JPH03504801A - 標識された核酸プローブ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 標識された核酸プローブ 発明の技術分野 本発明は、分析物における標的核酸配列を検出するためのポリヌクレオチドプロ ーブに関する。より詳細には本発明は、ポリペプチドもしくは他の有機分子がプ ローブを標識すると共にこれを検出可能にするよう作用する標識されたポリヌク レオチドプローブに関するものである。本発明の標識されたプローブは、核酸に おける標的塩基配列の検出が望まれる多くの実験至、工業および医学の用途に有 用であることが了解この説明においては、次の用語を使用する：分析物：その存 在を検出しかつ所望に応じ定量化すべき、単独もしくは混合物としての物質。こ の分析物は小分子量もしくは高分子量のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、これら分子 を含む分子状複合体、または核酸を含有する生物学系、たとえばウィルス、細胞 もしくは細胞群とすることができる。一般的な分析物としては、核酸（ＤＮＡｅ よびＲＮＡ）または−末鎖もしくは二本鎖のいずれかとしてのその断片、ウィル ス、細菌、培養中の細胞などがある。ざらに真菌類、藻類、他の微生物、並びに 動物（たとえばを椎動物）および植物、その細胞、組織および体液も包含させる 。

して作用するような成分。

ゲノムＤＮＡ：生物のＤＮＡを含む分析物。典型的には、分析物は精製された核 ＤＮＡであって、必ずしも必要でないが生物ＤＮＡに存在する全てのヌクレオチ ド配列を包含することができる。

４嶌：そのままで或いは信号用成分または架橋用成分と信号用成分との組合せが 共有付着した後に或いは信号用成分または架橋用成分と信号用成分との組合せが 非共有結合した後に検出可能かつ成る場合には定量可能となる信号をもたらすよ うな結合基によりプローブに付着した成分。

結合基：標識をプローブに結合もしくは付着させるよう作用する成分。結合基は 標識をプローブから離間して保持し、プローブと標的どの間の結合に対する阻害 を防止するよう作し相補的であるポリヌクレオチド配列。

標識に付着し或いは結合した架橋用成分に対し共有付着もしくは非共有結合した 際に、標識およびこの標識が付着する成分を検出するための信号を与えるような 成分。

４的：その存在を検出すべき分析物に存在する核酸における塩基の特定配列。

生物試料および非生物試料における微量の物質の分析および検出が、臨床および 分析実験至において日常の作業となった。これらの検出技術は主として２種類に 分類することができる：（１）リガンドーリセプタ相互作用に基づくもの（たと えば免疫分析に基づく技術）、並びに（２）核酸ハイブリッド化に基づくものく ポリヌクレオチド配列に基づく技術）。

免疫分析に基づく技術は、抗体およびこれに相補的な抗原の非共有結合からなる 工程順序を特徴とする。たとえばＴ。

チャード、［放射線免疫分析および関連技術の概論Ｊ　　（１９７８）参照。

ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術は、ワトソンークリックの対形成を介す る塩基のハイブリッド化を可能にする条件下に、標識されたポリヌクレオチド配 列もしくはプローブを分析物の相補的配列に対し非共有結合させかつ前記ハイブ リッド化を検出することからなる工程順序を特徴とする［Ｍ、グルンドシュタイ ンおよびＤ−Ｓ、ホグネス、「コロニーハイブリッド化：特定遺伝子を含有する クローン化ＤＮＡの分離方法」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・ サイエンス・ＵＳＡ、第７２巻、第３９６１〜６５頁（１９７５）：Ｄ、Ｔ、キ ングスベリ−１「遺伝子病および感染病の診断にあけるＤＮＡプローブ」、トレ ンズ・イン・バイオテクノロジー、第５巻、第１０７〜１１頁（１９８７）　］ 。

分析物の相補的配列に対する標識された配列もしくはプローブの非共有結合は、 ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術の主認識現象である。この結合現象は、 正確な分子整列とプローブおよび標的の相補的ヌクレオチドの相互作用とによっ てもたらされる。エネルギー上、これは非共有結合の自由エネルギー、たとえば 水素結合、スクッキング自由エネルギーなどの放出によって促進される。

標的配列を含有する分析物を決定するためブロー・ブの非共有結合を用いるには 、標的に対するプローブの結合を検出しうろことが必要である。この検出は、信 号化の工程もしくは現象によって行なわれる。信号化の工程もしくは現象は、主 認識現象の発生に関する検出を定量的もしくは定性的に可能にする。

一般に、信号成分をプローブに付着させるための別個の標識成分の使用が、主認 識現象と信号現象とを組合せるための望ましい方法である。第１に、この技術は プローブに対する大型の架橋用および信号用成分の付着を可能にすると共に、プ ローブの構造および標的に対するその結合を最小にしか阻害しない。第２に、別 個の標識の使用は、プローブ分子内の単一部位に対する多くの信号用成分の間接 的付着を可能にする。多くの塩基に対し信号用成分を付着させるのでなく、単一 箇所に対する多くの信号用成分を有する標識の付着はプローブと標的との間の結 合が阻害される傾向を最小化させるよう作用すると共に、単一の信号用成分の場 合よりも大きい信号を与える。他の改善は、標識とプローブとの間の堅固な付着 箇所として結合基を用いてハイブリッド化の際に標識をプローブから離間保持す ることである。

ポリヌクレオチド配列に基づく検出技術の主認識現象と信号化現象とは直接的、 比例的または反比例的に組合せることができる。たとえば検出可能なプローブを 用いて行なわれる核酸ハイブリッド化分析のようなシステムにおいて、信号の量 は一般に存在する分析物の量に正比例する。反比例の技術は、たとえば検出され る信号の量が試料中に存在する分析物の量の増加と共に減少する競合分析を包含 する。

少量の標的しか存在しない場合は、増幅技術が極めて重要となる。たとえば、分 析の信号用成分は各認識成分につき１〇二　１の比で存在して、１０倍の感度増 大を与えることができる。

広範な種類の信号化現象を用いて、主認識現象の発生を検出することができる。

選択される信号化現象は、用いる信号用成分を特徴とする特定信号に依存する。

標識自身はざらに処理しなくとも検出可能であるが、しばしば信号用成分を標識 または信号用成分と架橋用成分との組合せに対し共有付着させるか或いは非共有 結合させて、主認識現象を検出可能にする。

架橋用成分と信号用成分との上記組合せは標識に対する付着もしくは結合の前に 作成しうるが、これは標識に対し順次に付着させ或いは結合させることもできる 。たとえば先ず最初に、架橋用成分を標識に対し結合させまたは付着させ、次い で信号用成分を付着された標識および架橋用成分と組合せる。ざらに、数個の架 橋用成分および／′または信号用成分を如何なる架橋用成分と信号用成分との組 合せでも一緒に用いうろことを了解すべきである。

標識に対する信号用成分または架橋用成分と信号化用成分との組合せの共有付着 の例は、信号用成分による標識の化学的改変を包含する。ざらに主認識現象は、 信号用成分または架橋用成分と信号用成分との組合せのそれ自身適当な手段によ り検出しうる非共有結合によって、或いは信号を与えるよう架橋用成分と信号用 成分との組合せの標識に対する上記手段の１つにより検出しうる非共有結合によ って検出することができる。たとえば、標識は架橋用成分（たとえばレクチン） に対し結合させ、次いでレクチン（すなわち架橋用成分）を介し他の成分に結合 させて適当な手段により検出することができる。

分析物検出系にプローブとして有用なポリヌクレオチド配列の標識に対し共有付 着もしくは非共有結合ざぜるべく用いうる広範な種類の信号用成分および架橋用 成分が存在する。

必要とされることは、信号用成分が信号を与えてこれをこれを適当な手段により 検出しうると共に、存在する架橋用成分を標識に対し共有付着し、或いは非共有 結合する能力によって特性化し、ざらに信号用成分と結合する能力を有すること のみでおる。

信号用成分は放射性もしくは非放射性とすることができる。

放射性信号用成分は燐、沃素、水素、炭素、コバルト、ニッケルなどの１種もし くはそれ以上の放射性同位元素を特徴とする。好ましくは、放射性同位元素はβ 線もしくはＴ線を発生し、長い半減期を有する。放射性信号用成分の検出は、典 型的には照射によって生じた結晶検出器からの光子放出の刺戟によって或いは写 真乳剤のフォギングによって行なわれる。

非放射性信号用成分は、その使用が照射線への露出に伴う危険を与えず、かつ使 用後の特殊な廃棄技術を必要としないという利点を有する［Ｄ、Ｔ、キングスベ リ−（１９８７）　、第１０８頁］：さらに、これらは一般に一層安定である結 果、一層安価に使用される。非放射性信号用成分の検出感度は高く、または放射 性信号用成分の感度よりも高い。

非放射性標識と共に有用でおる好適な非放射性信号用成分または架橋用成分と信 号用成分との組合せには、ビオチン／アビジン結合系に基づくものがある［Ｐ、 Ｒ，ランガー等、「ビオチン標識されたポリヌクレオチドの酵素的合成：新規な 核酸親和性プローブ」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエン ス・ＵＳＡ、第７８巻、第６６３３〜３７頁（１９８１）　：Ｒ，ｌ−１，シン ガーおよびり、Ｃ，ワード、「ビオチン化されたヌクレオチド同族体とのその場 でのハイブリッド化を用いる皺筋肉組織培養で可禍化されるアクチン遺伝子発瑛 」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７９ 巻、第７３３１〜３５頁（１９８２）　］。非放射性信号用および架橋−信号用 システムについては、米国特許第４，７１１，９５５号を参照することができる 。

非放射能標識のポリヌクレオチドは、検出システムでそれ程広範に使用されてい ない。何故なら、ハイブリッド化を阻害しない標識の付着が高価となり、ざらに プローブに対する信号用成分の付着が困難となるからである。標識に対し付加さ せるようポリヌクレオチドを改変するのに有用である化学反応条件はしばしば激 し過ぎて、特定のヌクレオチドに関し充分選択的とならない。より重要なことに 、ポリヌクレオチド配列の化学標識は、しばしばハイブリッド化に必要な水素結 合を阻害する。たとえば、グリオキサールおよびケトキサールのようなジカルボ ニル試薬はグアニン残基と反応するが、グリオキサールおよびケトキサールと反 応したヌクレオチドは分析物における相補的配列にバイブリド化しない。何故な ら、グリオキサールもしくはケトキサール成分はハイブリッド化に必要な水素結 合を阻害するからである［Ｍ、リット、「トランスファーリボ核酸に関する構造 研究、■、酵母フェニルアラニンのトランスファーリボ核酸におけるケトキサー ルによる露出グアニン部位の標識」、バイオケミストリー、第８巻、第３２４９ 〜５３頁（１９６９）　］。

たとえば米国特許第４，７１１，９５５号公報に開示されたような他の手段は、 結合基による個々の塩基に対する標識の共有付着を可能にする。次いで標識され たプローブを、プローブに対し相補的なポリヌクレオチドを雛型として用いるこ とにより、標識された塩基および未標識の塩基から作成せねばならない。かくし て、プローブ上の標識の位置に関し僅かな特異性しか可能でなく、その結果、隣 接する標識間に立体的干渉が生じうる。ざらに、ポリヌクレオチド中への組込み の前にあける標識された単量体ヌクレオチドの合成は高価な化学工程を含む。ポ リヌクレオチド中への標識された単量体ヌクレオチドの結合も高価でおる。何故 なら、酵素的結合に用いる酵素の価格が高いからである。

プローブ配列の個々のヌクレオチドを標識する標識技術の他の欠点は、信号強度 が一般に低いことである。単一の信号用成分が各ヌクレオチド塩基に付着される ため、容易に検出しうる信号強度のレベルをうるには長いプローブ分子が必要と される。これは、プローブと分析物との間の僅かな不整合を検出するプローブの 能力を低下させる。何故なら、他の塩基間における充分な水素結合がプローブを 洗浄の間に分析物に結合させ続けるからである。塩基対の間の単一の不整合を検 出することが、たとえば踵状赤血球貧血のような成る種の遺伝病を診断する際に 極めて重要である［８．Ｊ、コナー等、「合成オリゴヌクレオチドとのハイブリ ッド化による踵状赤血球β５−グロビン対立遺伝子の検出」、プロシーディング ・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ｔＪＳＡ、第８０巻、第２７８〜８２ 頁（１９８３）　］。

本発明の特に重要な用途は、生物の全ゲノムをスクリーニングして特定の標的塩 基配列を検出することにある。たとえば、小児年齢に達した後まで病気が出現し ない、たとえばハンチントン舞踏病のような場合、或いはへテロ接合の個体がキ ャリヤとなるたとえば踵状赤血球貧血およびティ・サックス病のような場合、潜 在的な親における遺伝性の病気の存在を検出することが望ましい。ゲノムスクリ ーニングは、大きい感度を有するプローブを必要とする。さらに効果的なゲノム スクリーニングは、影響を受けた遺伝にあける単一塩基に突然変異を検出して、 単一塩基のみの変化から生ずるたとえば鎌状赤血球貧血のような遺伝性の病気を 検出しうる短いプローブを必要とする［コナー等、１９８３］。ゲノムＤＮＡも しくはＲＮＡの分析物における標的ポリヌクレオチド配列を選択的に検出しうる プローブを、ゲノムプローブと呼ぶことができる。現在まで、野生型の個体から 突然変異種を識別しうるような放射性信号用成分を持ったもの並びに長さ約４０ ０塩基対より大きいものとは別のゲノムプローブは開示されていない。下記する ように、本発明による作成される短いプローブは、これを行なうことができる。

泣哩五皿慮 本発明は、放射線標識されたプローブの使用および従来技術のプローブ標識方法 に伴う問題の両者をヌクレオチドプローブと複数の信号用成分を持った標識とを 提供することにより解決する。この標識はアミンおよびスルフヒドリル反応性の へテロニ官能性試薬とプローブおよび標識との反応によりプローブに付着され、 この反応は標識におけるスルフヒドリル基の酸化をもたらす。プローブと標識と の間の付着の方式は、プローブと標的ポリヌクレオチドとの間のハイブリッド化 に際し干渉を減少させるよう作用する。１具体例において、付着箇所はプローブ の５′−末端におけるアミノ基である。

他の具体例において、付着箇所はプローブ内の改変塩基に固定されたアミノ基で ある。本発明は、標識に対する複数の信号用成分の付着を可能にすることによる 、プローブ結合から生ずる信号の増幅を与える。他面において本発明は、ゲノム ＤＮＡにおけるヌクレオチド配列の変化の検出方法を提供する。この方法は、本 発明による標識された核酸プローブを用いると共に遺伝子内の単一ヌクレオチド の変化を検出するのに充分な感度を有する。

図面の簡単な説明 第１図はポリヌクレオチドプローブの５’　−ＯＨ基を活性化する際に用いられ る化学反応の略図であり、第２図は活性化されたポリヌクレオチドプローブに対 し標識を付着させる際に用いられる化学反応の略図である。

発明の詳細な説明 本発明によれば、分析物における標的配列に対し相補的なヌクレオチド配列を有 する核酸プローブ分子を、反応性スルフヒドリル基からなる有機分子をプローブ の５′−末端に共有付着ざぜることにより標識する。好適具体例において、標識 はそのアミン末端にシスティン残基を有するポリペプチドストランドである。代 案として、標識は反応性アミン基と少なくとも１個のスルフヒドリル基とを有す る任意の分子とすることもできる。好ましくは、ポリペプチドストランドは、反 応性カルボキシル基および／またはアミノ基を有する複数の残基を含む。例とし て、リジンおよびオルニチンは反応性アミノ基を有するのに対し、アスパラギン 酸およびグルタミン酸は反応性カルボキシル基を有する。好適具体例において、 架橋用成分は、ポリペプチドがプローブに付着された後に、このポリペプチドに 付着される。好適な架橋用成分はビオチンおよびイミノビオチンを包含する。標 識されたプローブが分析物にバイブリド化された債、これら標識を信号成分に対 し或いはこれに付着された信号用成分を有する第２架橋用成分に露出させて検出 することができる。好ましくは、アビジンもしくはストレプトアビジンが第２架 橋用成分であって、これには信号成分が付着されている。

代案具体例においては、反応性アミン基を有する残基にビオチンを共有付着させ る代りに、放射性沃素原子をポリペプチドストランドにおけるチロシン残基に共 有付着させることもできる。ざらに他の具体例においては、クマリンを反応性カ ルボキシル基を有する残基に付着ざぜることもできる。クマリンの存在は、光学 的に或いは免疫化学手段により検出することができる。明らかなように、標識と 信号との他の組合せも用いることができる。

多数の核酸配列を、本発明にしたがって分析物を検出する際のプローブとして使 用することができる。たとえば各種のウィルス、ウィロイド、真菌類、寄生虫も しくは細菌感染、遺伝子障害を特性化するポリヌクレオチド配列のようなＲＮＡ およびＤＮＡの両者における標的配列、または検出することが望ましい分析物に あける他の配列が包含される。これらプローブは合成、半合成または天然源とす ることができる。プローブ分子はポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシヌク レオチドの両者を包含する。

現在好適な具体例は約３０塩基対のプローブを用いるが、標的配列に対し特異的 かつ安定にバイブリド化しうる限り、より短いプローブを使用することもできる 。このプローブは、ＤＮＡデュプレックスのセンスもしくはアンチセンスストラ ンドのいずれかにバイブリド化するよう設計することができる。しかしながら、 標的がメツセンジャＲＮＡである場合、プローブの配列はこれに対し相補的とす べきである。プローブのグアニンおよびシトシン含有量は、標的配列を検出する 能力につき臨界的でない。

本発明による標識されたプローブの合成は一連の工程で行なわれる。好適具体例 において、プローブ分子はアミノアルキル化により５′−末端にて活性化される 。これは、カルボニルジイミダゾールを用いる５’−ＯＨ基からその５′−イミ ダゾリル誘導体への変換に続く、たとえばヘキサメチレンジアミンのようなアミ ノアルキル化合物による置換によって達成することができる。この具体例を実施 するための方法の詳細な説明は、ワラハタ−等、「５′−アミノアルキルオリゴ デオキシヌクレオチドの合成に関する簡単かつ効率的な方法」、ヌクレイツク・ アシッド・リサーチ、第１４巻、第７９８５〜９４頁（１９８６）に見ることが できる。好適具体例のへキサメチレンジアミノの代りに、他のジアミンを用いる こともできる。代案として、５’−ＯＨを他のアゾリードにより［Ｈ。

Ａ、スターブ、「複素環式アミドしアゾリード］を用いる合成」、アンゲバンテ ・ヘミ−・インターナショナル・エディジョン、第１巻、第３５１〜６７頁（１ ９６２）　］またはメスチレンスルホニルもしくはｐ−トルエンスルホニル基に より活性化し、次いでＳＮ２置換反応によりアミノ化することができる。

標識は任意の好適な長さとすることができる。結合基および標識の共有付着を可 能にするには、好ましくは標識が反応性スルフヒドリル基を有する。好ましくは 標識は、ざらに架橋用成分もしくは信号成分を付着させうる反応性基を含む。

標識は、上記の性質を有する任意の有機分子とすることができる。好適具体例に おいて、標識はポリペプチドであり、かつ架橋用成分はオルニチンもしくはリジ ン残塁のアミン基、並びにアスパラギンＭおよびグルタミン酸残基のカルボキシ ル基に付着される。好ましくは、ポリペプチド標識は、これに付着した少なくと も５個の架橋用成分を有する。或いは、信号用成分をこれら残基に直接に付着さ せることもできる。

標識がポリペプチドである場合、ポリペプチドストランドを化学的に合成して周 知の技術に応答させることができる。

或いは、これを天然原料から誘導することもできる。

ポリペプチドストランドに付着された架橋用成分および／′または信号用成分の 間の干渉を最小化させるには、架橋用もしくは信号用成分を付着させる残基が隣 接してはならない。

このような離間は、第２架橋用成分および信号成分による架橋用成分もしくは反 応性残基に対するアクセスを容易化させる。

標識がポリペプチドでおる場合、このポリペプチドストランドはシスティン残基 またはスルフヒドリル基を有する他の改変残基を包含する。好適具体例において 、スルフヒドリル基はポリペプチドストランドのアミン末端もしくはカルボキシ ル末端に存在する。この配置により、標識がプローブの５′−末端に付着するの で、プローブおよび標識は隣接しない。

標識がアミノ酸残基を含む場合、残基はたとえばグリシン、アスパラギン、アス パラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、アルギニンおよ びチロシンのような親水性であるものから選択することができる。さらに、任意 の天然アミノ酸もしくはそのＤ異性体を包含する標識を形成することもでき、た だし残基の間および残基と架橋用成分との間に電荷もしくは立体障害が存在する 場合は、たとえばアビジンもしくはストレプトアビジンのような信号用成分もし くは第２架橋用成分による標識に対するアクセスを妨げない。

好ましくは、標識は順次にアミンおよびスルフヒドリル反応性のへテロニ官能性 基を活性化プローブと反応させ、次いで標識と反応させることにより形成された 結合基によって、活性化プローブに付着される。好ましくは、結合は活性化プロ ーブ分子をスクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチルコシクロヘキサン−１− カルボキシレートと反応させて求核性置換反応にてＮ−ヒドロキシスクシンイミ ドを放出させた後に、誘導化されたプローブを反応性スルフヒドリル基を有する 標識分子に対し露出させることにより形成される。たとえばメタマレイミドベン ゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミジル［４−イオド アセチルコアミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−プロモアセチルコお よびＮ−スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネートのような他の 化合物を用いて、結合基を形成さぜることもできる。得られる標識は、このよう に形成された結合により、プローブから離間保持される。

本発明の標識されたプローブの有用な特徴は、複数の信号成分を各プローブに付 着させうろことにある。かくして、各主認識現象の増幅が与えられる。好適具体 例において、架橋用成分は、標識されたポリペプチドストランドにおける５個の りジン残基に付着される。発生した信号が、存在する標識分子の個数に比例する と仮定すれば、この技術は少なくとも５倍の信号の増幅を与える。第２架橋用成 分または複数の信号用成分を有する架橋用成分の組合せを用いれば、ざらに増幅 が可能である。

使用する標識に応じ、信号用成分は、標識に直接に結合するよう選択することが できる。しかしながら好ましくは、信号を架橋用成分に付着ざぜると共に、この 架橋用成分を標識に結合させる。たとえば、ビオチンを架橋用成分として使用す る場合、アビジンを第２架橋用成分として使用することができ、かつアビジンは これに付着して蛍光性分子を信号用成分として有することができる。或いは、架 橋用成分は標識に対する抗体とすることもできる。ざらに本発明の範囲内におけ る他の代案は、第１抗体を架橋用成分として用いると共に、信号用成分を有する 第２抗体を第２架橋用成分として、用いることでおる。

好適具体例においては、ビオチンを架橋用成分として使用する。ビオチンは、標 識されたプローブをビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドと共に培養すること によりプローブに付着される。これは、プローブに存在する反応性アミノ基に対 するビオチン分子の共有結合をもたらす。

この方法の変法を用いて、これらヌクレオチドの塩基成分を標識することもでき る。本発明の結合基を５’　−ＯＨ誘導化プローブに付着させずに、同じ結合基 を用いて化学おける変化を殆んど伴わずに標識をランガー等（１９８１）および ワード等に係る米国特許第４，７１１，９５５号の改変塩基の反応性アミノ基に 付着させることができる。特に、上記米国特許公報に開示された改変塩基の結合 基は反応性アミノ基を有するので、これらはアミンおよびスルフヒドリル反応性 のへテロニ官能性試薬と反応して、標識をこれに付着させることができる。

このようにして塩基を標識する場合、２個の結合基が標識をプローブに付着させ る。ランガー等の方法により塩基に付着された結合基を第１結合基と呼び、ざら に改変塩基のアミノ基とアミノおよびスルフヒドリル性へテロニ官能性試薬、並 びに標識との間の反応により形成された結合基を第２結合基と称する。架橋用お よび信号用成分は、上記のように標識されたプローブに付着させることができる 。

実施例 本発明を一層よく理解しうるよう、以下に実施例を示す。

これら実施例は単に説明の目的であり、本発明の範囲を決して限定するものと解 釈してはならない。

実施例　１ ＤＮＡプローブの作成および活性化 （ａ＞プローブ合成 アプライド・ビオシステムズ・モデル３８０Ａ型の自動化ＤＮＡ合成装置を用い て、４種のＤＮＡプローブを作成した。

これらプローブの塩基配列は次の通りである：１、　　　５’　　ＧＡｃ　　Ｃ ＡＣｃｃτ　ＧＣＴ　ＣＴＣＣＴＧ　　ＧＧＣＡＣＡ　ＧＣＧ　　（、Ｇ＾、。

２＋　　　５Ｉ　　ＣＡ（：　　ＧＣＴ　　ＧＣＴ　ＣＴＣＣＴＧ　　ＧＣＣＡ ＣＡ　　ＧＣＧ　　ＯＣＡ　　ＣＧ導入、　　　　５’　　ＴＴＧ　　ＣＴＧ　 　にＴＡ　ＴＡＴ　　ＣＡＴ　ＣＴＧ　　ＣＧＴ　　ＴＴＴ　　’！ＴＣＡＴＧ ４、　　５’　　ＴＴＧ　ＣＴＣにＴＡ　ＴＡＴ　ＣＡＣＣＴＣＣＧＴ　ＴＴＴ 　ＴＴＧ　ＡＴに合成装置は、手動の端末法を用いてＤＭＴｒ　ａ−オフにつき プログラミングした。プローブを作成すべく用いたモノマーは、充分保護された ヌクレオシド−〇−メチルホスホルアミダイトモノマーとした。

上記プローブは、全てヒト組織プラスミノーゲン活性化剤（ｒｔＰＡＪ）をコー ドする遺伝子に対しアンチセンス（相補的）とした。プローブ２は、より短いプ ローブ１の改変体とした。プローブ３、並びにプローブ１および２は、ｔＰＡ遺 伝子の種々異なる領域に対し相補的である。プローブ４は下線の位置以外にはプ ローブ３と同一であり、この下線位置は故意に導入した不整合である。

（ｂ）プローブのアミノアルキルイ ブローブの５’−ＯＨ基を、ワハター等（１９８６）により記載された方法の変 法を用いて５′−アミノアルキル誘導体として活性化させた。合成の間および合 成の後、これらプローブをアミノプロピル調節された気孔ガラス玉（エレクトロ ヌクレオニクス社）の固体支持体に付着させた。プローブの合成後、このプロー ブがまだ付着されている固体支持体を中庸多孔質のフリットとストップコックと を備えた小型の反応容器に採取した。プローブを乾燥アセトニトリルにより無水 条件下で充分洗浄した。カルボニルジイミダゾール（５０ｍｇ）を１ｒｒ１ｆ！ の無水アセトニトリルに溶解し、この溶液を反応容器中へ導入した。活性化反応 を、時々振とうしながら室温にて３０分間にわたり進行させた。この時間の後、 固体支持体を乾燥アセトニトリルにより充分洗浄した。

活性化されたプローブをイソプロパツールに溶解された０、３Ｍのへキサメチレ ンジアミンの溶液１ｒｎＩｌと反応させることにより、プローブの５′−アミノ アルキル誘導体を作成した。求核性置換反応を、時々振とうしなから室温にて１ 時間進行させた。１時間後、これら試薬をイソプロパツールに続きメタノールで 洗浄除去した。まだ固体支持体に付着しているプローブを風乾させた。

乾燥後、プローブをチオフェノール：トリエチルアミン：ジオキサン（１：２： ２）の溶液１ｄで３０分間処理して、燐酸保護基を除去した。このオリゴマーを 濃水酸化アンモニウムにより固体支持体から１時間かけて切除した。次いで反応 混合物を約５時間にわたり約５５℃まで加温して、塩基保護基を除去した。反応 混合物を減圧下で乾燥することにより水酸化アンモニウムを除去した。

水酸化アンモニウムを蒸発させた後、活性化されたプローブを水中に溶解させか つ凍結乾燥させた。最初の精製は、寸法に基づき、５０ｍＨの酢酸トリエチルア ンモニウムで１）Ｈ７，０に平衡化ざ才た５ｒｎｉのセファデックスＧ２５カラ ム（ファルマシア社）により行なった。６種のフラクション１０滴を集め、プロ ーブ分子を含有するフラクションをゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラ フィー（ｒＨＰＬＣＪ　）により精製した。

ＨＰＬＣ精製を用いた場合、溶剤Ａは１０％アセトニトリルと９０％の５０ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム（ｒＴＥＡＡＪ　）とのｐ＠７．０の混合物で構成 し、溶媒Ｂは８０％アセトニトリルと２０％ＴＥＡＡとの同じ＜ｐＨ７，０の混 合物とした。これら溶剤をＣ８カラム（ビオラド社）に施して、最初に０％の溶 媒Ｂの濃度勾配を形成し、これを２５分間にて２５％の溶媒Ｂまで増大させた。

溶媒濃度勾配を用いてオリゴマーをカラムから溶出させると共に、ピークを含有 するフラクションを集めかつ凍結乾燥させた。

精製用にゲル電気泳動を用いた場合、厚さ１．５ｍｍの変性用ポリアクリルアミ ドゲルを用いた。このオリゴマーを短波長の紫外光の下で可視化させ、適するバ ンドを切除すると共に、ｐ）−１７，０の１００ｍ）ｌの重炭酸トリエチルアン モニウムにより６０℃にて４時間溶出させた。次いで溶出液中に存在するオリゴ マーを１Ｗ１ｆｌの使い捨てＣ１８カラム（ビオラド社）で脱塩し、水中の２５ ％アセトニトリルによりカラムから溶出させた。

１ｒｄ！の希釈物における２６０ＯＡの吸光度を測定することによりＤＮＡ含有 量を決定し、精製された誘導化プローブを凍結乾燥した。

実施例　２ １３残基のポリペプチドをメルフイルドの方法［Ｒ，Ｂ、メルフイールド、「固 相ペプチド合成工：テトラベブチドの合成」、ジャーナル・アメリカン・ケミカ ル・ソサエティ、第８５巻、第２１４３〜５４頁（１９６３）　］によりアプラ イド・ビオシステムス４３０Ａ型自動化ペプチド合成装置で合成した。合成ポリ ペプチドは次の配列を有した： ｌｊ’５ＴＶｒＧ　Ｉ　Ｖｌｊ’ＳＡＳｎＳｅｒＬＶｓＰｒＯＡｒｇｌｙｓ（３ １ｕＴｈｒＣｙｓ０ ポリペプチドの合成の後、掃去剤ｐ−チオクレゾール、ｐ−クレゾールおよび硫 化エチルメチルの存在下で無水弗化水素を用いて保護解除した。副生成物の形成 を最小化させるべく、掃去剤を用いた。これら試薬を次の混合物として用いた： １０ｒｒ１１の１００％無水弗化水素、１ｒ１１ｆ！のｐ−クレゾール、 １ｒｒ１１の硫化エチルメチル、 ０、１（ｌのｐ−チオクレゾール。

調整用Ｃ４もしくはＣｔｅカラムを用いるＨＰＬＣにより粗ペプチドを精製し、 その際水中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶剤Ａとして用いると共に２０％アセ トニトリルと８０％水との混合物における０、１％トリフルオロ酢酸を溶剤Ｂと して用いた。０％溶剤Ｂから１００％溶剤Ｂまでの４０分間にわたる濃度勾配を 用いて、ペプチドをカラムから溶出させた。２２００人にあける吸光度を監視す ることにより、精製ペプチドを検出した。精製されたペプチドを含有する部分を 集め、凍結乾燥し、かつ０℃で貯蔵した。このポリペプチドを６ＮのＨＣｊ中で １１０℃にて２４時間にわたり加水分解した後に加水分解物をベックマン型アミ ノ酸分析器で分析することにより、ポリペプチドの組成を確認した。

（ｂ）プローブに対する標識の付着 実施例１により作成された約１．５Ａ２６０単位の乾燥誘導化プローブをｐＨ７ ，７の０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液４００μｆｆニ懸濁させた。これにアセトニ トリル３ＤＯｌｌＪにあける２ｍｇのスクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチ ルコシクロヘキサン−１−カルボキシレートを添加した。混合した後、反応を室 温にて６時間進行させた。次いで、アセトニトリルを急速減圧を用いて除去した 。水溶液を不溶性沈澱物のペレット化の後にｐ）−１７，０の５０ｍＨのＴＥＡ Ａで平衡化された！ＭのＧ２Ｓカラムに施し、得られた縮合物（すなわち５′− マレイミドメチルシクロへキシルオリゴヌクレオチド）を同じ緩衝液により溶出 させた。６種のフラクション１０滴を集め、反応生成物を含有するフラクション を活性化プローブの精製につき上記した条件下でＣ８カラムにより精製した。反 応生成物を凍、結乾燥し、そのＤＮＡ含有量を水中に再懸濁させた後に２６００ 人にあける吸光度を測定することにより決定した。

約０．８Ｑ、Ｄ、単位（ｐＨ７゜３（７）ＨＥＰＥＳ緩衝液２０ＯＳにおける反 応生成物の２６００人で測定された吸光度）を２ｍｇのポリペプチド標識と混合 した。反応を１時間進行させた。標識されたオリゴヌクレオチドを、活性化オリ ゴマーの精製につき上記した条件下でＨＰＬＣにより精製した。より低い保持時 間を有する単一ピークとして溶出した標識プローブを未標識のプローブと比較し た。標識プローブに対応するピークを集め、凍結乾燥させ、１ｍｌの水に再懸濁 させた。２６０ＯＡにあけるその吸光度は、これが０．１８０．　Ｄ、単位で構 成されることを示した。

（Ｃ）標識プローブのビオチニル化 この実施例の上記（ｂ）部からの標識プローブを急速減圧下で凍結乾燥させた。

凍結乾燥したＤＮＡをｐ）１７．３の０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液２００１Ｊｉ に懸濁させた。１ｍ（］の］ビオチンーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステを ２００成のアセトニトリルと混合した。この混合物を標識プローブ分子の溶液に 添加し、反応を室温にて４時間進行させた。アセトニトリルを急速減圧により蒸 発させ、この水溶液を実施例１に記載した条件下でＣ８カラムによりＨＰＬＣで 精製した。ビオチニル化された標識プローブは、出発物質から充分分離された単 一ピークとしてカラムから溶出した。ビオチニル化された標識プローブを集め、 凍結乾燥し、かつ１０％アセトニトリルと水との混合物１ｄに懸濁させた。この 混合物は２６００人にて０．ＩＱ、Ｄ、単位の吸光度を有した。

実施例　３ 標識プローブを用いるＤＮＡ配列の検出（ａ＞ドツト・プロットの作成 ドツト・プロット［Ｆ、Ｃ，カファトス等、［ドツト・プロット・ハイブリッド 化法による核酸配列同族性および関連濃度の決定」、ヌクレイツク・アシッド・ リサーチ、第７巻、第 １５４１〜２２頁（１９７９）　］を、プラスミド含有のｔＰＡから一連ノフラ スミドＤＮＡの希釈物をニトロセルロースフィルタ上にスポットして作成した。

各ドツトは、ざらに２ｎｇの音波処理された鮭精子ＤＮＡを含んだ。

（ｂ）フィルタの予備ハイブリッドイ処理分析物と鮭精子ＤＮＡとが含浸された 乾燥フィルタを水で濡らし、かつ６ＸＳＳＣで濡らして吸取り乾燥させた［ａ： ３．ＯＭの塩化ナトリウムおよび０．３Ｍのクエン酸ナトリウムコ。次いで、こ れらフィルタを次の溶液により４６℃で２〜４時間にわたり処理した： ５ｒ／ｄｌの１００％ホルムアミド ２．５ｄの２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ ０，５ｄの１ｏｏｘ　ｓ　ｓ　ｃ Ｏ，２５ｄの２５ｒ＋Ｍ燐酸ナトリウム溶液（１）Ｈ６，５）０．７５７の水。

上記溶液を４個のフィルタの処理につき使用した。

（Ｃ）ハイブリッド化 試験試料に対する標識プローブ分子のハイブリッド化を、次の組成を有する緩衝 溶液で行なった：４、５ＩｒＩｆ！のホルムアミド ２．５−の２０Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ ０，１ｍｌ１の１００ｘテンハルツ溶液ｂ０、２ｒｎｉの１Ｍの燐酸ナトリウム （ｔ）Ｈ６，５）０、２ｍｇ／　ｍｆ！の新たに煮沸した鮭精子ＤＮＡ２．３ｄ の水。

［ｂ：デンハルツ等、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ ケーション、第２３巻、第６４１〜４５頁（、１９６６）　　コ　。

標識されたプローブを５０ｎＱ／ｒｎＩｌのハイブリッド化溶液の濃度で使用し た。２個のフィルタにつき密封されたハイブリッド化用の袋で５ｄの緩衝溶液を 用いてハイブリッド化を行なった。

ハイブリッド化の後、これらフィルタを次のように洗浄した： 室温にて１０分間にねたり６ＸＳＳＣ（２回交換）、４６℃にて１０分間にわた り３ＸＳＳＣ（２回交換）、５５℃にて１０分間にわたりｌＸ５ＳＣ（２回交換 ）、５５℃ニテ１０分間にわたり０．１ｘＳＳＣ（２回交換）。

（ｄ）フィルタのブロッキング バックグランドを最小化させるため、ドツトプロットにつき用いたフィルタ上の 非特異性部位をブロックした。これらフィルタをｐｌ−１７，５の０．１Ｍトリ ス緩衝液で５分間洗浄した。

これらフィルタを次いで０．１Ｍトリス緩衝液と０．４５　Ｍ塩化す１〜リウム との混合物（ｐＨ７，５）にあける３％牛血清アルブミン中で５８℃にて３０分 間培養し、次いで吸取り乾燥させた。

（ｅ）炙世 結合したプローブを、ブルージーン（登録商標）非放射性核酸検出装＠（ＢＲＬ ）により検出した。要するに、洗浄されかつブロックされたフィルタを、新たに 作成されたストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合溶液にて空温で１ ５分間にわたり緩和に振とうしながら培養した。結合溶液は、１０μｅの１ｍ（ ｌａｍｆ！保存溶液をｐＨ７，５の０．１ｍｉトリス緩衝液１０ｒｎｌに添加し て作成した。この溶液１（７を２個のフィルタにつき使用した。この培養の後、 フィルタをそれぞれ１５分間かけて２０（７のトリス緩衝液で２回およびｐＨ７ ，５の０．４５．Ｍ塩化ナトリウムで空温にて１５分間洗浄した。

試料ＤＮＡに対する標識プローブ分子のハイブリッド化を可視化させるため、フ ィルタを発色溶液と共に培養した。この）容液はジメチルホルムアミド中の４４ μｌのニトロブルーテトラゾリウム（７０％ジメチルホルムアミと中の７５ｍＱ ／′ｍｌ！　）と３３成の５−ブロム−４−クロル−３−インドイル／′ホスフ ェート（１００％ジメチルホルムアミド中の５０ｍＭ　ｒｎｌｌ　）とを、０． ４５Ｍの塩化ナトリウムおよび５０ｍＭの塩化マグネシウムを含有するｐＨ９， ５の０．１Ｍ１〜リス緩衝液ｉｏｍｉ！中に含有した。

微光下で培養を密封ポリプロピレン袋内にて２〜３時間にわたり行なった。フィ ルタを２０ｍＭのトリス緩衝液と０．５＋ｔ＋ＨのＥＤＴＡとよりなるＤＨ７， ５の溶液で洗浄することにより、発色を停止させた。次いで、これらフィルタを 吸取り、かつ減圧下で２分間乾燥させた後に貯蔵した。

（ｆ）結果 プローブ１をハイブリッド化試験に用いた場合、２回交換した６ｘＳＳＣと２回 交換した３ｘＳＳＣとよりなる洗浄を全て４６℃にて１０分間行なった際に０． ６２５１）（ｌの標的ＤＮＡを肉眼検出することができた。同様な洗浄条件下に て、より短いポリヌクレオチド（プローブ２および３）よりなるプローブにつき 同様な結果が得られた。これらプロー１はいずれも比較ＤＮＡにバイブリド化し なかった。さらに、３７％のＧＣ含有量を有するプローブ３は、より高いＧＣ含 有量を有するプロー７１および２と対比して、無視しうるバックグランドを生じ た。

プローブ３をハイブリッド化試験に用いると共にフィルタを高厳密条件（すなわ ち実施例３に示したような全体的洗浄方式）で洗浄した際、比色検出技術を用い てｉｏｐｇの標的ＤＮＡを肉眼検出することができた。

単一の塩基不整合を有するプローブ４を同じ条件下で試験した際、プローブＤＮ Ａは全く検出することができなかった。

したがって、この技術は単一塩基対の変化を検出しうるほど充分敏感である。

実施例　４ 料における特定ヌクレオチド配列の存在を検出することもできる。事実、この実 施例に示すように、本発明の標識されたプローブとサウザン・プロツチング技術 ［Ｅ、Ｍ、ザウザン、［ゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ断片にあける特定 配列の検出」、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第９８巻、第５０３〜 １７頁（１９７５）　］との併用は、ゲノムＤＮＡの試料にあける単一コピー遺 伝子（すなわち生物のゲノムに１回のみ生ずるヌクレオチド配列）の検出を可能 にする。

３種のプローブを実施例１に記載したように合成すると共に標識した。これらプ ローブは次の配列を有した：１、　　　５’　　ｃＡＣＣＡＣにＣＴ　にＣＴ　 ＣＴＣＣＴＣＧＧＣＡＣＡ５、　　　５’　　ＣＴＣＧ？’Ａ　　ＴＡＴ　　Ｃ ＡＴ　ＣＴＧ　　ＣＣＴ　　ＴｒＴ　ＴＴＣ６、５１ＣＴ：Ｇ　　ＣＴＡ　ＴＡ Ｔ　　ＣＡＣＣＴＧ　　ＣにＴ　Ｔ！Ｔ　　ＴτＣプローブ１および５はヒトｔ ＰＡ遺伝子に対し完全に整合したアンチセンスのプローブであり、プローブ６は 故意に導入した不整合で必る下線位置の他はプローブ５と同一である。

この実施例のプローブ１は実施例１のプローブ１と同一である。プローブ５およ び６はｔＰＡ遺伝子の異なる領域に相補的である。

（ａ）ヒトゲノムＤＮＡの作成 ヒトゲノムＤＮＡを、ニューシャーシー州、ヒユーマン・ジエネティックス・ミ ュータント・セル・レボジトリ−から得られたヒト細胞ラインＧＭ１４１６．４ ８．４Ｘの細胞からＲ，ケイトの方法、「２種のラットインシュリン遺伝子のメ チル化パターンの比較Ｊ、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５ ８巻、第６６４５〜５２頁（１９８３）によって分離した。

このＤＮＡの１部を３種の異なる制限酵素で切断して、異なる長さの断片を作成 した。制限酵素は、標的配列内の種々の位置でＤＮＡを切断しないように選択し た。

プローブ１を用いる分析の場合、２０／ｉの上記のように作成出し、これをλフ ァージから分離された０、６７５のＤＮＡに添加した。制限酵素で処理した後、 ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。次いで、これら断片を１，０％アガロースゲ ルで分離し、その際λＤＮＡを制限酵素の性能に関する比較として用いた。同じ 細胞ラインからのヒトゲノムＤＮＡをも上記と同様に酵素ＥｃｏＥＩＩよびＨｉ 　ｎｄ３によって切断した。

８ｇ１２、ＥｃｏＲｌおよびＨｉ　ｎｄ３で切断されたＤＮＡにおけるプローブ １の標的配列を有する制限断片の寸法は、それぞれ５８０３．１５７０および３ ３９０の塩基対であった。

プローブ５および６を用いる分析の場合は、ヒトゲノムＤＮＡを上記と同様にＢ ｇｌ　２、ＰＶｕ２＃よびＢｇＩ　１で切断した。プローブ５および６に関する 標的配列を含んだ制限断片の寸法は、１．０％アガロースゲルで分析した場合、 それぞれ５１７６．３８４３および１５１０＠基対であった。

ヒトゲノムＤＮＡの制限断片をニトロセルロース濾紙またはナイロン膜にＥ、Ｍ 、サウザンの方法（１９７５）により移動ざぜた。

ＤＮＡ含浸されたナイロン膜を実施例３の部（ｂ）〜（ｄ）に記載１ノだように 処理したが、ただし部（ｂ）の最初の２回の洗浄のみを用いると共に発色（部ｄ ）を９０分間だけ進行さＤＮＡ含浸されたニトロセルロースフィルタを１ｏｏ４ の新たに変性させた鮭精子ＤＮＡと１０ｍ１のプラークスクリーン緩衝剤（２Ｊ のポリビニルピロリドン、２ｇのフィコール−４００，２ｇの牛血清アルブミン 、５８ｇの塩化ナトリウム、１９のピロ燐酸ナトリウム、１０（ｌのドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）および９５０Ｗｒｉの蒸溜水）とを含有する混合物に５ ０℃にて３０分間浸漬した。５ｄの緩衝液における４０ｎｇのいずれかのプロー ブを用いてハイブリッド化を５０℃にて１晩行なった。

バイブリド化したフィルタを高厳密条件下で次のように洗浄した： （ａ）各フィルタを１００ｍ１のプラークスクリーン緩衝液にて別々に５０℃で １５分間洗浄した。

（ｂ）フィルタを合し、かつ３ＸＳＳＣにおける０、１％ＳＤＳにて５０℃で１ ５分間にわたり第２回の洗浄を行なった。

（Ｃ）次いでフィルタを、１．０％ＳＤＳと３．２Ｍトリメチルアンモニウムク ロライドとの混合物を２回交換して６０℃で２０分間洗浄した。

（ｄ＞最後に０．１％ＳＤＳおよび３ＸＳＳＣにより６０℃にて１５分間洗浄し た。

実施例３の部（Ｃ）および（ｄ）に記載したようにフィルタのブロッキングと可 視化とを行ない、ただし発色を２時間後に停止させた。

５は、その各標的を検出した。標的ＤＮＡバンドに対応する個々のバンドが、Ｄ ＮＡ含浸したフィルタ上に明確に見えた。

プローブ１は、それぞれＢｇＩ　２、ＥＣ０ＲＩおよびＨｉ　ｎｄ３で切断され たＤＮＡＧＣ”Ｕ３８０３．１５７０および３３９０塩基対の制限断片を検出し た。プローブ５は、それぞれＢｇｌ　２、ＰＶＬ、１２およびＢｑ　Ｉ　１切断 されたＤＮＡにて５１７６．３８４３および１５７０塩基対の制限断片を検出し た。これに対し、１つの位置にて標的ＤＮＡに対し不整合であったプローブ６は 、いずれのバンドにもバイブリド化しなかった。

これらの結果は、本発明の標識プローブが僅か１個のヌクレオチドにおいてのみ 相違する各標的を識別しうろことを示している。ざらに、長さ僅か２４個のヌク レオドでありかつ僅か３７％のグアニンおよびヒトシンを含有するプローブ５が 効果的であったことも重要である。

実施例　５ 抗原抗体の複合体の検出 本発明の他の実施例において、ビオチニル化されたペプチド標識を、検出すべき 蛋白に対し特異性の抗体に付着させた。

或いは、この標識を抗原に付着させ、かつこれに特異性の抗体を検出することも できる。ざらに他の実施例においては、１個の標識された抗体を用いて、第２の 抗体の存在を検出することもできる。ざらに他の具体例においては、標識をリセ プタ（このリセプタは、たとえばホルモンのための細胞表面リセプタのような抗 原もしくは抗体のいずれでもない）に特異的に結合する蛋白もしくはポリペプチ ドに付着させて、この種のリセプタの存在を検出することもできる。次の説明を 簡単にするため、「特異性結合試薬」という用語は、標識が付着する成分を説明 するために使用され、この特異性結合試薬は存在を決定しようとする物質に特異 的に結合する任意の蛋白物質とすることができ、この物質は特異性結合試薬の標 的として規定される。

好ましくは標識は複数の架橋用成分を有するので、複数の信号用成分を標識と抗 体との間の単一の付着箇所によって各抗体分子に付着させることができるａ［ａ ：任意の信号用成分を用いることができる。有用な信号用成分の例は酵素、蛍光 性化合物、放射性同位元素およびクマリンを包含する］。

これに対し、抗体標識の現存する殆んどの方法は、各抗体分子に対する複数の信 号用成分の付着を必要とし、特異性が変化するという危険性を伴い、或いは匹敵 する信号強度を得るための第２抗体を用いる「サンドイッチ」　（たとえば米国 特許第４．３７６、１１０号）を必要とする。

抗体分子は遊離アミン基（リジンのε−アミノ基およびＮ−末端アミノ基）とシ スティン残基との両者を有するので、標識を抗体に付着させる技術は好ましくは 本発明の他の具体例とは相違する。現在好適な具体例においては、ペプチドを先 ず最初に反応性ε−アミノ、α−アミノおよびδ−アミノ基（存在する場合）に てビオチニル化する。アミノおよびスルフヒドリル反応性のへテロ三官能性試薬 、好ましくはスクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドエチルコシクロヘキサン−１ −カルボキシレート（ｒｓＭｃｃＪ　”）をスルフヒドリルと、好ましくはペプ チドのシスティン残基にて反応させることにより結合基を形成させる。アミノお よびスルフヒドリル反応性のへテロ三官能性試薬が反応するシスティンは、ペプ チドにおけるそのアミンもしくはカルボキシ末端を含む任意の箇所で生じうる。

他のアミノおよびスルフヒドリル反応性のへテロ三官能性試薬、たとえばメタマ レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミジル ［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−ブロム アセチル］および一スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネートも 、この具体例の範囲内である。次いで、誘導化されたペプチドと特異性結合試薬 との混合は、アミンおよびスルフヒドリル反応性へテロ三官能性試薬のアミン反 応性成分と特異性結合試薬の遊離アミン基との反応により特異性結合試薬に対す る誘導化標識の共有付着をもたらす。

代案として、少なくとも１個のシスティン残基を含むペプチド標識を、同じく少 なくとも１個のシスティン残基を含む特異性結合試薬に対し結合基の使用なしに 付着させることもできる。何故なら、混合に際しシスティン残基が互いに反応し て、それらの間にジスルフィド結合を形成するからである。

この反応は、ＳＭＣＣとシスティン残基との間の反応と対比して、比較的遅い速 度を有する。この反応は、４℃にて緩和に揺動させながら１晩行なわれる。

（ａ）ペプチド標識のビオチニル化 実施例２（ａ）の５ｍｇのペプチド標識を、ｐＨ８，２の０．２Ｍ　　ＮａＨＣ Ｏ３の５００成に溶解させた。この溶液に、アセトニトリル２００成にあける１ ０ｍｇのビオチン−Ｎ−ヒドロスクシンイミドを添加してモル過剰のビオチンを 得た。

１００ＪＩＩ２の水を、濁りを除去するために添加した。反応を空温にて４時間 進行させた。次いで、２０ｍｇのジチオスレイトールを添加して還元条件を与え 、反応を１６６時間進させた。得られた溶液を燐酸塩緩衝塩水（ｒＰＢｓＪ　） （０，１３７ＭのＮａＣ１、２，７ｍＨのＫＣｊ、　７．８ｍＨのＮａ２ＨＰＯ ４・７Ｈ２０＝Ｂよび１．１７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）にて５ｍｆ！の（３２５カ ラムで脱塩した。ビオチニル化されたペプチドを含有するフラクションを集めた 。Ｈ化されたペプチドを、さらに０１８カラムを用いるＨＰＬＣにより精製した 。誘導化されたペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸にあける０〜１００％の アセトニトリルの濃度勾配によりＣ１８カラムから２５分間かけて溶出させた。

誘導化ペプチドを含有するフラクションを集め、かつ凍結乾燥させた。

７．２のＰＢＳ３００μｅに再懸濁した。アセトニトリル５０／Ｊにおける２ｍ ｇのＳＭＣＣをこの溶液に添加した。反応を１時間進行させた。次いで反応混合 物を、この実施例の部（ａ＞に記載したようにＨＰＬＣで精製した。ＳＭＣＣ結 合基（「ペプチド」）に結合した誘導化ペプチドを集め、かつ２７１０人におけ る吸光度の測定によって定量した。

リボコルチン−１に対するモノクローナル抗体１ｍＱを、ｐＨ７，２のＰＢＳ３ ００ＩＪｉ中にて０．３頗もしくは０．４５μ９のペプチドと合した。反応を４ ℃にて緩和に揺動しながら１６６時間進させた。この時間の後、反応混合物を１ ｘＰ８Ｓ（これには０．２％のナトリウムアジドが添加されている）に対し４℃ にて緩衝液を２回交換しながら透析した。透析の後、反応混合物の容積をＰＢＳ により１ｍｌまで増加させ、混合物を冷温貯蔵した。

（Ｃ）結果 精製されたりポコルチン−１を電気泳動用緩衝液（ｐＨ６，８の５０ｍ）ｌ　ト リスＨＣｊ、１２．５％のグリセリン、２％のＳＤＳおよび２％のメルカプトエ タノール）と混合し、６５℃にて１０分間加熱し、ざらにＳＤＳ　　ＰＡＧＥに より分析した［レムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６０〜８５頁（１９７０） 　］。

個々のレーンは１、ｏ、ｉ、ｏ、　ｏｉおよび０．００１μ９のリボコルチン− １を含有した。電気泳動の後、蛋白をトウビン等の方法［プロシーディング・ナ ショナル・アカデミ−・サイエンス・ＬＪＳＡ、第７６巻、第４３５０〜５４頁 （１９７９）コによりニトロセルロースに移した。

これらニトロセルロースフィルタをｐＨ７，５のｉｏｍＨｉ’リス１−Ｉ　ＣＮ と１５０１ＴＩＨのＮａＣｔ７との混合物（「トリス緩衝液」）で１０分間濡ら した。これらフィルタにおける非特異性結合部位を、トリス緩衝液にあける３％ 牛血清アルブミン（ｒＢＳＡＪ　）の溶液でフィルタを空温にて３０分間処理す ることによりブロックした。これらフィルタをトリス緩衝液で濯ぎ、次いで個々 にゆっくり撹拌しながら実施例の部（ａ）および（ｂ）で標識された１０１Ｊ！ ｊの抗体を含有するトリス緩衝剤の溶液１０ｄ中で１時間培養した。

抗体処理されたフィルタを約２００ｄのトリス緩衝液で激しく洗浄し、その際１ 回の交換当り約１０分間かけて緩衝液を３回交換した。次いで、これらフィルタ を１．Ｏμ９／ｄのストレプトアビジンーアルカリホスフ７ターゼ結合物（実施 例３（ｅ））を含有する１０ｒｎｌのトリス緩衝液にて１０分間にわたり培養し た。次いで、これらフィルタを１回の交換につき１０分間かけて１５０７！のト リス緩衝液を２回交換しながら洗浄した。

発色のため、これらフィルタを０．３３ｍＣ１／ｒｒｄ！のニトロブルーテトラ ゾリウム（ｒＮＢＴＪ　）と０．１６５ｍ（１／ｄの５−７０ムークロルー３− インドリルホスフェート（ｒＢｃＩＰＪ　）とを含有Ｔル１００ｍＭ　（７）ト １，１スＨＣｆｆｉと０．４５ＭのＮａＣｇと５０ｍｇのＭｇＣｆ１２とのｐ） −１９，５の混合物にて暗所中で２〜３時間培養した。フィルタを水で洗浄する ことにより発色を停止させた。０．３０ｉおよび０．４５℃１ｇの標識ペプチド で処理したフィルタは、１０ｎｇ程度に少ないリボコルチン−１を含有する反応 生成物を各レーンに示した。

実施例　６ 同位元素標識されないヌクレオチドのハイブリッド化分析にあける化学ルミネセ ンス基質の使用 本発明のざらに他の具体例において、化学ルミネセンス物質をもたらすアルカリ ホスファターゼ用の基質を、実施例３および５のニトロブルーテトラゾリウム（ ｒＮＢＴＪ　）、ｉｌｊよび５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフェ ート（ｒｅＣＩＰＪ）の代りに使用した。１具体例において、式：を有するジオ キセタンをアルカリホスファターゼ用の基質として使用した。この具体例におい て、下はスピロ結合により４員環に結合したシクロアルキルもしくはポリシクロ アルキル基であり；ＶはＨまたは酵素切断しうる基であり：Ｙは蛍光性発色団で あり；ＸはＨ、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアルキ ル、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキルもしくは酵素切断 しうる基であり：ＺはＨもしくは酵素切断しうる基でおり、ただし■、Ｘ、Ｙも しくはＺの少なくとも１つは酵素が酵素切断しうる基をジオキセタンから切断し て、ざらにジオキセタンの化学結合エネルギーを光として放出するよう分解する 不安定な陽帯電物質を形成する酵素切断しうる基とせねばならない。

より好ましくは、この基質は３−　（２’　−スピロアダマンタン）−４−メト キシ−４−（３’　−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ｒ ＡＭＰＰＤＪ　）である。たとえばＡＭＰＰＤのような高エネルギー化学ルミネ センス基質は、より迅速な分析およびプローブと分析物との間の結合の一層敏感 な検出を可能にする。アルカリホスファターゼによるＡＭＰＰＤの切断は化学ル ミネセンス物質を゛もたらし、これを光学装置によって検出することができる。

たとえばＥＰＯ出願第２５４，０５１号およびＷＰ８８／　００６９５号公報参 照。

この実施例で示した結果はＡＭＰＰＤとＤＮＡプローブとの使用に基づくもので あるが、示した方法は実施例５に記載した特異性結合試薬に関しても用いること ができる。ざらに、酵素と基質との間の反応に際し化学ルミネセンス物質を生成 する酵素と基質化合物との任意の他の組合せも本発明の範囲内であることを了解 すべきである。

（ａ）試料の作成 ヒトゲノムＤＮＡのサウザン・プロットを、実施例４（ａ）の手順により作成し た。２０μ９のＤＮＡを制限エンドヌク１ノアーゼＢＱ　Ｉ　２、ＥＣＯＲＩお よびＨｉ　ｎｄ３により切断して、実施例４（ａ〉におけると同様それぞれ５８ ０３．１５７０および３３９０塩基対の断片を生ぜしめた。切断したＤＮＡを１ ％アガロースゲルにて電気泳動にかけた。変性および中和の後、ＤＮＡ断片を同 様に実施例４（ａ）に記載したようにナイロン膜に移した。

実施例４のプローブ１と同一のＤＮＡプローブを実施例３（ｂ）および（Ｃ）に 記載した方法によりゲノムＤＮＡのバイブリド化させ、ただしこれらプローブは ８　ｎＱ／　ｍＡのバイブリド化溶液の濃度にて使用した。次いで、これらフィ ルタを実施例３（Ｃ）および（ｄ）に記載した方法により洗浄しかオレフィン性 中間体Ａ： を合成することにより、アルカリホスファターゼ基質ＡＭＰＰＤを作成すること ができる。この中間体は、スピロアダマンタンと燐イリドとの反応により合成さ れる。燐イリドは、トリフェニルホスフィンと臭素化ベンゼン誘導体との反応に より生成される： この反応は強塩基（Ｖなわちｎ−ブチルリチウム）の存在下にテトラヒドロフラ ン中で一７８℃にて行なわれ、燐イリド：を生成する。このイ１ノドは、スごロ アダマンタノンとの反応に際しオレフィン性中間体Ａを生成する：シングレット 酸素の存在下にあけるオレフィン性中間体Ａの照射はＡＭＰＰＤをもたらす。

（ｂ）検出 アルカリホスファターゼ用の基質としてのＮＢＴ／’ＢＣＩＰおよびＡＭＰＰＤ の性能を、これら基質または同様に処理されたフィルタで得られた結果を比較す ることにより評価した。１個のフィルタは、実施例３（ｅ）に記載したように処 理した。第２のフィルタは、ｐＨ７，５の０．１Ｍトリス１−Ｉ　Ｃｌと０．４ ５　ＮのＮａＣＪ！どの溶液における３％Ｗ　／’ＶのＢＳＡでブロックした後 に、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ溶液［実施例３（ｅ）に記載 したようにトリス緩衝液における０、　１　ｍ（Ｊｙ’　ｍａｌ　］と共に空温 で１５分間培養した。

培養後、フィルタを０．１ＭトリスＨＣ４と０．４５ＮａＣｊ！との溶液１５０ ｍｆ！で２回交換しなから空温にて１５分間洗浄した。

膜を、ｐＨ９，５の０．１％ＢＳＡと５ｍ）４のＮ　ａ　ＨＣＯａと１ｍＨのＭ ｇＣｊ２とよりなる溶液で洗浄した。洗浄後、膜をｐＨ９，５ノ０．１％ＢＳＡ 、５１１１８のＮａＨＣＯａおよび’ｌ＋ｎＨのＭＱＣｆ２２におけるＬ　６ｍ ）ｌのＡＭＰＰＤの１００ＪＩｉで飽和した。

この膜をプラスチック袋に密封すると共にカメラのルミノメータに入れて、発光 をポラロイドインスタントフィルム（Ａ　Ｓ　Ａ　２０．０００）に露光させた 。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質で処理された膜は検出可能な信号を３０分間で発生した のに対し、ＡＭＰＰＤは検出可能な信号を２分間以内に発生させた。ざらに、化 学ルミネセンス物質は慣用のＮＢＴ／’ＢＣＩＰ技術によるよりも一層敏感な分 析を可能にする。化学ルミネセンスに関する他の検出器を、この実施例の写真フ ィルムの代りに用いうろことを了解すべきである。この種の検出器は、ビデオ装 置および同相の光子検出器を包含する。

実施例　７ 医学診断を含む分子生物学の各種の分野で、ポリメラーゼ連鎖反応技術（ｒＰｃ ＲＪ　）が増々使用されつつある。この方法は、細胞もしくは組織から分離され た極めて少量のＤＮＡから標的配列を検出する。この実施例は、ＰＣＲを用いる 標的配列の迅速かつ敏感な検出の方法を開示する。さらに、この具体例の範囲内 にはＰＣＲのための血液からのＤＮＡ試料の迅速な作成方法も存在する。

要するにＰＣＲは、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプ ライマーにより相補的ポリヌクレオチドストランド雛型にプライマーが結合する 部位から開始してヌクレオチドモノマーからＤＮＡ延長生成物を発生させること により、標的ヌクレオチド配列を増幅させる方法である。

これらプライマーは、増幅すべき配列を一括するように選択される。雛型ストラ ンドから断片を発生させた後、反応媒体の温度の上昇は雛型ストランドと熱安定 性ＤＮＡポリメラーゼと延長断片との解離をＤＮＡポリメラーゼ酵素の失活なし に生ぜしめる。好適具体例において、熱安定性ＤＮＡボリルラーゼはテルムス・ アクワチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑａｔｉｃｕｓ）から得られる。次いで、各 延長生成物は他の合成操作の雛型として作用し、求める量の配列を対数的に増大 させる。一般的に、ＥＰＯ出願第２５８，０１７号参照。

本発明によるプローブ標識および試料作成方法をＰＣＲと組合せて、標的配列を 検出するための有力な技術を与えることができる。この実施例においては、これ ら具体例をヒトゲノムＤＮＡ１．：；！′３けるｔＰＡＪ伝子の検出に用いる。

のトリスＨＣＮとの冷溶液２００１１１と混合した。この溶液を、実験室の渦流 ミキサーを用いて低速度で混合した。次いで、細胞を約５．ＯＯＯｒｐｍにて１ 分間の遠心分離により遠心分離した。

上澄液を捨てた後、細胞を上記緩衝液に再懸濁すると共に混合および遠心分離工 程を反復することにより洗浄した。

次いで、ペレット化した細胞を１ｘＰＢｓにおけるＮＰ４０（他の任意の非イオ ン型洗剤もＮＰ４０の代りに用いることができる）の１００１１１で４℃にて処 理した。この混合物を簡単に回動させ、５．００Ｏｒｐｍにて１分間の遠心分離 により核を遠心分離した。ピペットにより上澄液をゆっくり除去した。ＤＨ７， ５の０．１５　ＭのＮａＣｊと５０１１１ＨのトリスＨＣＮとの冷溶液１ｏｏｎ を添加することにより、核を洗浄した。この液体を再びピペットによりゆっくり 除去した。

次いで、１０μｅの１％デオキシコリン酸ナトリウム（デオキシコリン酸ナトリ ウムの代りに任意の陽帯電した洗剤を使用することもできるａ）を核ペレットに 添加した［ａ：１％濃度のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ドデシル＠ 酸ナトリウムとしても知られる）を核溶解のためのデオキシコリン酸ナトリウム の代りに使用することができる。この場合は、Ｐ　ＣＲでの増幅前にＣ１８シリ カ固体支持体くワットマン）を用いて、これを除去せねばならない。この洗剤を 用いて行った同時実験は、デオキシコリン酸ナトリウムによる結果と匹敵する結 果を与えた］。この混合物を回動させ、かつ前記と同様に遠心分離し、溶液を空 温にて１５分間静置した。次いで、この溶液を５分間煮沸してＤＮＡを溶解させ 、再び回動すると共に遠心分離した。１０／Ｊの２回蒸溜した水をＤＮＡ溶液に 添加し、１０μｅの得られた溶液を残余の実施例に用いた。

得られたＤＮＡ溶液を１０ｍＭのトリスＨＣｊと１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジ アミンテトラ酢Ｍ）とのＤＨｒ、ｓノミ合物ニーｃ５０（Ｉｎ２まで希釈し、前 記と同様に回動させると共に遠心分離した。５０μＣのこの溶液を、ＰＣＲ用の ヒトＤＮＡ源として使用した。ざらに、この実施例は少量のヒト血液を試料とし て用いたが、この技術は他の細胞懸濁物、並びにより多量もしくはより少量にも 適用しうろことが明らかである。たとえば、この技術を使用して、培養で増殖さ せたｍ胞からの核酸を試験するため或いは滑液の試料にも使用することができる 。

ＰＣＲの試料を作成する際にこのＤＮＡの分離方法を用いるのが好適で市るが、 他の目的に対するＤＮＡの製造方法を用いることもこの具体例の範囲内である。

（ｂ）ヒトゲノムＤＮＡにおける標的配列の増大実施例１（ａ）に記載した方法 を用いて２種のプライマーを合成した。これらプライマーは次の配列を有するニ ブライマーＡ：５’　ＡＡＡ　　ＧＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＧＡＴＴＡ　　ＣＣＡ 　　ＧＣ３’ プライマーＢ：５’　ＴＧＧ　　ＣＣＴ　　ＣＣＴ　　ＡＡＡＧＴＧ　　ＣＴＧ 　　ＧＧ　　３’ プライマーＡはｔｐａをコードする＋ストランドに相補的である一方、プライマ ーＢは対応の一ストランドに相補的でおる。これらプライマーの使用は、３５０ 塩基対のＤＮＡ断片を増大させる。

ＰＣＲ反応を次の反応混合物で行なった：各ＰＣＲサイクルは次の工程で構成し た：１．９３℃にて２分間の変性 ２．４０℃にて２分間のプライマー融合３．６０℃にて４分間の連鎖延長。

これら３種の工程を、パーキン・エルマー・セタス型ターモサイクラーにて全部 で４０サイクルにわたり行なった。

ＰＣＲ反応混合物にあけるヒトゲノムＤＮＡの初期質量は、４回の別々の実験の それぞれにつき１ｈｏｎｇ　、　１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．１ｎｇとした。

（ｃ）机辺 上記工程の完了後、１０ｄの反応混合物を０．５ＭのＮａＯＨと１．５ＭのＮａ Ｃｊとの混合物１５μｅにおいて６０℃で変性させた。１時間後、混合物をｐｉ −１７，５の０．５Ｍトリスおよび１．５ＭのＮａＣｊの２００成で中和した。

これら試料を、スロット・プロツチイング装置［マニホールド２スロツト・プロ ッター、スライヒヤー・アンド・シューレ］を用いてニトロセルロースフィルタ 上にプロットした。

フィルターを、１００４／’ｍの音波処理された鮭精子ＤＮＡと実施例４にあけ るプローブ６の配列を持った８ｎｏのプローブとを含有する１０ｒｒ１１のＰＢ Ｓにて５５℃で１晩バイブリド化した。濾紙を次の溶液で洗浄した： １０分間にわたり５５℃にて５ｘＳＳＣｆｔ５．、ｉ：び０．１％５ＤＳ（２回 交換）、 １０ＲＦニワｔＣＩ’）５０℃にて３ＸＳＳＣＪ’；Ｊ：び０．１％ＳＯ８，１ ０分子Ｊニワ７：す５０℃にて１　ｘｓｓｃ＃よび０．１％５ＤＳ（２回交換） 。

註 ａ　：　ＰＣＲ反応緩衝液ハ５００ｎ＋Ｍ　（７）　Ｋ　Ｇ　１２　ト１００＋ ｎＨ（７）　ト’）　スＨＣＲと１５ｍ）ｌのＭｇＣ！！２と０．１％Ｗ　／　 Ｖ　Ｆ）ゼラチントチ構成する（１）Ｈ８，３）。

ｂ：この実施例の部（ａ）にしたがって作成したじトＤＮＡおよび従来技術によ り作成したヒトＤＮＡを用いて対の実験を行なった。たとえばＰ、Ｅ、デブリン 等、「独特かつ縮退したオリゴヌクレオチドプローブを用いるゲノムＤＮＡのサ ウザン分析、縮退の減少方法Ｊ　、ＤＮＡ、第１巻、第４９９〜５０７頁（，１ ９８８）参照。ヒトＤＮＡ源がこの実施例の部（ａ）で処理されたヒト血液であ る場合、５０ｔ１ｆｆの最終溶液をＰＣＲ反応混合物につき使用した。この反応 混合物における２回蒸溜水の容積を４０成だけ相応に減少させて１３．５ｄとし た。

Ｃ：それぞれ２００μＭの濃度にあける一般にヒト細胞中に存在する４種のデオ キシヌクレオチド（すなわちｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）の 混合物を使用した。

ｄ：１μＭの濃度 ｅ：２．５単位に対応する。Ｔａｑポリメラ〜ゼ酵素はパーキン・エルマー・セ タスから得た。本分中に示した容積を、供給された材料から用いた。

ｆ　：　６ＸＳＳＣに関する処方については実施例３（Ｃ）に示す。

フィルタを洗浄した後、フィルタ上の非特異性結合部位を実施例３（ｄ）の手順 によりブロックした。結合したプローブを実施例３（ｅ）の方法により検出した 。

ざらに、ＰＣＲ反応の完結後、４種の実験のそれぞれから得られた１０ｄを実施 例４の方法によりアガロースゲル電気泳動にかけ、ただし２％アガロースゲルを 使用した。変性および中和の後、ＤＮＡを実施例４に記載したようにニトロセル ロースフィルタまたはジーン・スクリーン（登録商標）フィルタに移した。これ らフィルタを洗浄し、ブロックし、結合したプローブを実施例４に記載したよう に検出し、その際その実施例のプローブ６の配列を有するプロー７を用いた。

（ｄ）結果 ＰＣＲとプローブ標識との組合せは、ＰＣＲ反応の生成物に関する電気泳動およ びサウザン・プロットの後に、ｉｏｏｐｇ程度に少ない出発ゲノムＤＮＡにて標 的配列の検出を可能にした。これは、ＰＣＲ反応混合物における約３０分子のＤ ＮＡに相当する。検出されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動で分離した 後にＤＮＡ断片をサウザン・ブロッチングすることによりＰＣＲにて増大された ３５０塩基対の断片であることが確認された。３５０塩基対の増大断片は、ヒト ＤＮＡをこの実施例の部（ａ）にしたがって作成した場合にも検出された。この 場合、遺伝子は０．６２５成のヒト血液の均等量で検出された。

実施例　８ アンチセンス治療におけるプローブ標識の使用アンチセンス治療は、細胞内に存 在する標的ポリヌクレオチドに結合する外来ポリヌクレオチドの投与を意味する 。

「アンチセンス」という用語は、この種のオリゴヌクレオチドがその細胞内標的 に相補的でおることを意味する。有用なオリゴヌクレオチド配列は、増殖および 複製の過程を干渉し或いは変化させる。この方法は、新規な抗ウイルス性および 新形成防止性薬剤の発生を可能にすると思われる。一般的な概論については「ア ンチセンス分子生物学およびＳ−オリゴス」、シンセシス、第１巻、第１〜５頁 （シンセセル、１９８８年１０月）参照。

有用なアンチセンス治療剤の開発における主たる障害は、その標的の細胞内位置 であった（同上）。ざらにレメトワ等、「小胞性口内炎ウィルスＮ蛋白ｍＲＮＡ 開始部位に対し相補的なポリ（Ｌ−リジン）−結合オリゴデオキシリボヌクレオ チド配列の特異的抗ウィルス活性」、プロシーディング・ナショナル・アカデミ −・サイエンス・ＵＳＡ、第８４巻、第６４８〜５２頁、第６４８頁（１９８７ ）参照。したがって、この種の薬剤の細胞内供給方法を開発することが望ましい 。

本発明の１具体例においては、アンチセンス治療剤（「アンチセンス剤」）を細 胞により摂取されるペプチド（［ペプチジルアンチセンス剤」）に結合させる。

有用なペプチドの例はペプチドホルモン、抗原もしくは抗体およびペプチド毒素 を包含する。アンチセンス剤に露出すべき細胞もしくは組織群により選択的に摂 取されるペプチドを選択することにより、アンチセンス剤の特異的供給を行なう ことができる。

アンチセンス剤は、実施例１および２の方法にしたがい、細胞により摂取される ことが知られたペプチドに共有結合される。要するに、アンチセンス剤の５’　 −ＯＨ基はアミノアルキル化により活性化される。ペプチドは、アミンおよびス ルフヒドリル反応性のへテロニ官能性試薬により活性化アンチセンス剤に共有付 着する。後者は、ペプチド中に存在するシスティン残基に結合する。

ペプチドに結合したアンチセンス剤に細胞を露出すると、ペプチジルアンチセン ス剤がエンドサイドースされ、このアンチセンス剤が細胞内の標的ポリヌクレオ チドに結合して、その治療効果を発揮する。

国際調査報告 ””−””−””’−””−ＰＣＴ／υ５８９１０２３６３国際調査報告

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. １．標的ポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドと、スルフヒドリル 基を含む標識と、結合基とからなり、この結合基はアミノおよびスルフヒドリル 反応性のヘテロ二官能性試薬と標識のスルフヒドリル基との反応により形成され 、この反応はスルフヒドリル基の酸化をもたらすことを特徴とする標識されたプ ローブ。
2. ２．標識がシステイン残基を含むポリペプチドからなる請求の範囲第１項記載の 標識されたプローブ。
3. ３．少なくとも１個の信号用成分が標識に付着された請求の範囲第１項記載の標 識されたプローブ。
4. ４．少なくとも１個の信号用成分が、少なくとも１個の架橋用成分により標識に 付着された請求の範囲第３項記載の標識されたプローブ。
5. ５．架橋用成分がビオチン、イミノビオチン、アビジン、ストレプトアビジンお よび標識に対する抗体よりなる群から選択される請求の範囲第４項記載の標識さ れたプローブ。
6. ６．信号用成分が放射性同位元素、酵素クマリンおよび蛍光性化合物よりなる群 から選択される請求の範囲第３項、第４項または第５項記載の標識されたプロー ブ。
7. ７．結合基がプローブの５′末端にてアミノ基に結合された請求の範囲第１項、 第２項、第３項または第４項記載の標識されたプローブ。
8. ８．結合基が塩基に付着された請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項 記載の標識されたプローブ。
9. ９．（ａ）標的配列に対し相補的な塩基の配列を含むプローブ分子を選択し、 （ｂ）このプローブ分子の５′−ＯＨ基をアミノ化し、（ｃ）結合基をアミノ化 されたプローブ分子に対しアミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性 試薬により付着させ、 （ｄ）標識をプローブ分子の結合基に結合ささせることを特徴とするプローブ分 子の標識方法。
10. １０．アミノ化の工程が、 （ａ）プローブ分子をアゾリードと反応させ、（ｂ）上記工程（ａ）のプローブ 分子をジアミンで誘導化する 工程をさらに含む請求の範囲第９項記載のプローブ分子の標識方法。
11. １１．アゾリードがカルボニル−ジイミダゾールである請求の範囲第１０項記載 のプローブ分子の標識方法。
12. １２．ジアミンがヘキサメチレンジアミンである請求の範囲第１０項記載のプロ ーブ分子の標識方法。
13. １３．アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬を４−［Ｎ−マ レイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、メタ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミジル［４−イオ ドアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−ブロムアセチル］ およびＮ−スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネートよりなる群 から選択する請求の範囲第９項記載のプローブ分子の標識方法。
14. １４．結合の工程が、標識上のスルフヒドリル基を結合基で酸化する工程をさら に含む請求の範囲第９項記載のプローブ分子の標識方法。
15. １５．結合の工程が、少なくとも１個の信号用成分を標識に付着させる工程をさ らに含む請求の範囲第９項記載のプローブ分子の標識方法。
16. １６．（ａ）標的配列に対し相補的な塩基の配列を含むプローブ分子を選択し、 （ｂ）反応性アミノ基を有する結合基をプローブ分子の少なくとも１個の塩基に 共有結合させ、（ｃ）アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬 を結合基のアミノ基に付着させて第２結合基を形成し、 （ｄ）この第２結合基に標識をスルフヒドリル基の酸化によって結合させる ことを特徴とするプローブ分子の標識方法。
17. １７．アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬を４−［Ｎ−マ レイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、メタ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミジル［４−イオ ドアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−ブロムアセチル］ およびＮ−スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネートよりなる群 から選択する請求の範囲第１６項記載のプローブ分子の標識方法。
18. １８．結合の工程が、少なくとも１個の信号用成分を標識に付着させる工程をさ らに含む請求の範囲第１６項記載のプローブ分子の標識方法。
19. １９．付着の工程が、少なくとも１個の信号用成分を少なくとも１個の架橋用成 分により標識に付着させる工程を含む請求の範囲第１８項記載のプローブ分子の 標識方法。
20. ２０．（ａ）請求の範囲第９、１０、１１、１２、１３、１４または１５項記載 の方法により標識されたプローブをゲノムＤＮＡの試料に添加し、 （ｂ）標識されたプローブを標的分子にハイブリド化させ、 （ｃ）標的分子に結合されてない標識プローブ分子を除去し、 （ｄ）標識プローブ分子の少なくとも１個の信号用成分から信号を検出する ことを特徴とするゲノムＤＮＡにおける標識の検出方法。
21. ２１．（ａ）請求の範囲第１６、１７、１８または１９項記載の方法により標識 されたプローブをゲノムＤＮＡの試料に添加し、 （ｂ）標識されたプローブを標的分子にハイブリド化させ、 （ｃ）標的分子に結合されてない標識プローブ分子を除去し、 （ｄ）標識プローブ分子の少なくとも１個の信号用成分から信号を検出する ことを特徴とするゲノムＤＮＡにおける標識の検出方法。
22. ２２．分析物に特異的に結合するポリペプチドと、このポリペプチドに付着した スルフヒドリル基を含む標識とからなり、アミノおよびスルフヒドリル反応性の ヘテロ二官能性試薬と標識および特異性結合剤との反応によりスルフヒドリル基 の酸化をもたらすことを特徴とする標識された特異性結合試薬。
23. ２３．標識が、システイン残基を含むポリペプチドからなる請求の範囲第２２項 記載の標識された特異性結合試薬。
24. ２４．アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬をスクシニミジ ル４−〔Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、メタ −マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミ ジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−ブ ロムアセチル］および−スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネー トよりなる群から選択する請求の範囲第２２項記載の標識された特異性結合試薬 。
25. ２５．少なくとも１個の信号用成分が標識に付着された請求の範囲第２２項記載 の標識された特異性結合試薬。
26. ２６．信号用成分が酵素、放射性同位元素、クマリンおよび蛍光性化合物よりな る群から選択される請求の範囲第２５項記載の標識された特異性結合試薬。
27. ２７．少なくとも１個の信号用成分が少なくとも１個の架橋用成分により標識に 付着された請求の範囲第２５項記載の標識された特異性結合試薬。
28. ２８．架橋用成分がビオチン、イミノビオチン、アビジンおよびストレプトアビ ジンよりなる群から選択される請求の範囲第２７項記載の標識された特異性結合 試薬。
29. ２９．（ａ）分析物に対し特異性であるポリペプチドからなる特異性結合試薬を 選択し、 （ｂ）少なくとも１個の架橋用成分を、スルフヒドリル基を含む標識における少 なくとも１個のアミノ基に付着させ、 （ｃ）アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬を標識と反応さ せてスルフヒドリル基の酸化をもたらすことにより標識を誘導化させ、（ｄ）こ の標識を特異性結合試薬に結合させることを特徴とする特異性結合試薬の標識方 法。
30. ３０．付着の工程が、標識のアミノ基をビオチンおよびイミノビオチンよりなる 群から選択される架橋用成分と還元条件下で反応させることをさらに含む請求の 範囲第２９項記載の特異性結合試薬の標識方法。
31. ３１．アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬をスクシニミジ ル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、メタ −マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミ ジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−ブ ロムアセチル］および−スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネー トよりなる群から選択する請求の範囲第２９項記載の特異性結合試薬の標識方法 。
32. ３２．結合の工程が、少なくとも１個の信号用成分を標識に付着させる工程をさ らに含む請求の範囲第２９項記載の特異性結合試薬の標識方法。
33. ３３．（ａ）スルフヒドリル基を有する少なくとも１個のアミノ酸残基からなる ペプチド標識を選択し、（ｂ）特異性結合試薬とペプチド標識とを、ペプチド標 識上に存在するシステイン基と特異性結合試薬との間にジスルフィド結合を形成 させる条件下で混合することを特徴とする少なくとも１個のスルフヒドリル基を 有する特異性結合試薬の標識方法。
34. ３４．標的を含有する混合物におけるこの標識の存在を検出するに際し、 （ａ）混合物を標識されたプローブに露出し、この標識プローブは第２標的ポリ ヌクレオチドに対し相補的な第１ポリヌクレオチドとスルフヒドリル基を有する 標識と、アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬と標識との反 応により形成された結合基とからなり、前記反応によりスルフヒドリル基の酸化 をもたらし、前記結合基はプローブの５′末端に付着され、 （ｂ）標的に結合されてない標識プローブを除去し、（ｃ）標的に結合した標識 プローブを、この標識プローブとの反応に際し化学ルミネセンス生成物を生ずる 基質と反応させ、 （ｄ）化学ルミネセンス生成物の存在を検出することを特徴とする標的の存在の 検出方法。
35. ３５．基質が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｔはスピロ結合により４員環に結合されたシクロアルキルもしくはポリ シクロアルキル基であり、ＶはＨもしくは酵素切断しうる基であり、Ｙは蛍光性 発色団であり、ＸはＨ、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリール、ヘテ ロアルキル、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキルもしくは 酵素切断しうる基であり、ＺはＨもしくは酵素切断しうる基あり、ただしＶ、Ｘ 、ＹもしくはＺの少なくとも１つは酵素切断しうる基であって酵素がジオキセタ ンから酵素切断しうる基を切断して不安定な陰帯電物質を形成せねばならなず、 この物質はさらに分解してジオキセタンの化学結合エネルギーを光として放出す る］ のジオキセタンである請求の範囲第３４項記載の標的の存在の検出方法。
36. ３６．ジオキセタンがＡＭＰＰＤである請求の範囲第３５項記載の標的の存在の 検出方法。
37. ３７．アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬をスクシニミジ ル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、メタ −マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミ ジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−ブ ロムアセチル］および−スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネー トよりなる群から選択する請求の範囲第３４項記載の標的を含む混合物における 標的の存在の検出方法。
38. ３８．特異性結合試薬の標的を含有する混合物にて特異性結合試薬の標的の存在 を検出するに際し、（ａ）混合物を請求の範囲第２９、３０、３１または３２項 記載の方法により標識された特異性結合試薬に露出させ、 （ｂ）特異性結合試薬の標的に結合されてない標識された特異性結合試薬を除去 し、 （ｃ）結合している標識された特異性結合試薬を、反応に際し化学ルミネセンス 生成物を生ずる基質と反応させ、（ｄ）化学ルミネセンス生成物を検出すること を特徴とする特異性結合試薬の標的の存在を検出する方法。
39. ３９．基質が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｔはスピロ結合により４員環に結合されたシクロアルキルもしくはポリ シクロアルキル基であり、ＶはＨもしくは酵素切断しうる基であり、Ｙは蛍光性 発色団であり、ＸはＨ、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリール、ヘテ ロアルキル、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロヘテロアルキルもしくは 酵素切断しうる基であり、ＺはＨもしくは酵素切断しうる基であり、ただしＶ、 Ｘ、ＹもしくはＺの少なくとも１つは酵素切断しうる基であって酵素がジオキセ タンから酵素切断しうる基を切断してジオキセタンに結合した陰帯電置換基を形 成せねばならなず、この陰帯電置換基はさらにジオキセタンを分解させてジオキ セタンの基Ｙを含むルミネセンス物質を形成する］ のジオキセタンである請求の範囲第３８項記載の標的の存在を検出する方法。
40. ４０．ジオキセタンがＡＭＰＰＤである請求の範囲第３９項記載の特異性結合試 薬の標的の存在を検出する方法。
41. ４１．（ａ）細胞を試料から分離し、 （ｂ）洗浄されかつ分離された細胞を非イオン型洗剤で処理し、 （ｃ）洗剤処理された細胞から核を分離し、（ｄ）分離された核からＤＮＡを抽 出することを特徴とする細胞の懸濁物からＤＮＡを分離する方法。
42. ４２．非イオン型洗剤がＮＰ４０である請求の範囲第４１項記載の細胞の懸濁物 からＤＮＡを分離する方法。
43. ４３．抽出の工程が、 （ａ）陰帯電した洗剤の１部を分離された核に添加し、（ｂ）分離された核から ＤＮＡを可溶化させる工程をさらに含む請求の範囲第４１項記載の細胞の懸濁物 からＤＮＡを分離する方法。
44. ４４．陰帯電した洗剤をドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムおよびデオキシ コリン酸ナトリウムよりなる群から選択する請求の範囲第４３項記載の細胞の懸 濁物からＤＮＡを分離する方法。
45. ４５．（ａ）核酸の１部を分離し、 （ｂ）標的を含みうる核酸の１部を増大させ、（ｃ）標識プローブにより標的の 存在を検出する工程からなる混合物における標的の存在を決定するに際し、（ｉ ）アミノアルキル化によりプローブの５′−ＯＨ末端を活性化させ、 （ｉｉ）少なくとも１個の信号用成分をスルフヒドリル基と少なくとも１個のア ミノ基とを含む標識に付着させ、（ｉｉｉ）前記プローブおよび標識をアミノお よびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬と反応させることにより標識を プローブに結合させ、前記反応によりスルフヒドリル基の酸化をもたらす ことを特徴とする混合物における標的の存在を決定する方法。
46. ４６．アンチセンス治療剤を細胞により摂取されたポリペプチドに付着させるこ とによりアンチセンス治療剤を細胞に供給するに際し、 （ａ）アンチセンス治療剤の５′−ＯＨ基をアミノ化し、 （ｂ）アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬からなる結合基 をアミノ化されたアンチセンス治療剤に付着させ、 （ｃ）結合基を細胞により摂取されたポリペプチドに結合させる ことを特徴とする細胞に対しアンチセンス治療剤を供給する方法。
47. ４７．アミノ化の工程が、 （ａ）アンチセンス治療剤をアゾリードと反応させ、（ｂ）工程（ａ）のアンチ センス治療剤をジアミンで誘導化させる 工程をさらに含む請求の範囲第４６項記載の細胞に対しアンチセンス治療剤を供 給する方法。
48. ４８．アゾリードがカルボニル−ジイミダゾールである請求の範囲第４７項記載 の細胞に対しアンチセンス治療剤を供給する方法。
49. ４９．ジアミンがヘキサメチレンジアミンである請求の範囲第４８項記載の細胞 に対しアンチセンス治療剤を供給する方法。
50. ５０．アミノおよびスルフヒドリル反応性のヘテロ二官能性試薬をスクシニミジ ル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、メタ −マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシニミ ジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、Ｎ−スクシニミジル［４−ブ ロムアセチル］および−スクシニミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネー トよりなる群から選択する請求の範囲第４６項記載のアンチセンス治療剤を供給 する方法。
51. ５１．細胞により摂取されるポリペプチドをペプチドホルモン、抗体、抗原およ び毒素よりなる群から選択する請求の範囲第４６項記載のアンチセンス治療剤を 供給する方法。