ、　１０ｍｇ ／ＩＧＡ３　（Ｗｅｂｂら、１９８３）および２００ｍｇ／ｌカナマイシンを含 むカルス誘導培地上に茎切片を置くことにより、芽が試験された。 第１２図に述べられている合成り、　ｔ、　ｔ、遺伝子は、例５に述べられてい るように、植物発現ベクター中に置かれた。 プラスミドは次の性質をもつ：約１８００塩基対の合成りｇｌ　Ｉ　Ｉ断片が、 強化３５ＳプロモーターがＢ、　ｔ、　ｔ、遺伝子を発現するような様式で、ｐ ＭＯＮ８９３に挿入された。この構築物、ｐＭＯＮ１９８２はタバコおよびトマ トの両者を形質転換するために使用された。カナマイシン耐性植物として選択さ れたタバコ植物は、ウサギ抗Ｂ、　ｔ、　ｔ、抗体で調べられた。交叉反応物質 が、ＣＰＨに対して死亡させるのに通していると予想されるレベルで検出された 。これらの標的昆虫は、タバコを餌にしないが、トランスジェニックタバコ植物 は、合成遺伝子が検出できるレベルまでこのタンパク質の発現を改良することを 示している。 ｐＭＯ）Ｊ１９Ｂ２構築物をもつトマト植物が、ＣＰＢに対して殺虫効果のある レベルでＢ、　ｔ、　ｔ、タンパク質を生産すると測定された。最初の研究では 、４種の植物（５１９０，５２２５゜５３２８および５１３３）の葉は、ＣＰＢ の幼虫にさらされると、はとんどあるいは全く損傷を示さなかった（残存する葉 がない場合を４として、０から４のスケールでＯから１の損傷率）、これらの条 件下で、コントロールの葉は完全に食べられた。これらの植物の免疫学的分析に より批Ｂ、　ｔ、　ｔ、抗体と交叉反応する物質の存在が確定された。これらの 植物のタンパク賞発現のレベルは、全抽出タンパク質５０μｇ中に約１から５ｎ ｇのＢ、ｔ、ｔ、タンパク質と見積もられた。ＣＰＲからの葉組織の保護を示し く損傷率０から１）、良好な昆虫の死亡を示す、全部で１７のトマト植物（試験 された６５のうちの１７）が同定された。 ｐＭＯＮ１９８２をもつタバコおよびトマトで見られるのと類似した結果が、同 じ植物種のｐＭＯＮ１９８４で見られた。ｐＭＯＮ１９８４は、合成プロテアー ゼ阻害剤（ＣＭＴＩ）が天然のタンパク分解の切断部位の上流に融合されている ことを除いて、ｐＭＯＮ１９８２と同一である。タバコにおける発現レベルは、 全可溶性タンパク質５０μｇあたり１０から１５ｎｇの間で、ｐＭＯＮ１９８２ に類似していると見積もられた。 ＣＰＨによる摂食から葉を保護する、ｐ？ｌ０Ｎ１９８４を発現するトマト植物 が同定された。損傷率は１００％昆虫死亡で０であった。 ジャガイモが例５に述べられたように、強化されたＣａＭＶ３５Ｓ　／合成り、 　ｔ、　ｔ、遺伝子をもつｐＭＯＮ１９８２に類似のベクターで形質転換された 。このベクターで形質転換されたジャガイモ植物の葉が、ＣＰＢ昆虫バイオアン セイにより調べられた。試験された３５の植物のうち４種の植物、１６ａ、　１ ３ｃ、　Ｌ３ｄおよび２３ａの葉は、調べられたどきに全体的に保護された。３ 種の別の植物、１３ｅ、　ｌａおよび１３ｂの葉を用いた昆虫バイオアッセイは 、葉の物質が全て採られるのを４として、０から４のスケールで１の損傷レベル を記録した。免疫学的分析により、葉組織中のＢ、ｔ。 ｔ、交叉反応物質の存在が確認された。植物１６ａ（損傷率０）の葉組織のＢ、 　ｔ、　ｔ、タンパク質レベルは、全可溶性タンパク質５０μｇあたり２０から ５０ａｇのＢ、　ｔ、　ｔ、タンパク質と見積もられた。１６ｃ組織に見られる Ｂ、　ｔ、　ｔ、タンパク質のレベルは、その生物学的活性と一致した。１３ｅ および１３ｂ（損傷率１を記録した組織）の免疫学的分析から、植物１６ａの場 合よりも少ないタンパク質（全可溶性タンパク質５０μｇあたり５から１０ｎｇ ）が得られる。植物１６ａの切片が全植物アッセイでＣＰＢの５０から２００の 卵を用いて試験された。これらの条件下で、１６ａはコントロールのジャガイモ 植物が激しく損傷されたのであるが、損傷を示さず、昆虫は１００％死亡した。 例６−−合成り、ｔ、に、　Ｐ２タンパク質遺伝子Ｐ２タンパク質はＢ、ｔ、に 、　ＨＤ−１を含むＢ、　ｔ、のいくつかの株により生産される独特の殺虫効果 をもつタンパク質である。これは鱗し目および双し目昆虫の両者に対する活性に より特徴付けられる（Ｙａｍａｍｏｔｏとｌ１ｚｕｋａ、　１９８３）　。 Ｐ２タンパク質を暗号化する遺伝子が単離され、性質が調べられた（Ｄｏｎｏｖ ａｎら、１９８８）。これらの遺伝子により暗号化されるＰ２タンパク賞は約６ ００アミノ酸の長さである。 これらのタンパク質は、前の例に述べられているＢ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−１およびＨＤ−７３タンパク質のような鱗し口枠異的なＰｌ型のタンパク 質と僅かに限定された相同性をもつ。 Ｐ２タンパク質は、イラクサキンウワバ、スズメガおよびオオタバコガを含む各 種の鱗し目の幼虫に対して実質的な活性をもつ、それらは農業経済的に重要な害 虫に対して活性があるので、Ｐ２タンパク質は、単独で、あるいは上の例に述べ られている他のＢ、　ｔ、毒素との組合わせで、昆虫耐性のトランスジェニック 植物の生産の望ましい候補者である。いくつかの植物では、Ｐ２タンパク質の発 現だけで、害虫に対する保護を与えるのに十分である。さらにＰ２タンパク賞は 、農業経済的に重要な双し目の害虫に対しての保護を与える。他の場合、Ｂ、ｔ 、に、　ＨＤ−１またはＨＤ−７３タンパク賞と共にＰ２が発現されるのが好ま しい。 Ｐ２タンパク質は、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１または１１０−７３の結晶タンパク 質毒素と徂合わされると、少なくとも付加的なレベルの殺虫活性を与え、この組 合わせは共同性の活性さえ与える。Ｐ２タンパク質の作用様式は知られていない が、その明らかなアミノ酸配列は、Ｂ、ｔ、に、　）ＩＤ−１およびＨＤ−７３ 型のタンパク質とは異なる機能をすることを示唆する。 同一植物中で異なる作用様式をもつ２種の昆虫耐性タンパク質の生産は、植物中 でのＢ、　ｔ、タンパク質に耐性の昆虫の発生の可能性を最小にする。Ｐ２遺伝 子とＨＤ−１およびＨＤ−７３遺伝子の間の実質的な相同性が欠けていることは 、植物染色体中での多重性昆虫耐性遺伝子間の組換えの可能性を最小にする。 Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１およびＨＤ−７３遺伝子の配列は区別できるが、Ｐ２タ ンパク賞を暗号化する遺伝子はこれらの遺伝子と多くの共通の性質をもつ。特に Ｐ２タンパク質遺伝子は、高Ａ＋Ｔ含量（６５％）、多くの潜在的なポリアゾニ レ−ジョン信号配列（２６）および非常に多くのＡＴＴＴＡ配列（１０）をもつ 。はとんど発現されない野生型Ｂ、ｔＪ、　ＨＤ−１および［１−７３遺伝子に 全体的に類イ以しているために、前例で遭遇したように、同じ問題が野生型Ｐ２ 遺伝子の発現に予想される０合成り、　ｔ、遺伝子を設計するための上述の方法 に基づいて、この遺伝子は植物の保護に十分なレベルで発現されるべき合成Ｐ２ 遺伝子が設計された。野生型および合成Ｐ２遺伝子の比較が第１３図に示されて いる。 例７−−合成り、ｔ、　Ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓ遺伝子Ｂ、ｔ、　Ｅｎｔｏｍｏ ｃｉｄｕｓ　（“Ｂｔｅｎｔ”）タンパク質はＢ、　ｔ、細菌のいくつかの株に より生産される明らかな殺虫効果をもつタンパク質である。シロイチモンジョト ウガを含む５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ種のようなり、ｔ、に、　ＨＤ−１および）１ ０−７３に比較的非感受性の、いくつかの鱗し目に対しての高レベルの活性によ り特徴付けされる（ｖｉｓｓｅｒら、１９８８）。Ｂ　ｔｅｎ　ｔタンパク質を 暗号化する遺伝子が単離され、特徴付けされたＣＨｏｎｅｅら、１９８８）。こ れらの遺伝子により暗号化されるＢ　ｔｅｎ　ｔクンバク質は、Ｂ、ｔ、に、　 ）１０−１およびＨＤ−７３とおよそ同じ長さである。これらのタンパク質は、 Ｂ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−１およびＨＤ−７３タンパク質とほんの６８％のアミノ酸相同性をもつ。 Ｂｔｅｎｔタンパク質のＮ−末端半分だけが、ＨＤ−１およびＨＤ−７３の場合 のように、殺虫活性に必要であることはありそうである。最初の６２５アミノ酸 の範囲で、ＢｔｅｎｔはＨＤ−１およびＨＤ−７３とほんの３８％のアミノ酸相 同性をもつ。 ＨＤ−１およびＨＤ−７３に比較的非感受性である５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ種に対 してより高活性であるため、Ｂｔｅｎｔタンパク質はそれだけで、あるいは上の 例に述べられている他のＢ、　ｔ。 毒素との組合わせで、昆虫耐性トランスジェニック植物生産のための望ましい候 補者である。ある植物では、Ｂ　ｔｅｎ　ｔの生産だけで農業経済的に重要な害 虫をコントロールするのに十分である。他の植物では、２種の異なる昆虫耐性タ ンパク質の生産がより多くの昆虫に対しての保護を与える。どちらのタンパク質 もその中で活性があるようなそれらの昆虫に対して、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１ま たは）ＩＤ−７３型のタンパク質プラスＢｔｅｎｔタンパク質の組合わせは、少 なくとも付加的な殺虫効果を与え、さらに相互作用的な活性を与える。加えて、 区別できるアミノ酸配列のために、Ｂｔｅｎｔタンパク質はＨＤ−１またはＨＤ −７３とは異なる作用様式をもつ。同一植物中での、異なる作用様式をもつ２種 の殺虫効果をもつタンパク質の生産は、Ｂ、　ｔ、タンパク質に耐性の昆虫の植 物における発生の可能性を最小にする。Ｂ、ｔ、に、型遺伝子とのＤＮＡ配列の 相同性の相対的な欠如は、植物染色体での多くの昆虫耐性遺伝子間の組換えの可 能性を最小にする。 Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１および）１０−７３遺伝子の配列とは区別できるが、Ｂ 　ｔｅｎ　ｔタンパク質を暗号化する遺伝子はこれらの遺伝子と多くの共通の性 質をもつ、特に、Ｂｔｅｎｔタンパク質遺伝子は高Ａ＋Ｔ含量（６２％）、多く の潜在的なポリアゾニレ−ジョン信号配列（全長のコーディング配列のもの３９ 、および活性毒素断片を暗号化する最初の１８７５ヌクレオチドのもの２７）お よび非常に多くのＡＴＴＴＡ配列（全長のコーディング配列１６および最初の１ ８７５ヌクレオチドのもの１２）をもつ、殆ど発現されない野生型Ｂ、ｔ、ｋ。 ＨＤ−１およびＨＤ−７３遺伝子に全体的に類似しているために、野生型Ｂｔｅ ｎｔ遺伝子は、野生型ＨＤ−１およびＨＤ−７３遺伝子で遭遇しているような発 現についての類似した問題を示すことが予想される。他の合成り、　ｔ、遺伝子 を設計するために用いた上述の方法に基づいて、合成りｔｅｎｔ遺伝子が設計さ れ、その遺伝子は植物の保護に適当なレベルで発現された。野生型および合成り 　ｔｅｎ　を遺伝子の比較が第１４図に示されている。 例８−−）ウモロコシでの発現のための合成り、ｔ、に、遺伝子 トウモロコシ細胞における高レベルの外来遺伝子の発現は、トウモロコシの遺伝 子イントロンの存在により強められることか示された（Ｃａｌｌｉｓら、１９Ｂ ？）　、代表的には、これらのイントロンはキメラ遺伝子の５″未翻訳領域に位 置した。ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＮＯＳ　３“端がトウモロコシ細胞 での外来遺伝子の発現に効果的に機能することか示された（ＦｒｏｗＩｌら、１ ９８６）。 第１５図によれば、これらの配列を含む植物発現カセットベクター（ｐＭＯＮ７ ４４）が構築された。特に、発現カセットは強化されたＣａＭＶ３５Ｓプロモー ターとそれに続くトウモロコシＡｄｈｌ遺伝子のイントロン１をもつ（Ｃａｌｌ ｉｓら、１９８７）。これにコーディング配列を挿入するためのマルチリンカ− クローニング部位が続く；このマルチリンカ−はその中にＢａ１１１部位を含む 。ＮＯ５３”端がマルチリンカ−につながっている。ｐＭＯＮ７４４はまた、ト ランスジェニックトウモロコシ細胞のカナマイシン選択のための選択マーカー遺 伝子、３５Ｓ／ＮＰＴＩＩ／ＮＯＳ　３’を含む。さらに、ｐＭＯＮ７４４は大 腸菌の複製起点および大腸菌プラスミドの選択のためのアンピシリン耐性遺伝子 をもつ。 前の例で述べられている５個のＢ、　ｔ、に、コーディング配列が、Ｂ、ｔ、ｋ 、のトウモロコシ細胞での発現のためにｐＭＯＮ７４４のＢａ１１１部位に挿入 された。挿入されたコーディング配列および得られたベクターは： １　、ｐＭＯＮ８６５２を作製するためのｐＭＯＮ９９２１の野生型Ｂ、　ｔ。 ｋ、　　ＨＤ−１ ２、ｐＭＯＮ８６４２を作製するためのｐＭＯＮ５３７０の修飾されたＢ、ｔ、 に、　　ＨＤ−１ ３、ｐＭＯＮ８６４３を作製するためのｐＭＯＮ５３７７の合成り、ｔ、ｋ。 ４、　ｐＭＯＮ８６４４を作製するためのｐＭＯＮ５３９０の合成り、ｔ、ｋ。 ＨＤ−７３ ５＋　ｐＭＯＮ１０９０２を作製するためのＩ）ＭＯＮ１０５１８の合成の全長 のＢ、ｔ、に、　Ｉ（Ｄ−７３ ｐＭＯＮ８６５２　（野生型Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１）がトウモロコシ細胞プロ トプラストを形質転換するために使用され、安定な形質転換カナマイシン耐性カ ルスが単離された。トウモロコシ細胞のＢ、　ｔ、に、ｍＲＮＡはヌクレアーゼ Ｓｌ保護実験により解析され、トランスジェニックトマト植物で同じ野生型コー ディング配列（ｐＭＯＮ９９２１　）を用いたときに見られるのに匹敵するレベ ルで存在することが発見された。 ｐＭＯＮ８６５２およびｐＭＯＮ８６４２　（修飾ＨＤ−１）が一時的な発現系 でトウモロコシ細胞プロトプラストを形質転換するために使用された。Ｂ、ｔ、 に、ｍＲＮＡレベルはヌクレアーゼＳ１保護実験により解析された。修飾ＨＤ− １は一時的な形質転換トウモロコシ細胞中で、野生型コーディング配列に比べ、 Ｂ、　ｔ、に、ｍＲＮＡを数倍に増加させた。このことば、双子葉植物およびそ の細胞で示されたように、Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１遺伝子に導入された修飾が単 子葉植物細胞でのＢ、　ｔ、に、発現を強化できることを示した。 ｐＭＯＮａＥｉ４２（修飾ＨＤ−１）およびｐＭＯＮ８６４３　（合成１１０− １）が、ＰＥＧを用いたＤＮＡ取り込みによるブラックメキシカンスイート（Ｂ ＭＳ）　）ウモロコシ細胞プロトプラストを形質転換するために使用され、安定 な形質転換トウモロコシカルスがカナマイシンを含む植物生育培地上での生育に より選択された。単独の形質転換細胞に由来する個々のカルスコロニーが単離さ れ、カナマイシンを含む培地上に別別に広げられた。 これらの細胞のＢ、ｔ、に、遺伝子の発現を評価するために、カルス試料がスズ メガの幼虫に対するバイオアッセイにより、昆虫毒性について試験された。それ ぞれのベクターについて、９６のカルス系がバイオアッセイにより試験された。 それぞれのカルスの部分が滅菌水寒天平板に置かれ、５匹のスズメガの新生幼虫 が加えられ４日間餌を与えられた。　Ｉ）ＭＯＮ８６４３では、９６カルスのう ち１５個で食餌後幼虫が１００％死亡し、これらのカルスは殆ど食餌による損傷 を示さなかった。　ｐＭＯＮ８６４２では、９６カルスのうち１個だけが幼虫に 対して毒性があった。このことは、Ｂ。 【、に、遺伝子が殺虫効果のあるレベルでこれらの試料で発現されることを示し た。　ｐＭＯＮ８６４３を含むカルスがｐＭＯＮ８６４２よりも顕著に毒性があ るという観察は、双子葉植物を用いた前の例に類似して、修飾１（Ｄ−１コ一デ イング配列が使用されたときよりも、合成ＨＤ−１ヨー１コーデイング配 発現が得られることを示した．半定量的なイムノアッセイは、ｐＭＯＮ８６４３ 毒性試料がｐＭＯＮ８６４２毒性試料よりもかなり高レベルのＢ．　ｔ．に、タ ンパク質をもつことを示した。 スズメガに対して毒性のある１６個のカルス試料はまたアワツメイガに対する活 性が試験された．アワツメイガはスズメガよりもＨＤ−１遺伝子産物に対して、 約４０倍感受性が低い。アワツメイガの幼虫がカルス試料にのせられ、４日間餌 を与えられた．試験された１６カルスのうち２個は、共にｐＭＯＮ８６４３　（ 合成ＨＤ−１）をもつが、アワツメイガの幼虫に対して毒性があった。 トウモロコシの分化組織でのＢ．ｔ．に、遺伝子の発現を評価するために、ＤＮ Ａ分配の別の方法が使用された．若葉がトウモロコシ植物から切りとられ、ＤＮ Ａ試料が葉組織にマイクロプロジェクタイル衝撃により分配された。このシステ ムでは、マイクロプロジェクタイル上のＯＮ八は衝撃後葉細胞で一時的に発現さ れる．３種のＤＮＡ試料が使用され、それぞれのＤＮＡは３連で試験された。 １　、　１）ＭＯＮ７４４　、Ｂ．ｔ．に、遺伝子をもたないトウモロコシ発現 ベクター ２、ｐ阿０Ｎ８６４３　（合成ＨＤ−１）３、　ｐＭＯＮ７５２、Ｂ．ｔ．に、 遺伝子をもたない、ＣＵＳ遺伝子に関するトウモロコシ発現ベクター 葉は室温で２４時間インキュベートされた。ｐＭＯＮ７５２試料は、ＧＵＳ遺伝 子産物が視覚的に検出できるように基質で染色された．この分析は、それぞれの 試料で１００個以上のスポットがＧＵＳ産物を発現していることを示し、３連試 料はＧＵＳ発現が非常に類似したレベルであることを示した。ｐＭＯＮ７４４お よびｐＭＯＮ８６４３試料では、５匹のスズメガの幼虫がそれぞれの葉に加えら れ、４８時間餌が与えられた。ｐＭＯＮ７４４を入れられた３個の試料全てがか なりの食餌による損傷を示し、幼虫は全く死亡しなかった。 ｐＭＯＮ８６４３を入れられた３個の試料全てが食餌による損傷の証拠を示さず 、幼虫は１００％死亡した．試料はまたＢ。 ｔ．に、タンパク質の存在について定量的イムノアッセイにより試験された，　 ｐＭＯＮ８６４３試料全てが検出できるＢ．　ｔ．ｋ。 タンパク質をもっていた．これらの結果は、Ｂ．ｔ．に、遺伝子が殺虫効果のあ るレベルでトウモロコシの分化組織で発現されることを示した。 例９ーージャガイモの葉の合成ロールウィルス外被タンパク質遺伝子 各種植物ウィルスの外被タンパク賞遺伝子の植物での発現が、これらのウィルス に耐性の効果的な技術方法であることが証明された．ウィルス耐性を達成するた めに、ウィルス外被タンパク質を効果的なレベルで発現することが重要である． 多くの植物ウィルス外被タンパク質遺伝子では、これは問題であることが明らか ではなかった。 しかしジャガイモの葉のロールウィルス（ＰＬＲＶ）の外被タンパク賞遺伝子で は、外被タンパク質の発現は他の外被タンパク質に比べ低いことが観察され、こ のタンパク質の低レベルがＰＬＲＶに対する最適な耐性に導かない。 ＰＬＲＶ外被タ外被タンパ転質遺伝子６に示されている。第１６図によれば、上 側の配列は植物発現のためにベクターｐＭＯＮ８９３にもともと工作された遺伝 子を示している．遺伝子にはヌクレオチド２０から６４３の間を含むコーディン グ配列をもつ７４９ヌクレオチドのＢｇｌＩ　ｒ−ＥｃｏＲＩ断片が含まれた。 この断片はまた１９ヌクレオチドの５゛ノンコ一デイング配列と１０４ヌクレオ チドの３′ノンコ一デイング配列を含んでいた。このＰＬＲＶ外被タ外被タンパ 転質遺伝子ウィルス外被タンパク質遺伝子に比べ、植物で相対的に低頻度で発現 された。 合成遺伝子がＰＬＲｖ外被タンパク質の植物発現を改良するために設計された． 再び第１６図によれば、合成ＰＬＲＶ遺伝子につくられた変化が下列に示されて いる．この遺伝子は天然に生じる遺伝子と全く同じタンパク質を暗号化するよう に設計された。合成遺伝子の最初はヌクレオチドの１４番で、配列の終わりがヌ クレオチドの６５４番であることに注意しなさい。合成遺伝子のコーディング配 列は図の２０から６４３番のヌクレオチドである．これらの端点の上流および下 流に示された変化は、コーディング配列のすぐ外側に便利な制限酵素部位を導入 するのにだけ役立つ。それ故、合成遺伝子の大きさは天然に生ずる遺伝子よりも 小さい６４１ヌクレオチドである０合成遺伝子は、ＢｇｌｌｌとＥｃｏＲＩ制限 酵素部位を暗号化する断片が除去されたことを除いて、５°と３”端での実質的 に全てのノンコーディング配列のためにより短い。 合成遺伝子は２つの主たる点で、天然に生ずる遺伝子と異なる。第１に、コーデ ィング配列内の４１個の別々のコドンが、双子葉植物遺伝子の検分でのアミノ酸 に対する約１５％以下のコドンを構成する与えられたアミノ酸の殆ど全てのコド ンを除去するために変えられた。第２に、元来の遺伝子の５゛および３°のノン コーディング配列が除去された。図１に述べられているアルゴリズムに厳密に従 うことはないが、いくつかのコドンの変化、特に長い３“ノンコーディング領域 の除去はこのアルゴリズムに一致する。 もともとのＰＬＲＶ配列は２個の潜在的な植物ポリアゾニレ−ジョン信号（ＡＡ ＣＣＡＡおよびＡＡＧＣＡＴ）を含み、これら両者が合成遺伝子で除去された３ ″ノンコ一デイング配列に現れる。もともとのＰＬＲＶ遺伝子はまたＡＴＴＴＡ 配列を含む。これもまた３゛ノンコ一デイング配列に含まれ、遺伝子の連続した Ａ＋Ｔの最も長いつながり（７個のＡ＋Ｔヌクレオチドのつながり）の中にある 。この配列は合成遺伝子では除去された。それ故、図１のアルゴリズムが変化の 標的にする配列が、３“ノンコーディング断片の除去により、合成ＰＬＲｖ外被 タンパク質遺伝子中で変えられた。 コーディング配列内で、コドン変化がまた上述の配列の３つの他の領域を除去す るために行われた。特に、コーディング配列内にある５個の連続したＡ＋７２カ 所および５個の連続したＧ＋Ｃ１カ所が合成遺伝子では除去された。 合成ＰＬＲＶ外被タ外被タンパ転質遺伝子ＯＮ８９３のような植物形質転換ベク ターにクローン化され、上述のようにジャガイモ植物を形質転換するために使用 された。これらの植物は天然に生ずる遺伝子で達成されるよりも高レベルでＰＬ Ｒｖ外被タ外被タンパ光質し、これらの植物はＰＬＲＶによる怒染に増加した耐 性を示す。 例１０−−１？ＵＢＩｓｃｏ小サブユニツトプロモーターをもつ合成り、　ｔ、 遺伝子の発現およびクロロプラスト・トランジットペプチド ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニッ）　（ＳＳＵ）を暗号化する植物遺伝子はしばし ば高頻度で発現され、簡単に調節され、時には組織特異性を示す。これらの発現 の性質は、主としてこれらの遺伝子のプロモーター配列による。形質転換された 植物で外来遺伝子を発現させるために、ＳＳＵプロモーターを使用することは可 能である０代表的に植物は多くのＳＳＵ遺伝子を含み、そして異種のＳＳＵ遺伝 子の発現レベルおよび組織特異性は異なるであろう。ＳＳＵタンパク質は核で暗 号化され、クロロプラスト・トランジットペプチド（ＣＴＰ）として知られるＮ −末端の拡張をもつ前駆体として細胞質で合成される。　　ＣＴＰは前駆体をク ロロプラストへ向け、ＳＳＵタンパク質のクロロプラストへの取り込みを促進す る。この過程で、ＣＴＰはＳＳＵタンパク質から切断される。これらのＣＴＰ配 列は外来タンパク質を形質転換された植物のクロロプラストへ向けるために用い られた。 ＳＳＵプロモーターは植物でのＢ、　ｔ、に、遺伝子の発現に対していくつかの 利点がある。いくつかのＳＳＵプロモーターは非常に高頻度で発現され、ＣａＭ Ｖ３５Ｓプロモーターで観察されるのと同じか、またはより高い発現レベルを生 じた。ＳＳＵプロモーターからの発現の組織分布はＣａＭＶ３５Ｓプロモーター のものとは異なり、それでいくつかの害虫のコントロールのため、ＳＳＵが最も 高頻度で発現される細胞へＢ、ｔ、に、の発現を向けるのが有利である。例えば 、相対的に構成的であるが、葉においてＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、他の葉 の部分よりも維管束組織でより高頻度に発現され、一方、殆どのＳＳＵプロモー ターは葉の葉肉細胞で最も高頻度で発現される。いくつかのＳＳｕプロモーター はまた、より高度に組織特異的で、例えばある細胞でのＢ、　ｔ、発現がそれら の細胞にとって有害であったとすると、植物組織のほんの一部でＢ、　ｔ、に、 を発現させるために特異的ＳＳＵプロモーターを利用することが可能である。 例えば、ジャガイモにおけるジャガイモハムシのコントロールにとって、食用の 塊茎ではなく葉でＢ、ｔ、ｔ、発現をさせるためにＳＳＵプロモーターを使用す ることは有利である。 Ｂ、　ｔ、タンパク質をクロロプラストへ局所化させるために５ＳＩＩ　ＣＴＰ 配列を用いることはまた有利である。Ｂ、ｔ、のクロロプラストへの局所化は細 胞質に見いだされるプロテアーゼからタンパク質を保護できた。これはＢ、　ｔ 、タンパク質を安定化し、より高レベルの活性タンパク質の蓄積を導き出すこと ができる。　　ＣＴＰを含むＢ、　ｔ、遺伝子はＳＳＵプロモーターまたはＣａ ＭＶ３５Ｓのような他のプロモーターとの組合わせで用いられた。 各種の植物形質転換ベクターが、Ｂ、ｔ、に、遺伝子の発現のために、ＳＳＵプ ロモーターおよびＳＳＵ　ＣＴＰを用いて構築された。用いられたプロモーター およびＣＴＰは、Ｔｕｍｅｒらにより述べられた（１９８６）ペチュニア５ＳＩ Ｊ１１ａ遺伝子、およびＫｒｅｂｂｅｒｓら（１９８８）とＨｌｉｏｎｏｒら（ １９８９）により述べられたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのａｔｓｌＡ遺伝子（ＳＳ ｔｌ遺伝子）由来であった。ペチュニア５ＳＵＩＩａプロモーターには、ＳＳＵ コーディング配列の上流約８００ｂｐに広がったＤＮＡ断片が含まれた。Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓのａｔｓｌＡプロモーターには、ＳＳＵコーディング配列の上 流約１．８ｋｂに広がったＤＮＡ断片が含まれた。 上流の端のｐｔｌｃ１Ｂマルチリンカ−由来の便利な部位がｐＭＯＮ８９３のよ うな植物形質転換ベクターへこれらのプロモーターを動かすために用いられた。 これらのプロモーター断片はＳＳＵコーディング配列の開始まで広げられ、その 点にはＮｃｏ　Ｉ制限酵素部位がＳＳＵコーディング配列の代わりに、Ｂ、　ｔ 、コーディング配列を挿入させるために工作された。 ＳＳＵプロモーターがそれらのＣＴＰと組合わされて使用されると、ＤＮＡ断片 はＣＴＰのコーディング配列および成熟ＳＳＵコーディング配列の小さな部分を 通して広げられ、その点にはＮｃｏｌ制限酵素部位が標準的な技術により、ＣＴ Ｐと読みとり枠内でＢ、　ｔ、コーディング配列を融合させるために工作された 。特に、ペチュニア５Ｓｕｌｌａ　ＣＴＰでは、Ｂ、　ｔ、コーディング配列Ｎ ｃｏ１部位が置かれた点で、成熟ＳＳＵ配列のアミノ酸８個の後のＳＳＵ配列に 融合された。予備的な試験管内でのクロロプラスト取り込み実験が、成熟ＳＳＵ のこの断片が含まれている場合にだけＢ、　ｔ、に、の取り込みが観察されるこ とを示したので、成熟ＳＳＵ配列の８個のアミノ酸が含まれた。　　Ａｒａｂｉ ｄｏｐｓｉｓ　ａｔｓｌＡ　ＣＴＰでは、完全なＣＴＰが配列ｇｌｙ−ｇｌｙ− ａｒｇ−ｖａｌ−ａｓｎ−ｃｙｓ−ｍｅＬ−ｇｌｎ−ａｌａ−ｓｅｔをもつ成熟 ＳＳＵ配列の２４個のアミノ酸と共に含まれ、Ｂ、　ｔ、融合のＮｃｏ１部位で 終わった。この短い配列は（ｃｙｓとｍｅＬＯ間の）天然のＳＳＵ　ＣＴＰ切断 部位および切断部位周辺の短い断片を繰り返す、この配列はクロロプラストへの 正確な取り込みを確実にするために含まれた。 Ｂ、　ｔ、コーディング配列はｍｅｔコドンの後ろのこのａｔｓｌＡＣＴＰに融 合された。このＣＴＰ構築物と他の（非Ｂ、　ｔ、　）コーディング配列を用い た試験管内での取り込み実験は、このＣＴＰがクロロプラストへタンパク質を向 けることを示した。 ＣＴＰがＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとの組合わせで使用される場合、同じＣＴ Ｐ断片が使用された。それらはＢｇｌ１１部位の工作により、ＣＴＰのＡＴＧ開 始部位のすぐ上流から切り出され、ＢｇｌｌＩからＮｃｏｌまでの断片として、 ｐＭＯＮ８９３のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に置かれた。　Ｂ、ｔ、コ ーディング配列は上述のように融合された。 ｐＭＯＮ９９２１　（第１図を見よ）の野生型Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１コ一デイ ング配列はａｔｓｌＡプロモーターに融合され、ｐＭＯＮ１９２５が、また、ａ ｔｓｌＡとＣＴＰに融合され、ｐＭＯＮ１９２１が作製された。これらのベクタ ーはタバコ植物を形質転換するために使用され、その植物はスズメガに対する活 性が調べられた。毒性植物は回収されなかった。　　ＰＭＯＮ８９３の強化され たＣａＭＶ３５ＳプロモーターからＢ、　ｔ、に、コーディング配列が発現され るｐＭＯＮ９９２１で形質転換した後、低頻度ではあるが毒性植物が回収される 事実、および、ａｔｓｌＡプロモーターそれ自身がＣａＭＶ３５Ｓプロモーター に匹敵する強さで、ＣＴＰ配列が含まれると約１０倍強くなることをＥｌｉｏ− ｎｏｒらが報告した（１９８９）事実から考えると、このことは驚くべきである 。少なくとも野生型Ｂ、ｔ、に、　ＨＤ−１コ一デイング配列の場合、これがそ の場合であるとは思われない。 各種の植物形質転換ベクターが第４図の短縮型の合成ＨＤ−７３コーディング配 列または、第１１図の全長のＢ、ｔ、ｋ。 １（Ｄ−７３コ一デイング配列を用いて構築された。これらは以下の表にあげら れている。 表ＸＶ ＣＴＰをもつ遺伝子構築物 ｐＭＯＮ１０８０６　　　　Ｅｎ　３５Ｓ　　　ａｔｓｌＡ　　　　短縮型ｐＭ ＯＮ１０８１４　　　　Ｅｎ　３５Ｓ　　　５ＳＵ１１ａ　　　　全長ｐＭＯＮ Ｉ０８１１　　　５Ｓυ１１ａ　　　５ＳＬＩＩＩａ　　　　短縮型表ＸＶ（続 き） ＣＴＰをもつ遺伝子構築物 ｐＭＯＮ１０８１９　　　５ＳＩＪ１１ａ　　　ｎｏｎｅ　　　　　短縮型ｐＭ ＯＮ１０８１５　　　　ａｔｓｌＡ　　　　ｎｏｎｅ　　　　　短縮型ｐＭＯＮ １０８１７　　　　ａｔｓｌＡ　　　　ａｔｓｌＡ　　　　短縮型ｐＭＯＮ１０ ８２１　　　　Ｅｎ　３５Ｓ　　　ａｔｓｌＡ　　　　短縮型ｐＭＯＮ１０Ｂ２ ２　　　　Ｅｎ　３５Ｓ　　　ａｔｓｌＡ　　　　全長ｐＭＯＮ１０８３８　　 　５ＳＵ１１ａ　　　５ＳＵ１１ａ　　　　全長ｐＭＯＮＩ０８３９　　　　ａ 　ｔｓ　ＩＡ　　　　ａ　ｔｓ　ＩＡ　　　　全長上記のベクター全てがタバコ 植物を形質転換するために使用された。短縮型Ｂ、ｔ、に、遺伝子をもつ全ての ベクターについて、これらの植物の葉組織の昆虫に対する毒性およびＢ、ｔ、に 、タンパク質レベルがイムノアッセイにより分析された。 ｐＭＯＮ１０８０６．１０Ｂ１１．１０８］９および１０８２１は、ＣＴＰをも たないＥｎ　３５Ｓプロモーターそれ自身により管理される合成り、ｔ、に、　 ＨＤ−７３コ一デイング配列をもつｐＭＯＮ５３８３およびｐＭＯＮ５３９０に 匹敵するレベルのＢ、ｔ、ｋ、タンパク質を生産する。これらの植物はまた、検 出されたＢ、ｔ、に、レベルに対し予想される殺虫活性をもつ。（ａｔｓｌＡプ ロモーターをもつ）　ｐＭＯＮ１０８１５およびｐＭＯＮ１０８１７では、Ｆ３ ．ｔ、に、タンパク質のレベルはｐＭＯＮ５３８３またはｐＭＯＮ５３９０をも つ植物で見られるよりも約５倍高い。これらの植物はまた、より高い殺虫活性を もつ、　１０８１５および１０８１７をもつ植物は、葉の全可溶性タンパク質の １％までＢ、ｔ、に、　ＨＤ−７３を含む。これは合成遺伝子を用いて得られる 最高レベルのＢ、　ｔ、に、タンパク質である。 この結果は２つの点で驚くべきことである。まず上記のように、ＢｔｓｌＡプロ モーターおよびＣＴＰに融合された野生型コーディング配列はＥｎ　３５Ｓの場 合よりも高い発現レベルの証拠を示さず、事実、殺虫効果をもつ植物がないこと に基づくより低い発現であった。第２に、Ｅｌ　１ｏｎｏｒらは、２種の他の遺 伝子で、ａｔｓｌＡＣＴＰが約１０倍ａｔｓｌＡプロモーターからの発現を増加 できることを示している（１９８９）　、合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝子 では、ａｔｓｌＡプロモーターだけの場合に見られるのに加えて、ＣＴＰを含む ことにより見られる一致した増加はない。 ５ＳＵＩＩＡ　ＣＴＰに融合され、Ｅｎ　３５Ｓプロモーターにより動かされる 全長の合成）１０−７３をもつタバコ植物は、ＣＴＰを含まないｐＭＯＮ１５１ Ｂに匹敵するレベルのＢ、ｔ、に、タンパク質および殺虫活性を生産した。さら にｐＭＯＮ１０５ｉ８では、植物から抽出されたＢ、　ｔ、に、タンパク質が、 明らかに細胞質中で（毒性には必要ではない）Ｃ−末端部分を切断されたことに よる全長よりも短い多くの形態を含むことが、ゲル電気泳動により観察された。 ｐＭＯＮ１０８１４では、タンパク質の大部分は完全な全長であると思われ、こ れはタンパク質がクロロプラストへのターゲティングにより、タンパク質分解か ら安定化されることを示している。 例１１−−信号ベプチドの使用による細胞外空間または液胞へのＢ、　ｔ、タン パク質のターゲティングここで述べられている合成遺伝子から生産されるＢ、　 ｔ。 タンパク質は、植物細胞の細胞質に局所分布し、この細胞質への分布が殺虫効果 をもつ植物をもたらす。植物細胞の他の区画−Ｂ、ｔ、タンパク質を向けること は、いくつかの目的にとって有利である。細胞質とは別の区画へＢ、　ｔ、タン パク質が局所分布することは、殺虫活性を強化するタンパク質の回収のより多い 蓄積を導き出すように、細胞質プロテアーゼにＢ、　ｔ、タンパク質をほとんど さらさせない結果が得られる。細胞外局所分布はより大きい効力を導＜　Ｂ、　 ｔ、タンパク質に対し、ある昆虫をより効果的にさらすことができる。Ｂ、　ｔ 、タンパク質が植物細胞機能に有害であることが見いだされるとすると、非細胞 質区画への局所分布はＢ、　ｔ、タンパク質からこれらの細胞を保護できる。 他の真核生物同様植物では、細胞外に、あるいはいくつかの特定の区画に局所分 布されることが運命づけられているタンパク質は、典型的には信号ペプチドとし て知られるＮ−末端アミノ酸の拡張をもって合成される。この信号ペプチドはタ ンパク質を区分化経路へ入れるように管理し、典型的には区分化の初期段階で成 熟タンパク質から切断される。細胞外タンパク質では、分泌経路は代表的に、こ の段階で生じる信号ペプチドの切断を伴う、小胞体へのコトランスシーション挿 入を含む。その後、成熟タンパク質はジルジ体を通過して、原形質膜に融合した 液胞へ移動し、それからタンパク質は細胞外空間へ放出される。他の区画が予定 されているタンパク質は類似の経路に従う。例えば、小胞体またはジルジ体のタ ンパク質はこの図式に従うが、これらは特異的に適当な区画に保持される。植物 では、いくつかのタンパク質もまた、多くの植物の細胞質の別の膜結合区画であ る液胞が標的である。液胞が標的のタンパク質はジルジ体で上記の経路から分岐 し、液胞と融合した小胞へ入る。 このタンパク質ターゲティングの共通の性質は、区分化経路を開始する信号ペプ チドである。信号ペプチドがタンパク質と融合すると、多くの場合そのタンパク 質のターゲティングは小胞体へ導かれる。この段階の効率はむしろ成熟タンパク 質自身の配列に依存する。細胞外空間へよりむしろ特定の区画へタンパク質を向 ける信号は明らかには定義されていない、特異的な区画へタンパク質を向ける多 くの信号は、成熟タンパク質のアミノ酸配列内に含まれると思われる。このこと はいくつかの液胞を標的にしたタンパク質で示されたが、これらの配列を正確に 定義することはまだできない。細胞外空間への分泌は、他の区分化信号を含まな い信号配列をもつタンパク質の“デフォルビ経路であると思われる。それ故、Ｂ 、　ｔ、タンパク質を細胞質外へ向ける手段は、合成り、　ｔ、遺伝子に対する 遺伝子を既知の植物信号ペプチドを暗号化するＤＮＡ配列に融合することである 。これらの融合遺伝子は分泌経路へ入るＢ、【、タンパク質を生じ、細胞外分泌 あるいは液胞または他の区画へのターゲティングを導き出す。 いくつかの植物遺伝子の信号配列が述べられている。 そのような配列の１つは、Ｃｏｒｎｅｌ　１ｓｓｅｎらにより述べられているタ バコの病原関連タンパク質ＰＲ１ｂである。ｐＲｉｂタンパク賞は通常細胞外空 間に局所分布する。別の型の信号ペプチドがマメ科植物の種子貯蔵タンパク質に 含まれる。これらのタンパク質は、種子に見られる液胞様区画の種子のタンパク 質体に局所分布する。インゲン豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）の ７３貯蔵タンパク質のベータサブユニット、ｐｖｕＢの信号ペプチドＤＮＡ配列 がＤｏｙｌｅらにより述べられた。これらの公表された配列に基づき、ＰＲｌｂ およびＰｖｕＢの信号ペプチドを暗号化する遺伝子がオリゴヌクレオチドの化学 合成により合成された。これらの信号ペプチドの合成遺伝子は正確に報告された ＤＮＡ配列と一致した。それぞれの信号ペプチドの翻訳開始コドンのすぐ上流に 、ＢａｍＨＩおよびＢｇ１１１部位が５゛端のＢａ鋤旧部位を用いて挿入された 。これによりＥｎ　３５Ｓプロモーターから発現するためにｐＭＯＮ８９３のＢ ｇｌｌＩ部位へ信号ペプチドを暗号化する断片が挿入される。外来タンパク質の 分泌または区分化を達成するためのいくつかの場合、信号ペプチドの正常な切断 部位の後ろにあるアミノ酸配列を含むことが必要であることが証明された。これ は信号ペプチドの適正な切断を確実にするために必要である。ＰＲｌｂでは、合 成［ＩＮＡＮＡ配列た成熟ＰＲ１ｂの最初の１０個のアミノ酸を含んでいた。Ｐ ｖｕＢでは、合成りＮＡ配列は成熟ＰｖｕＢの最初の１３個のアミノ酸を含んで いた。合成り、ｔ、遺伝子のメチオニン開始コドンに読みとり枠内で融合させる ために、両方の合成信号ペプチド暗号化断片はＮｃｏＩ部位で終わった。 これらの信号ペプチドを含む合成り、ｔ、に、　ＨＤ−７３遺伝子を暗号化する ４種のベクターが構築された。　ｐＭＯＮ５３８３の合成短縮型ＨＤ−７３遺伝 子が、ＰｖｕＢの信号ペプチド配列と融合され、ｐＭＯＮ８９３に取り込まれて ｐＭＯＮ１０８２７が作製された。ｐＭＯＮ５３８３の合成短縮型ＨＤ−７３遺 伝子はまた、ＰＲｌｂの信号ペプチド配列に融合され、ｐＭＯＮ１０８２４が作 製された。 ｐＭＯＮ１０５１８の全長合成＋１０−７３遺伝子はＰｖｕＢの信号ペプチド配 列に融合され、ｐＭＯＮ１０８２８を作製するためにｐＭＯＮ８９３に取り込ま れた。ｐＭＯＮ１０５１Ｂの全長合成ＨＤ−７３遺伝子はまた、ＰＲｌｂの信号 ペプチド配列と融合され、ｐＭＯＮ１０８２５を作製するためにｐＭＯＮ８９３ に取り込まれた。 これらのベクターはタバコ植物を形質転換するために使用され、その植物はウェ スタンプロット分析によるＢ、ｔ、に、タンパク質の発現および殺虫効果につい て試験された。ｐＭＯＮＩＯ８２４およびｐＦ１ＯＮ１０８２７は、葉において 短縮型ＨＤ−７３ベクターである９台０Ｎ５３８３およびｐＭＯＮ５３９０に匹 敵する量のＢ、　ｔ、に、タンパク質を生産した。ｐＭＯＮ１０８２５およびｐ ＭＯＮ１０８２ＢはｐＭＯＮ１０５１Ｂに匹敵する量の全長のＢ、Ｌ、に、タン パク質を生産した。全ての場合、植物はスズメガに対して殺虫効果を有していた 。 引用文献 Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３）　３０４： １８４Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ 　　（１９８５）　３：６２９−６３５゜ ２０９゜ Ｈｏｒｓｃｈ、　　Ｒ，Ｂ、　　ｅｔ　ａｌ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８ ５）、　　２７７：１２２９゜Ｊａｒｒｅｔ、　　Ｒ，Ｌ、　　ｅｔ　ａｌ、、 　　Ｉｎ　ｖｒｔｒｏ　　（１９８Ｄ＋　　１７：８２５゜Ｋｌｅｅ、　　Ｈ， Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　　　（１９８５）＋　３ ：６３７−６４２゜ Ｋｏｚａｋ＋　　Ｍ−＋ヨ１０」Ｌ（１９８４）、　　３０８：２４１−２４６ ゜０ｄｅｌｌ、　　　Ｊ、　　　ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ｎａｔｕｒｅ　　　（ １９８５ン　、　　　３１３：８１０゜Ｓｈａｗ＋　　Ｇ、　＆　Ｋａｍｅｎ、 　　Ｒ，、Ｃｅｌ↓（１９８６）、　　４６：６５９−６６７゜Ｖａｅｃｋ、　 Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）、　Ｖｏｌ、３２８．９． ３３゜νｅｌｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　ＥＭＢＯＪ　　（１９８４）、　　３ ：２７２３　２７３０゜Ｗｅｂｂ、　Ｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｐｌａｎ ｔ　Ｓｃｉ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８３）＋　３０：１゜１４０１　　　ＡＴ ＴｒＡＣＡＧＧ＾ＧＧＡＧＡＴＡＴＴＣ丁丁ＣＧＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＴＧ ＧＣ１４４０ＦＩＧ、　３Ｂ ＦＩＧ、　３Ｃ １４０１　　　ＡＴＣＧＧＡ丁八〇ＴＡＴへＡＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧ ＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣ１４４０ＦｆＧ、　４Ｃ ＦＩＧ、８Ｃ ＦＩＧ、９Ａ ＦＩＧ、９Ｂ １４０１　　ＡＴＣＧＧＡＴＡＧＴＡＴＴＡＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴ ＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣ１４４０ＦＩＧ。９Ｃ ＦＩＧ、９Ｄ ２８４１　　　ＧＣＴＧＴＣＴＧＴＧ八τＴＣＣＧＧＧＴへＴＣＡＡＴＧＣＧＧ ＣＴＡＴＴＴｒＴＧ入Ａ　　　　２１１８０ＦＩＧ、９Ｅ ＦＩＧ、　１０Ａ Ｆ　ＩＧ、　１０Ｂ １３６１　　　ＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＴＣＧＴＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＡ、 ＴＡＡＴＡＴＡＡＴＴＧＣ１４００ＦｆＧ、　１０Ｇ ＦＩＧ、　１００ ＦＩＧ、　１ｆＡ ＦＩＧ、１１Ｂ １４０１　　　ＡＴＣＧＧＡＴＡＧＴＡＴＴＡＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧ ＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣ１４４０ＦＩＧ、　ＩＣ ＦＩＧ、　ｆｌ　Ｄ １４０１　　ＡＧＴＭＡＧＧＣＡＴＡＴＡＡＧＴＴＡＣＡＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴ ＴＣＣＧＴＴＧＴＣ１４４０ＧＣＣＣＡＴ　ＣＧ丁 ＦＪＧ、？２Ｃ ＣＣＡＣＴＣＧＣＣＣＴＣＡ ＣＴ　　　　　　ＣＴＣＴＡＧＡＣＡ　　　　　ＣＴＦＩＧ、　１３Ａ ＣＣＴＣＣＴＣＡ　　　　　ＣＴＡ ＦＩＧ、　１４Ｃ ＦＩＧ、　１４Ｄ ３５６１　　　ＧＧＡＧＧＡＡ　　　３５６７　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　ＦＩＧ、ＭＥＦＩＧ、１６Ａ ６８１　　　ＡＣＣＡＡＣ入Ｃ品ＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＧＣＡτ ＧＡＧＣＧ入ττ丁　　　７２０ＦＩＧ、１６Ｂ 手続補正書（自発） 平成２年／７月、３ｏ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）植物での外来遺伝子の発現を前記遺伝子の構造コーディング配列を修飾す ることにより改良する方法において、その改良が【配列があります】 および ＣＡＴＡＡＡからなる群から選択されたポリアデニレーション信号の出現を減少 することを含む方法。 （２）さらに構造コーディング配列内へのＡＴＴＴＡ配列の出現を減少という改 良を含む請求項１に記載の方法。 （３）植物において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫効 果のあるタンパク質の発現を強めるために、野生型構造遺伝子配列を修飾するた めの、 ａ）前記タンパク質を暗号化する配列を残したままで、前記野生型遺伝子に含ま れるポリアデニレーション信号を除去すること、および、 ｂ）前記タンパク質を暗号化する配列を残したままで、前記野生型遺伝子に含ま れるＡＴＴＴＡ配列を除去することからなる方法。 （４）さらに前記タンパク質を暗号化する構造遺伝子配列を保持したままで、自 己相補的な配列を除去したり、そのような配列を植物でよく使われるコドンを含 む非自己相補的なＤＮＡと置換することからなる請求項３に記載の方法。 （５）さらにポリアデニレーション信号およびＡＴＴＴＡ配列の除去に植物でよ く使われる配列を使用することを含む請求項４に記載の方法。 （６）ポリアデニレーション信号が、【配列があります】およびＣＡＴＡＡＡか らなる群から選択される請求項３に記載の方法。 （７）ポリアデニレーション信号が、【配列があります】およびＣＡＴＡＡＡか らなる群から選択される請求項４に記載の方法。 （８）ポリアデニレーション信号が【配列があります】およびＣＡＴＡＡＡから なる群から選択される請求項５に記載の方法。 （９）植物において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫効 果のあるタンパク質の発現を強めるために、野生型構造遺伝子配列を修飾するた めの方法であって、ａ）４個より多い連続的なアデニンまたはチミンのヌクレオ チドをもつ前記配列内の領域を同定し、ｂ）前記タンパク質を暗号化する遺伝子 配列を保持したままで、１０塩基配列内の２個あるいはそれ以上のポリアデニレ ーション信号をもつ段階ａ）の領域を、前記信号を除去するために修飾し、そし て、 ｃ）前記タンパク質を暗号化する遺伝子配列を保持したままで、植物の主たるポ リアデニレーション信号、１個より多い重要でないポリアデニレーション信号を 含む連続的な配列および１個より多いＡＴＴＴＡ配列を含む連続的な配列を除去 するために、段階ａ）の領域周辺の１５から３０塩基の領域を修飾する、 ことからなる方法。 （１０）植物の主たるポリアデニレーション信号が、ＡＡＴＡＡＡおよびＡＡＴ ＡＡＴからなる群から選択される請求項９に記載の方法。 （１１）ポリアデニレーション信号が、【配列があります】およびＣＡＴＡＡＡ からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。 （１２）さらにポリアデニレーション信号およびＡＴＴＴＡ配列を除去するのに 、植物でよく使われる配列を使用することを含む請求項１１に記載の方法。 （１３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫効果をもつタン パク質を暗号化する構造遺伝子で、本質的にポリアデニレーション信号およびＡ ＴＴＴＡ配列が欠けている遺伝子。 （１４）【配列があります】 およびＣＡＴＡＡＡからな る群から選択されるポリアデニレーション信号が本質的に欠けている請求項１３ に記載の構造遺伝子。 （１５）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−１の殺虫効果をもつタンパク質を 暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子：【配列があります】 （１６）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−７３の殺虫効果をもつタンパク質 を暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子：【配列があります】 （１７）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−１の殺虫効果をもつタンパク質を 暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子：【配列があります】 （１８）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−７３の殺虫効果をもつタンパク質 を暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子：【配列があります】 （１９）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−７３の殺虫効果をもつ完全長のタ ンパク質を暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子： 【配列があります】 （２０）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−７３の殺虫効果をもつ完全長のタ ンパク質を暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子： 【配列があります】 （２１）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−７３の殺虫効果をもつ完全長のタ ンパク質を暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子： 【配列があります】 （２２）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｔ．の殺虫効果をもつタンパク質を暗号化す る請求項１３に記載の構造遺伝子：【配列があります】 （２３）次の配列をもつ、Ｂ．ｔ．ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓの殺虫効果をもつタ ンパク質を暗号化する請求項１３に記載の構造遺伝子：【配列があります】 （２４）次の配列をもつ、Ｐ２の殺虫効果をもつタンパク質を暗号化する請求項 １３に記載の構造遺伝子：【配列があります】 （２５）請求項１３に記載の構造遺伝子をもつ植物遺伝子を含む植物形質転換ベ クター。 （２６）Ｂ．ｔ．ｋ．ＨＤ−１のＮ−末端の６１０アミノ酸とＢ．ｔ．ｋ．ＨＤ −７３のＣ−末端の５６７アミノ酸からなる融合タンパク質を暗号化する請求項 １３に記載の構造遺伝子配列で、次の配列をもつ遺伝子： 【配列があります】 （２７）さらに５個以上の連続的なＡ＋ＴまたはＧ＋Ｃ塩基を含む配列の除去を 含む請求項４に記載の方法。 （２８）大多数の植物でよく使われるコドンを含む請求項１３に記載の構造遺伝 子配列。 （２９）ジャガイモの葉のロールウイルスの外被タンパク質を暗号化する構造遺 伝子で、次の配列をもつ遺伝子：【配列があります】（３０）Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの殺虫効果をもつタンパク質を暗号化する構造コ ーディング配列を含む植物のキメラ遺伝子で、この構造コーディング配列の中に あると推定される多くのポリアデニレーション信号を減衰するように修飾されて いる遺伝子。 （３１）ポリアデニレーション信号が、【配列があります】およびＣＡＴＡＡＡ からなる群から選択される請求項３０に記載の植物のキメラ遺伝子。 （３２）構造コーディング配列が、この構造コーディング配列内の多くのＡＴＴ ＴＡ配列を減衰するようにさらに修飾されている請求項３１に記載の植物キメラ 遺伝子。 （３３）構造コーディング配列が本質的に、ポリアデニレーション信号とＡＴＴ ＴＡ配列を欠いている請求３２に記載の植物キメラ遺伝子。 （３４）請求項３３に記載の遺伝子を含む形質転換された植物細胞。 （３５）大豆、綿、アルファルファ、ナタネ、亜麻、トマト、テンサイ、ヒマワ リ、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、米および小麦からなる群から選択され る請求項３４に記載の形質転換された植物細胞。 （３６）請求項３４に記載の形質転換された植物細胞を含む植物。 （３７）請求項３５に記載の植物細胞を含む請求項３６に記載の植物。 （３８）請求項３６に記載の植物により生産された種子。