ES2417879T3 - Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B - Google Patents

Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B Download PDF

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Abstract

Un compuesto oligonucleótido antisentido de 20 bases nucleicas de longitud que tiene una secuencia de bases nucleicas como se expone en la SEQ ID NO: 247 y que comprende 5-metilcitidina en las bases nucleicas 2, 3, 5, 9, 12, 15, 17, 19 y 20, en el que cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato, las bases nucleicas 1-5 y 16-20 comprenden una modificació.

Description

Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
Campo de la invención
La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de la apolipoproteína B. 5 Esta invención se refiere a oligonucleótidos que pueden hibridar específicamente con ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína B. Se ha mostrado que dichos compuestos modulan la expresión de la apolipoproteína B.
Antecedentes de la invención
Las lipoproteínas son partículas globulares de tipo micela que consisten en un núcleo no polar de acilgliceroles y ésteres de colesterilo rodeado de un recubrimiento anfifílico de proteína, fosfolípidos y colesterol. Las lipoproteínas
10 se han clasificado en 5 amplias categorías basándose en sus propiedades funcionales y físicas: quilomicrones, que transportan lípidos de la dieta del intestino a los tejidos; lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL); lipoproteínas de densidad intermedia (IDL); lipoproteínas de baja densidad (LDL); todas ellas transportan triacilgliceroles y colesterol desde el hígado a los tejidos; y las lipoproteínas de alta densidad (HDL), que transportan el colesterol endógeno desde los tejidos al hígado.
15 Las partículas de lipoproteínas experimentan un procesamiento metabólico continuo y tienen propiedades y composiciones variables. Las densidades de las lipoproteínas aumentan sin disminuir el diámetro de la partícula debido a que la densidad de los recubrimientos exteriores es menor que la del núcleo interior. Los componentes proteicos de las lipoproteínas se conocen como apolipoproteínas. Al menos 9 apolipoproteínas están distribuidas en cantidades significativas entre las diferentes lipoproteínas humanas.
20 La apolipoproteína B (también conocida como ApoB, apolipoproteína B-100; ApoB-100, apolipoproteína B-48; ApoB48 y antígeno Ag(x)), es una glicoproteína grande que tiene una función indispensable en el ensamblaje y la secreción de lípidos y en el transporte y la captación mediada por receptor, y la entrega de distintas clases de lipoproteínas. La importancia de la apolipoproteína B se extiende a una variedad de funciones, desde la absorción y el procesamiento de los lípidos de la dieta a la regulación de los niveles de lipoproteínas circulantes (Davidson y
25 Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Esta última propiedad está en la base de su importancia en términos de susceptibilidad a la aterosclerosis, que se correlaciona mucho con la concentración ambiente de lipoproteínas que contienen apolipoproteína B (Davidson and Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
En los mamíferos existen dos formas de apolipoproteína B. La ApoB-100 representa la proteína de longitud completa que contiene 4536 restos de aminoácidos, sintetizada exclusivamente en el hígado humano (Davidson y Shelness,
30 Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). Una forma truncada, conocida como apoB-48, es colineal con los 2152 restos de aminoácidos terminales y se sintetiza en el intestino delgado de todos los mamíferos (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
La apoB-100 es el principal componente proteico de LDL y contiene el dominio necesario para la interacción de esta especie de lipoproteína con el receptor de LDL. Además, la apoB-100 contiene un resto de cisteína no emparejado
35 que media la interacción con la apolipoproteína (a) y genera otra lipoproteína distinta aterogénica llamada lipoproteína Lp(a) (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
En los seres humanos, la apoB-48 circula asociada con los quilomicrones y los restos de quilomicrones y estas partículas son eliminadas por un receptor distinto conocido como proteína relacionada con el receptor de LDL (Davidson y Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193). La apoB-48 se puede considerar como una adaptación
40 crucial por la cual el lípido de la dieta es suministrado desde el intestino delgado al hígado, mientras que la apoB100 participa en el transporte y el suministro de colesterol plasmático endógeno (Davidson and Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
La base por la cual el gen estructural común de la apolipoproteína B produce dos isoformas de proteína distintas es un proceso conocido como edición del ARN. Un sitio específico de reacción de edición de citosina en uracilo produce
45 un codón de parada UAA y terminación de la traducción de la apolipoproteína B para producir ApoB-48 (Davidson and Shelness, Annu. Rev. Nutr., 2000, 20, 169-193).
La apolipoproteína B se clonó en 1985 (Law et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1985, 82, 8340-8344) y se cartografió en el cromosoma 2p23-2p24 en 1986 (Deeb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1986, 83, 419-422).
En la patente de EE.UU. 5.786.206 se describen y reivindican métodos y composiciones para determinar el nivel de
50 lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el plasma que incluye secuencias de ADN aisladas que codifican regiones del epítopo de la apolipoproteína B-100 (Smith et al., 1998).
Se encontró que ratones transgénicos que expresan la apolipoproteína B humana y alimentados con una dieta alta en grasa, desarrollaban niveles altos de colesterol en el plasma y presentaban un aumento de 11 veces de las lesiones ateroscleróticas frente a las crías de la misma camada no transgénicas (Kim and Young, J. Lipid Res.,
1998, 39, 703-723; Nishina et al., J. Lipid Res., 1990, 31, 859-869).
Además, los ratones transgénicos que expresan formas truncadas de la apolipoproteína B se han usado para identificar las características estructurales carboxilo terminales de la ApoB-100 que son necesarias para las interacciones con la apolipoproteína(a) para generar la partícula de lipoproteína Lp(a) e investigar características estructurales de la región de unión al receptor de LDL de la ApoB-100 (Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703723; McCormick et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 23616-23622).
Se han generado ratones con el gen de la apolipoproteína B desactivado (que llevan alteraciones tanto en la ApoB100 como la ApoB-48) que están protegidos frente al desarrollo de hipercolesterolemia cuando se alimentan con una dieta alta en grasa (Farese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995, 92, 1774-1778; Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723). La incidencia de la aterosclerosis se ha investigado en ratones que expresan exclusivamente ApoB-100 o ApoB-48 y se encontró que la susceptibilidad a la aterosclerosis dependía de los niveles totales de colesterol. El que los ratones sintetizaran ApoB-100 o ApoB-48 no afectaba a la extensión de la aterosclerosis, indicando que probablemente no hay una diferencia importante en la aterogenicidad intrínseca de la ApoB-100 frente a la ApoB-48 (Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Veniant et al., J. Clin. Invest., 1997, 100, 180-188).
Niveles plasmáticos elevados de lipoproteína Lp(a) que contiene apoB-100, están asociados con un mayor riesgo de aterosclerosis y sus manifestaciones, que pueden incluir la hipercolesterolemia (Seed et al., N. Engl. J. Med., 1990, 322, 1494-1499), infarto de miocardio (Sandkamp et al., Clin. Chem., 1990, 36, 20-23) y trombosis (Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997, 99, E11).
En la concentración plasmática de Lp(a) influye mucho los factores hereditarios y es refractaria a la mayoría de los fármacos y a la manipulación de la dieta (Katan and Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessby et al., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71). La terapia farmacológica de los niveles de Lp(a) elevados ha tenido un éxito solo moderado y la aféresis sigue siendo la modalidad terapéutica más eficaz (Hajjar and Nachman, Annu. Rev. Med., 1996, 47, 423-442).
En la patente de EE.UU. 6.156.315 y la correspondiente publicación PCT WO 99/18986 se describe y reivindica un método para inhibir la unión del LDL a la matriz de los vasos sanguíneos en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que es capaz de unirse a la región amino terminal de la apolipoproteína B, inhibiendo así la unión de la lipoproteína de baja densidad a la matriz de los vasos sanguíneos (Goldberg and Pillarisetti, 2000; Goldberg and Pillarisetti, 1999).
En la patente de EE.UU. 6.096.516 se describen y reivindican vectores que contienen anticuerpos recombinantes murinos que codifican el ADNc que se une a la ApoB-100 humana con el fin de diagnóstico y tratamiento de enfermedades cardiovasculares (Kwak et al., 2000).
En la solicitud de patente europea EP 911344 publicada el 28 de abril, 1999 (y que corresponde a la patente de EE.UU. 6.309.844 se describe y reivindica un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la ApoB-48 y no se une específicamente a la ApoB-100, que es útil para el diagnóstico y la terapia de la hiperlipidemia y la esclerosis arterial (Uchida and Kurano, 1998).
En la publicación PCT WO 01/30354 se describen y reivindican métodos de tratamiento de un paciente con un trastorno cardiovascular, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto a dicho paciente, en el que dicho compuesto actúa durante un periodo de tiempo para reducir las concentraciones plasmáticas de apolipoproteína B o lipoproteínas que contienen apolipoproteína B estimulando una ruta de degradación de la apolipoproteína B (Fisher and Williams, 2001).
En la patente de EE.UU. 5.220.006 se describe y reivindica una secuencia de ADN que actúa en cis clonada que media la supresión de apolipoproteína B aterogénica (Ross et al., 1993).
En la publicación PCT WO 01/12789 se describe y reivindica un ribozima que escinde el ARNm de ApoB-100 específicamente en la posición 6679 (Chan et al., 2001).
Tang et al., Chinese Journal of Arteriosclerosis, 1999, 7(4) describen experimentos que usan oligodesoxinucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B en células hepáticas de rata.
Eggerman et al., Federal Register, 2000, 65(110) discuten experimentos que usan oligodesoxinucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B en células hepáticas humanas.
Hasta la fecha, las estrategias dirigidas a inhibir la función de la apolipoproteína B se han limitado a la aféresis de Lp(a), anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y ribozimas. Sin embargo, con excepción de la aféresis de Lp(a), estas estrategias de investigación no se han ensayado como protocolos terapéuticos. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad desde hace tiempo de agentes adicionales capaces de inhibir de forma eficaz la función de la apolipoproteína B.
Está surgiendo la tecnología antisentido como un medio eficaz de reducir la expresión de productos génicos específicos y por lo tanto puede llegar a ser singularmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación que implican la modulación de la expresión de la apolipoproteína B.
La presente invención proporciona composiciones y métodos para modular la expresión de la apolipoproteína B, incluyendo la inhibición de la isoforma alternativa de la apolipoproteína B, la ApoB-48.
5 Compendio de la invención
La invención proporciona un compuesto oligonucleótido antisentido de 20 bases nucleicas de longitud que tiene una secuencia de bases nucleicas como se expone en la SEQ ID NO: 247 y que comprende 5-metilcitidina en las bases nucleicas 2, 3, 5, 9, 12, 15, 17, 19 y 20, en donde cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato, las bases nucleicas 1-5 y 16-20 comprenden una modificación 2'-metoxietoxi, y las bases nucleicas 6-15 son
10 desoxinucleótidos.
La invención también proporciona una composición que comprende el compuesto oligonucleótido antisentido de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona el compuesto oligonucleótido antisentido de la invención o la composición de la invención, para usar en la terapia o profilaxis de una enfermedad.
15 La invención también proporciona el compuesto oligonucleótido antisentido de la invención o la composición de la invención, para usar en el tratamiento de la hipercolesterolemia en un ser humano.
La invención también proporciona el compuesto oligonucleótido antisentido de la invención o la composición de la invención, para usar en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular, tal como la aterosclerosis, en un ser humano.
20 La invención también proporciona el compuesto oligonucleótido antisentido de la invención o la composición de la invención, para usar en el tratamiento de la hiperlipidemia en un ser humano.
La invención también proporciona el compuesto oligonucleótido antisentido de la invención o la composición de la invención, para usar en el tratamiento de la diabetes en un ser humano.
La invención también proporciona el compuesto oligonucleótido antisentido de la invención o la composición de la 25 invención, para usar en el tratamiento de la obesidad en un ser humano.
La invención también proporciona el uso del compuesto oligonucleótido antisentido de la invención en la preparación de un medicamento para tratar la hipercolesterolemia en un ser humano.
La invención también proporciona el uso del compuesto oligonucleótido antisentido de la invención en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad cardiovascular, tal como la aterosclerosis, en un ser humano.
30 La invención también proporciona el uso del compuesto oligonucleótido antisentido de la invención en la preparación de un medicamento para tratar la hiperlipidemia en un ser humano.
La invención también proporciona el uso del compuesto oligonucleótido antisentido de la invención en la preparación de un medicamento para tratar la diabetes en un ser humano.
La invención también proporciona el uso del compuesto oligonucleótido antisentido de la invención en la preparación 35 de un medicamento para tratar la obesidad en un ser humano.
Compendio de la descripción
La presente descripción se refiere a compuestos, en particular oligonucleótidos antisentido, que están dirigidos a un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, y que modulan la expresión de la apolipoproteína B. También se describen composiciones farmacéuticas y otras composiciones que comprenden los compuestos de la descripción. 40 Además, se describen métodos para modular la expresión de la apolipoproteína B en células o tejidos, que comprenden poner en contacto dichas células o tejidos con uno o más compuestos antisentido o composiciones de la descripción. Además se describen métodos de tratamiento de un animal, en particular un ser humano, que se sospecha que tiene o es propenso a tener una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B, por administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más
45 compuestos antisentido o composiciones de la descripción.
En particular, en la presente memoria se describe un compuesto de 8 a 50 bases nucleicas de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con e inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, comprendiendo dicho compuesto al menos 8 bases nucleicas contiguas de cualquiera de las SEQ ID NO: 127-134, 136, 138-174, 176-317,
50 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 y 845-854.
También se describe en la presente memoria un compuesto de 8 a 50 bases nucleicas de longitud, que hibrida específicamente con al menos una parte de 8 bases nucleicas de un sitio activo en una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, comprendiendo dicho compuesto al menos 8 bases nucleicas contiguas de cualquiera de las SEQ ID NO: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 y 845-854, siendo dicho sitio activo una región en dicho ácido nucleico, en el que la unión de dicho compuesto a dicho sitio inhibe significativamente la expresión de la apolipoproteína B comparado con un control.
También se describe en la presente memoria un compuesto de 8 a 50 bases nucleicas de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con dicho ácido nucleico e inhibe la expresión de la apolipoproteína B, en el que la apolipoproteína B es codificada por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 3 y (b) y una variante natural del polinucleótido que codifica la apolipoproteína B que hibrida con el complemento del polinucleótido (a) en condiciones restrictivas, comprendiendo dicho compuesto al menos 8 bases nucleicas contiguas de una cualquiera de las SEQ ID NO: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 y 845-854.
También se describe en la presente memoria un compuesto de 8 a 50 bases nucleicas de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con dicho ácido nucleico e inhibe la expresión de la apolipoproteína B, en el que la apolipoproteína B es codificada por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 17, comprendiendo dicho compuesto al menos 8 bases nucleicas contiguas de uno cualquiera de las SEQ ID NO: 127-134, 136, 138174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839 842, 843 y 845-854.
También se describe en la presente memoria un compuesto de 8 a 50 bases nucleicas de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con un sitio activo en dicho ácido nucleico e inhibe la expresión de la apolipoproteína B, comprendiendo dicho compuesto al menos 8 bases nucleicas contiguas de cualquiera de las SEQ ID NO: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 y 845-854, siendo dicho sitio activo una región en dicho ácido nucleico, en el que la unión de dicho compuesto a dicho sitio inhibe significativamente la expresión de la apolipoproteína B comparado con un control.
También se describe en la presente memoria un compuesto mimético oligonucleótido de 8 a 50 bases nucleicas de longitud dirigido a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con dicho ácido nucleico e inhibe la expresión de la apolipoproteína B, comprendiendo dicho compuesto al menos 8 bases nucleicas contiguas de cualquiera de las SEQ ID NO: 127-134, 136, 138-174, 176-317, 319-321, 323-333, 335-339, 341-374, 376-416, 418-500, 502-510, 512-804, 815, 816, 819-821, 824, 825, 827, 828, 830, 831, 833-835, 837-839, 842, 843 y 845-854.
También se describe en la presente memoria un compuesto antisentido de 8 a 50 bases nucleicas de longitud, en el que dicho compuesto específicamente hibrida con los nucleótidos 2920-3420 expuestos en la SEQ ID NO: 3, e inhibe la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B humana después de 16 a 24 h en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en un cultivo en una concentración 150 nM. En algunos aspectos, el compuesto antisentido de 8 a 50 bases nucleicas de longitud hibrida con los nucleótidos 3230-3288 expuestos en la SEQ ID NO: 3 e inhibe la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B humana después de 16 a 24 h en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en un cultivo en una concentración 150 nM. En otro aspecto, los compuestos inhiben la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B en al menos 50%, después de 16 a 24 en células HepG2 al 80% de confluencia en una concentración 150 nM.
En un aspecto, los compuestos de la descripción están dirigidos a una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, en el que dicho compuesto hibrida específicamente con e inhibe la expresión de la forma larga de la apolipoproteína B, la ApoB-100. En otro aspecto, los compuestos hibridan específicamente con dicho ácido nucleico e inhiben la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B en al menos 5%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivo a una concentración óptima. En otro aspecto más, los compuestos inhiben la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B en al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, o al menos 50%.
En otro aspecto, los compuestos son oligonucleótidos antisentido, y en un aspecto, el compuesto tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 224, el oligonucleótido antisentido hibrida con una región complementaria al SEQ ID NO: 224, el compuesto comprende la SEQ ID NO: 224, el compuesto consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 224 o el compuesto consiste en la SEQ ID NO: 224.
En otro aspecto, el compuesto tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 247, el oligonucleótido antisentido hibrida con una región complementaria al SEQ ID NO: 247, el compuesto comprende la SEQ ID NO: 247, el compuesto consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 247 o el compuesto consiste en la SEQ ID NO: 247.
En otro aspecto, el compuesto tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 319, el oligonucleótido antisentido hibrida con una región complementaria al SEQ ID NO: 319, el compuesto comprende la SEQ ID NO: 319, el compuesto consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 319 o el compuesto consiste en la SEQ ID NO: 319.
En un aspecto, los compuestos comprenden al menos un enlace internucleósido modificado, y en otro aspecto, el enlace internucleósido es una unión fosforotioato.
En otro aspecto, los compuestos comprenden al menos un resto de azúcar modificado, y en un aspecto, el resto de azúcar modificado es un resto de 2'-O-metoxietil-azúcar.
En otro aspecto, los compuestos comprenden al menos una base nucleica modificada, y en un aspecto la base nucleica modificada es una 5-metilcitosina.
En otro aspecto más, los compuestos son oligonucleótidos quiméricos. Los compuestos quiméricos preferidos incluyen los que tienen uno o más enlaces fosforotioato y que además comprenden alas de 2'-metoxietoxilnucleótido y un hueco de 10 bases nucleicas 2'-desoxinucleótidos.
En otro aspecto, los compuestos hibridan específicamente con e inhiben la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica una forma empalmada alternativamente de la apolipoproteína B.
También se describen en la presente memoria composiciones que comprenden un compuesto de la descripción y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la composición comprende además un sistema de dispersión coloidal, y en otro aspecto, el compuesto en la composición es un oligonucleótido antisentido. En algunos aspectos, la composición comprende un compuesto antisentido de la descripción hibridado con una hebra complementaria. La hibridación de la cadena antisentido puede formar uno o más extremos romos o uno o más extremos salientes. En algunos aspectos, el extremo saliente comprende una base modificada.
También se describen en la presente memoria métodos para inhibir la expresión de la apolipoproteína B en células o tejidos, que comprenden poner en contacto dichas células o tejidos con un compuesto de la descripción de modo que se inhiba la expresión de la apolipoproteína B. También se describen métodos para tratar un animal que tiene una enfermedad o afección asociada con la apolipoproteína B, que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la descripción, de modo que se inhiba la expresión de la apolipoproteína B. En diferentes aspectos, la afección está asociada con el metabolismo anómalo de lípidos, la afección está asociada con el metabolismo anómalo de colesterol, la afección es la aterosclerosis, la afección es una afección metabólica común, la afección metabólica anómalo es la hiperlipidemia, la enfermedad es la diabetes, la diabetes es diabetes de tipo 2, la afección es la obesidad y/o la enfermedad es una enfermedad cardiovascular.
También se describen en la presente memoria métodos para modular los niveles de glucosa en un animal que comprenden administrar a dicho animal un compuesto de la descripción, y en un aspecto, el animal es un ser humano. En diferentes aspectos, los niveles de glucosa son niveles de glucosa plasmática, los niveles de glucosa son niveles de glucosa en el suero, y/o el animal es un animal diabético.
También se describen en la presente memoria métodos para prevenir o retrasar el inicio de una enfermedad o afección asociada con la apolipoproteína B en un animal, que comprenden administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la descripción. En un aspecto, el animal es un ser humano. En otros aspectos, la afección es una afección metabólica anómala, la afección metabólica anómala es la hiperlipidemia, la enfermedad es la diabetes, la diabetes es la diabetes de tipo 2, la afección es la obesidad, la afección es la aterosclerosis, la afección implica el metabolismo anómalo de lípidos, y/o la afección implica el metabolismo anómalo de colesterol.
También se describen en la presente memoria métodos para prevenir o retrasar el inicio de un aumento de los niveles de glucosa en un animal, que comprenden administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la descripción. En un aspecto, el animal es un ser humano. En otros aspectos, los niveles de glucosa son niveles de glucosa en el suero y/o los niveles de glucosa son niveles de glucosa plasmática.
También se describen en la presente memoria métodos para modular los niveles de colesterol en el suero en un animal, que comprenden administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la descripción. En un aspecto, el animal es un ser humano.
También se describen en la presente memoria métodos para modular los niveles de lipoproteínas en un animal, que comprenden administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la descripción. En un aspecto, el animal es un ser humano. En otros aspectos, la lipoproteína es VLDL, la lipoproteína es HDL, y/o la lipoproteína es LDL.
También se describen en la presente memoria métodos para modular los niveles de triglicéridos en el suero en un animal, que comprenden administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un
compuesto de la descripción. En un aspecto, el animal es un ser humano.
También se describe en la presente memoria el uso de un compuesto de la descripción para fabricar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B, un medicamento para el tratamiento de una afección asociada con el metabolismo anómalo de lípidos, un medicamento para el tratamiento de una afección asociada con el metabolismo anómalo del colesterol, un medicamento para el tratamiento de la aterosclerosis, un medicamento para el tratamiento de la hiperlipidemia, un medicamento para el tratamiento de la diabetes, un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 2, un medicamento para el tratamiento de la obesidad, un medicamento para el tratamiento de una enfermedad cardiovascular, un medicamento para prevenir o retrasar el inicio de niveles aumentados de glucosa, un medicamento para prevenir o retrasar el inicio de niveles aumentados de glucosa en el suero, un medicamento para prevenir o retrasar el inicio de niveles aumentados de glucosa plasmática, un medicamento para modular los niveles de colesterol en el suero, un medicamento para modular los niveles de lipoproteínas en el suero, un medicamento para modular los niveles de VLDL en el suero, un medicamento para modular los niveles de HDL en el suero y/o un medicamento para modular los niveles de LDL en el suero, un medicamento para modular los niveles de triglicéridos en el suero.
En otro aspecto, se describen en la presente memoria métodos para reducir los niveles de lipoproteínas circulantes, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. En otro aspecto, se describen en la presente memoria métodos para reducir el transporte de lipoproteínas, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. También se describen en la presente memoria métodos para reducir la absorción/adsorción de lipoproteínas, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B.
En otro aspecto, se describen en la presente memoria métodos para reducir los niveles de triglicéridos circulantes, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de la apolipoproteína B. También se describen métodos para reducir el transporte de triglicéridos, que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de la apolipoproteína B. También se describen en la presente memoria métodos para reducir la absorción/adsorción de triglicéridos, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de la apolipoproteína B.
En otro aspecto, se describen en la presente memoria métodos para reducir los niveles de colesterol circulantes, incluyendo ésteres de colesterilo y/o colesterol no esterificado, que comprenden la etapas de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B También se contemplan métodos para reducir el transporte de colesterol, incluyendo ésteres de colesterilo y/o colesterol no esterificado, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. También se describen en la presente memoria métodos para reducir la absorción/adsorción de colesterol, incluyendo ésteres de colesterilo y/o colesterol no esterificado, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B.
También se describen en la presente memoria métodos para reducir los niveles de lípidos circulantes, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. También se describen en la presente memoria, métodos para reducir el transporte de lípidos en el plasma, que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de la apolipoproteína B. Además se describen en la presente memoria métodos para reducir la absorción/adsorción de lípidos, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B.
También se describen en la presente memoria métodos para reducir los niveles de lípidos de la dieta, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. También se describen métodos para reducir el transporte de lípidos de la dieta, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, así como métodos para reducir la absorción/adsorción de lípidos de la dieta que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B
También se describen en la presente memoria métodos para reducir los niveles de ácidos grasos circulantes, que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. También se describen en la presente memoria métodos para reducir el transporte de ácidos grasos, que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de la apolipoproteína B. También se contemplan métodos para reducir la absorción de ácidos grasos, que comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un
compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de la apolipoproteína B.
También se describen en la presente memoria métodos para reducir los reactantes de fase aguda circulantes, que comprenden las etapas de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. En otro aspecto, se describen en la presente memoria métodos para reducir el transporte de reactantes de fase aguda, que comprenden las etapas de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, así como métodos para reducir la absorción de reactantes de fase aguda que comprenden las etapas de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B
También se describen en la presente memoria métodos para reducir los quilomicrones circulantes que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, métodos para reducir el transporte de quilomicrones que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, y métodos para reducir la absorción de quilomicrones que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína
B.
También se describen en la presente memoria métodos para reducir las partículas remanantes de quilomicrones circulantes que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, métodos para reducir el transporte de remanentes de quilomicrones que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, y métodos para reducir la absorción de remanentes de quilomicrones que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B.
También se describen en la presente memoria métodos para reducir el VLDL, LDL, LDL, y/o HDL circulantes que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B. Igualmente, se describen en la presente memoria métodos para reducir el transporte de VLDL, LDL, LDL y/o HDL que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, además de métodos para reducir la absorción de VLDL, IDL, LDL y/o HDL que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B.
En otro aspecto más, se describen en la presente memoria métodos para tratar una afección asociada con la expresión de apolipoproteína B que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para reducir la expresión de apolipoproteína B, seleccionada dicha afección de hiperlipoproteínemia, hiperlipoproteínemia familiar de tipo 3 (disbetalipoproteínemia familiar), e hiperalfalipoproteínemia familiar; hiperlipidemia, hiperlipidemias mixtas, hiperlipidemia tipo lipoproteína múltiple, e hiperlipidemia combinada familiar; hipertrigliceridemia, hipertrigliceridemia familiar, y lipoproteína lipasa familiar; hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, hipercolesterolemia poligénica, y apolipoproteína B defectuosa familiar; trastornos cardiovasculares incluyendo aterosclerosis y enfermedad arterial coronaria; enfermedad vascular periférica; enfermedad de von Gierke (enfermedad de almacenamiento del glucógeno, tipo I); lipodistrofias (formas congénita y adquirida); síndrome de Cushing; enanismo ateliótico sexual (deficiencia de la hormona del crecimiento aislada); diabetes mellitus; hipertiroidismo; hipertensión; anorexia nerviosa; síndrome de Werner; porfiria intermitente aguda; cirrosis biliar primaria; obstrucción biliar extrahepática; hepatitis aguda; hepatoma; lupus eritematoso sistémico; gammapatías monoclonales (incluyendo mieloma, mieloma múltiple, macroglobulinemia y linfoma); endocrinopatías; obesidad; síndrome nefrótico; síndrome metabólico; inflamación; hipotiroidismo; uremia (hiperuricemia); impotencia; enfermedad hepática obstructiva; hipercalcemia idiopática; disglobulinemia; niveles de insulina elevados; síndrome X; contractura de Dupuytren; y enfermedad de Alzheimer y demencia.
También se describen en la presente memoria métodos para reducir el riesgo de una afección que comprenden las etapas de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B, seleccionada dicha afección de embarazo; claudicación intermitente; gota; y enfermedad por toxicidad de mercurio y amalgamas.
También se describen en la presente memoria métodos para inhibir la unión de partículas de colesterol al endotelio vascular que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B, y como resultado también se describen en la presente memoria métodos para reducir el riesgo de: (i) oxidación de partículas de colesterol; (ii) unión de monocitos al endotelio vascular; (iii) diferenciación de monocitos en macrófagos; (iv) ingestión por macrófagos de partículas de lípidos oxidadas y liberación de citoquinas (incluyendo, pero sin limitar, IL-1, TNF-alfa, TGF-beta); (v) formación de plaquetas de lesiones de fibrograsa fibrosa e inflamación; (vi) lesiones del endotelio que conducen a coágulos; y (vii) coágulos que conducen a infarto de miocardio o accidente cerebrovascular, que también comprenden las etapas de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B.
También se describen en la presente memoria métodos para reducir la hiperlipidemia asociada con alcoholismo, tabaco, uso de anticonceptivos orales, uso de glucocorticoides, uso de agentes de bloqueo beta-adrenérgicos, o uso de isotretinoína (ácido 13-cis-retinoico) que comprenden la etapa de administrar a un individuo una cantidad de un compuesto de la descripción suficiente para inhibir la expresión de apolipoproteína B
También se describe en la presente memoria un compuesto oligonucleótidos antisentido de 8 a 50 bases nucleicas de longitud que comprende al menos 8 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 247 y que tiene una longitud de al menos 12 o al menos de 14 a 30 bases nucleicas.
La invención proporciona un compuesto oligonucleótido antisentido de 20 bases nucleicas de longitud que tiene una secuencia de bases nucleicas como se expone en la SEQ ID NO: 247 y que comprende 5-metilcitidina en las bases nucleicas 2, 3, 5, 9, 12, 15, 17, 19 y 20, en el que cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato, las bases nucleicas 1-5 y 16-20 comprenden una modificación 2'-metoxietoxilo, y las bases nucleicas 6-15 son desoxinucleótidos.
También se describe en la presente memoria un compuesto que comprende una primera cadena de bases nucleicas, de 8 a 50 bases nucleicas de longitud y que comprende una secuencia de al menos 8 bases nucleicas contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, hibridada con una segunda cadena de bases nucleicas, de 8 a 50 bases nucleicas de longitud, y que comprende una secuencia suficientemente complementaria de la primera cada para permitir así la hibridación estable, inhibiendo dicho compuesto la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B después de 16 a 24 h, en al menos 30% o al menos 50%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivos en una concentración 100 nM.
Se describe además una vesícula, tal como un liposoma, que comprende un compuesto o composición de la descripción.
Los métodos preferidos de administración de los compuestos o composiciones de la descripción, a un animal son por vía intravenosa, subcutánea u oral. La administración se puede repetir.
También se describe en la presente memoria un método para reducir la secreción de lipoproteína (a) por lo hepatocitos, que comprende (a) poner en contacto los hepatocitos con una cantidad de una composición que comprende un compuesto no catalítico de 8 a 50 bases nucleicas de longitud que hibrida específicamente con el ARNm que codifica la apolipoproteína B humana e inhibe la expresión del ARNm después de 16 a 24 h, en al menos 30% o al menos 50%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivos en una concentración 150 nM, en el que al menos dicha cantidad es eficaz para inhibir la expresión de la apolipoproteína B en los hepatocitos; y (b) medir la secreción de la lipoproteína (a) por los hepatocitos.
También se describe en la presente memoria un método para tratar una afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B en un primate, tal como un ser humano, que comprende administrar al primate una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto no catalítico de 8 a 50 bases nucleicas de longitud que hibrida específicamente con el ARNm que codifica la apolipoproteína B humana e inhibe la expresión del ARNm después de 16 a 24 h, en al menos 30% o al menos 50%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivos en una concentración 150 nM.
También se describe en la presente memoria un método para reducir la expresión de la apolipoproteína B en el hígado de un animal, que comprende administrar al animal entre 2 mg/kg y 20 mg/kg de un compuesto no catalítico de 8 a 50 bases nucleicas de longitud que hibrida específicamente con el ARNm que codifica la apolipoproteína B humana en al menos 30% o al menos 50%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivos en una concentración 150 nM.
También se describe un método para fabricar un compuesto de la descripción que comprende hibridar específicamente in vitro una primera cadena de bases nucleicas que comprende una secuencia de al menos 8 bases nucleicas contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO:3 con una segunda cadena de bases nucleicas que comprende una secuencia suficientemente complementaria de dicha primera cadena de forma que permite la hibridación estable.
También se describe en la presente memoria el uso de un compuesto de la descripción en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de todas y cada una de las afecciones descritas en la presente memoria.
Descripción detallada de la invención
La presente invención usa compuestos oligómeros, específicamente oligonucleótidos antisentido, para usar en la modulación de la función de moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína B, modulando finalmente la cantidad de apolipoproteína B producida. Esto se logra proporcionando compuestos antisentido que hibridan específicamente con uno o más ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína B. Como se usa en la presente memoria, las expresiones "ácido nucleico diana" y "ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B" abarcan ADN que codifica la apolipoproteína B, ARN (incluyendo pre-ARNm y ARNm) transcritos a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con un ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico diana por compuestos con los que hibrida específicamente se denomina "antisentido". Las funciones del ADN con las que se va a interferir incluyen la replicación y transcripción. Las funciones del ARN con las que se va a interferir incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocación del ARN al sitio de traducción de proteínas,
5 traducción de proteínas a partir de ARN, empalme del ARN para dar una o más especies de ARNm y actividad catalítica en la que puede estar implicado o ser facilitada por el ARN. El efecto global de dicha interferencia con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de la apolipoproteína B. En el contexto de la presente invención, "modulación" significa un aumento (estimulación) o una disminución (inhibición) de la expresión de un gen. En el contexto de la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión génica y el ARNm es una diana preferida.
Se prefiere dirigirse a ácidos nucleicos específicos para el procedimiento antisentido. "Dirigir" un compuesto antisentido a un ácido nucleico particular, en el contexto de esta invención, es un procedimiento de múltiples etapas. El procedimiento normalmente empieza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función se va a modular. Este puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión está 15 asociada con un trastorno o estado patológico particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente invención, la diana es una molécula de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B. El proceso de dirigir también incluye determinar un sitio o sitios en este gen para que se produzca la interacción antisentido de modo que resulte el efecto deseado, p. ej., la detección o modulación de la expresión de la proteína. En el contexto de la presente descripción, un sitio intragénico preferido es la región que abarca el codón de inicio o terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) del gen. Puesto que como se conoce en la técnica el codón de inicio de la traducción típicamente es 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcritas; 5'-ATG en la correspondiente molécula de ADN), el codón de inicio de la traducción también se denomina "codón AUG", el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Una minoría de genes tienen un codón de inicio de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG, y se ha mostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. Por lo tanto, las 25 expresiones "codón de inicio de la traducción" y "codón de inicio" pueden abarcar muchas secuencias de codones, incluso aunque el aminoácido iniciador en cada caso típicamente es metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). También se sabe en la técnica que los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, cualquiera de los cuales se puede usar preferiblemente para el inicio de la traducción en un tipo de célula o tejido particular, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la invención, "codón de inicio" y "codón de inicio de la traducción" se refiere al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de una molécula de ARNm transcrita a partir de un gen que codifica la apolipoproteína B, independientemente de la
o las secuencias de dichos codones.
También se conoce en la técnica, que un codón de terminación de la traducción (o "codón de parada") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las correspondientes secuencias de ADN
35 son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente). Las expresiones "región del codón de inicio" y "región del codón de inicio de la traducción", se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que abarca desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de inicio de la traducción. De forma similar, las expresiones "región del codón de parada" y "región del codón de terminación de la traducción", se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que abarca desde aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de terminación de la traducción.
El marco de lectura abierto (ORF) o "región codificante", que se sabe en la técnica que se refiere a la región entre el codón de inicio de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede ser una región diana de forma eficaz. Otras regiones diana incluyen la región 5' no traducida (5'UTR), que se sabe en la
45 técnica que se refiere a la parte de un ARNm en la dirección 5' desde el codón de inicio de la traducción, y por lo tanto incluye los nucleótidos entre el sitio de la caperuza 5' y el codón de inicio de la traducción de un ARNm o los correspondientes nucleótidos en el gen, y la región 3' no traducida (3'UTR) que se sabe en la técnica que se refiere a la parte de un ARNm en la dirección 3' desde el codón de terminación de la traducción, y por lo tanto incluye nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm o los correspondientes nucleótidos en el gen. La caperuza 5' de un ARNm comprende un resto de guanosina N7-metilado unido al resto más extremo 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'La región de la caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura de la caperuza 5' así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la caperuza. La región de la caperuza 5' también puede ser una región diana preferida.
Aunque algunos ARNm eucariotas son traducidos directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas
55 como "intrones" que son escindidas de un transcrito antes de ser traducidas. El resto de las regiones (y por lo tanto traducidas) se conocen como "exones" y son empalmadas entre sí para formar una secuencia de ARNm continua. Los sitios de empalme del ARNm, es decir, las uniones intrón-exón, también pueden ser regiones diana preferidas, y son particularmente útiles en situaciones en las que en la enfermedad está implicado el empalme aberrante, o cuando está implicado en la enfermedad un exceso de producción de un producto de empalme de ARNm particular. Las uniones de fusiones aberrantes debidas a reordenamientos o eliminaciones también son dianas preferidas. También se ha encontrado que los intrones también pueden ser regiones diana eficaces, y por lo tanto preferidas, para los compuestos antisentido dirigidos, por ejemplo, a ADN o pre-ARNm.
Se han identificado uno o más sitios diana, y se eligen oligonucleótidos que son suficientemente complementarios de la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.
En el contexto de esta invención, "hibridación" significa enlace de hidrógeno, que puede ser enlace de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversos. Por ejemplo, la adenina y la timina son bases nucleicas 5 complementarias que se aparean mediante la formación de enlaces hidrógeno. "Complementario," como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una determinada posición de un oligonucleótido es capaz de forman enlace de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces se considera que el nucleótido y el ADN
o ARN son complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre
10 sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden formar enlaces de hidrógeno unos con otros. Por lo tanto, "que puede hibridar específicamente" y "complementario" son términos que se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad o apareamiento preciso de modo que se produce una unión específica y estable entre los oligonucleótidos y al ADN o ARN diana. Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no es necesario que sea 100%
15 complementaria de la de su ácido nucleico diana para que puede hibridar específicamente. Un compuesto antisentido puede hibridar específicamente cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana para producir una pérdida de utilidad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias que no son diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de
20 ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.
Los compuestos antisentido y otros compuestos de la invención que hibridan con la diana e inhiben la expresión de la diana, se identifican mediante experimentación, y las secuencias de estos compuestos se identifican en lo sucesivo como realizaciones preferidas de la invención. Los sitios diana de los que estas secuencias preferidas son
25 complementarias se denominan en lo sucesivo "sitios activos" y por lo tanto son sitios preferidos para usar como dianas. Por lo tanto, otra realización de la invención abarca compuestos que hibridan con estos sitios activos.
Los compuestos antisentido normalmente se usan como reactivos de investigación y diagnóstico. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido que son capaces de inhibir la expresión génica con exquisita especificidad, los usan a menudo los expertos en la técnica para elucidar la función de genes particulares. Los compuestos antisentido
30 también se usan, por ejemplo, para distinguir entre funciones de diferentes miembros de una ruta biológica. Por lo tanto, la modulación antisentido se ha aprovechado para uso en investigación.
Para usar en kits y en diagnóstico, los compuestos antisentido de la presente invención, solos o en combinación con otros compuestos antisentido o compuestos terapéuticos, se pueden usar como herramientas en análisis diferencial y/o combinatorio para elucidar patrones de expresión de una parte o del complemento entero de genes expresados
35 en células y tejidos.
Se comparan los patrones de expresión en células o tejidos tratados con uno o más compuestos antisentido con células o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y se analizan los diferentes niveles de expresión génica en los patrones producidos en lo que se refiere, por ejemplo, a la asociación con la enfermedad, ruta de señalización, localización celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Los
40 análisis se pueden llevar a cabo en células estimuladas o no estimuladas y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan a los patrones de expresión.
Los ejemplos de métodos de análisis de expresión génica conocidos en la técnica, incluyen matrices y micromatrices de ADN (Brazma and Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16), SAGE (análisis en serie de la expresión génica) (Madden, et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425), READS (amplificación con 45 enzimas de restricción de ADNc digeridos) (Prashar and Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análisis de expresión génica total) (Sutcliffe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81), matrices de proteínas y proteómica (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 210010), secuenciación de marcador de secuencia expresado (EST) (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huella dactilar de ARN sustractiva (SuRF) (Fuchs, et al., Anal. Biochem.,
50 2000, 286, 91-98; Larson, et al., Cytometry, 2000, 41, 203-208), clonación sustractiva, presentación diferencial (DD) (Jurecic and Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21), hibridación genómica comparativa (Carulli, et al., J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96), técnicas de FISH (hibridación in situ fluorescente) (Going and Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904) y métodos de espectrometría de masas (revisados en To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41).
55 La especificidad y sensibilidad del compuesto antisentido también la aprovechan los expertos en la técnica para usos terapéuticos. Se han usado oligonucleótidos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de estados patológicos en animales y el hombre. Los fármacos de oligonucleótidos antisentido, incluyendo ribozimas, se han administrado de forma segura y eficaz a seres humanos y actualmente están en marcha numerosos ensayos clínicos. Por lo tanto, está establecido que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que se
60 pueden configurar para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, en especial seres humanos.
En el contexto de esta invención, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o un polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. Por tanto, este término incluye oligonucleótidos compuestos por bases nucleicas presentes en la naturaleza, azúcares y enlaces internucleósidos
5 covalentes (cadena principal) (ARN y ADN), así como oligonucleótidos que tienen porciones que no son de origen natural que actúan de manera similar (miméticos de oligonucleótidos). Con frecuencia se prefieren los miméticos de oligonucleótidos frente a las formas naturales debido a las propiedades deseables tales como, por ejemplo, mayor captación celular, mayor afinidad por el ácido nucleico diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Aunque los oligonucleótidos antisentido son una forma preferida de compuesto antisentido, la presente descripción
10 incluye otros compuestos antisentido oligómeros, incluyendo, pero sin limitar miméticos de oligonucleótidos tal como se describe a continuación. Los compuestos antisentido de acuerdo con esta descripción comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 bases nucleicas (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleósidos unidos). Los compuestos antisentido particularmente preferidos son oligonucleótidos antisentido, incluso más preferiblemente los que comprenden de aproximadamente 12, aproximadamente 14, aproximadamente
15 20 a aproximadamente 30 bases nucleicas. Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS) (oligozimas) y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana y modulan su expresión. En realizaciones preferidas, el compuesto antisentido es un oligonucleótido no catalítico, es decir, no depende de una propiedad catalítica del oligonucleótido para su actividad moduladora. Los compuestos antisentido de la invención pueden incluir moléculas bicatenarias en las que una
20 primera cadena es hibridada establemente con una segunda cadena.
Tal y como se conoce en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar 25 pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto 2', 3' o 5' hidroxilo del azúcar. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfato enlazan covalentemente nucleósidos entre sí, para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de esta estructura polimérica lineal se pueden unir además para formar una estructura circular, sin embargo, en general se prefieren las estructuras lineales abiertas. Dentro de la estructura del oligonucleótido, los grupos fosfato se conocen comúnmente como los que forman la cadena principal
30 de internucleósidos del oligonucleótido. El enlace normal o cadena principal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
Los ejemplos específicos de compuestos antisentido útiles en esta invención incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Tal y como se define en esta memoria descriptiva, los oligonucleótidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen los que conservan un
35 átomo de fósforo en la cadena principal y los que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. A los efectos de esta memoria descriptiva, y a veces como referencia en la técnica, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su cadena principal internucleosídica, también se pueden considerar oligonucleósidos.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificadas preferidas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquil-fosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros 40 alquilos incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino-fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos de estos unidos 2'-5', y aquellos que tienen polaridad inversa en la que uno o más enlaces internucleótidos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los oligonucleótidos preferidos que tienen polaridad inversa comprenden un
45 enlace sencillo de 3' a 3' en el enlace internucleótido más extremo 3', es decir un solo resto de nucleósido inverso que puede ser sin base (la base nucleica no está o tiene un grupo hidroxilo en su lugar). También están incluidas diferentes sales, sales mixtas u formas de ácido libre.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, peso sin limitar, las patentes de EE.UU.: 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196;
50 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599; 5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 y 5.625.050.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen cadenas principales que están formadas por uniones internucleósidos de alquilo de cadena corta o cicloalquilo, 55 uniones internucleósidos de heteroátomo mixto o cicloalquilo, o una o más uniones internucleósidos heteroatómico de cadena corta o heterocíclico. Estos incluyen los que tienen uniones morfolino (formadas en parte de la parte de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de riboacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; 60 cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas
principales de amida; y otras que tienen partes con componentes N, O, S y CH2 mezclados.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, peso sin limitar, las patentes de EE.UU.: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225;
5 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 y 5.677.439.
En otros miméticos de oligonucleótidos preferidos, tanto el azúcar como el enlace internucleósido, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleótidos se sustituyenten por grupos nuevos. Las unidades de bases se mantienen para la hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Uno de dichos compuestos 10 oligómeros, un mimético de oligonucleótido que se ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denonima un ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos PNA, la cadena principal-azúcar de un oligonucleótido se sustituyen con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las bases nucleicas se conservan y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte de amida de la cadena principal. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la 15 preparación de compuestos PNA incluyen, pero sin limitar, las patentes de EE.UU.: 5.539.082; 5.714.331; y
5.719.262. Se pueden encontrar enseñanzas adicionales de compuestos PNA en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Las realizaciones más preferidas de la invención son oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales con heteroátomos, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2
20 [conocido como cadena principal de metilen(metilimino) o MMI], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- y O-N(CH3)-CH2-CH2- [en los que la cadena principal de fosfodiéster natural está representada como -O-P-O-CH2-] en la patente de EE.UU. citadas antes 5.489.677, y las cadenas principales de amida de la patente de EE.UU. citada antes 5.602.240. También se prefieren los oligonucleótidos que tienen estructuras de cadena principal de morfolino de la patente de EE.UU. citadas antes 5.034.506.
25 Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, en los que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de C1 a C10 o alquenilo y alquinilo de C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Se prefieren en particular O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, en los que n y m son de
30 aproximadamente 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o Oaralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalante, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo
35 para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocida como 2'-O-(2metoxietil) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación preferida adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también
40 conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2, también descrito en los ejemplos a continuación.
Una modificación preferida adicional incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando así un resto de azúcar bicíclico. La unión preferiblemente es un grupo metileno (-CH2-)n que forma puente con el átomo de oxígeno en 2' y el átomo de
45 carbono en 4' en el que n es 1 ó 2. Los LNA y su preparación se describe en el documento WO 98/39352 y WO 99/14226.
Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alilo (2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-alilo (2'-O-CH2-CH=CH2) y 2'-fluoro (2'-F). La modificación en 2' puede estar en la posición arabino (superior) o la posición ribo (inferior). Una modificación en 2'-arabino preferida es 2'-F. También se pueden 50 hacer modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, en particular en la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en los oligonucleótidos unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcares tales como restos ciclobutilo en lugar el azúcar pentafuranosilo. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero sin limitar, las patentes de EE.UU.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080;
55 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; 5.792.747; y 5.700.920.
Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de bases nucleicas (denominadas frecuentemente en la técnica simplemente como "bases"). Tal y como se emplea en la presente memoria, las bases nucleicas "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases púricas adenina (A) y guanina (G), y las bases 60 pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las bases nucleicas modificadas incluyen otras bases nucleicas naturales o sintéticas tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2aminoadenina, derivados 6-metilo y otros alquilo de adenina y guanina, derivados 2-propilo y otros alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halogenouracilo y citosina, derivados 5-propinilo (-C≡C-CH3) de uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases pirimidínicas, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 55 uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras 8-sustituidas adeninas y guaninas, 5-halógeno en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros 5-sustituido uracilos y citosinas, 7metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7desazaadenina y 3-deaazaguanina y 3-desazaadenina. Las bases nucleicas modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricícicas tales como fenoxazina-citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazinacitidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), pinzas G tales como una fenoxazina-citidina sustituida (p. ej. 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol-citidina (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), piridoindol-citidina (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las bases nucleicas modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base púrica o pirimidínica es sustituida por otros heterociclos, por ejemplo, 7-desazaadenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Ácidos nucleicos adicionales incluyen los descritos en la 15 patente de EE.UU. nº 3.687.808, los descritos en The Concise Enciclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos descritos por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y aquellos descritos por Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993. Algunos de estas bases nucleicas son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligómeros de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del ácido nucleico dúplex en 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones de bases preferidas, incluso más en particular cuando se combinan con modificaciones 2'-O
25 metoxietilo en el azúcar.
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de las bases nucleicas indicadas antes, así como otras bases nucleicas modificadas incluyen, pero sin limitar, la patente de EE.UU. 3.687.808 indicada antes, así como las patentes de EE.UU.: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091. 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; y 5.681.941, y patente de Estados Unidos 5.750.692.
Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica la unión química al oligonucleótido de uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la invención incluyen intercalantes, 35 moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la captación de oligómeros, potencian la resistencia de los oligómeros a la degradación, y/o refuerzan la hibridación específica de secuencia con el ARN. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la captación del oligómero, distribución, metabolismo o excreción. Los grupos conjugados representativos se describen en la solicitud de patente internacional PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre, 1992. Los restos conjugados incluyen, pero sin limitar, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsinger et 45 al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, p. ej., restos dodecanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), o ácido adamantano-acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), o un resto octadecilamina o hexilaminocarbonil-oxicolesterol (Crooke
55 et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. , 1996, 277, 923-937). Los oligonucleótidos de la invención también se pueden conjugar con sustancias que son fármacos activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbitúrico, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico. Los conjugados de oligonucleótido-fármaco y su preparación se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos 09/334,130 (presentada el 15 de junio, 1999).
Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados de oligonucleótidos incluyen, peso sin limitar, las patentes de EE.UU.: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465;
5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723.
5.416.203. 5.451.463. 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.
No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado sean modificadas de forma uniforme, y se puede incorporaran más de una de las modificaciones mencionadas antes en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido en un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto oligonucleótido. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en la que el oligonucleótido se modifica de modo que confiere al oligonucleótido una resistencia incrementada frente a la degradación con nucleasas, una mayor captación celular y/o un aumento de la afinidad de la unión con el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir ARN:ADN o híbridos de ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de la RNasa H, produce la escisión del ARN diana, potenciando así mucho la eficacia de la inhibición de la expresión génica por el oligonucleótido. Por consiguiente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, comparado con fosforotioatos de desoxioligonucleótidos que hibridan con la misma región diana. La escisión del ARN diana se puede detectar rutinariamente mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas asociadas de hibridación de ácidos nucleicos, conocidas en la técnica.
Los compuestos antisentido quiméricos de la invención se pueden formar como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos como se ha descrito anteriormente. Dichos compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gápmeros. Documentos de patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de dichas estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a: 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922.
Los compuestos antisentido usados de acuerdo con esta invención se pueden preparar convenientemente y de manera rutinaria mediante la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis se puede obtener de varios vendedores que incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Se puede emplear adicional o alternativamente cualquier otro medio para dicha síntesis conocido en la técnica. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como los fosforotioatos y los derivados alquilados.
Los compuestos antisentido de la invención se sintetizan in vitro y no incluyen composiciones de compuestos antisentido de origen biológico, o construcciones de vectores genéticos diseñadas para dirigir la síntesis in vivo de moléculas antisentido.
Los compuestos de la invención también se pueden mezclar, encapsular, conjugar o asociar de otra forma con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, tal como por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas al receptor, formulaciones por vía oral, rectal, tópica u otras, para ayudar a la captación, distribución y/o absorción. Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichas formulaciones que ayudan a la captación, distribución y/o absorción incluyen, pero sin limitar, las patentes de EE.UU.: 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.
Los compuestos antisentido de la invención abarcan cualquier sal, éster o sal de dicho éster o cualquier otro compuesto farmacéuticamente aceptable, que tras la administración a un animal, incluyendo un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o resto del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción señala también profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos, y otros bioequivalentes.
El término "profármaco" indica un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva y que se convierte en una forma activa (es decir, fármaco) dentro del cuerpo, o de sus células, por la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones de profármacos de los oligonucleótidos de la invención se preparan como derivados de SATE [(S-acetil-2-tioetil)fosfato] de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 93/24510 de Gosselin et al., publicado el 9 de diciembre 1993 o en los documentos WO 94/26764 y U.S 5.770.713 de Imbach et al.
La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto original y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo.
Las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables se forman con metales o aminas, tales como metales alcalinos y alcalinotérreos o aminas orgánicas. Los ejemplos de metales usados como cationes son sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Los ejemplos de aminas adecuadas son N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, diciclohexilamina, etilendiamina, N-metilglucamina, y procaína (véase, por ejemplo, Berge et 5 al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19). Las sales de adición de base de dichos compuestos ácidos se preparan poniendo en contacto la forma de ácido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal en la forma convencional. La forma de ácido libre se puede regenerar poniendo en contacto la forma de sal con un ácido y aislando el ácido libre de la forma convencional. Las formas de ácido libre difieren algo de sus respectivas formas de sal en algunas propiedades físicas tales como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a sus respectivos ácidos libres para los propósitos de la presente invención. Como se usa en la presente memoria, una "sal de adición farmacéuticamente" incluye una sal farmacéuticamente aceptable de una forma ácida de uno de los componentes de las composiciones de la invención. Estas incluyen sales de ácidos orgánicos e inorgánicos de las aminas. Las sales de ácido preferidas son hidrocloruros, acetatos, salicilatos, nitratos y fosfatos. Otras sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas 15 para los expertos en la técnica, e incluyen sales básicas de una variedad de ácidos inorgánicos y orgánicos, tales como, por ejemplo, con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico; con ácidos orgánicos carboxílicos, sulfónicos, sulfo o fosfo, o ácidos sulfámicos Nsustituidos, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido glucurónico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicíclico, ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido enbónico, ácido nicotínico
o ácido isonicotínico; con aminoácidos, tales como los 20 alfa-aminoácidos implicados en la síntesis de proteínas en la naturaleza, por ejemplo ácido glutámico o ácido aspártico, y también ácido fenilacético, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 4
25 metilbencenosulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, 2- o 3-fosforoglicerato, glucosa6-fosfato, ácido N-ciclohexilsulfámico (con la formación de ciclamatos), o con otros compuestos orgánicos ácidos, tales como ácido ascórbico. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos también se pueden preparar con un catión farmacéuticamente aceptable. Los cationes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la técnica, e incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, de amonio y amonio cuaternario. También son posibles los carbonatos e hidrogenocarbonatos.
Para los oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a (a) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, poliaminas tales como espermina y espermidina, etc.; (b) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con
35 ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido ptoluenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; y (d) sales formadas a partir de aniones elementales tales como cloro, bromo y yodo.
Los compuestos antisentido de la presente invención se pueden usar para el diagnóstico, tratamiento terapéutico, profiláctico y como reactivos y kits de investigación. Para tratamientos terapéuticos, un animal, preferiblemente un ser humano que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno que se puede tratar por modulación de la expresión de la apolipoproteína B, se trata por administración de compuestos antisentido de acuerdo con esta invención. Los compuestos de la invención se pueden usar en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad
45 eficaz de un compuesto antisentido a un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos antisentido y los métodos de la invención también pueden ser útiles de forma profiláctica, p. ej., para prevenir o retrasar la infección, inflamación o formación de tumor, por ejemplo.
Los compuestos antisentido de la invención son útiles para la investigación y el diagnóstico, porque estos compuestos hibridan con ácidos nucleicos que codifican la apolipoproteína B, permitiendo construir fácilmente los ensayos de tipo sándwich y otros ensayos para explotar este hecho. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido de esta invención con un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína B, se puede detectar por medios conocidos en la técnica. Dichos medios pueden incluir la conjugación de una enzima al oligonucleótido, radiomarcaje del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También se pueden preparar kits que usan dichos medios de detección para detectar el nivel de apolipoproteína B en una muestra.
55 La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen compuestos antisentido de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en una serie de formas dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y de la zona que se va a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica y en membranas mucosas incluyendo el suministro vaginal y rectal), pulmonar, p. ej., por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo con nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica), oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraaerterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, p. ej., intratecal
o intraventricular. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración oral.
Las composiciones farmacéuticas y formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches intradérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o convenientes. También pueden ser útiles los preservativos recubiertos, guantes y similares. Las 5 formulaciones típicas preferidas incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención están mezclados con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes de quelación y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferidos incluyen los neutros (p. ej. dioleoilfosfatidiletanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidil-colina DMPC, diestearoilfosfatidil-colina), negativos (p. ej. dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (p. ej. dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidil-etanolamina DOTMA). Los oligonucleótidos de la invención se pueden encapsular en liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres preferidos incluyen, pero sin limitar, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, gliceril-1
15 monocaprato, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un éster de alquilo C1-10 (p. ej. miristato de isopropilo IPM), monoglicérido, diglicérico o sus sales farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la solicitud de patente de Estados Unidos 09/315.298 presentada el 20 de mayo, 1999.
Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o disoluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser convenientes los espesantes, agentes de sabor, diluyentes, emulsionantes, ayudantes de dispersión o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención se administran junto con uno o más tensioactivos potenciadores de la penetración o quelantes. Los tensioactivos preferidos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sus sales, ácidos biliares 25 y/o sus sales. Los ácidos/sales biliares preferidos incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio, glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos preferidos incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una de sus sales farmacéuticamente aceptable (p. ej., de sodio). También se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácido biliares/sales. Una combinación particularmente preferida es la sal de sodio del ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros potenciadores de la penetración incluyen el éter polioxietilen-9
35 laurilo, éter de polioxietilen-20-cetilo. Los oligonucleótidos de la invención se pueden suministrar por vía oral en forma granular incluyendo partículas secadas por atomización, o complejadas para formar micro o nanopartículas. Los agentes de complejación de oligonucleótidos incluyen:
poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationiazadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivatizadas con DEAE, pululanos, celulosas y almidones. Los agentes de complejación particularmente preferidos incluyen quitosán, N-trimetilquitosán, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliaminoestireno (e.g. p-amino), poli(cianoacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(cianoacrilato de isohexilo), metacrilato de DEAE, hexilacrilato de DEAE, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano,
45 polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(D,L-ácido láctico), poli(ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG). Se describen otras formulaciones orales para oligonucleótidos y su preparación en detalle en las solicitudes de Estados Unidos 08/886.829 (presentada el 1 de julio, 1997), 09/108.673 (presentada el 1 de julio, 1998), 09/256.515 (presentada el 23 de febrero, 1999), 09/082.624 (presentada el 21 de mayo, 1998) y 09/315.298 (presentada el 20 de mayo, 1999).
Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir disoluciones acuosas estériles, que pueden contener también tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero sin limitar, potenciadores de la penetración, compuestos vehículos y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitar, disoluciones, emulsiones y
55 formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero sin limitar, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el(los) vehículo(s) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima, los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y después, si es necesario, moldeando el producto.
Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas formas farmacéuticas posibles, tales como, pero sin limitar, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones
5 en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
En una realización de la presente invención, las composiciones farmacéuticas se pueden formular y usar en forma de espumas. Las formas farmacéuticas incluyen formulaciones tales como, pero sin limitar, emulsiones,
10 microemulsiones, cremas, gelatinas y liposomas. Aunque son de naturaleza básicamente similar, estas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final. La preparación de dichas composiciones y formulaciones en general es conocida para el experto en la técnica farmacéutica y de la formulación, y se puede aplicar a la formulación de las composiciones de la presente invención.
Emulsiones
15 Las composiciones de la presente invención se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son sistemas típicamente heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotas que normalmente superan 0,1 μm de diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms,
20 Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 301). Las emulsiones son con frecuencia sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersadas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de la forma agua en aceite (ag/ac) o de aceite en agua (ac/ag). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa como gotas minúsculas en una fase oleosa voluminosa,
25 la composición resultante se llama una emulsión de agua en aceite (ag/ac). Alternativamente, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa como gotas minúsculas en una fase acuosa voluminosa, la composición resultante se llama una emulsión de aceite en agua (ac/ag). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas y el fármaco activo, que pueden estar presentes como una disolución en la fase acuosa, la fase oleosa o él mismo como una fase separada. También pueden estar presentes excipientes
30 farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizantes, colorantes y antioxidantes, en las emulsiones, según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser múltiples emulsiones que están compuestas de más de dos fases tal como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (ac/ag/ac) y de agua en aceite en agua (ag/ac/ag). Dichas formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que las emulsiones binarias sencillas no proporcionan. Las emulsiones múltiples en las que pequeñas gotas de aceite
35 individuales de una emulsión de ac/ag encierran gotas de agua pequeñas constituyen una emulsión de ag/ac/ag. De la misma forma, un sistema de pequeñas gotas de aceite encerradas en glóbulos de agua esterilizada en una fase de aceite continua proporciona una emulsión de ac/ag/ac.
Las emulsiones se caracterizan por tener poca o no tener estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión está bien dispersa en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma mediante 40 emulsionantes o por la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido
o un sólido, como es el caso de bases de pomadas y cremas de tipo emulsión. Otros medios para estabilizar emulsiones implican el uso de emulsionantes que se pueden incorporan en cualquier de las fases de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar ampliamente en 4 categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes naturales, bases de absorción y sólidos finamente dispersos (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,
45 Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
Los tensioactivos sintéticos, conocidos también como agentes tensioactivos, han encontrado un amplio campo de aplicación en la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 50 volume 1, p. 199). Los tensioactivos son típicamente anfifílicos y comprenden una parte hidrófila y una hidrófoba. La relación de la naturaleza hidrófila a la hidrófoba del tensioactivo se ha denominado el equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa para clasificar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos se pueden clasificar en diferentes clases basándose en la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfóteros (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),
55 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
Los emulsionantes naturales usados en formulaciones de emulsiones incluyen lanolina, cera de abeja, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción tienen propiedades hidrófilas de modo que se pueden empapar en agua para formar emulsiones de ag/ac que todavía retienen la consistencia semisólida, tal como lanolina anhidra y vaselina hidrófila. También se han usado los sólidos finamente divididos como buenos emulsionantes, en especial 60 en combinación con tensioactivos en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como
hidróxidos de metales pesados, arcillas que no se hinchan tales como bentonita, atapulguita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos, y sólidos no polares tales como carbón o triestearato de glicerilo.
También están incluidos una gran variedad de materiales no emulsionantes en formulaciones en emulsión y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
Los coloides hidrófilos o hidrocoloides incluyen gomas naturales y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma de karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o hinchan en agua para formar disoluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando películas interfaciales fuertes alrededor de las pequeñas gotas de la fase dispersa y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Puesto que las emulsiones a menudo contienen una serie de ingredientes tales como hidratos de carbono, proteínas, esteroles y fosfátidos, que pueden soportar fácilmente el desarrollo de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan conservantes. Los conservantes usados habitualmente incluidos en las formulaciones en emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres del ácido p-hidroxibenzoico, y ácido bórico. También se añaden habitualmente antioxidantes a las formulaciones en emulsión para prevenir el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser depuradores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes de reducción tales como ácido ascórbico y metabisulfito sódico, y compuestos sinérgicos de antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
La aplicación de las formulaciones en emulsión por vía dermatológica, oral y parenteral y los métodos para su fabricación han sido revisados en la bibliografía (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Las formulaciones en emulsión para el suministro oral se han usado muy ampliamente debido a la facilidad de uso de la formulación, y la eficacia desde el punto de vista de la absorción y la biodisponibilidad. (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Los laxantes de base de aceite mineral, las vitaminas solubles en aceite y preparaciones nutritivas de alto contenido en grasa están entre los materiales que se han administrado habitualmente por vía oral en forma de emulsiones de ac/ag.
En una realización de la presente invención, las composiciones de oligonucleótidos y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y compuesto anfifílico, que es una sola disolución líquida termodinámicamente estable y ópticamente isótropa (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Típicamente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una disolución acuosa de tensioactivo y después añadiendo una cantidad suficiente de un cuarto componente, en general un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que están estabilizados mediante películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung and Shah, en: Controlled Release of Drugs: polimers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Las microemulsiones normalmente se preparan por una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. El que la microemulsión sea del tipo de agua en aceite (ag/ac) o de aceite en agua (ac/ag) depende de las propiedades del aceite y el tensioactivo usados y de la estructura y el empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y colas hidrocarbonadas de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271).
Se ha estudiado ampliamente el procedimiento fenomenológico que usa diagramas de fases y ha dado un conocimiento exhaustivo al experto en la técnica, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). Comparadas con las emulsiones normales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de pequeñas gotas termodinámicamente estable que se forman espontáneamente.
Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero sin limitar, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, éteres de polioxietileno y oleilo, ésteres de ácido graso y poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de
hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DA0750), solos o combinados con cotensioactivos. El cotensioactivo, normalmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial penetrando en la película de tensioactivo y por consiguiente creando una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensioactivo. Sin embargo, las microemulsiones se pueden preparar sin usar cotensioactivos y los sistemas de microemulsión autoemulsionantes exentos de alcohol son conocidos en la técnica. La fase acuosa típicamente puede ser, pero sin limitar, agua, una disolución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles, y derivados del etilenglicol. La fase de aceite puede incluir, pero sin limitar, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y triglicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácido graso y glicerilo polioxietilado, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son particularmente interesantes desde el punto de vista de la solubilización del fármaco y la absorción potenciada de los fármacos. Se han propuesto microemulsiones basadas en lípidos (tanto de ac/ag como de ag/ac) para potenciar la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones proporcionan ventajas de mejor solubilización del fármaco, protección del fármaco frente a la hidrólisis enzimática, posible potenciación de la absorción de fármaco debido a alteraciones inducidas por el tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral frente a las formas farmacéuticas sólidas, mejor potencia clínica, y menor toxicidad (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). A menudo las microemulsiones se pueden formar de manera espontánea cuando sus componentes se ponen juntos a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos, péptidos u oligonucleótidos termolábiles. Las microemulsiones también han sido eficaces en el suministro transdérmico de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones en microemulsión y las formulaciones de la presente invención faciliten la mayor absorción sistémica de oligonucleótidos y ácidos nucleicos del tracto gastrointestinal, así como que mejore la captación celular local de oligonucleótidos y ácidos nucleicos en el tracto gastrointestinal, vagina, cavidad bucal y otras zonas de administración.
Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3), Labrasol, y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y potenciar la absorción de los oligonucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de la penetración usados en las microemulsiones de la presente invención se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías: tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se ha discutido antes.
Liposomas
Hay muchas estructuras de tensioactivos organizadas además de las microemulsiones que se han estudiado y usado para la formulación de fármacos. Estos incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como los liposomas, han atraído un gran interés debido a su especificidad y a la duración de la acción que ofrecen, desde el punto de vista de suministro del fármaco. Como se usa en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas.
Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipófilo y un interior acuoso. La parte acuosa contiene la composición que se va a liberar. Los liposomas catiónicos tienen la ventaja de poder fusionarse con la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse de forma tan eficaz con la pared celular, son atrapados por macrófagos in vivo.
Con el fin de cruzar la piel intacta de mamífero, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro menor de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por lo tanto, es deseable usar un liposoma que sea muy deformable y pueda pasar a través de dichos poros finos.
Otras ventajas de los liposomas incluyen: los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia variedad de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger los fármacos encapsulados en sus compartimentos internos frente al metabolismo y la degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). En la preparación de formulaciones de liposomas son importantes las consideraciones sobre la carga superficial del lípido, el tamaño de vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.
Los liposomas son útiles para la transferencia y suministro de principios activos al sitio de acción. Debido a que la membrana liposomal es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando se aplican liposomas a un tejido, los liposomas empiezan a fusionarse con las membranas celulares. A medida que la fusión del liposoma y la célula avanza, el contenido del liposoma se vacía en la célula donde el agente activo puede actuar.
Las formulaciones liposomales han sido el centro de una investigación exhaustiva como modo de liberación de muchos fármacos. Hay cada vez más pruebas de que para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas frente a otras formulaciones. Dichas ventajas incluyen menos efectos secundarios relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en la diana deseada, y
5 la capacidad de administrar una amplia variedad de fármacos, tanto hidrófilos como hidrófobos, a la piel.
Varias publicaciones han detallado la capacidad de los liposomas para suministrar agentes a la piel, incluyendo ADN de alto peso molecular. Se han administrado a la piel compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADN de alto peso molecular. La mayoría de las aplicaciones se dirigían a la epidermis superior.
Los liposomas están en dos clases amplias. Los liposomas catiónicos son liposomas con carga positiva que
10 interaccionan con moléculas de ADN con carga negativa para formar un complejo estable. El complejo de ADN/liposoma con carga positiva se une a la superficie celular con carga negativa y es internalizado en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen liberando su contenido al citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o tienen carga negativa, atrapan ADN más que formar complejo con él.
15 Puesto que tanto el ADN como el lípido están cargados de forma similar, se produce repulsión en lugar de formación de complejo. No obstante, algo de ADN es atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han usado para suministrar ADN que codifica el gen de la timidina quinasa a monocapas celulares en cultivo. Se detectó la expresión del gen endógeno en las células diana (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
20 Uno de los tipos principales de composiciones de liposomas incluyen fosfolípidos distintos de la fosfatidilcolina natural. Por ejemplo, se pueden formar composiciones de liposomas neutros a partir de dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos en general se forman a partir de dimiristoil-fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición de liposomas está formada por
25 fosfatidilcolina (PC), tal como por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo está formado por mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Varios estudios han evaluado el suministro tópico de formulaciones liposomales de fármacos a la piel. La aplicación de liposomas que contenían interferón en la piel de cobayas dio como resultado una reducción de las ampollas del herpes cutáneo, mientras que el suministro de interferón por otra vía (p. ej., como una disolución o una emulsión) no
30 era eficaz (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional ensayó la eficacia del interferón administrado como parte de una formulación liposomal frente a la administración del interferón usando un sistema acuoso, y concluyó que la formulación liposomal era superior a la administración acuosa (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
Los sistemas liposomales no iónicos también se han examinado para determinar su utilidad en el suministro de
35 fármacos a la piel, en particular sistemas de comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Se usaron formulaciones liposomales no iónicas que comprendían Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter de estearilo y polioxietileno-10) y Novasome™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter de estearilo y polioxietileno-10) para suministrar ciclosporina A en la dermis de la piel de ratón. Los resultados indicaron que dichos sistemas liposomales no iónicos eran eficaces para facilitar la deposición de la ciclosporina A en diferentes capas de la piel
40 (Hu et al. S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", un término que como se usa en la presente memoria, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado tiempos de vida en la circulación potenciados con respecto a liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados 45 son aquellos en los que parte del lípido que forma la vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glucolípidos, tales como monosialogangliósido GM1, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tal como un resto de polietilenglicol (PEG). Sin querer estar ligado a ninguna teoría en particular, se cree en la técnica que, al menos para los liposomas estéricamente estabilizados que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivatizados con PEG, la semivida en la circulación potenciada de estos liposomas estéricamente estabilizados deriva de una menor
50 captación en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Se conocen en la técnica diferentes liposomas que comprenden uno o más glucolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) describieron la capacidad del monosialogangliósido GM1, sulfato de galactocerebrósido y fosfatidilinositol para mejorar las semividas en la sangre de los liposomas. Estos hallazgos 55 fueron expuestos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La patente de EE.UU. nº
4.837.028 y la publicación internacional WO 88/04924, ambos de Allen et al., describen liposomas que comprenden
(1) esfingomielina y (2) el gangliósido GM1 o un éster sulfato de galactocerebrósido. La patente de EE.UU. nº
5.543.152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que comprenden 1,2-sndimiristoilfosfatidilcolina se describen en la publicación internacional WO 97/13499 (Lim et al.).
En la técnica se conocen muchos liposomas que comprenden lípidos derivatizados con uno o más polímeros hidrófilos y métodos para su preparación. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describían liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2C1215G, que contiene un resto de PEG. Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) observaron que el recubrimiento hidrófilo de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos 5 daba como resultado semividas en la sangre potenciadas. Describen fosfolípidos sintéticos modificados por unión de grupos carboxílicos de polialquilenglicoles (p. ej., PEG) Sears (patentes de EE.UU. nº 4.426.330 y 4.534.899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describían experimentos que demostraban que los liposomas que comprendían fosfatidiletanolamina (PE) derivatizada con PEG o estearato de PEG tenían aumentos significativos de las semividas en la circulación sanguínea. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron dichas observaciones a otros fosfolípidos derivatizados con PEG, p. ej., DSPE-PEG, formado por la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Se describen liposomas que tienen restos PEG unidos de forma covalente a su superficie externa en la patente europea nº EP 0 445 131 B1 y la publicación internacional WO 90/04384 de Fisher. Las composiciones de liposomas que contienen 1-20 por ciento en moles de PE derivatizado con PEG, y los métodos para su uso, los describen Woodle et al. (patentes de EE.UU. nº 5.013.556 y 5.356.633) y
15 Martin et al. (patente de EE.UU. nº 5.213.804 y patente europea nº EP 0496813 B1). Se describen liposomas que comprenden una serie de conjugados de lípido-polímero en la publicación internacional WO 91/05545 y la patente de EE.UU. nº 5.225.212 (ambas de Martin et al.) y en la publicación internacional WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Se describen liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados con PEG en la publicación internacional WO 96/10391 (Choi et al.). Las patentes de EE.UU. nº 5.540.935 (Miyazaki et al.) y 5.556.948 (Tagawa et al.) describen liposomas que contienen PEG que pueden estar además derivatizados con restos funcionales en sus superficies.
Se conoce un número limitado de liposomas que comprenden ácidos nucleicos en la técnica. La publicación internacional WO 96/40062 de Thierry et al. describe métodos para encapsular ácidos nucleicos de alto peso molecular en liposomas. La patente de EE.UU. nº 5.264.221 de Tagawa et al. describe liposomas unidos a proteínas y afirma que el contenido de dichos liposomas puede incluir un ARN antisentido. La patente de EE.UU. nº 5.665.710
25 de Rahman et al. describe determinados métodos para encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. La publicación internacional WO 97/04787 de Love et al. describe liposomas que comprenden oligonucleótidos antisentido dirigidos al gen raf.
Los transferosomas son otro tipo más de liposomas, y son agregados de lípidos muy deformables que son candidatos atractivos para vehículos de suministro de fármacos. Los transferosomas se pueden describir como pequeñas gotas lipídicas que son tan deformables que pueden penetrar fácilmente a través de los poros que son más pequeños que las gotas pequeñas. Los transferosomas se pueden adaptar al entorno en el que se usan, p. ej., son autooptimizantes (se adaptan a la forma de los poros en la piel), autorreparadores, con frecuencia alcanzan sus objetivos sin fragmentación, y a menudo autocargables. Para hacer transferosomas se pueden añadir activadores de borde de superficie, normalmente tensioactivos, a una composición de liposomas convencional. Los transferosomas
35 se han usado para suministrar albúmina de suero a la piel. Se ha mostrado que el suministro mediado por transferosoma de la albúmina de suero es tan eficaz como la inyección subcutánea de una disolución que contiene albúmina de suero.
Los tensioactivos tienen una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. El modo más común de clasificar y ordenar las propiedades de muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrófilo (conocido también como la "cabeza") proporciona el medio más útil para clasificar los diferentes tipos de tensioactivos usados en las formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no
45 iónicos tienen una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y se pueden usar en un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB están en el intervalo de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas no iónicas y los éteres tales como alcoholes grasos etoxilados, alcoholes propoxilados y polímeros de bloques etoxilados/propoxilados también están incluidos en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula de tensioactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, lactilatos de acilo, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como sulfatos de alquilo y sulfatos de alquilo etoxilados,
55 sulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos, acil-isetionatos, acil-tauratos y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivos aniónicos son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molécula de tensioactivo lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros de esta clase más usados.
Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de llevar una carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica
como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, Nalquilbetaínas y fosfátidos.
Se ha revisado el uso de tensioactivos en fármacos, formulaciones y en emulsiones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
Potenciadores de la penetración
En una realización, la presente invención usa diferentes potenciadores de la penetración para producir el suministro eficaz de ácidos nucleicos, en particular de oligonucleótidos, en la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en disolución tanto en formas ionizada como no ionizada. Sin embargo, normalmente solo los fármacos solubles en lípidos o lipófilos cruzan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso fármacos no lipófilos pueden cruzar las membranas celulares si la membrana que se va a cruzar se trata con un potenciador de la penetración. Además de añadir la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos.
Los potenciadores de la penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada una de las clases mencionadas antes de potenciadores de la penetración se describen a continuación con mayor detalle.
Tensioactivos: En relación con la presente invención, los tensioactivos (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa, reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfacial entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de los oligonucleótidos a través de la mucosa. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato sódico, éter de laurilo y polioxietileno-9 y éter de cetilo y polioxietileno-20) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); y emulsiones de productos químicos perfluorados FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Ácidos grasos: Los diferentes ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido míristico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C1-10 de los mismos (p. ej., metilo, isopropilo y t-butilo), y mono y diglicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Sales biliares: La función fisiológica de la bilis incluye el facilitar la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Diferentes sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como potenciadores de la penetración. Por lo tanto la expresión "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes naturales de la bilis así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares de la invención incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o sus sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicocolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y éter de laurilo y polioxietileno-9 (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Agentes quelantes: Los agentes quelantes, como se usa en relación con la presente invención, se pueden definir como compuestos que retiran iones metálicos de la disolución formando complejos con los mismos, con el resultado de que se potencia la absorción de los oligonucleótidos a través de la mucosa. En relación con su uso como potenciadores de la penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de DNasa, ya que la mayoría de las ADN nucleasas caracterizadas requieren un ion metálico divalente para la catálisis y por lo tanto son inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes de la invención incluyen, pero sin limitar, etilendiaminatetraacetato de sodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (p. ej., salicilato, 5-metoxisalicilato y homovanilato de sodio), derivados de Nacilo del colágeno, derivados de laureth-9 y N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas)(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
No tensioactivos no quelantes: Como se usa en la presente memoria, los compuestos potenciadores de la penetración no tensioactivos no quelantes se pueden definir como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que, no obstante, potencian la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa digestiva (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas,
5 derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco de sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
También se pueden añadir agentes que potencian la captación de oligonucleótidos a nivel celular a las composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, se sabe que los lípidos
10 catiónicos, tales como la lipofectina (Junichi et al, patente de EE.UU. nº 5.705.188), derivados de glicerol catiónicos y moléculas policatiónicas tales como la polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731), también potencian la captación celular de oligonucleótidos.
Se pueden usar otros agentes para potenciar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tales como 2-pirrol, azonas y terpenos tales como limoneno y
15 mentona.
Vehículos
Algunas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos vehículo en la formulación. Como se usa en la presente memoria, "compuesto vehículo" o "vehículo" se puede referir a un ácido nucleico o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no tiene actividad biológica por sí mismo) pero es reconocido como un ácido nucleico 20 por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad del ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto vehículo, típicamente con un exceso de esta última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otros depósitos extracirculatorios, supuestamente debido a la competición entre el compuesto
25 vehículo y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotioato en tejido hepático se puede reducir cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitidílico o ácido 4-acetamido-4'-isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5; 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
Excipientes
30 A diferencia de un compuesto vehículo, un "vehículo farmacéutico" o "excipiente" es un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la forma de administración planeada en mente, de modo que proporcione el volumen, consistencia, etc. deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los
35 vehículos farmacéuticos típicos incluyen, pero sin limitar, agentes aglutinantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (p. ej., lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato sódico, acetato sódico,
40 etc.); disgregantes (p. ej., almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato sódico, etc.).
Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de forma perjudicial con ácidos nucleicos también se pueden usar para formular las composiciones de la presente invención. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin
45 limitar, agua, disoluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos puede incluir disoluciones acuosas estériles y no estériles, disoluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes, o disoluciones de los ácidos nucleicos en bases líquidas u oleosas sólidas. Las disoluciones pueden contener tampones, diluyentes y otros
50 aditivos adecuados. Se pueden usar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionen de forma perjudicial con ácidos nucleicos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitar, agua, disoluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
55 Suministro en pulsos
Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar por suministro en pulsos. "Suministro en pulsos" se refiere a una formulación farmacéutica que suministra un primer pulso de fármaco combinado con un
potenciador de la penetración y un segundo pulso de potenciador de la penetración para promover la absorción del fármaco que no se ha absorbido tras la liberación de potenciador de la penetración con el primer pulso.
Una realización de la presente invención es una formulación oral de liberación retardada para la absorción intestinal de fármaco potenciada, que comprende:
(a)
una primera población de partículas de vehículo que comprenden dicho fármaco y un potenciador de la penetración, en el que dicho fármaco y dicho potenciador de la penetración son liberados en un primer sitio en el intestino; y
(b)
una segunda población de partículas de vehículo que comprenden un potenciador de la penetración y un recubrimiento o matriz de liberación retardada, en el que el potenciador de la penetración es liberado en un segundo sitio en el intestino, más abajo del primero sitio, de modo que la absorción del fármaco es potenciada cuando el fármaco alcanza el segundo sitio.
Alternativamente, el potenciador de la penetración en (a) y (b) es diferente.
Esta potenciación se obtiene por encapsulación de al menos dos poblaciones de partículas de vehículo. La primera población de partículas de vehículo comprende una sustancia biológicamente activa y un potenciador de la penetración, y la segunda (y opcionalmente adicional) población de partículas de vehículo comprende un potenciador de la penetración y un recubrimiento o matriz para la liberación retardada.
Un "efecto del primer paso" que se aplica a los fármacos administrados por vía oral es la degradación debido a la acción del ácido gástrico y diferentes enzimas digestivas. Un medio para mejorar los efectos de eliminación del primer paso es aumentar la dosis del fármaco administrado, compensando de esta forma la proporción de fármaco perdido en la eliminación del primer paso. Aunque esto se puede lograr fácilmente con la administración i.v., por ejemplo, simplemente proporcionando más fármaco a un animal, otros factores influyen en la biodisponibilidad de los fármacos administrados por medios no parenterales. Por ejemplo, un fármaco se puede degradar enzimática o químicamente en el canal alimentario o el torrente sanguíneo y/o puede ser impermeable o permeable frente a diferentes membranas mucosas.
Se contempla también que estas composiciones farmacéuticas son capaces de potenciar la absorción de sustancias biológicamente activas cuando se administran por vía rectal, vaginal, nasal o pulmonar. También se contempla que la liberación de la sustancia biológicamente activa se puede lograr en cualquier parte del tracto gastrointestinal.
Las composiciones farmacéuticas líquidas de oligonucleótidos se pueden preparar mediante la combinación del oligonucleótido con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos o disolución salina. Se pueden incluir opcionalmente otros compuestos terapéuticos.
La presente invención también contempla el uso de composiciones sólidas en partículas. Dichas composiciones preferiblemente comprenden partículas de oligonucleótido que son de tamaño respirable. Dichas partículas se puede preparar, por ejemplo, moliendo el oligonucleótido seco por medios convencionales, por ejemplo con un mortero y mano de mortero, y después pasando la composición en polvo resultante a través de un tamiz de malla nº 400 para separar las partículas grandes y los aglomerados. Una composición sólida en partículas compuesta de un oligonucleótido activo puede contener opcionalmente un dispersante que sirve para facilitar la formación de un aerosol, por ejemplo lactosa.
De acuerdo con la presente invención, las composiciones de oligonucleótidos se pueden aerolizar. La aerolización de partículas líquidas se puede producir por cualquier medio adecuado, tal como un nebulizador. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.501.729. Los nebulizadores son dispositivos disponibles en el comercio que transforman disoluciones o suspensiones en un aerosol de tipo niebla terapéutico por medio de la aceleración de un gas comprimido, típicamente aire y oxígeno, a través de un orificio Venturi estrecho o mediante agitación ultrasónica. Los nebulizadores adecuados incluyen los vendidos por Blairex® con los nombres PARI LC PLUS, PARI DURA-NEB 2000, PARI-BABY Size, compresor PARI PRONEB con LC PLUS, sistema compresor/nebulizador PARI WALKHALER, nebulizador reutilizable PARI LC PLUS y PARI LC Jet+ ®Nebulizer.
Las formulaciones de ejemplo para usar en los nebulizadores consisten en un oligonucleótido en un líquido, tal como agua estéril exenta de pirógenos, o disolución salina, en la que el oligonucleótido comprende hasta aproximadamente 40% en p/p de la formulación. Preferiblemente, el oligonucleótido comprende menos de 20% en p/p. Si se desea, se pueden añadir a la composición aditivos adicionales tales como conservantes (por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo), antioxidantes, y agentes de sabor.
Las partículas sólidas que comprenden un oligonucleótido también se pueden aerolizar usando cualquier generador de aerosol de medicamento en partículas sólidas conocido en la técnica. Dichos generadores de aerosoles producen partículas respirables, como se ha descrito antes, y además producen dosis medidas reproducibles por unidad de volumen del aerosol. Los generadores de aerosoles de partículas sólidas adecuados incluyen insufladores e inhaladores dosificadores. Los inhaladores dosificadores se usan en la técnica y son útiles en la presente invención.
Preferiblemente, los aerosoles de líquidos o sólidos se producen a una velocidad de aproximadamente 10 a 150 litros por minuto, más preferiblemente de aproximadamente 30 a 150 litros por min y los más preferiblemente aproximadamente 60 litros por min.
La biodisponibilidad potenciada de las sustancias biológicamente activas también se logra mediante la administración oral de las composiciones y los métodos de la presente invención. El término "biodisponibilidad" se refiere a una medición de qué parte de un fármaco administrado llega al sistema circulatorio cuando se usa un modo de administración no parenteral para introducir el fármaco en un animal.
Los potenciadores de la penetración incluyen, pero sin limitar, miembros de clases moleculares tales como tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y moléculas no tensioactivas no quelantes. (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Los vehículos son moléculas inertes que se pueden incluir en las composiciones de la presente invención para que interfieran con los procesos que conducen a la reducción de los niveles del fármaco biodisponible.
Otros componentes
Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente otros componentes auxiliares encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, agentes antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas farmacéuticas de las composiciones de la presente invención, tales como colorantes, agentes de sabor, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deberían interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, agentes lubricantes, conservantes, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, agentes de sabor y/o sustancias aromáticas y similares, que no interaccionan perjudicialmente con el o los ácidos nucleicos de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Algunas realizaciones de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos antisentido, y (b) uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo que no es antisentido. Los ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitar, daunorubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, arabinósido de citosina, bis-cloroetilnitrosourea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosourea, mostazas nitrogenadas, melfalán, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4hidroxiperoxiciclofosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecán, topotecán, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilstilbestrol (DES). Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J. Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos se pueden usar de forma individual (p. ej., 5-FU y oligonucleótido), secuencial (p. ej., 5-FU y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o más de otros de dichos agentes quimioterapéuticos (p. ej., 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). Los fármacos antiinflamatorios, incluyendo, pero sin limitar, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivíricos, incluyendo, pero sin limitar, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también se pueden combinar en composiciones de la invención. Véase, en general, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N.J., páginas 2499-2506 y 46-49, respectivamente). Otros agentes quimioterapéuticos que no son de tipo antisentido también están dentro del alcance de esta invención. Se pueden usar dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.
En otra realización relacionada, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos antisentido, en particular oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. Se conocen numerosos ejemplos de compuestos antisentido en la técnica. Se pueden usar dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.
La formulación de las composiciones terapéuticas y su posterior administración se cree que se basa en la experiencia de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y la sensibilidad del estado patológico que se va a tratar, durando el curso del tratamiento desde varios días a varios meses, o hasta que se realice la cura o se logre una disminución del estado patológico. Los esquemas de dosificación óptimos se pueden calcular a partir de mediciones de la acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las
dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales, y en general se puede calcular basándose en las CE50 encontradas eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es de 0,01 ug a 100 g por kg de peso corporal, y se puede dar una o más veces al día, de forma semanal, mensual o anual, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden calcular fácilmente la frecuencia de repetición para la dosificación basándose en los tiempos de permanencia medidos y las concentraciones de fármaco en los fluidos corporales o tejidos. Después del tratamiento satisfactorio, puede ser conveniente que el paciente siga una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado patológico, en el que el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, en el intervalo de 0,01 ug a 100 g por kg de peso corporal, una o más veces al día, hasta una vez cada 20 años.
Terapia de Combinación
La invención también proporciona métodos de terapia de combinación, en la que se administran uno o más compuestos de la invención y uno o más compuestos terapéuticos/profilácticos para tratar una afección y/o un estado patológico como se describe en el presente documento. En diferentes aspectos, el o los compuestos de la invención y el o los compuestos terapéuticos/profilácticos se coadministran en forma de una mezcla, o se administran de forma individual. En un aspecto, la vía de administración es la misma para el o los compuestos de la invención y el o los compuestos terapéuticos/profilácticos, mientras que en otros compuestos, el o los compuestos de la invención y el o los compuestos terapéuticos/profilácticos se administran por diferentes vías. En una realización, las dosificaciones del o de los compuestos de la invención y el o los compuestos terapéuticos/profilácticos son cantidades que son terapéutica o profilácticamente eficaces para cada compuesto cuando se administran individualmente. Alternativamente, la administración combinada permite el uso de dosificaciones menores que las que se requerirían para lograr un efecto terapéutico o profiláctico si se administraran individualmente, y dichos métodos son útiles para disminuir uno o más efectos secundarios del compuesto de dosis reducida.
En un aspecto, se administran un compuesto de la presente invención y uno o más de los otros compuestos terapéuticos/profilácticos eficaces para tratar una afección, en el que ambos compuestos actúan por el mismo o por diferentes mecanismos. El o los compuestos terapéuticos/profilácticos incluyen, pero sin limitar, resinas secuestrantes de sales biliares (p. ej., colestiramina, colestipol y hidrocloruro de colesevelam), inhibidores de la HMGCoA-reductasa (p. ej., lovastatina, cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, simvastatina, y fluvastatina), ácido nicotínico, derivados del ácido fíbrico (p. ej., clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, bezafibrato, y ciprofibrato), probucol, neomicina, dextrotiroxina, ésteres de estanoles vegetales, inhibidores de la absorción de colesterol (p. ej., ezetimiba), implitapida, inhibidores de transportadores de ácidos biliares (transportadores apicales de ácidos biliares dependientes de sodio), reguladores de CYP7a hepático, productos terapéuticos de sustitución de estrógenos (p. ej., tamoxigen), y antiinflamatorios (p. ej., glucocorticoides).
Por consiguiente, la invención proporciona además el uso de un compuesto de la invención y uno o más de otro u otros compuestos terapéuticos/profilácticos como se describe en la presente memoria, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o afección como se describe en la presente memoria.
Suministro dirigido
En otro aspecto, se proporcionan métodos para dirigir un compuesto de la invención a un tejido, órgano o sitio específicos del cuerpo. Los ejemplos de dianas incluyen hígado, pulmón, riñón, corazón y placas ateroscleróticas en un vaso sanguíneo. Los métodos para dirigir compuestos son bien conocidos en la técnica.
En una realización el compuesto se dirige por administración directa o local. Por ejemplo, cuando se dirige a un vaso sanguíneo, el compuesto se administra directamente a la parte relevante del vaso desde el interior del lumen, p. ej., balón simple o doble balón, o a través de la túnica adventicia con material que ayuda a la liberación lenta del compuesto, p. ej., un sistema de gel plurónico como describen Simons et al., Nature 359: 67-70 (1992). Otras técnicas de liberación lenta para el suministro local del compuesto a un vaso incluyen el recubrimiento de una prótesis endovascular con el compuesto. Se describen métodos de suministro de compuestos antisentido a un vaso sanguíneo en la patente de EE.UU. nº 6.159.946.
Cuando se dirige a un tejido u órgano particular, el compuesto se puede administrar en o alrededor de ese tejido u órgano. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.547.787, describe métodos y dispositivos para dirigir agentes terapéuticos al corazón. En un aspecto, la administración se produce por la inyección directa o por inyección a un vaso sanguíneo asociado con el tejido u órgano. Por ejemplo, cuando se dirige al hígado, el compuesto se puede administrar por inyección o infusión a través de la vena porta.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para dirigir un compuesto que incluyen asociar el compuesto con un agente que dirige la captura del compuesto por uno o más tipos de células. Los agentes de ejemplo incluyen lípidos y estructuras basadas en lípidos tales como liposomas, en general en combinación con un resto que se dirige al órgano o tejido específico tal como, por ejemplo, un anticuerpo, un receptor de superficie celular, un ligando para un receptor de superficie celular, un polisacárido, un fármaco, una hormona, un hapteno, un lípido especial y un ácido nucleico como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.495.532. La patente de EE.UU. nº 5.399.331, describe el acoplamiento de proteínas a liposomas mediante el uso de un agente de reticulación que tiene al menos un grupo maleimido y una función reactiva con amina. Las patentes de EE.UU. nº 4.885.172, 5.059.421 y 5.171.578, describen proteínas que se unen a liposomas mediante el uso de glicoproteína estreptavidina y recubrimiento de
5 liposomas directores con polisacáridos. Otros agentes directores basados en lípidos incluyen, por ejemplo, micelas y productos cristalinos como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.217.886.
En otro aspecto, los agentes directores incluyen mircroesferas poliméricas porosas que derivan de poliésteres copolímeros y homopolímeros que contienen enlaces éster hidrolizables que son biodegradables, como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.818.542. Los poliésteres típicos incluyen poli(ácido glicólico) (PGA) y poli(ácido láctico) 10 (PLA), y copolímeros de glicólido y L(-lactida) (PGL), que son particularmente adecuados para los métodos y las composiciones de la presente invención, en cuanto que presentan una baja toxicidad humana y son biodegradables. El poliéster u otro polímero, oligómero o copolímero particular usado como matriz polimérica de la microesfera no es crítico y se puede usar una variedad de polímeros dependiendo de la porosidad, consistencia, forma y distribución de tamaños deseados. Otros polímeros o copolímeros biodegradables o bioerosionables incluyen, por ejemplo, 15 gelatina, agar, almidón de maíz, arabinogalactano, albúmina, colágeno, materiales naturales y sintéticos, tales como poli(ε-caprolactona), poli(ε-caprolactona-CO-ácido láctico), poli(ε-caprolactona-CO-ácido glicólico), poli(ácido βhidroxibutírico), poli(óxido de etileno), polietileno, poli(2-cianoacrilato de alquilo), (p. ej., metilo, etilo, butilo), hidrogeles tales como poli(metacrilato de hidroxietilo), poliamidas (p. ej., poliacrilamida), poli(aminoácidos) (es decir, L-leucina, ácido L-aspártico, L-aspartato de β-metilo, L-aspartato de β-bencilo, ácido glutámico), poli(2-hidroxietil-DL
20 aspartamida), poli(éster urea), poli(L-fenilalanina/etilenglicol/1,6-diisocianatohexano) y poli(metacrilato de metilo). Los polímeros naturales y sintéticos de ejemplo adecuados para la liberación dirigida están disponibles en el comercio o se pueden obtener por reacciones de polimerización por condensación a partir de monómeros, comonómeros u oligómeros adecuados.
En otra realización más, la patente de EE.UU. nº 6.562.864 describe catequinas, incluyendo isómeros epi y otros
25 isómeros carbocatiónicos y derivados de los mismos, que como monómeros, dímeros y multímeros mayores, pueden formar complejos con agentes bioactivos catiónicos y nucleófilos para usar como agentes de suministro. Los multímeros de catequinas tienen una fuerte afinidad por proteínas polares, tales como las que residen en el endotelio vascular, y en membranas celulares/orgánulos y son particularmente útiles para el suministro dirigido de agentes bioactivos para seleccionar sitios in vivo. En el tratamiento de enfermedades y trastornos vasculares, tales
30 como la aterosclerosis y enfermedades de las arterias coronarias, el suministro de agentes incluye multímeros de catequinas sustituidas, incluyendo multímeros de catequinas amidadas que se forman por reacción entre catequina y restos que contienen nitrógeno tales como amoniaco.
Otras estrategias para el suministro dirigido de la invención incluyen ADEPT (terapia enzimática con profármaco dirigido por anticuerpo), GDEPT (EPT dirigido por genes) y VDEPT (EPT dirigido por virus) como se describe en la
35 patente de EE.UU. nº 6.433.012.
La presente invención proporciona además dispositivos médicos y kits para el suministro dirigido, en la que el dispositivo es, por ejemplo, una jeringa, una prótesis endovascular o catéter. Los kits incluyen un dispositivo para administrar un compuesto y un recipiente que comprende un compuesto de la invención. En un aspecto, el compuesto está precargado en el dispositivo. En otras realizaciones, el kit proporciona instrucciones para los
40 métodos de administración del compuesto y dosificaciones. Las patentes de EE.UU. que describen dispositivos y kits médicos para el suministro de compuestos antisentido incluyen las patentes de EE.UU. nº 6.368.356; 6.344.035; 6.344.028; 6.287.285; 6.200.304; 5.824.049; 5.749.915; 5.674.242; 5.670.161; 5.609.629; 5.593.974; y 5.470.307.
Aunque la presente invención ha sido descrita con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar la invención y no están destinados a limitar la misma.
45 Ejemplos
Ejemplo 1
Nucleósido-fosforamiditas para la síntesis de oligonucleótidos desoxi y 2'-alcoxi-amiditas
Las 2'-desoxi y 2'-metoxi-beta-cianoetildiisopropil-fosforamiditas se adquirieron en fuentes comerciales (p. ej. Chemgenes, Needham MA o Glen Research, Inc. Sterling VA). Otras nucleósido-amiditas sustituidas con 2'-O-alcoxi
50 se prepararon como se describe en la patente de EE.UU. 5.506.351. Para los oligonucleótidos sintetizados usando 2'-alcoxi-amiditas, se usó el ciclo estándar para oligonucleótidos no modificados, excepto que la etapa de espera después del suministro de pulso de tetrazol y base se aumentó a 360 s.
Los oligonucleótidos que contenían 5-metil-2'-desoxicitidina (5-Me-C) se sintetizaron según los métodos publicados [Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203] usando fosforamiditas disponibles en el comercio
55 (Glen Research, Sterling VA o ChemGenes, Needham MA).
2'-Fluoro-amiditas
2'-Fluorodesoxiadenosina-amiditas
Los 2'-fluoro-oligonucleótidos se sintetizaron como se ha descrito previamente [Kawasaki, et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841] y patente de Estados Unidos 5.670.633. Brevemente, el nucleósido protegido N6-benzoil-2'desoxi-2'-fluoroadenosina se sintetizó usando la 9-beta-D-arabinofuranosiladenina disponible en el comercio como material de partida y modificando los procedimientos de la bibliografía de modo que se introdujera el átomo 2'-alfafluoro por un desplazamiento SN2 de un grupo 2'-beta-tritilo. Por lo tanto, la N6-benzoil-9-beta-Darabinofuranosiladenina se protegió selectivamente con rendimiento moderado como el 3',5'-ditetrahidropiranilo (THP) intermedio. La desprotección de los grupos THP y N6-benzoilo se llevó a cabo usando metodologías convencionales y métodos convencionales para obtener el 5'-dimetoxitritil-(DMT) y 5'-DMT-3'-fosforamidita intermedios.
2'-Fluorodesoxiguanosina
La síntesis de la 2'-desoxi-2'-fluoroguanosina se llevó a cabo usando 9-beta-D-arabinofuranosilguanina protegida con tetraisopropildisiloxanilo (TPDS) como material de partida, y conversión a la diisobutirilarabinofuranosilguanosina intermedia. A la desprotección del grupo TPDS le siguió la protección del grupo hidroxilo con THP para dar la arabinofuranosilguanina protegida con diisobutiril-di-THP. A la O-desacetilación selectiva y formación de triflato le siguió el tratamiento del producto bruto con fluoruro, y después desprotección de los grupos THP.
Se usaron metodologías convencionales para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.
2'-Fluorouridina
La síntesis de la 2'-desoxi-2'-fluorouridina se llevó a cabo por modificación de un procedimiento de la bibliografía, en el que el 2,2'-anhidro-1-beta-D-arabinofuranosiluracilo se trató con fluoruro de hidrógeno-piridina al 70%. Se usaron procedimientos convencionales para obtener las 5'-DMT- y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.
2'-Fluorodesoxicitidina
La 2'-desoxi-2'-fluorocitidina se sintetizó por aminación de 2'-desoxi-2'-fluorouridina, seguido de protección selectiva para dar N4-benzoil-2'-desoxi-2'-fluorocitidina. Se usaron procedimientos convencionales para obtener las 5'-DMT-y 5'-DMT-3'-fosforamiditas.
Amiditas modificadas con 2'-O-(2-metoxietilo)
Las nucleósido-amiditas sustituidas con 2'-O-metoxietilo se preparan como sigue, o alternativamente, de acuerdo con los métodos de Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504.
2,2'-Anhidro[1-(beta-D-arabinofuranosil)-5-metiluridina]
Se añadieron 5-metiluridina (ribosiltimina, disponible en el comercio en Yamasa, Choshi, Japón) (72,0 g, 0,279 M), carbonato de difenilo (90,0 g, 0,420 M) y bicarbonato sódico (2,0 g, 0,024 M) a DMF (300 ml). La mezcla se calentó a la temperatura de reflujo, con agitación dejando que se liberara de una forma controlada el dióxido de carbono gaseoso formado. Después de 1 h, la disolución ligeramente oscurecida se concentró a presión reducida. El jarabe resultante se vertió en éter dietílico (2,5 litros), con agitación. El producto formó una goma. El éter se decantó y el residuo se disolvió en la mínima cantidad de metanol (aproximadamente 400 ml). La disolución se vertió en éter dietílico de nueva aportación (2,5 litros) para dar una goma rígida. El éter dietílico se decantó y la goma se secó en un horno con vacío (60°C a 1 mm de Hg durante 24 h) para dar un sólido que se trituró hasta un polvo marrón claro (57 g, 85% de rendimiento bruto). El espectro de RMN estaba de acuerdo con la estructura, contaminada con fenol en forma de su sal de sodio (aproximadamente 5%). El material se usó como estaba para las reacciones posteriores (o se purificó más por cromatografía en columna usando un gradiente de metanol en acetato de etilo (10-25%) para dar un sólido blanco, p.f. 222-4°C).
2'-O-Metoxietil-5-metiluridina
Se añadieron 2,2'-anhidro-5-metiluridina (195 g, 0,81 M), tris(2-metoxietil)borato (231 g, 0,98 M) y 2-metoxietanol (1,2 litros) en un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 litros y se puso en un baño de aceite previamente calentado a 160°C. Después de calentar durante 48 h a 155-160°C, el recipiente se abrió y la disolución se evaporó hasta sequedad y se trituró con MeOH (200 ml). El residuo se suspendió en acetona caliente (1 litro). Las sales insolubles se filtraron, se lavaron con acetona (150 ml) y el filtrado se evaporó. El residuo (280 g) se disolvió en CH3CN (600 ml) y se evaporó. Una columna de gel de sílice (3 kg) se empaquetó en CH2Cl2/acetona/MeOH (20:5:3) que contenía Et3NH al 0,5%. El residuo se disolvió en CH2Cl2 (250 ml) y se adsorbió sobre sílice (150 g) antes de cargarlo en la columna. El producto se eluyó con el disolvente de empaquetamiento para dar 160 g (63%) de producto. Se obtuvo material adicional volviendo a tratar las fracciones impuras.
2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
La 2'-O-Metoxietil-5-metiluridina (160 g, 0,506 M) se coevaporó con piridina (250 ml) y el residuo seco se disolvió en piridina (1,3 litros). Se añadió una primera parte alícuota de cloruro de dimetoxitritilo (94,3 g, 0,278 M) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió una segunda parte alícuota de cloruro de dimetoxitritilo 5 (94,3 g, 0,278 M) y la reacción se agitó durante una hora adicional. Después se añadió metanol (170 ml) para parar la reacción. La HPLC mostró la presencia de aproximadamente 70% de producto. Se evaporó el disolvente y se trituró con CH3CN (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl3 (1,5 litros) y se extrajo con 2x500 ml de disolución saturada de NaHCO3 y 2x500 ml de disolución saturada de NaCl. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó. Se obtuvieron 275 g de residuo. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice de 3,5 kg
10 empaquetada y eluida con EtOAc/hexano/acetona (5:5:1) que contenía Et3NH al 0,5%. Las fracciones puras se evaporaron para dar 164 g de producto. Se obtuvieron aproximadamente 20 g adicionales de las fracciones impuras para dar un rendimiento total de 183 g (57%).
3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina
Se combinaron la 2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (106 g, 0,167 M), DMF/piridina (750 ml de una
15 mezcla 3:1 preparada a partir de 562 ml de DMF y 188 ml de piridina) y anhídrido acético (24,38 ml, 0,258 M) y se agitaron a temperatura ambiente durante 24 h. La reacción se siguió por TLC inactivando primero la muestra de TLC por adición de MeOH. Tras completarse la reacción, que se juzga por la TLC, se añadió MeOH (50 ml) y la mezcla se evaporó a 35°C. El residuo se disolvió en CHCl3 (800 ml) y se extrajo con 2x200 ml de disolución saturada de bicarbonato sódico y 2x200 ml de disolución saturada de NaCl. Las capas acuosas se volvieron a extraer con 200 ml
20 de CHCl3. Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato sódico y se evaporaron para dar 122 g del residuo (aproximadamente 90% de producto). El residuo se purificó en una columna de gel de sílice de 3,5 kg y se eluyó usando EtOAc/hexano (4:1). Las fracciones de producto puro se evaporaron para dar 96 g (84%). Se recuperaron 1,5 g adicionales de las últimas fracciones.
3'-O-Acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina
25 Se preparó una primera disolución disolviendo 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metiluridina (96 g, 0,144 M) en CH3CN (700 ml) y se dejó aparte. Se añadió trietilamina (189 ml, 1,44 M) a una disolución de triazol (90 g, 1,3 M) en CH3CN (1 litro), se enfrió a -5°C y se agitó durante 0,5 h usando un agitador de varilla. Se añadió gota a gota POCl3 a lo largo de un periodo de 30 min, a la disolución agitada mantenida a 0-10°C, y la mezcla resultante se agitó durante 2 h adicionales. Se añadió gota a gota la primera disolución, a lo largo de un periodo de 45 min, a esta
30 última disolución. La mezcla de reacción resultante se almacenó durante la noche en una habitación fría. Las sales se filtraron de la mezcla de reacción y se evaporó la disolución. El residuo se disolvió en EtOAc (1 litro) y los sólidos insolubles se separaron por filtración. El filtrado se lavó con 1x300 ml de NaHCO3 y 2x300 ml de disolución saturada de NaCl, se secó sobre sulfato magnésico y se evaporó. El residuo se trituró con EtOAc para dar el compuesto del título.
35 2'-O-Metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina
Una disolución de 3'-O-acetil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-4-triazoluridina (103 g, 0,141 M) en dioxano (500 ml) y NH4OH (30 ml) se agitó durante 2 h. La disolución de dioxano se evaporó y el residuo se destiló azeotrópicamente con MeOH (2x200 ml). El residuo se disolvió en MeOH (300 ml) y se transfirió a un recipiente de presión de acero inoxidable de 2 litros. Se añadió MeOH (400 ml) saturado con NH3 gaseoso y el recipiente se
40 calentó a 100°C durante 2 h (la TLC mostró la conversión completa). El contenido del recipiente se evaporó hasta sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc (500 ml) y se lavó una vez con disolución saturada de NaCl (200 ml). Las capas orgánicas se secaron sobre sulfato sódico y el disolvente se evaporó para dar 85 g (95%) del compuesto del título.
N4-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-citidina
45 Se disolvió 2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (85 g, 0,134 M) en DMF (800 ml) y se añadió anhídrido benzoico (37,2 g, 0,165 M) con agitación. Después de agitar durante 3 h, la TLC mostraba que la reacción se había completado en aproximadamente 95%. El disolvente se evaporó y el residuo se destiló azeotrópicamente con MeOH (200 ml). El residuo se disolvió en CHCl3 (700 ml) y se extrajo con disolución saturada de NaHCO3 (2x300 ml) y disolución saturada de NaCl (2x300 ml), se secó sobre MgSO4 y se evaporó para dar el residuo (96 g). El residuo se
50 cromatografió en una columna de sílice de 1,5 kg usando EtOAc/hexano (1:1) que contenía Et3NH al 0,5% como disolvente de elución. Las fracciones del producto puro se evaporaron para dar 90 g (90%) del compuesto del título.
N4-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metil-citidina-3'-amidita
Se disolvió N4-benzoil-2'-O-metoxietil-5'-O-dimetoxitritil-5-metilcitidina (74 g, 0,10 M) en CH2Cl2 (1 litro). Se añadieron tetrazol diisopropilamina (7,1 g) y 2-cianoetoxi-tetra-(isopropil)fosfito (40,5 ml, 0,123 M) con agitación en 55 atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se agitó durante 20 h a temperatura ambiente (la TLC mostró que la reacción se había completado en un 95%). La mezcla de reacción se extrajo con disolución saturada de NaHCO3 (1x300 ml) y disolución saturada de NaCl (3x300 ml). Los lavados acuosos se volvieron a extraer con CH2Cl2 (300
ml), y los extractos se combinaron, se secaron sobre MgSO4 y se concentraron. El residuo obtenido se cromatografió en una columna de sílice de 1,5 kg usando EtOAc/hexano (3:1) como disolvente de elución. Las fracciones puras del producto se combinaron para dar 90,6 g (87%) del compuesto del título.
2'-O-(Aminooxietil)-nucleósido-amiditas y 2'-O-(dimetilaminooxietil)-nucleósido-amiditas
5 2'-(Dimetilaminooxietoxi)-nucleósido-amiditas
Las 2'-(dimetilaminooxietoxi)-nucleósido-amiditas [también conocidas en la técnica como 2'-O-(dimetilaminooxietil)nucleósido-amiditas] se preparan como se describe en los siguientes párrafos. Las nucleósido-amiditas de adenosina, citidina y guanosina se preparan de forma similar a la timidina (5-metiluridina) excepto que las aminas exocíclicas se protegen con un resto benzoilo en el caso de la adenosina y citidina y con un isobutirilo en el caso de
10 la guanosina.
5'-O-terc-Butildifenilsilil-O2-2'-anhidro-5-metiluridina
Se disolvieron O2-2'-anhidro-5-metiluridina (Pro. Bio. Sint., Varese, Italia, 100,0 g, 0,416 mmol), dimetilaminopiridina (0,66 g, 0,013 eq, 0,0054 mmol) en piridina seca (500 ml) a temperatura ambiente en atmósfera de argón y con agitación mecánica. Se añadió terc-butildifenilclorosilano (125,8 g, 119,0 ml, 1,1 eq, 0,458 mmol) en una porción. La 15 reacción se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. La TLC (Rf 0,22, acetato de etilo) indicó una reacción completa. La disolución se concentró a presión reducida hasta un aceite espeso. Este se repartió entre diclorometano (1 litro) y disolución saturada de bicarbonato sódico (2x1 litro) y salmuera (1 litro). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico y se concentró a presión reducida hasta un aceite espeso. El aceite se disolvió en una mezcla de acetato de etilo y éter dietílico 1:1 (600 ml) y la disolución se enfrió a -10°C. El producto cristalino
20 resultante se recogió por filtración, se lavó con éter dietílico (3x200 ml) y se secó (40°C, 1 mm de Hg, 24 h) hasta 149 g (74,8%) de sólido blanco. La TLC y la RMN estaban de acuerdo con el producto puro.
5'-O-terc-Butildifenilsilil-2'-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina
En un reactor de presión sin agitación, de acero inoxidable de 2 litros, se añadió borano en tetrahidrofurano (1,0 M, 2,0 eq, 622 ml). En la campana extractora y con agitación manual, se añadió con cuidado primero etilenglicol (350 25 ml, exceso) hasta que disminuyó la evolución de hidrógeno gaseoso. Se añadieron 5'-O-terc-butildifenilsilil-O2-2'anhidro-5-metiluridina (149 g, 0,311 mol) y bicarbonato sódico (0,074 g, 0,003 eq) con agitación manual. El reactor se cerró herméticamente y se calentó en un baño de aceite hasta que se alcanzó una temperatura interior de 160ºC y después se mantuvo durante 16 h (presión < 7 kg/cm2). El recipiente de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se abrió. La TLC (Rf 0,67 para el producto deseado y Rf 0,82 para el producto secundario ara-T, acetato de etilo) 30 indicaba una conversión al producto de aproximadamente 70%. Con el fin de evitar la formación de producto secundario adicional, se detuvo la reacción, se concentró a presión reducida (de 10 a 1 mm de Hg) en un baño de agua caliente (40-100°C) con las condiciones más extremas usadas para separar el etilenglicol. [Alternativamente, una vez que el disolvente de bajo punto de ebullición se ha separado, la disolución que queda se puede repartir entre acetato de etilo y agua. El producto estará en la fase orgánica]. El residuo se purificó por cromatografía en
35 columna (2 kg de gel de sílice, gradiente de acetato de etilo-hexanos de 1:1 a 4:1). Se combinaron las fracciones adecuadas, se separaron los productos volátiles y se secaron para dar el producto en forma de una espuma blanca crujiente (84 g, 50%), material de partida contaminado (17,4 g) y material de partida puro reutilizable 20 g. El rendimiento basado en el material de partida menos puro recuperado era de 58%. La TLC y la RMN estaban de acuerdo con 99% de producto puro.
40 2'-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina
Se mezcló la 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-(2-hidroxietil)-5-metiluridina (20 g, 36,98 mmol) con trifenilfosfina (11,63 g, 44,36 mmol) y N-hidroxiftalimida (7,24 g, 44,36 mmol). Después se secó sobre P2O5 con alto vacío durante dos días a 40°C. La mezcla de reacción se barrió con argón y se añadió THF seco (369,8 ml, Aldrich, botella con cierre hermético seguro) para dar una disolución transparente. Se añadió gota a gota azodicarboxilato de dietilo (6,98 ml, 45 44,36 mmol) a la mezcla de reacción. La velocidad de adición se mantiene de forma que la coloración rojo oscuro resultante acaba de bajar antes de añadir la siguiente gota. Tras completarse la adición, la reacción se agitó durante 4 h. En ese momento, la TLC mostró que la reacción se había completado (acetato de etilo:hexano, 60:40). El disolvente se evaporó a vacío. El residuo obtenido se puso en una columna ultrarrápida con acetato de etilo:hexano (60:40), para dar la 2'-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina en forma de una espuma blanca (21,819
50 g, 86%).
5'-O-terc-Butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina
Se disolvió 2'-O-([2-ftalimidoxi)etil]-5'-t-butildifenilsilil-5-metiluridina (3,1 g, 4,5 mmol) en CH2Cl2 seco (4,5 ml) y se añadió gota a gota metilhidrazina (300 ml, 4,64 mmol) de -10°C a 0°C. Después de 1 h, la mezcla se filtró, el filtrado se lavó con CH2Cl2 enfriado con hielo y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, salmuera y se secaron 55 sobre Na2SO4. La disolución se concentró para dar la 2'-O-(aminooxietil)timidina, que después se disolvió en MeOH (67,5 ml). A esta se le añadió formaldehído (disolución acuosa al 20%, 1,1 eq.) y la mezcla resultante se agitó durante 1 h. El disolvente se separó a vacío; el residuo se cromatografió para dar la 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[(2
formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina en forma de una espuma blanca (1,95 g, 78%).
5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[N,N-dimetilaminooxietil]-5-metiluridina
Se disolvió la 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[(2-formadoximinooxi)etil]-5-metiluridina (1,77 g, 3,12 mmol) en una disolución de p-toluenosulfonato de piridinio 1 M (PPTS) en MeOH seco (30,6 ml). Se añadió cianoborohidruro sódico (0,39 g, 6,13 mmol) a esta disolución a 10ºC en atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a 10ºC. Después de esto, el recipiente de reacción se retiró del baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, la reacción se siguió por TLC (MeOH al 5% en CH2Cl2). Se añadió disolución acuosa de NaHCO3 (al 5%, 10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2x20 ml). La fase de acetato de etilo se secó sobre Na2SO4 anhidro, y se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en una disolución de PPTS 1 M en MeOH (30,6 ml). Se añadió formaldehído (al 20% en p/p, 30 ml, 3,37 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 min. La mezcla de reacción se enfrió a 10ºC en un baño de hielo, se añadió cianoborohidruro sódico (0,39 g, 6,13 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 10ºC durante 10 min. Después de 10 min, la mezcla de reacción se retiró del baño de hielo y se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se añadió a la mezcla de reacción disolución de NaHCO3 al 5% (25 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2x25 ml). La capa de acetato de etilo se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó a sequedad. El residuo obtenido se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida y se eluyó con MeOH al 5% en CH2Cl2 para dar la 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[N,Ndimetilaminooxietil]-5-metiluridina en forma de una espuma blanca (14,6 g, 80%).
2'-O-(Dimetilaminooxietil)-5-metiluridina
Se disolvió trihidrofluoruro de trietilamina (3,91 ml, 24,0 mmol) en THF seco y trietilamina (1,67 ml, 12 mmol, seco, conservado sobre KOH). Después, la mezcla de trietilamina-2HF se añadió a la 5'-O-terc-butildifenilsilil-2'-O-[N,Ndimetilaminooxietil]-5-metiluridina (1,40 g, 2,4 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La reacción se siguió por TLC (MeOH al 5% en CH2Cl2). El disolvente se separó a vacío y el residuo se puso en una columna ultrarrápida con MeOH al 10% en CH2Cl2 para dar la 2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (766 mg, 92,5%).
5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina
La 2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (750 mg, 2,17 mmol) se secó sobre P2O5 con alto vacío durante la noche a 40°C. Después se coevaporó con piridina anhidra (20 ml). El residuo obtenido se disolvió en piridina (11 ml) en atmósfera de argón. Se añadieron 4-dimetilaminopiridina (26,5 mg, 2,60 mmol), cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (880 mg, 2,60 mmol) a la mezcla y la reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que todo el material de partida había desaparecido. La piridina se separó a vacío y el residuo se cromatografió y se eluyó con MeOH al 10% en CH2Cl2 (que contenía unas gotas de piridina) para dar la 5'-O-DMT-2'-O-(dimetilamino-oxietil)-5-metiluridina (1,13 g, 80%).
5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-dimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita]
La 5'-O-DMT-2'-O-(dimetilaminooxietil)-5-metiluridina (1,08 g, 1,67 mmol) se coevaporó con tolueno (20 ml). Al residuo se le añadió N,N-diisopropilamina tetrazónido (0,29 g, 1,67 mmol) y se secó sobre P2O5 con alto vacío durante la noche a 40°C. Después la mezcla de reacción se disolvió en acetonitrilo anhidro (8,4 ml) y se añadió 2cianoetil-N,N,N1,N1-tetraisopropilfosforamidita (2,12 ml, 6,08 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h en atmósfera inerte. La evolución de la reacción se siguió por TLC (hexano:acetato de etilo 1:1). El disolvente se evaporó, después el residuo se disolvió en acetato de etilo (70 ml) y se lavó con disolución acuosa de NaHCO3 al 5% (40 ml). La capa de acetato de etilo se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró. El residuo obtenido se cromatografió (acetato de etilo como eluyente) para dar la 5'-O-DMT-2'-O-(2-N,Ndimetilaminooxietil)-5-metiluridina-3'-[(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidita] en forma de una espuma (1,04 g, 74,9%).
2'-(Aminooxietoxi)-nucleósido-amiditas
Las 2'-(aminooxietoxi)-nucleósido-amiditas [también conocidas en la técnica como 2'-O-(aminooxietil)-nucleósidoamiditas] se preparan como se describe en los siguiente párrafos. Las nucleósido-amiditas de adenosina, citidina y timidina se preparan como sigue.
N2-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,Ndiisopropilfosforamidita]
El análogo de 2'-O-aminooxietil-guanosina se puede obtener por 2'-O-alquilación selectiva de la diaminopurinaribósido. Se pueden adquirir cantidades de multigramos de diaminopurina-ribósido en Schering AG (Berlín) para proporcionar la 2'-O-(2-etilacetil)-diaminopurina-ribósido junto con una cantidad minoritaria del isómero 3'. El 2'-O-(2etilacetil)-diaminopurina-ribósido se puede resolver y convertir en la 2'-O-(2-etilacetil)guanosina por tratamiento con adenosina desaminasa. (McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., publicación internacional WO 94/02501 A1 940203.) Los procedimientos de protección convencionales darían la 2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4'dimetoxitritil)guanosina y la 2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-etilacetil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina que se puede reducir para dar la 2-N-isobutiril-6-O-difenilcarbamoil-2'-O-(2-hidroxietil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina.
Como antes, el grupo hidroxilo se puede desplazar mediante la N-hidroxiftalimida por una reacción de Mitsunobu, y se puede formar la fosforamidita del nucleósido protegido de la forma habitual para dar la 2-N-isobutiril-6-Odifenilcarbamoil-2'-O-([2-ftalmidoxi]etil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)guanosina-3'-[(2-cianoetil)-N,Ndiisopropilfosforamidita].
2'-dimetilaminoetoxietoxi (2'-DMAEOE)-nucleósido-amiditas
Las 2'-dimetilaminoetoxietoxi-nucleósido-amiditas (también conocidas en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo, es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N-(CH2)2, o 2'-DMAEOE-nucleósido-amiditas) se preparan como sigue. Otras nucleósidoamiditas se preparan de forma similar.
2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil]-5-metil-uridina
El 2[2-(dimetilamino)etoxi]etanol (Aldrich, 6,66 g, 50 mmol) se añade lentamente a una disolución de borano en tetrahidrofurano (1 M, 10 ml, 10 mmol) con agitación en una bomba de 100 ml. Al disolverse el sólido evoluciona hidrógeno gaseoso. Se añaden O2-, 2'-anhidro-5-metiluridina (1,2 g, 5 mmol) y bicarbonato sódico (2,5 mg) y la bomba se cierra herméticamente, se pone en un baño de aceite y se calienta a 155°C durante 26 h. La bomba se enfría a temperatura ambiente. La disolución bruta se concentra y el residuo se reparte entre agua (200 ml) y hexanos (200 ml). El exceso de fenol se extrae en la capa de hexano. La capa acuosa se extrae con acetato de etilo (3x200 ml) y las capas orgánicas combinadas se lavan una vez con agua, se secan sobre sulfato sódico anhidro y se concentran. El residuo se pasa por una columna de gel de sílice usando metanol/cloruro de metileno 1:20 (que tenía 2% de trietilamina) como eluyente. Al concentrar las fracciones de la columna, se forma un sólido incoloro que se recoge para dar el compuesto del título en forma de un sólido blanco.
5'-O-Dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)-etil)]-5-metil-uridina
A 0,5 g (1,3 mmol) de 2'-O-[2(2-N,N-dimetilamino-etoxi)etil)]-5-metil-uridina en piridina anhidra (8 ml), se añaden trietilamina (0,36 ml) y cloruro de dimetoxitritilo (DMT-Cl, 0,87 g, 2 eq.) y se agita durante 1 h. La mezcla de reacción se vierte en agua (200 ml) y se extrae con CH2Cl2 (2x200 ml). Las capas de CH2Cl2 combinadas se lavan con disolución saturada de NaHCO3, seguido de disolución saturada de NaCl y se secan sobre sulfato sódico anhidro. La evaporación del disolvente seguido de cromatografía en gel de sílice usando MeOH:CH2Cl2:Et3N (20:1, v/v, con 1% de trietilamina) da el compuesto del título.
5'-O-Dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N-dimetilamioetoxi)-etil)]-5-metil-uridina-3'-O-(cianoetil-N,N-diisopropil)fosforamidita
Se añaden diisopropilaminotetrazólido (0,6 g) y 2-cianoetoxi-N,N-diisopropil-fosforamidita (1,1 ml, 2 eq.) a una disolución de 5'-O-dimetoxitritil-2'-O-[2(2-N,N-dimetilaminoetoxi)etil)]-5-metiluridina (2,17 g, 3 mmol) disuelta en CH2Cl2 (20 ml) en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agita durante la noche y se evapora el disolvente. El residuo resultante se purifica por cromatografía en columna ultrarrápida de gel de sílice con acetato de etilo como eluyente para dar el compuesto del título.
Ejemplo 2
Síntesis de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos no sustituidos y sustituidos con fosfodiéster (P=O) se sintetizan en un sintetizador de ADN automático (Applied Biosystems modelo 380B) usando la química convencional de la fosforamidita con oxidación por yodo.
Los fosforotioatos (P=S) se sintetizan como los oligonucleótidos fosfodiéster excepto que la botella de oxidación estándar se sustituyó por disolución de 1,1-dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona 0,2 M en acetonitrilo para la tiación escalonada de los enlaces fosfito. La etapa de espera de la tiación se aumentó a 68 s y le siguió la etapa de rematado. Después de escisión de la columna de CPG y desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55°C (18 h), los oligonucleótidos se purificaron por precipitación dos veces con 2,5 volúmenes de etanol a partir de una disolución de NaCl 0,5 M. Los fosfinatos de oligonucleótidos se preparan como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.508.270.
Los alquilfosfonatos de oligonucleótidos se preparan como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.469.863.
Los 3'-desoxi-3'-metilen-fosfonatos de oligonucleótidos se preparan como se describe en las patentes de EE.UU. nº
5.610.289 o 5.625.050.
Las fosforamiditas de oligonucleótidos se preparan como se describe en la patente de EE.UU. 5.256.775 o patente de EE.UU. 5.366.878.
Los alquilfosfonotioato de oligonucleótidos se preparan como se describe en las solicitudes PCT publicadas PCT/US94/00902 y PCT/US93/06976 (publicadas como WO 94/17093 y WO 94/02499, respectivamente).
Los 3'-desoxi-3'-amino-fosforamidatos de oligonucleótidos se preparan como se describe en la patente de EE.UU.
5.476.925.
Los fosfotriésteres de oligonucleótidos se preparan como se describe en la patente de EE.UU. 5.023.243.
Los borano-fosfatos de oligonucleótidos se preparan como se describe en las patentes de EE.UU. 5.130.302 y
5.177.198.
5 Ejemplo 3
Síntesis de oligonucleósidos
Los oligonucleósidos unidos a metilenmetilimino, también identificados como oligonucleósidos unidos a MMI, oligonucleósidos unidos a metilendimetilhidrazo, también identificados como oligonucleósidos unidos a MDH, y oligonucleósidos unidos a metilencarbonilamino, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-3, y
10 oligonucleósidos unidos a metilenaminocarbonilo, también identificados como oligonucleósidos unidos a amida-4, así como compuestos de cadena principal mixta que tienen, por ejemplo, uniones que alternan MMI y P=O o P=S se preparan como se describe en las patentes de EE.UU. 5.378.825, 5.386.023, 5.489.677, 5.602.240 y 5.610.289.
Los oligonucleósidos unidos a formacetal y tioformacetal se preparan como se describe en las patentes de EE.UU.
5.264.562 y 5.264.564.
15 Los oligonucleósidos unidos a óxido de etileno se preparan como se describe en la patente de EE.UU. 5.223.618.
Ejemplo 4
Síntesis de PNA
Los ácidos nucleicos peptídicos (PNA) se preparan de acuerdo con cualquiera de diferentes procedimientos citados en Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 20 1996, 4, 5-23. También se pueden preparar de acuerdo con las patentes de EE.UU. 5.539.082, 5.700.922, y
5.719.262.
Ejemplo 5
Síntesis de oligonucleótidos quiméricos
Los oligonucleótidos, oligonucleósidos u oligonucleótidos/oligonucleósidos mixtos quiméricos de la invención pueden
25 ser de varios tipos. Estos incluyen un primer tipo en el que el segmento "hueco" de los nucleósidos ligados se sitúa entre los segmentos ala de 5' y 3' de nucleósidos unidos y un segundo tipo de "extremo abierto" en donde el segmento "huceo" se encuentra en el extremo, ya sea 3' o 5' terminal del compuesto oligomérico. Los oligonucleótidos del primer tipo también se conocen en la técnica como “gápmeros” u oligonucleótidos con hueco. Los oligonucleótidos del segundo tipo se conocen también en la técnica como "hemímeros" o "alámeros".
30 [2'-O-Me]-[2'-desoxi]-[2'-O-Me] Oligonucleótidos fosforotioatos quiméricos
Los oligonucleótidos quiméricos que tienen segmentos de oligonucleótido 2'-O-alquil-fosforotioato y 2'-desoxifosforotioato se sintetizan usando un sintetizador de ADN automático Applied Biosystems modelo 380B, como antes. Los oligonucleótidos se sintetizan usando el sintetizador automático y la 2'-desoxi-5'-dimetoxitritil-3'-O-fosforamidita para la parte de ADN y la 5'-dimetoxitritil-2'-O-metil-3'-O-fosforamidita para las alas 5' y 3'. El ciclo de síntesis 35 convencional se modifican aumentando la etapa de espera después del suministro de tetrazol y base a 600 s, repetido cuatro veces para el ARN y dos veces para el 2'-O-metilo. El oligonucleótido completamente protegido se escinde del soporte y el grupo fosfato se desprotege en amoniaco/etanol 3:1 a temperatura ambiente durante la noche y después se liofiliza hasta sequedad. Después se hace el tratamiento en amoniaco metanólico durante 24 h a temperatura ambiente para desproteger todas las bases y la muestra se liofiliza hasta sequedad otra vez. El
40 sedimento se vuelve a suspender en TBAF 1 M en THF durante 24 h a temperatura ambiente para desproteger las posiciones 2'. Después, la reacción se inactiva con TEAA 1 M y después la muestra se reduce a 1/2 de volumen mediante Rotavac antes de desalar en una columna de exclusión por tamaños G25. Después se analiza en el oligómero recuperado por espectrofotometría el rendimiento y la pureza por electroforesis capilar y espectrometría de masas.
45 [2'-O-(2-Metoxietil)]-[2'-desoxi]-(2'-O-(metoxietil)]-oligonucleótidos fosforotioatos quiméricos
Los [2'-O-(2-metoxietil)]-[2'-desoxi]-[-2'-O-(metoxietil)]-oligonucleótidos fosforotioato quiméricos se prepararon igual que el procedimiento anterior para el 2'-O-metil-oligonucleótido quimérico, sustituyendo las 2'-O-metil-amiditas por 2'O-(metoxietil)-amiditas.
[2'-O-(2-Metoxietil)fosfodiéster]-[2'-desoxi-fosforotioato]-[2'-O-(2-metoxietil)-fosfodiéster]-oligonucleótidos quiméricos
50 Los [2'-O-(2-metoxietil-fosfodiéster]-[2'-desoxi fosforotioato]-[2'-O-(metoxietil)-fosfodiéster]-oligonucleótidos
quiméricos se preparan igual que por el procedimiento anterior para los 2'-O-metil-oligonucleótidos quiméricos sustituyendo las 2'-O-metil-amiditas por 2'-O-(metoxietil)-amiditas, oxidación con yodo para generar los enlaces internucleótidos fosfodiéster dentro de las partes de ala para las estructuras quiméricas y sulfuración usando 1,1dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) para generar los enlaces internucleótidos fosforotioato para la región interna del centro.
Otros oligonucleótidos quiméricos, oligonucleósidos quiméricos y oligonucleótidos/oligonucleósidos mixtos quiméricos se sintetizan de acuerdo con la patente de Estados Unidos 5.623.065.
Ejemplo 6
Aislamiento de oligonucleótidos
Tras la escisión de la columna de vidrio de poros controlados (Applied Biosystems) y el desbloqueo en hidróxido de amonio concentrado a 55°C durante 18 h, los oligonucleótidos u oligonucleósidos se purifican por precipitación dos veces en NaCl 0,5 M con 2,5 volúmenes de etanol. Los oligonucleótidos sintetizados se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida en geles desnaturalizantes y se consideró que al menos 85% era material de longitud completa. Las cantidades relativas de enlaces fosforotioato y fosfodiéster obtenidos se comprobó periódicamente por espectroscopía de resonancia magnética nuclear de 31P, y para algunos estudios los oligonucleótidos se purificaron por HPLC como describen Chiang et al., J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171. Los resultados obtenidos con el material purificado por HPLC eran similares a los obtenidos con el material no purificado por HPLC.
Ejemplo 7
Síntesis de oligonucleótidos - Formato de placa de 96 pocillos
Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante la química de la fosforamidita P(III) en fase sólida en un sintetizador automático capaz de ensamblar 96 secuencias simultáneamente en un formato de 96 pocillos estándar. Los enlaces internucleótidos fosfodiéster se proporcionaron por oxidación con yodo acuoso. Los enlaces internucleótidos fosforotioato se generaron por sulfuración usando 1,1-dióxido de 3,H-1,2-benzoditiol-3-ona (Beaucage Reagent) en acetonitrilo anhidro. Las beta-cianoetildiisopropil-fosforamiditas con base protegida convencionales se adquirieron en proveedores comerciales (p. ej. PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, o Pharmacia, Piscataway, NJ). Los nucleósidos no convencionales se sintetizan por métodos patentados o conocidos de la bibliografía. Se usan como las beta-cianoetildiisopropil-fosforamiditas de base protegida.
Los oligonucleótidos se escindieron del soporte y se desprotegieron con NH4OH concentrado a temperatura elevada (55-60°C) durante 12-16 h y después el producto liberado se secó a vacío. Después, el producto seco se volvió a suspender en agua estéril para dar una placa madre, a partir de la cual se diluyen todas las muestras de placa analíticas y de ensayo usando pipetas robóticas.
Ejemplo 8
Análisis de oligonucleótidos - Formato de placa de 96 pocillos
La concentración de oligonucleótidos en cada pocillo se evaluó por dilución de las muestras y espectroscopía de absorción UV. La integridad de la longitud completa de los productos individuales se evaluó por electroforesis capilar (CE) en el formato de 96 pocillos (Beckman P/ACE™ NDQ) o, para las muestras preparadas individualmente, en un aparato comercial de CE (p. ej., Beckman P/ACE™ 5000, ABI 270). La composición de bases y de la cadena principal se confirmó por análisis de masas de los compuestos usando espectroscopía de masas por electropulverización. Todas las placas de ensayo se diluyeron a partir de la placa madre usando pipetas robóticas de un canal y múltiples canales. Se consideró que las placas eran aceptables si al menos 85% de los compuestos de la placa eran al menos 85% de la longitud completa.
Ejemplo 9
Cultivo celular y tratamiento de oligonucleótidos
El efecto de los compuestos antisentido en la expresión del ácido nucleico diana se puede ensayar en cualquiera de una variedad de tipos de células, con la condición de que el ácido nucleico diana esté presente en niveles medibles. Esto se puede determinar de forma rutinaria usando, por ejemplo PCR o análisis de transferencia Northern. Los siguientes 7 tipos de células se proporcionan solo con propósitos ilustrativos, pero se pueden usar rutinariamente otros tipos de células, con la condición de que la diana sea expresada en el tipo de célula elegido. Esto se puede determinar fácilmente por métodos rutinarios en la técnica, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, ensayos de protección de ribonucleasa, o RT-PCR.
Células T-24:
La línea celular de carcinoma de células transicionales de vejiga humanas T-24 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Las células T-24 se cultivaron de forma rutinaria en medio basal
completo McCoy 5A (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con suero de ternero fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), penicilina 100 unidades por ml, y estreptomicina 100 microgramos por ml (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se realizaron pases de las células de forma rutinaria por tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria nº 3872) con una densidad de 7000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR.
Para los análisis de transferencia Northern y otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de tejido tisular de 100 mm u otras convencionales y tratar de forma similar, usando volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
Células A549:
La línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Las células A549 se cultivaron de forma rutinaria en medio basal DMEM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con suero de ternero fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), penicilina 100 unidades por ml y estreptomicina 100 microgramos por ml (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se realizaron pases de las células de forma rutinaria por tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia.
Células NHDF:
Los fibroblastos dérmicos neonatales humanos (NHDF) se obtuvieron de Clonetics Corporation (Walkersville MD). Las NHDF se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento de fibroblastos (Clonetics Corporation, Walkersville MD) complementado como recomienda el proveedor. Las células se mantuvieron hasta 10 pases según recomendaba el proveedor.
Células HEK:
Los queratinocitos embrionarios humanos (HEK) se obtuvieron de Clonetics Corporation (Walkersville MD). Los HEK se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento de queratinocitos (Clonetics Corporation, Walkersville MD) formulado como recomendaba el proveedor. Las células se mantuvieron de forma rutinaria hasta 10 pases según recomendaba el proveedor.
Células HepG2:
La línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células HepG2 se cultivaron de forma rutinaria en MEM de Eagle complementado con suero de ternero fetal al 10%, aminoácidos no esenciales y piruvato sódico 1 mM (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se realizaron pases de las células de forma rutinaria por tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria nº 3872) con una densidad de 7000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR.
Para los análisis de transferencia Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de tejido tisular de 100 mm u otras convencionales y tratar de forma similar, usando volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
Células AML12:
La línea celular AML12 (hepática de ratón alfa 12) se estableció a partir de hepatocitos de un ratón (cepa CD1, línea MT42) transgénico para TGF alfa humano. Las células se cultivan en una mezcla 1:1 de medio Eagle modificado por Dulbecco y medio F12 de Ham con insulina 0,005 mg/ml, transferrina 0,005 mg/ml, selenio 5 ng/ml, y dexametasona 40 ng/ml, y 90%; suero bovino fetal al 10%. Para el subcultivo, el medio gastado se separa y se añade medio reciente de disolución de tripsina al 0,25%, EDTA al 0,03%. Se añade disolución de tripsina reciente (de 1 a 2 ml) y el cultivo se deja asentar a temperatura ambiente hasta que las células se desprenden.
Se realizaron pases de las células de forma rutinaria por tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria nº 3872) con una densidad de 7000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR.
Para los análisis de transferencia Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de tejido tisular de 100 mm u otras convencionales y tratar de forma similar, usando volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
Hepatocitos primarios de ratón:
Los hepatocitos primarios de ratón se prepararon a partir de ratones CD-1 adquiridos en Charles River Labs (Wilmington, MA) y se cultivaron de forma rutinaria en medio de adherencia de hepatocitos (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD), dexametasona 250 nM (Sigma), e insulina 10 nM (Sigma). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria nº 3872) con una densidad de 10000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR.
Para el análisis por transferencia Northern u otros análisis, las células se cultivan en placas de cultivo celular de 100 mm u otras convencionales recubiertas con colágeno de cola de rata (200 ug/ml) (Becton Dickinson) y se tratan de forma similar usando los volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
5 Células Hep3B:
La línea celular de carcinoma hepatocelular humano Hep3B se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células Hep3B se cultivaron de forma rutinaria en MEM de Dulbeccos con alto contenido en glucosa complementado con suero de ternero fetal al 10%, L-glutamina e hidrocloruro de piridoxina (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se realizaron pases de las células de forma rutinaria por tripsinización y dilución
10 cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (Falcon-Primaria nº 3846) con una densidad de 50.000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR.
Para los análisis de transferencia Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de tejido tisular de 100 mm u otras convencionales y tratar de forma similar, usando volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
15 Hepatocitos primarios de conejo:
Los hepatocitos primarios de conejo se adquirieron en Invitro Technologies (Gaithersburg, MD) y se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (Gibco). Cuando se adquirieron, las células se habían sembrado en placas de 96 pocillos para usar en análisis de RT-PCR y eran confluentes.
Para los análisis de transferencia Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de tejido tisular
20 de 100 mm u otras convencionales y tratar de forma similar, usando volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
Células HeLa:
La línea celular de carcinoma epiteloide HeLa se obtuvo de la American Tissue Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células HeLa se cultivaron de forma rutinaria en DMEM, con alto contenido de glucosa (Invitrogen 25 Corporation, Carlsbad, CA) complementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos (Falcon-Primaria nº 3846) con una densidad de 50.000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR. Se realizaron pases de las células de forma rutinaria por tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria nº 3872) con una densidad de 5.000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR. Para los
30 análisis de transferencia Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de tejido tisular de 100 mm u otras convencionales y tratar de forma similar, usando volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
Células epiteliales mamarias humanas:
Las células epiteliales mamarias humanas normales (HMEC) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas VA). Las HMEC se cultivaron de forma rutinaria en DMEM con bajo contenido en glucosa (Gibco/Life 35 Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con suero de ternero fetal al 10% (Gibco/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Se realizaron pases de las células de forma rutinaria por tripsinización y dilución cuando alcanzaron 90% de confluencia. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Falcon-Primaria nº 353872, BD Biosciences, Bedford, MA) con una densidad de 7000 células/pocillo para usar en análisis de RT-PCR. Para los análisis de transferencia Northern u otros análisis, las células se pueden sembrar en placas de tejido tisular de 100
40 mm u otras convencionales y tratar de forma similar, usando volúmenes de medio y el oligonucleótido adecuados.
Tratamiento con compuestos antisentido:
Cuando las células alcanzaron 80% de confluencia, se trataron con el oligonucleótido. Para las células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavaron una vez con 200 μl de medio OPTI-MEM™-1 reducido en suero (Gibco BRL) y se trataron con 130 μl de OPTI-MEM™-1 que contenían 3,75 μg/ml de LIPOFECTIN™ (Gibco BRL) y la
45 concentración deseada del oligonucleótido. Después de 4-7 h de tratamiento, el medio se sustituyó por medio de nueva aportación. Las células se recogieron 16-24 h después del tratamiento con oligonucleótido.
La concentración del oligonucleótido usado varía de una línea celular a otra. Para determinar la concentración óptima de oligonucleótido para una línea celular particular, las células se trataron con un oligonucleótido de control positivo en un intervalo de concentraciones. Para células humanas el oligonucleótido de control positivo es ISIS 50 13920, TCCGTCATCGCTCCTCAGGG, SEQ ID NO: 1, un 2'-O-metoxietil-gápmero (los 2'-O-metoxietilos se muestran en negrita) con una cadena principal de fosforotioato que se dirige a H-ras humano. Para células de ratón
o rata el oligonucleótido de control positivo es ISIS 15770, ATGCATTCTGCCCCCAAGGA, SEQ ID NO: 2, un 2'-Ometoxietil-gápmero (los 2'-O-metoxietilo se muestran en negrita) con una cadena principal de fosforotioato que se dirige a c-raf tanto de ratón como de rata. La concentración del oligonucleótido de control positivo que da como
resultado 80% de inhibición del ARNm de c-Ha-ras (para ISIS 13920) o c-raf (para ISIS 15770) se usa entonces como concentración de cribado para nuevos oligonucleótidos en experimentos posteriores para esa línea celular. Si no se alcanza el 80% de inhibición, se usa entonces la concentración más baja del oligonucleótido de control positivo que da como resultado 60% de inhibición del ARNm de H-ras o c-raf, como concentración de cribado de oligonucleótidos en experimentos posteriores para esa línea celular. Si no se alcanza el 60% de inhibición, se considera que esa línea celular particular no es adecuada para los experimentos de transfección de oligonucleótidos. Las concentraciones de oligonucleótidos antisentido usadas en la presente memoria son de 5 nM a 300 nM.
Ejemplo 10
Análisis de la inhibición por el oligonucleótido de la expresión de la apolipoproteína B
La modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B se puede ensayar en una variedad de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ARNm de la apolipoproteína B se pueden cuantificar por, p. ej., análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR en tiempo real (RT-PCR). Actualmente se prefiere la PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en el ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento del ARN se enseñan, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 y 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. El análisis Northern es rutinario en la técnica y se enseña, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. La (PCR) cuantitativa en tiempo real se puede llevar a cabo de forma conveniente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7700 disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA, y usarlo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los niveles de proteína de la apolipoproteína B se pueden cuantificar en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ELISA o separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos contra la apolipoproteína B se pueden identificar y obtener a partir de una variedad de fuentes, tales como el catálogo MSRS de anticuerpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o se pueden preparar por métodos convencionales de generación de anticuerpos. Los métodos para preparar antisueros policlonales se enseñan, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997. La preparación de anticuerpos monoclonales se enseña, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.
Los métodos de inmunoprecipitación son convencionales en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998. El análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) es convencional en la técnica y se puede encontrar, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997. Los ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) son convencionales en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.
Ejemplo 11
Aislamiento de poli(A)+ ARNm
El poli(A)+ ARNm se aisló de acuerdo con Miura et al., Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764. Se enseñan otros métodos de aislamiento de poli(A)+ ARNm, por ejemplo, en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993. Brevemente, para cultivar células en placas de 96 pocillos, se eliminó el medio de crecimiento de las células y cada pocillo se lavó con 200 μl de PBS frío. Se añadieron 60 μl de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM a pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,5%, complejo de vanadil-ribonucleósido 20 mM) a cada pocillo, la placa se agitó suavemente y después se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Se transfirieron 55 μl de lisato a placas de 96 pocillos recubiertas con Oligo d(T) (AGCT Inc., Irvine CA). Las placas se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 μl de tampón de lavado (Tris-HCl 10 mM a pH 7,6, EDTA 1 mM, NaCl 0,3 M). Después del lavado final, la placa se transfirió a toallas de papel para separar el exceso de tampón de lavado y se secaron al aire durante 5 min. Se añadieron a cada pocillos 60 μl de tampón de elución (Tris-HCl 5 mM a pH 7,6), precalentado a 70°C, la placa se incubó en una placa caliente a 90ºC durante 5 min, y después el eluato se transfirió a una placa nueva de 96 pocillos.
Las células cultivadas en placas de 100 mm u otras convencionales se pueden tratar de forma similar, usando volúmenes adecuados de todas las disoluciones.
Ejemplo 12
Aislamiento de ARN total
El ARN total se aisló usando el kit RNEASY 96™ y tampones adquiridos en Qiagen Inc. (Valencia CA) siguiendo los procedimientos descritos por el fabricante. Brevemente, para cultivar células en placas de 96 pocillos, se eliminó el medio de crecimiento de las células y cada pocillo se lavó con 200 μl de PBS frío. Se añadieron 100 μl de tampón RLT a cada pocillo y la placa se agitó enérgicamente durante 20 segundos. Después se añadieron 100 μl de etanol al 70% a cada pocillo y el contenido se mezcló cargando y descargando la pipeta 3 veces. Después las muestras se transfirieron a la placa de 96 pocillos RNEASY 96™ unida a un colector QIAVAC™ equipado con una bandeja de
5 recolección de residuos unida a una fuente de vacío. Se aplicó vacío durante 15 s. Se añadió 1 ml de tampón RW1 a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se volvió a aplicar el vacío durante 15 segundos. Después, se añadió 1 ml de tampón RPE a cada pocillo de la placa RNEASY 96™ y se aplicó el vacío durante un periodo de 15 segundos. Después se repitió el lavado con RPE y se aplicó vacío durante 10 min adicionales. Después se retiró la placa del colector QIAVAC™ y se transfirió en seco sobre toallas de papel. Después, la placa se volvió a unir al colector QIAVAC™ equipado con una rejilla con una rejilla de tubos de recolección que contenía tubos de recolección de 1,2 ml. El ARN después se eluyó añadiendo con pipeta 60 μl de agua en cada pocillo, incubando durante 1 min y después aplicando el vacío durante 30 segundos. La etapa de elución se repitió con 60 μl adicionales de agua.
Las etapas de pipeteo y elución repetitivas se pueden automatizar con un equipo QIAGEN Bio-Robot 9604 (Qiagen, Inc., Valencia CA). Esencialmente, después de la lisis de las células en la placa de cultivo, la placa se transfiere a la
15 plataforma del robot donde se llevan a cabo las etapas de pipeteo, tratamiento con DNasa y elución.
Ejemplo 13
Análisis por PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B
La cuantificación de los niveles de ARNm de apolipoproteína B se determinaron usando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM™ 7700 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este es un sistema de detección de fluorescencia, no basado en gel, en tubo cerrado, que permite la cuantificación de alta capacidad de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. A diferencia de la PCR convencional, en la que los productos de amplificación son cuantificados después de completarse la PCR, los productos en la PCR cuantitativa en tiempo real son cuantificados cuando se acumulan. Esto se lleva a cabo incluyendo en la reacción de la PCR una sonda de oligonucleótido que se reasocia 25 específicamente entre los cebadores de la PCR directo e inverso, y contiene dos colorantes fluorescentes. Un colorante indicador (p. ej., JOE, FAM, o VIC, obtenido de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 5' de la sonda y un colorante atenuador (p. ej., TAMRA, obtenido de Operon Technologies Inc., Alameda, CA o PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) se une al extremo 3' de la sonda. Cuando la sonda y el colorante están intactos, la emisión del colorante indicador es atenuada por la proximidad del colorante atenuador de 3'. Durante la amplificación, la reasociación de la sonda con la secuencia diana crea un sustrato que puede ser escindido por la actividad de 5'-exonucleasa de la polimerasa Taq. Durante la fase de extensión del ciclo de amplificación de la PCR, la escisión de la sonda por la polimerasa Taq libera el colorante indicador del resto de la sonda (y por lo tanto el resto atenuador) y se genera una señal fluorescente específica de la secuencia. Con cada ciclo, son escindidas moléculas indicadoras adicionales de sus respectivas
35 sondas, y se controla la intensidad de la fluorescencia a intervalos regulares mediante óptica láser incorporada en el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7700. En cada ensayo, una serie de reacciones paralelas que contienen diluciones seriadas de ARNm de muestras de control no tratadas genera una curva patrón que se usa para cuantificar el porcentaje de inhibición después del tratamiento de las muestras de ensayo con oligonucleótido antisentido.
Antes del análisis por PCR cuantitativa, se evalúa la capacidad de los conjuntos cebador-sonda específicos para el gen diana que se esta midiendo, para "multiplexar" con una reacción de amplificación de GAPDH. En el multiplexado, tanto el gen diana como el gen de referencia interno GAPDH son amplificados simultáneamente en una sola muestra. En este análisis, el ARNm aislado de células no tratadas se diluye de forma seriada. Cada dilución se amplifica en presencia de conjuntos de cebador-sonda específicos solo para GAPDH, solo para el gen diana
45 ("plexado individual"), o para ambos (multiplexado). Después de la amplificación por PCR, se generan las curvas patrón de la señal de ARNm de GADPH y diana como una función de la dilución, a partir de las muestras tanto de plexado individual como multiplexadas. Si tanto la pendiente como el coeficiente de correlación de las señales de GADPH y de la diana generados a partir de las muestras multiplexadas están dentro del 10% de sus valores correspondientes generados a partir de muestras de plexado individual, el conjunto de cebador-sonda específico para esa diana se considera que se puede multiplexar. También se conocen otros métodos de PCR en la técnica.
Los reactivos de la PCR se obtuvieron de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo añadiendo 25 μl de cóctel de PCR (1x tampón A TAQMAN™, MgCl2 5,5 mM, 300 μM de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, dUTP 600 μM, 100 nM de cada uno del cebador directo, cebador inverso y sonda, 1,25 unidades de AMPLITAQ GOLD™, y 12,5 unidades de transcriptasa inversa MuLV) a placas de 96 pocillos que
55 contenían 25 μl de disolución de ARN total. La reacción en RT se llevó a cabo por incubación durante 30 min a 48°C. Después de una incubación de 10 min a 95ºC para activar la AMPLITAQ GOLD™, se llevaron a cabo 40 ciclos de un protocolo de PCR en dos etapas: 95°C durante 15 segundos (desnaturalización) seguido de 60°C durante 1,5 minutos (reasociación/extensión).
Las cantidades del gen diana obtenidas por la RT-PCR en tiempo real se normalizaron usando el nivel de expresión de GAPDH, un gen cuya expresión es constante, o por cuantificación del ARN total usando RiboGreen™ (Molecular
Probes, Inc. Eugene, OR). La expresión de GAPDH se cuantifica por la RT-PCR en tiempo real, llevándola a cabo simultáneamente con la diana, multiplexado, o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RiboGreen™ de Molecular Probes. Los métodos de cuantificación del ARN por RiboGreen™ se enseñan en Jones, L.J., et al, Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374.
En este ensayo, se añaden mediante pipeta 175 μl de reactivo de trabajo RiboGreen™ (reactivo RiboGreen™ diluido 1:2865 en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, a pH 7,5) a una placa de 96 pocillos que contienen 25 μl de ARN celular purificado. La placa se lee en un aparato CytoFluor 4000 (PE Applied Biosystems) con excitación a 480 nm y emisión a 520 nm.
Las sondas y cebadores para la apolipoproteína B humana se diseñaron para hibridar con una secuencia de apolipoproteína B humana, usando la información de la secuencia publicada (número de acceso en GenBank NM_000384.1, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 3). Para la apolipoproteína B humana los cebadores de la PCR eran: cebador directo: TGCTAAAGGCACATATGGCCT (SEQ ID NO: 4) cebador inverso: CTCAGGTTGGACTCTCCATTGAG (SEQ ID NO: 5) y la sonda de la PCR era: FAM-CTTGTCAGAGGGATCCTAACACTGGCCG-TAMRA (SEQ ID NO: 6) donde FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante atenuador. Para la GAPDH humana los cebadores de la PCR eran: cebador directo: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC (SEQ ID NO: 7) cebador inverso: GAAGATGGTGATGGGATTTC (SEQ ID NO: 8) y la sonda de la PCR era: 5' JOE-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 9) donde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante atenuador.
Las sondas y cebadores para la apolipoproteína B de ratón se diseñaron para hibridar con una secuencia de apolipoproteína B de ratón, usando la información de la secuencia publicada (número de acceso en GenBank M35186, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 10). Para la apolipoproteína B de ratón los cebadores de la PCR eran: cebador directo: CGTGGGCTCCAGCATTCTA (SEQ ID NO: 11) cebador inverso: AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC (SEQ ID NO: 12) y la sonda de la PCR era: FAM-CCAATGGTCGGGCACTGCTCAA-TAMRA SEQ ID NO: 13) donde FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante atenuador. Para la GAPDH de ratón los cebadores de la PCR eran: cebador directo: GGCAAATTCAACGGCACAGT (SEQ ID NO: 14) cebador inverso: GGGTCTCGCTCCTGGAAGAT (SEQ ID NO:15) y la sonda de la PCR era: 5' JOE-AAGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTCATC-TAMRA 3' (SEQ ID NO: 16) donde JOE (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante atenuador.
Ejemplo 14
Análisis de transferencia Northern de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B
Dieciocho horas después del tratamiento antisentido, las monocapas celulares se lavaron dos veces con PBS frío y se lisaron en 1 ml de RNAZOL™ (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). El ARN total se preparó siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Se fraccionaron 20 microgramos de ARN total por electroforesis por geles de agarosa al 1,2% que contenían 1,1% de formaldehído usando un sistema de tampón MOPS (AMRESCO, Inc. Solon, OH). El ARN se transfirió del gel a las membranas de nailon HYBOND™-N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante transferencia capilar durante la noche usando un sistema de tampón de transferencia Northern/Southern (TEL-TEST "B" Inc., Friendswood, TX). La transferencia de ARN se confirmó por visualización UV. Las membranas se fijaron por reticulación UV usando un reticulador UV STRATALINKER™ UV Crosslinker 2400 (Stratagene, Inc, La Jolla, CA) y después se trataron con la sonda usando disolución de hibridación QUICKHYB™ (Stratagene, La Jolla, CA) usando las recomendaciones del fabricante para condiciones restrictivas.
Para detectar la apolipoproteína B humana, se preparó una sonda específica de la apolipoproteína B humana por PCR usando el cebador directo TGCTAAAGGCACATATGGCCT (SEQ ID NO: 4) y el cebador inverso CTCAGGTTGGACTCTCCATTGAG (SEQ ID NO: 5). Para normalizar las variaciones en la eficacia de la carga y transferencia, las membranas se cortaron en tiras y se trataron con sondas para el ARN de la gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humana (Clontech, Palo Alto, CA).
Para detectar la apolipoproteína B de ratón, se preparó una sonda específica de apolipoproteína B humana por PCR usando el cebador directo CGTGGGCTCCAGCATTCTA (SEQ ID NO: 11) y el cebador inverso AGTCATTTCTGCCTTTGCGTC (SEQ ID NO: 12). Para normalizar las variaciones en la eficacia de la carga y transferencia, las membranas se cortaron en tiras y se trataron con sondas para el ARN de la gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa (GAPDH) de ratón (Clontech, Palo Alto, CA).
Las membranas hibridadas se visualizaron y cuantificaron usando el Software fosfoRIMAGER™ y IMAGEQUANT™ V3.3 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Los datos se normalizaron para los niveles de GAPDH en los controles no tratados.
Ejemplo 15
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
Se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigir a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B humana,
5 usando la secuencia publicada (número de acceso en GenBank NM_000384.1, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 3). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 1. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 1 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados
10 (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos en los que las
15 células HepG2 se trataron con los compuestos de la tabla 1 en concentración 150 nM. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 1
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
147780
5'UTR 3 1 CCGCAGGTCCCGGTGGGAAT 40 17
147781
5'UTR 3 21 ACCGAGAAGGGCACTCAGCC 35 18
147782
5'UTR 3 71 GCCTCGGCCTCGCGGCCCTG 67 19
147783
Codón de inicio 3 114 TCCATCGCCAGCTGCGGTGG N.D. 20
147784
Codificante 3 151 CAGCGCCAGCAGCGCCAGCA 70 21
147785
Codificante 3 181 GCCCGCCAGCAGCAGCAGCA 29 22
147786
Codificante 3 321 CTTGAATCAGCAGTCCCAGG 34 23
147787
Codificante 3 451 CTTCAGCAAGGCTTTGCCCT N.D. 24
147788
Codificante 3 716 TTTCTGTTGCCACATTGCCC 95 25
147789
Codificante 3 911 GGAAGAGGTGTTGCTCCTTG 24 26
147790
Codificante 3 951 TGTGCTACCATCCCATACTT 33 27
147791
Codificante 3 1041 TCAAATGCGAGGCCCATCTT N.D. 28
147792
Codificante 3 1231 GGACACCTCAATCAGCTGTG 26 29
147793
Codificante 3 1361 TCAGGGCCACCAGGTAGGTG N.D. 30
147794
Codificante 3 1561 GTAATCTTCATCCCCAGTGC 47 31
147795
Codificante 3 1611 TGCTCCATGGTTTGGCCCAT N.D. 32
147796
Codificante 3 1791 GCAGCCAGTCGCTTATCTCC 8 33
147797
Codificante 3 2331 GTATAGCCAAAGTGGTCCAC N.D. 34
147798
Codificante 3 2496 CCCAGGAGCTGGAGGTCATG N.D. 35
147799
Codificante 3 2573 TTGAGCCCTTCCTGATGACC N.D. 36
147800
Codificante 3 2811 ATCTGGACCCCACTCCTAGC N.D. 37
147801
Codificante 3 2842 CAGACCCGACTCGTGGAAGA 38 38
147802
Codificante 3 3367 GCCCTCAGTAGATTCATCAT N.D. 39
147803
Codificante 3 3611 GCCATGCCACCCTGTTGGAA N.D. 40
147804
Codificante 3 3791 AACCCACGTGCCGGAAAGTC N.D. 41
147805
Codificante 3 3841 AGTCCCAGATGCCTTCTGAA N.D. 42
147806
Codificante 3 4281 ATGTGGTAACGAGCCCGAAG 100 43
147807
Codificante 3 4391 GGCGTAGAGACCGATCACAT 25 44
147808
Codificante 3 4641 GTGTTAGGATCCCTCTGACA N.D. 45
147809
Codificante 3 5241 CCCAGTGATAGCTCTGTGAG 60 46
147810
Codificante 3 5355 ATTTCAGCATATGAGCCCAT 0 47
147811
Codificante 3 5691 CCCTGAACCTTAGCAACAGT N.D. 48
147812
Codificante 3 5742 GCTGAAGCCAGCCCAGCGAT N.D. 49
147813
Codificante 3 5891 ACAGCTGCCCAGTATGTTCT N.D. 50
147814
Codificante 3 7087 CCCAATAAGATTTATAACAA 34 51
147815
Codificante 3 7731 TGGCCTACCAGAGACAGGTA 45 52
147816
Codificante 3 7841 TCATACGTTTAGCCCAATCT 100 53
147817
Codificante 3 7901 GCATGGTCCCAAGGATGGTC 0 54
147818
Codificante 3 8491 AGTGATGGAAGCTGCGATAC 30 55
147819
Codificante 3 9181 ATGAGCATCATGCCTCCCAG N.D. 56
147820
Codificante 3 9931 GAACACATAGCCGAATGCCG 100 57
147821
Codificante 3 10263 GTGGTGCCCTCTAATTTGTA N.D. 58
147822
Codificante 3 10631 CCCGAGAAAGAACCGAACCC N.D. 59
147823
Codificante 3 10712 TGCCCTGCAGCTTGACTGAA 19 60
147824
Codificante 3 11170 GAAATCCCATAAGCTCTTGT N.D. 61
147825
Codificante 3 12301 AGAAGCTGCCTCTTCTTCCC 72 62
147826
Codificante 3 12401 TCAGGGTGAGCCCTGTGTGT 80 63
147827
Codificante 3 12471 CTAATGGCCCCTTGATAAAC 13 64
147828
Codificante 3 12621 ACGTTATCCTTGAGTCCCTG 12 65
147829
Codificante 3 12741 TATATCCCAGGTTTCCCCGG 64 66
147830
Codificante 3 12801 ACCTGGGACAGTACCGTCCC N.D. 67
147831
3'UTR 3 13921 CTGCCTACTGCAAGGCTGGC 0 68
147832
3'UTR 3 13991 AGAGACCTTCCGAGCCCTGG N.D. 69
147833
3'UTR 3 14101 ATGATACACAATAAAGACTC 25 70
Como se muestra en la tabla 1, las SEQ ID NO 17, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 31, 38, 43, 46, 51, 52, 53, 55, 57, 62, 63 y 66 demostraron al menos 30% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo y por lo tanto se prefieren. Los sitios diana de los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "sitios activos" y por lo tanto son sitios preferidos para dirigir los compuestos de la presente
5 descripción. Puesto que la apolipoproteína B existe en dos formas en mamíferos (ApoB-48 y ApoB-100) que son colineales en el extremo amino, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a los nucleótidos 1-6530 hibridan con ambas formas, mientras que los que se dirigen a los nucleótidos 6531-14121 son específicos de la forma larga de la apolipoproteína B.
Ejemplo 16
10 Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Estudio de dosis-respuesta
Un subconjunto de oligonucleótidos antisentido del ejemplo 15 se investigaron más en estudios de dosis y respuesta. Las dosis de tratamiento eran 50, 150 y 250 nM. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 por PCR en tiempo real cuantivativa, como se describe en
15 otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos y se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
Porcentaje de inhibición
nº de ISIS
50 nM 150 nM 250 nM
147788
54 63 72
147806
23 45 28
147816
25 81 65
147820
10 0 73
20 Ejemplo 17
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B de ratón por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
Se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigir a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B de ratón, usando la secuencia publicada (número de acceso en GenBank M35186, incorporada en el presente documento 25 como SEQ ID NO: 10). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 3. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 3 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces
30 internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón en hepatocitos primarios de ratón por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los hepatocitos primarios de ratón se trataron con los compuestos 150 mM de la tabla 3. Los datos son medias de dos experimentos. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 3
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
147475
Codificante 10 13 ATTGTATGTGAGAGGTGAGG 79 71
147476
Codificante 10 66 GAGGAGATTGGATCTTAAGG 13 72
147477
Codificante 10 171 CTTCAAATTGGGACTCTCCT N.D 73
147478
Codificante 10 211 TCCAGGAATTGAGCTTGTGC 78 74
147479
Codificante 10 238 TTCAGGACTGGAGGATGAGG N.D 75
147480
Codificante 10 291 TCTCACCCTCATGCTCCATT 54 76
147481
Codificante 10 421 TGACTGTCAAGGGTGAGCTG 24 77
147482
Codificante 10 461 GTCCAGCCTAGGAACACTCA 59 78
147483
Codificante 10 531 ATGTCAATGCCACATGTCCA N.D 79
147484
Codificante 10 581 TTCATCCGAGAAGTTGGGAC 49 80
147485
Codificante 10 601 ATTTGGGACGAATGTATGCC 64 81
147486
Codificante 10 711 AGTTGAGGAAGCCAGATTCA N.D 82
147487
Codificante 10 964 TTCCCAGTCAGCTTTAGTGG 73 83
147488
Codificante 10 1023 AGCTTGCTTGTTGGGCACGG 72 84
147489
Codificante 10 1111 CCTATACTGGCTTCTATGTT 5 85
147490
Codificante 10 1191 TGAACTCCGTGTAAGGCAAG N.D 86
147491
Codificante 10 1216 GAGAAATCCTTCAGTAAGGG 71 87
147492
Codificante 10 1323 CAATGGAATGCTTGTCACTG 68 88
147493
Codificante 10 1441 GCTTCATTATAGGAGGTGGT 41 89
147494
Codificante 10 1531 ACAACTGGGATAGTGTAGCC 84 90
147495
Codificante 10 1631 GTTAGGACCAGGGATTGTGA 0 91
147496
Codificante 10 1691 ACCATGGAAAACTGGCAACT 19 92
147497
Codificante 10 1721 TGGGAGGAAAAACTTGAATA N.D 93
147498
Codificante 10 1861 TGGGCAACGATATCTGATTG 0 94
147499
Codificante 10 1901 CTGCAGGGCGTCAGTGACAA 29 95
147500
Codificante 10 1932 GCATCAGACGTGATGTTCCC N.D 96
147501
Codificante 10 2021 CTTGGTTAAACTAATGGTGC 18 97
147502
Codificante 10 2071 ATGGGAGCATGGAGGTTGGC 16 98
147503
Codificante 10 2141 AATGGATGATGAAACAGTGG 26 99
147504
Codificante 10 2201 ATCAATGCCTCCTGTTGCAG N.D 100
147505
Codificante 10 2231 GGAAGTGAGACTTTCTAAGC 76 101
147506
Codificante 10 2.281 AGGAAGGAACTCTTGATATT 58 102
147507
Codificante 10 2321 ATTGGCTTCATTGGCAACAC 81 103
147759
Codificante 10 1 AGGTGAGGAAGTTGGAATTC 19 104
147760
Codificante 10 121 TTGTTCCCTGAAGTTGTTAC N.D 105
147761
Codificante 10 251 GTTCATGGATTCCTTCAGGA 45 106
147762
Codificante 10 281 ATGCTCCATTCTCACATGCT 46 107
147763
Codificante 10 338 TGCGACTGTGTCTGATTTCC 34 108
147764
Codificante 10 541 GTCCCTGAAGATGTCAATGC 97 109
147765
Codificante 10 561 AGGCCCAGTTCCATGACCCT 59 110
147766
Codificante 10 761 GGAGCCCACGTGCTGAGATT 59 111
147767
Codificante 10 801 CGTCCTTGAGCAGTGCCCGA 5 112
147768
Codificante 10 1224 CCCATATGGAGAAATCCTTC 24 113
147769
Codificante 10 1581 CATGCCTGGAAGCCAGTGTC 89 114
147770
Codificante 10 1.741 GTGTTGAATCCCTTGAAATC 67 115
147771
Codificante 10 1781 GGTAAAGTTGCCCATGGCTG 68 116
147772
Codificante 10 1841 GTTATAAAGTCCAGCATTGG 78 117
147773
Codificante 10 1931 CATCAGACGTGATGTTCCCT 85 118
147774
Codificante 10 1956 TGGCTAGTTTCAATCCCCTT 84 119
147775
Codificante 10 2002 CTGTCATGACTGCCCTTTAC 52 120
147776
Codificante 10 2091 GCTTGAAGTTCATTGAGAAT 92 121
147777
Codificante 10 2291 TTCCTGAGAAAGGAAGGAAC N.D 122
147778
Codificante 10 2331 TCAGATATACATTGGCTTCA 14 123
Como se muestra en la tabla 3, las SEQ ID No 71, 74, 76, 78, 81, 83, 84, 87, 88, 90, 101, 102, 103, 109, 111, 111, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120 y 121 demostraron al menos 50% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B de ratón en este ensayo y por lo tanto son preferidas. Los sitios diana de los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "sitios activos" y por lo tanto son sitios preferidos para dirigir los compuestos de la presente descripción.
Ejemplo 18
5 Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B de ratón por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Estudio de dosis-respuesta
Un subconjunto de oligonucleótidos antisentido del ejemplo 17 se investigaron más en estudios de dosis y respuesta. Las dosis de tratamiento eran 50, 150 y 300 nM. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón en células hepatocitos primarios por PCR en tiempo real cuantitativa, como
10 se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos y se muestran en la tabla 4.
Tabla 4
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
Porcentaje de inhibición
nº de ISIS
50 nM 50 nM 300 nM
147483
56 88 89
147764
48 84 90
147769
3 14 28
147776
0 17 44
Ejemplo 19
Análisis de transferencia Western de los niveles de la proteína apolipoproteína B
Se llevaron a cabo análisis de transferencia Western (análisis de inmunotransferencia) usando métodos convencionales. Las células se recogieron 16-20 h después del tratamiento con oligonucleótido, se lavaron una vez 20 con PBS, se suspendieron en tampón de Laemmli (100 !l/pocillo), se hirvieron durante 5 min y se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 16%. Los geles se hicieron correr durante 1,5 h a 150 V, y se transfirieron a membrana para la transferencia Western. Se usó el anticuerpo primario adecuado dirigido contra la apolipoproteína B, con un anticuerpo secundario radiomarcado o con marcaje fluorescente dirigido contra el anticuerpo primario. Las bandas se visualizaron usando fosfoRIMAGER™ (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) o el sistema de detección de
25 quimioluminiscente ECL+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
Ejemplo 20
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en ratones C57BL/6: Animales magros frente a animales alimentados con dieta alta en grasa.
Se usaron ratones C57BL/6, una cepa que se ha descrito que es susceptible a la formación de placas
30 ateroscleróticas inducidas por hiperlipidemia, en los siguientes estudios para evaluar los oligonucleótidos antisentido como potenciales compuestos reductores de lípidos en ratones magros frente a alimentados con dieta alta en grasa.
Los ratones C57BL/6 macho se dividieron en dos grupos; (1) animales de control no manipulados genéticamente (animales magros) y (2) animales que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa). Los animales de control recibieron tratamiento salino y se mantuvieron con una dieta normal para roedores. Después de ayunar
35 durante la noche, se administró a los ratones de cada grupo por vía intraperitoneal cada 3 días, disolución salina o ISIS 147764 50 mg/kg (SEQ ID No: 109) durante 6 semanas. Al terminar el estudio y 48 h después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de ARNm diana en el hígado, niveles de colesterol y triglicéridos, niveles de enzimas hepáticas y niveles de glucosa en el suero.
Los resultados de los estudios comparativos se muestran en la tabla 5. Tabla 5 Efectos del tratamiento con ISIS 147764 en los niveles de ARNm de apolipoproteína B, colesterol, lípidos,
triglicéridos, enzimas hepáticas y glucosa, en ratones magros y con dieta alta en grasa.
Grupo de
Porcentaje de cambio
tratamiento
Lipoproteínas Enzimas hepáticas
ARNm
COL. VLDL LDL HDL TRIG. AST ALT GLUC.
Control magros
-73 -63 no hay cambios -64 -44 -34 ligera disminución no hay cambios no hay cambios
Grupo de dieta alta en grasa
-87 -67 no hay cambios -87 -65 no hay cambios ligera disminución ligero aumento -28
Es evidente a partir de estos datos, que el tratamiento con ISIS 147764 disminuyó el colesterol así como las lipoproteínas LDL y HDL y la glucosa en el suero tanto en ratones magros como en los de dieta alta en grasa, y que los efectos demostrados se deben, de hecho, a la inhibición de la expresión de la apolipoproteína B como apoya la disminución de los niveles de ARNm. No se observaron cambios significativos en los niveles de enzimas hepáticas,
10 lo que indica que el oligonucleótido antisentido no era tóxico para ninguno de los grupos de tratamiento.
Ejemplo 21
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en ratones alimentados con dieta alta en grasa; Estudio de la evolución temporal de 6 semanas
Se llevó a cabo un estudio de la evolución temporal de 6 semanas para investigar más los efectos de ISIS 147764 15 en el metabolismo de lípidos y glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasa.
Se evaluó en ratones C57BL/6 macho (n=8) que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa) a lo largo de un periodo de 6 semanas, los efectos del tratamiento con el oligonucleótido antisentido, ISIS 147764. Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina (50 mg/kg). Un subconjunto de animales recibió una dosis oral diaria (20 mg/kg) de atorvastatina de calcio (Lipitor®, Pfizer Inc.). Se administró a todos los ratones, 20 excepto los animales tratados con atorvastatina, por vía intraperitoneal cada 3 días (dos veces por semana), después de la noche en ayunas, 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) o disolución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas. Se analizó el colesterol y las lipoproteínas en el suero en los tiempos de medición intermedios de 0, 2 y 6 semanas. Al terminar el estudio, los animales se sacrificaron 48 h después de las inyecciones finales y se evaluaron los niveles de ARNm diana en el hígado, niveles de colesterol, lipoproteína, triglicéridos, enzimas 25 hepáticas (AST y ALT) y glucosa en el suero, así como los pesos corporal, del hígado, bazo y almohadillas de grasa.
Ejemplo 22
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en ratones alimentados con dieta alta en grasa - expresión de ARNm en el hígado
Se evaluó en ratones C57BL/6 macho (n=8) que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa) a lo largo
30 de un periodo de 6 semanas, los efectos de ISIS 147764 en la expresión de ARNm. Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina (50 mg/kg). Se administró a los ratones por vía intraperitoneal cada 3 días (dos veces por semana) 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) o disolución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas. Al terminar el estudio, los animales se sacrificaron 48 h después de las inyecciones finales y se evaluaron los niveles de ARNm diana en el hígado. ISIS 147764 mostró un efecto de dosis-respuesta, reduciendo
35 los niveles de ARNm en 15, 75 y 88% con dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente.
Las muestras de proteínas hepáticas recogidas al final del periodo de tratamiento se sometieron a análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo dirigido contra la proteínas apolipoproteína B de ratón (Gladstone Institute, San Francisco, CA). Estos datos demuestran que el tratamiento con ISIS 147764 disminuye la expresión de la proteína apolipoproteína B en el hígado, de una forma dependiente de la dosis, además de reducir los niveles de
40 ARNm.
Ejemplo 23
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de colesterol y triglicéridos en el suero
Se evaluó en ratones C57BL/6 macho (n=8) que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa) a lo largo
45 de un periodo de 6 semanas, los efectos de ISIS 147764 en los niveles de colesterol y triglicéridos en el suero. Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina (50 mg/kg). Se administró a los ratones por vía intraperitoneal cada 3 días (dos veces por semana) 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) o disolución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Los niveles de colesterol en el suero se midieron a las 0, 2 y 6 semanas y estos datos se muestran en la tabla 6. Los valores en la tabla se expresan como porcentaje de inhibición y están normalizados respecto al control de disolución 5 salina.
Además del colesterol del suero, al final del estudio, los animales se sacrificaron 48 h después de las inyecciones finales y se evaluaron los niveles de triglicéridos.
Los ratones tratados con ISIS 147764 mostraron una reducción tanto del colesterol en el suero (240 mg/dl para los animales de control y 225, 125 y 110 mg/dl para dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente) como de los
10 triglicéridos (115 mg/dl para animales de control y 125, 150 y 85 mg/dl para dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente) con respecto a los niveles normales al final de estudio. Estos datos también se compararon con los efectos de la atorvastatina de calcio con una dosis oral de 20 mg/kg, que mostró solo una mínima disminución del colesterol en el suero del 20% al terminar el estudio.
Tabla 6
15 Porcentaje de inhibición de la apolipoproteína B en los niveles de colesterol por ISIS 147764
Porcentaje de inhibición
tiempo
Disolución salina 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg
0 semanas
0 0 0 0
2 semanas
0 5 12 20
6 semanas
0 10 45 55
Ejemplo 24
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de lipoproteína
Se evaluó en ratones C57BL/6 macho (n=8) que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa) a lo largo
20 de un periodo de 6 semanas, los efectos de ISIS 147764 en los niveles de lipoproteínas (VLDL, LDL y HDL). Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina (50 mg/kg). Se administró a los ratones por vía intraperitoneal cada 3 días (dos veces por semana) 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) o disolución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Los niveles de lipoproteínas se midieron a las 0, 2 y 6 semanas y estos datos se muestran en la tabla 7. Los valores
25 en la tabla se expresan como porcentaje de inhibición y están normalizados respecto al control de disolución salina. Los valores negativos indican un aumento observado en los niveles de lipoproteínas.
Estos datos también se compararon con los efectos de la atorvastatina de calcio con una dosis oral diaria de 20 mg/kg a las 0, 2 y 6 semanas.
Estos datos demuestran que con una dosis de 50 mg/kg, ISIS 147764 es capaz de reducir todas las categorías de 30 lipoproteínas en el suero investigadas en una mayor extensión que la atorvastatina.
Tabla 7
Porcentaje de inhibición de la apolipoproteína B de ratón por ISIS 147764 en los niveles de lipoproteínas comparado con la atorvastatina
Porcentaje de inhibición
Dosis
Lipoproteína
Tiempo (semanas) disolución salina 5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg atorvastatina (20 mg/kg)
VLDL
0 0 0 0 0 0
2
0 25 30 40 15
6
0 10 -30 15 -5
LDL
0 0 0 0 0 0
2
0 -30 10 40 10
6
0 -10 55 90 -10
HDL
0 0 0 0 0 0
2
0 5 10 10 15
6
0 10 45 50 20
Ejemplo 25
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de AST y ALT en el suero
Se evaluó en ratones C57BL/6 macho (n=8) que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa) a lo largo de un periodo de 6 semanas, los efectos de ISIS 147764 en los niveles de enzimas hepáticas (AST y ALT). Los mayores niveles de las enzimas hepáticas ALT y AST indican toxicidad y daño hepático. Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina (50 mg/kg). Se administró a los ratones por vía intraperitoneal cada 3 días (dos veces por semana) 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) o disolución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas. Los niveles de AST y ALT se midieron a las 6 semanas.
Los ratones tratados con ISIS 147764 no mostraron un cambio significativo en los niveles de AST a lo largo de la duración del estudio comparado con los controles de disolución salina (105, 70 y 80 UI/l para dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente, comparado con 65 UI/l para el control con disolución salina). Los ratones tratados con atorvastatina con una dosis oral diaria de 20 mg/kg tenían niveles de AST de 85 UI/l.
Los niveles de ALT aumentaron con todos los tratamientos con ISIS 147764 a lo largo de la duración del estudio comparado con los controles de disolución salina (50, 70 y 100 UI/l para dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente, comparado con 25 UI/l para controles de disolución salina). Los ratones tratados con atorvastatina con una dosis oral diaria de 20 mg/kg tenían niveles de AST de 40 UI/l.
Ejemplo 26
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en los niveles de glucosa en el suero
Se evaluó en ratones C57BL/6 macho (n=8) que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa) a lo largo de un periodo de 6 semanas, los efectos de ISIS 147764 en los niveles de glucosa en el suero. Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina (50 mg/kg). Se administró a los ratones por vía intraperitoneal cada 3 días (dos veces por semana) 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) o disolución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Al terminar el estudio, los animales se sacrificaron 48 h después de las inyecciones finales y se evaluaron los niveles de glucosa en el suero. ISIS 147764 mostró un efecto de dosis-respuesta, reduciendo los niveles de glucosa en el suero a 225, 190 y 180 mg/dl con dosis de 5, 25 y 50 mg/kg, respectivamente, comparado con el control de disolución salina de 300 mg/dl. Los ratones tratados con atorvastatina con una dosis oral diaria de 20 mg/kg tenían niveles de glucosa en el suero de 215 mg/dl. Estos datos demuestran que ISIS 147764 es capaz de reducir los niveles de glucosa en el suero en ratones alimentados con dieta alta en grasa.
Ejemplo 27
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en el peso corporal, de bazo, hígado y almohadillas de grasa
Se evaluó en ratones C57BL/6 macho (n=8) que recibían una dieta alta en grasa (60% de kcal de grasa) a lo largo de un periodo de 6 semanas, los efectos de ISIS 147764 en el peso corporal, de bazo, hígado y almohadillas de grasa.Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina (50 mg/kg). Se administró a los ratones por vía intraperitoneal cada 3 días (dos veces por semana) 5, 25, 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) o disolución salina (50 mg/kg) durante 6 semanas.
Al terminar el estudio, los animales se sacrificaron 48 h después de las inyecciones finales y se midieron los pesos corporal, de bazo, hígado y almohadillas de grasa. Estos datos se muestran en la tabla 8. Los valores se expresan como porcentaje de cambio en el peso corporal o peso del órgano comparado con los animales de control tratados con disolución salina. Los datos de los ratones tratados con atorvastatina con una dosis diaria de 20 mg/kg también se muestran en la tabla. Los valores negativos indicaban una disminución del peso.
Tabla 8
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B de ratón en el peso corporal y de órganos
Porcentaje de cambio
Dosis
Atorvastatina
Tejido
5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg 20 mg/kg
Peso corporal total
5 5 -4 1
Bazo
10 10 46 10
Hígado
18 70 80 15
Grasa
10 6 -47 7
Estos datos muestran una disminución en la grasa a lo largo del intervalo de dosificación de ISIS 147764 contrarrestado por un aumento tanto del peso del bazo como del hígado con una dosis mayor para dar una disminución general del peso corporal total.
Ejemplo 28
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147764) en ratones que no expresan B6.129P-Apoetm1Unc: Animales magros frente a animales alimentados con dieta alta en grasa.
Los ratones que no expresan B6.129P-ApoEtm1Unc (denominados en la presente memoria ratones que no expresan ApoE) obtenidos de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), son homocigóticos para la mutación Apoetm1Unc y muestran un aumento notable de los niveles totales de colesterol en el plasma que no son afectados por la edad o el sexo. Estos animales presentan estrías grasas en la aorta proximal a la edad de 3 meses. Estas lesiones aumentan con la edad y evolucionan a lesiones con menos lípidos pero células más alargadas, típico de un estadio más avanzado de la lesión preaterosclerótica.
La mutación en estos ratones reside en el gen de la apolipoproteína E (ApoE). La función principal de la proteína ApoE es transportar el colesterol y los triglicéridos por todo el cuerpo. Estabiliza la estructura de las lipoproteínas, se une al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) y proteínas relacionadas, y está presente en una subclase de HDL, proporcionándoles la capacidad para unirse al LDLR. La ApoE es expresada de forma más abundante en el hígado y el cerebro. Se usaron ratones hembra que no expresan B6.129P-Apoetm1Unc (ratones que no expresan ApoE) en los siguientes estudios para evaluar los oligonucleótidos antisentido como potenciales compuestos que reducen los lípidos.
Los ratones hembra que no expresan ApoE tenían edades comprendidas entre 5 y 7 semanas y se pusieron en una dieta normal durante 2 semanas antes de iniciar el estudio. Después, los ratones que no expresan ApoE se alimentaron a voluntad con una dieta con 60% de grasa, con 0,15% de colesterol añadido para inducir dislipidemia y obesidad. Los animales de control se mantuvieron con una dieta alta en grasa sin colesterol añadido. Después de ayunar durante la noche, se administró a los ratones de cada grupo por vía intraperitoneal cada 3 días, disolución salina, 50 mg/kg de un oligonucleótido antisentido de control (ISIS 29837; TCGATCTCCTTTTATGCCCG; SEQ. ID. NO. 124) o 5, 25 ó 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID No: 109) durante 6 semanas.
El oligonucleótido de control es un oligonucleótido quimérico ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuesto de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.
Al terminar el estudio y 48 h después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de ARNm diana en el hígado por métodos de RT-PCR verificado por análisis de transferencia Northern, los niveles de glucosa, niveles de colesterol y lípidos por métodos de separación de HPLC y niveles de triglicéridos y enzimas hepáticas (realizados por LabCorp Preclinical Services; San Diego, CA). Los datos de los ratones que no expresan ApoE tratados con atorvastatina con una dosis diaria de 20 mg/kg, también se muestran en la tabla para comparar.
Los resultados de los estudios comparativos se muestran en la tabla 9. Los datos están normalizados respecto a controles de disolución salina.
Tabla 9
Efectos del tratamiento con ISIS 147764 en los niveles de ARNm de apolipoproteína B, colesterol, glucosa, lípidos, triglicéridos y enzimas hepáticas, en ratones que no expresan ApoE.
Porcentaje de inhibición
Dosis
Control
5 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg atorvastatina (20 mg/kg)
ARNm
0 2 42 70 10
Glucosa
Niveles de glucosa (mg/dl)
225
195 209 191 162
Niveles de colesterol (mg/dl)
Colesterol
1750 1630 1750 1490 938
Niveles de lipoproteínas (mg/dl)
Lipoproteína
HDL 51 49 62 61 42
LDL
525 475 500 325 250
VLDL
1190 1111 1194 1113 653
Niveles de enzimas hepáticas (UI/l)
Enzimas hepáticas
AST 55 50 60 85 75
ALT
56 48 59 87 76
5 Es evidente a partir de estos datos que el tratamiento con ISIS 147764 disminuía la glucosa y el colesterol así como todas las lipoproteínas investigadas (HDL, LDL y VLDL) en los ratones que no expresan ApoE. Además, estas disminuciones se correlacionan con una disminución en los niveles tanto de proteína como de ARN de apolipoproteína B, demostrando un mecanismo de acción de tipo antisentido. No se observaron cambios significativos en los niveles de enzimas hepáticas, lo que indica que el oligonucleótido antisentido no era tóxico para
10 ninguno de los grupos de tratamiento.
Ejemplo 29
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi: Oligonucleótidos adicionales
Se diseñó otra serie de oligonucleótidos para dirigir a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B humana,
15 usando la secuencia publicada (número de acceso en GenBank NM_000384.1, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 3). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 10. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 10 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados
20 (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos en los que las
25 células HepG2 se trataron con los compuestos de la tabla 10 en concentración 150 nM. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 10
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
270985
5'UTR 3 199 TTCCTCTTCGGCCCTGGCGC 75 124
270986
codificante 3 299 CTCCACTGGAACTCTCAGCC 0 125
270987
unión exón: exón 3 359 CCTCCAGCTCAACCTTGCAG 0 126
270988
codificante 3 429 GGGTTGAAGCCATACACCTC 6 127
270989
unión exón: exón 3 509 CCAGCTTGAGCTCATACCTG 64 128
270990
codificante 3 584 CCCTCTTGATGTTCAGGATG 42 129
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
270991
codificante 3 669 GAGCAGTTTCCATACACGGT 21 130
270992
codificante 3 699 CCCTTCCTCGTCTTGACGGT 8 131
270993
codificante 3 756 TTGAAGCGATCACACTGCCC 69 132
270994
codificante 3 799 GCCTTTGATGAGAGCAAGTG 51 133
270995
codificante 3 869 TCCTCTTAGCGTCCAGTGTG 40 134
270996
codificante 3 1179 CCTCTCAGCTCAGTAACCAG 0 135
270997
codificante 3 1279 GCACTGAGGCTGTCCACACT 24 136
270998
codificante 3 1419 CGCTGATCCCTCGCCATGTT 1 137
270999
codificante 3 1459 GTTGACCGCGTGGCTCAGCG 76 138
271000
codificante 3 1499 GCAGCTCCTGGGTCCCTGTA 22 139
271001
codificante 3 1859 CCCATGGTAGAATTTGGACA 53 140
271002
unión exón: exón 3 2179 AATCTCGATGAGGTCAGCTG 48 141
271003
codificante 3 2299 GACACCATCAGGAACTTGAC 46 142
271004
codificante 3 2459 GCTCCTCTCCCAAGATGCGG 10 143
271005
codificante 3 2518 GGCACCCATCAGAAGCAGCT 32 144
271006
codificante 3 2789 AGTCCGGAATGATGATGCCC 42 145
271007
codificante 3 2919 CTGAGCAGCTTGACTGGTCT 26 146
271008
codificante 3 3100 CCCGGTCAGCGGATAGTAGG 37 147
271010
unión exón: exón 3 3449 TGTCACAACTTAGGTGGCCC 57 148
271011
codificante 3 3919 GTCTGGCAATCCCATGTTCT 51 149
271012
codificante 3 4089 CCCACAGACTTGAAGTGGAG 55 150
271013
codificante 3 4579 GAACTGCCCATCAATCTTGA 19 151
271014
codificante 3 5146 CCCAGAGAGGCCAAGCTCTG 54 152
271015
codificante 3 5189 TGTGTTCCCTGAAGCGGCCA 43 153
271016
codificante 3 5269 ACCCAGAATCATGGCCTGAT 19 154
271017
codificante 3 6049 GGTGCCTGTCTGCTCAGCTG 30 155
271018
codificante 3 6520 ATGTGAAACTTGTCTCTCCC 44 156
271019
codificante 3 6639 TATGTCTGCAGTTGAGATAG 15 157
271020
codificante 3 6859 TTGAATCCAGGATGCAGTAC 35 158
271021
codificante 3 7459 GAGTCTCTGAGTCACCTCAC 38 159
271022
codificante 3 7819 GATAGAATATTGCTCTGCAA 100 160
271023
codificante 3 7861 CCCTTGCTCTACCAATGCTT 44 161
271025
codificante 3 8449 TCCATTCCCTATGTCAGCAT 16 162
271026
codificante 3 8589 GACTCCTTCAGAGCCAGCGG 39 163
271027
codificante 3 8629 CCCATGCTCCGTTCTCAGGT 26 164
271028
codificante 3 8829 CGCAGGTCAGCCTGACTAGA 98 165
271030
codificante 3 9119 CAGTTAGAACACTGTGGCCC 52 166
271031
codificante 3 10159 CAGTGTGATGACACTTGATT 49 167
271032
codificante 3 10301 CTGTGGCTAACTTCAATCCC 22 168
271033
codificante 3 10349 CAGTACTGTTATGACTACCC 34 169
271034
codificante 3 10699 CACTGAAGACCGTGTGCTCT 35 170
271035
codificante 3 10811 TCGTACTGTGCTCCCAGAGG 23 171
271036
codificante 3 10839 AAGAGGCCCTCTAGCTGTAA 95 172
271037
codificante 3 11039 AAGACCCAGAATGAATCCGG 23 173
271038
codificante 3 11779 GTCTACCTCAAAGCGTGCAG 29 174
271039
codificante 3 11939 TAGAGGCTAACGTACCATCT 4 175
271041
codificante 3 12149 CCATATCCATGCCCACGGTG 37 176
271042
codificante 3 12265 AGTTTCCTCATCAGATTCCC 57 177
271043
codificante 3 12380 CCCAGTGGTACTTGTTGACA 68 178
271044
codificante 3 12526 CCCAGTGGTGCCACTGGCTG 22 179
271045
codificante 3 12579 GTCAACAGTTCCTGGTACAG 19 180
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
271046
codificante 3 12749 CCCTAGTGTATATCCCAGGT 61 181
271048
codificante 3 13009 CTGAAGATTACGTAGCACCT 7 182
271049
codificante 3 13299 GTCCAGCCAACTATACTTGG 54 183
271050
codificante 3 13779 CCTGGAGCAAGCTTCATGTA 42 184
281586
unión exón: exón 3 229 TGGACAGACCAGGCTGACAT 80 185
281587
codificante 3 269 ATGTGTACTTCCGGAGGTGC 77 186
281588
codificante 3 389 TCTTCAGGATGAAGCTGCAG 80 187
281589
codificante 3 449 TCAGCAAGGCTTTGCCCTCA 90 188
281590
codificante 3 529 CTGCTTCCCTTCTGGAATGG 84 189
281591
codificante 3 709 TGCCACATTGCCCTTCCTCG 90 190
281592
codificante 3 829 GCTGATCAGAGTTGACAAGG 56 191
281593
codificante 3 849 TACTGACAGGACTGGCTGCT 93 192
281594
codificante 3 889 GATGGCTTCTGCCACATGCT 74 193
281595
codificante 3 1059 GATGTGGATTTGGTGCTCTC 76 194
281596
codificante 3 1199 TGACTGCTTCATCACTGAGG 77 195
281597
codificante 3 1349 GGTAGGTGACCACATCTATC 36 196
281598
codificante 3 1390 TCGCAGCTGCTGTGCTGAGG 70 197
281599
unión exón: exón 3 1589 TTCCAATGACCCGCAGAATC 74 198
281600
codificante 3 1678 GATCATCAGTGATGGCTTTG 52 199
281601
codificante 3 1699 AGCCTGGATGGCAGCTTTCT 83 200
281602
codificante 3 1749 GTCTGAAGAAGAACCTCCTG 84 201
281603
codificante 3 1829 TATCTGCCTGTGAAGGACTC 82 202
281604
codificante 3 1919 CTGAGTTCAAGATATTGGCA 78 203
281605
unión exón: exón 3 2189 CTTCCAAGCCAATCTCGATG 82 204
281606
codificante 3 2649 TGCAACTGTAATCCAGCTCC 86 205
281607
unión exón: exón 3 2729 CCAGTTCAGCCTGCATGTTG 84 206
281608
codificante 3 2949 GTAGAGACCAAATGTAATGT 62 207
281609
codificante 3 3059 CGTTGGAGTAAGCGCCTGAG 70 208
281610
unión exón: exón 3 3118 CAGCTCTAATCTGGTGTCCC 69 209
281611
codificante 3 3189 CTGTCCTCTCTCTGGAGCTC 93 210
281612
codificante 3 3289 CAAGGTCATACTCTGCCGAT 83 211
281613
codificante 3 3488 GTATGGAAATAACACCCTTG 70 212
281614
codificante 3 3579 TAAGCTGTAGCAGATGAGTC 63 213
281615
codificante 3 4039 TAGATCTCTGGAGGATTTGC 81 214
281616
codificante 3 4180 GTCTAGAACACCCAGGAGAG 66 215
281617
codificante 3 4299 ACCACAGAGTCAGCCTTCAT 89 216
281618
codificante 3 4511 AAGCAGACATCTGTGGTCCC 90 217
281619
codificante 3 4660 CTCTCCATTGAGCCGGCCAG 96 218
281620
codificante 3 4919 CCTGATATTCAGAACGCAGC 89 219
281621
codificante 3 5009 CAGTGCCTAAGATGTCAGCA 53 220
281622
codificante 3 5109 AGCACCAGGAGACTACACTT 88 221
281623
codificante 3 5212 CCCATCCAGACTGAATTTTG 59 222
281624
codificante 3 5562 GGTTCTAGCCGTAGTTTCCC 75 223
281625
codificante 3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 94 224
281626
codificante 3 5839 ATGTGCATCGATGGTCATGG 88 225
281627
codificante 3 5869 CCAGAGAGCGAGTTTCCCAT 82 226
281628
codificante 3 5979 CTAGACACGAGATGATGACT 81 227
281629
codificante 3 6099 TCCAAGTCCTGGCTGTATTC 83 228
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
281630
codificante 3 6144 CGTCCAGTAAGCTCCACGCC 82 229
281631
codificante 3 6249 TCAACGGCATCTCTCATCTC 88 230
281632
codificante 3 6759 TGATAGTGCTCATCAAGACT 75 231
281633
codificante 3 6889 GATTCTGATTTGGTACTTAG 73 232
281634
codificante 3 7149 CTCTCGATTAACTCATGGAC 81 233
281635
codificante 3 7549 ATACACTGCAACTGTGGCCT 89 234
281636
codificante 3 7779 GCAAGAGTCCACCAATCAGA 68 235
281637
codificante 3 7929 AGAGCCTGAAGACTGACTTC 74 236
281638
codificante 3 8929 TCCCTCATCTGAGAATCTGG 66 237
281640
codificante 3 10240 CAGTGCATCAATGACAGATG 87 238
281641
codificante 3 10619 CCGAACCCTTGACATCTCCT 72 239
281642
codificante 3 10659 GCCTCACTAGCAATAGTTCC 59 240
281643
codificante 3 10899 GACATTTGCCATGGAGAGAG 61 241
281644
codificante 3 11209 CTGTCTCCTACCAATGCTGG 26 242
281645
unión exón: exón 3 11979 TCTGCACTGAAGTCACGGTG 78 243
281646
codificante 3 12249 TCCCGGACCCTCAACTCAGT 76 244
281648
3'UTR 3 13958 GCAGGTCCAGTTCATATGTG 81 245
281649
3'UTR 3 14008 GCCATCCTTCTGAGTTCAGA 76 246
301012
unión exón: exón 3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 87 247
301013
5'UTR 3 3 CCCCGCAGGTCCCGGTGGGA 82 248
301014
5'UTR 3 6 CAGCCCCGCAGGTCCCGGTG 88 249
301015
5'UTR 3 23 CAACCGAGAAGGGCACTCAG 53 250
301016
5'UTR 3 35 CCTCAGCGGCAGCAACCGAG 62 251
301017
5'UTR 3 36 TCCTCAGCGGCAGCAACCGA 47 252
301018
5'UTR 3 37 CTCCTCAGCGGCAGCAACCG 45 253
301019
5'UTR 3 39 GGCTCCTCAGCGGCAGCAAC 70 254
301020
5'UTR 3 43 GGCGGGCTCCTCAGCGGCAG 85 255
301021
5'UTR 3 116 GGTCCATCGCCAGCTGCGGT 89 256
301022
Codón de inicio 3 120 GGCGGGTCCATCGCCAGCTG 69 257
301023
Codón de parada 3 13800 TAGAGGATGATAGTAAGTTC 69 258
301024
3'UTR 3 13824 AAATGAAGATTTCTTTTAAA 5 259
301025
3'UTR 3 13854 TATGTGAAAGTTCAATTGGA 76 260
301026
3'UTR 3 13882 ATATAGGCAGTTTGAATTTT 57 261
301027
3'UTR 3 13903 GCTCACTGTATGGTTTTATC 89 262
301028
3'UTR 3 13904 GGCTCACTGTATGGTTTTAT 93 263
301029
3'UTR 3 13908 GGCTGGCTCACTGTATGGTT 90 264
301030
3'UTR 3 13909 AGGCTGGCTCACTGTATGGT 90 265
301031
3'UTR 3 13910 AAGGCTGGCTCACTGTATGG 90 266
301032
3'UTR 3 13917 CTACTGCAAGGCTGGCTCAC 63 267
301033
3'UTR 3 13922 ACTGCCTACTGCAAGGCTGG 77 268
301034
3'UTR 3 13934 TGCTTATAGTCTACTGCCTA 88 269
301035
3'UTR 3 13937 TTCTGCTTATAGTCTACTGC 82 270
301036
3'UTR 3 13964 TTTGGTGCAGGTCCAGTTCA 88 271
301037
3'UTR 3 13968 CAGCTTTGGTGCAGGTCCAG 90 272
301038
3'UTR 3 13970 GCCAGCTTTGGTGCAGGTCC 86 273
301039
3'UTR 3 13974 TGGTGCCAGCTTTGGTGCAG 73 274
301040
3'UTR 3 13978 GCCCTGGTGCCAGCTTTGGT 74 275
301041
3'UTR 3 13997 GAGTTCAGAGACCTTCCGAG 85 276
301042
3'UTR 3 14012 AAATGCCATCCTTCTGAGTT 81 277
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
301043
3'UTR 3 14014 AAAAATGCCATCCTTCTGAG 81 278
301044
3'UTR 3 14049 AAAATAACTCAGATCCTGAT 76 279
301045
3'UTR 3 14052 AGCAAAATAACTCAGATCCT 90 280
301046
3'UTR 3 14057 AGTTTAGCAAAATAACTCAG 80 281
301047
3'UTR 3 14064 TCCCCCAAGTTTAGCAAAAT 56 282
301048
3'UTR 3 14071 TTCCTCCTCCCCCAAGTTTA 67 283
301217
3'UTR 3 14087 AGACTCCATTTATTTGTTCC 81 284
Ejemplo 30
Inhibición antisentido de la apolipoproteína B - Desplazamiento sobre gen
Se llevó a cabo un "desplazamiento sobre gen" en el que se diseñó otra serie de oligonucleótidos para dirigir a las
5 regiones del ARN de la apolipoproteína B humana (número de acceso en GenBank NM_000384.1, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 3) que están cerca del sitio diana de las SEQ ID No 224 o 247. Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 11. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 11 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco"
10 central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria.
15 Las dosis de tratamiento eran 50 nM y 150 nM y están indicadas en la tabla 11. Los datos son medias de dos experimentos. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 11
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Desplazamiento sobre gen
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. 150 nM % de INHIB. 50 nM SEQ ID NO
308589
unión exón: exón 3 3230 CTTCTGCTTGAGTTACAAAC 94 20 285
308590
unión exón: exón 3 3232 ACCTTCTGCTTGAGTTACAA 98 26 286
308591
unión exón: exón 3 3234 GCACCTTCTGCTTGAGTTAC 92 76 287
308592
unión exón: exón 3 3236 TCGCACCTTCTGCTTGAGTT 96 49 288
308593
unión exón: exón 3 3238 CTTCGCACCTTCTGCTTGAG 80 41 289
308594
unión exón: exón 3 3240 TGCTTCGCACCTTCTGCTTG 88 57 290
308595
unión exón: exón 3 3242 TCTGCTTCGCACCTTCTGCT 82 60 291
308596
unión exón: exón 3 3244 AGTCTGCTTCGCACCTTCTG 94 81 292
308597
unión exón: exón 3 3246 TCAGTCTGCTTCGCACCTTC 91 66 293
308598
unión exón: exón 3 3248 CCTCAGTCTGCTTCGCACCT 85 59 294
308599
unión exón: exón 3 3250 AGCCTCAGTCTGCTTCGCAC 94 79 295
308600
codificante 3 3252 GTAGCCTCAGTCTGCTTCGC 89 72 296
308601
codificante 3 3254 TGGTAGCCTCAGTCTGCTTC 91 63 297
308602
codificante 3 3256 ICATGGTAGCCTCAGTCTGCT 92 83 298
308603
codificante 3 3258 GTCATGGTAGCCTCAGTCTG 97 56 299
308604
codificante 3 3260 ATGTCATGGTAGCCTCAGTC 90 73 300
308605
codificante 3 3262 GAATGTCATGGTAGCCTCAG 81 50 301
308606
codificante 3 3264 TTGAATGTCATGGTAGCCTC 97 54 302
308607
codificante 3 3266 ATTTGAATGTCATGGTAGCC 77 9 303
308608
codificante 3 3268 ATATTTGAATGTCATGGTAG 85 70 304
308609
codificante 3 5582 CAGCCACATGCAGCTTCAGG 96 78 305
308610
codificante 3 5584 ACCAGCCACATGCAGCTTCA 90 40 306
308611
codificante 3 5586 TTACCAGCCACATGCAGCTT 95 59 307
308612
codificante 3 5588 GGTTACCAGCCACATGCAGC 90 75 308
308613
codificante 3 5590 TAGGTTACCAGCCACATGCA 87 43 309
308614
codificante 3 5592 TTTAGGTTACCAGCCACATG 92 74 310
308615
codificante 3 5594 CTTTTAGGTTACCAGCCACA 85 45 311
308616
codificante 3 5596 TCCTTTTAGGTTACCAGCCA 81 39 312
308617
codificante 3 5598 GCTCCTTTTAGGTTACCAGC 87 77 313
308618
codificante 3 5600 AGGCTCCTTTTAGGTTACCA 77 61 314
308619
codificante 3 5602 GTAGGCTCCTTTTAGGTTAC 74 69 315
308620
codificante 3 5604 TGGTAGGCTCCTTTTAGGTT 88 69 316
308621
codificante 3 5606 TTTGGTAGGCTCCTTTTAGG 91 56 317
Como se muestra en las tablas 10 y 11, las SEQ ID No 124, 128, 129, 132, 133, 134, 138, 140, 141, 142, 144, 145, 147, 148, 149, 150, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 172, 176, 177, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228,
229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, y 317 demostraron al menos 5 30% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo y por lo tanto son preferidas. Son más preferidas las SEQ ID No 224, 247 y 262. Las regiones diana de los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "segmentos diana preferidos" y por lo tanto son sitios preferidos para dirigir los compuestos de la presente descripción. Estos segmentos diana preferidos se muestran en la tabla 18. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos mostrados
10 en las tablas 10 y 11. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en el ácido nucleico diana particular, al que se une el oligonucleótido. También se muestran en la tabla 18 las especies en las que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.
Ejemplo 31
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos 15 que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi:Dirigido al número de acceso en GenBank M14162.1
Se diseñó otra serie de oligonucleótidos para dirigir a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B humana, usando la secuencia publicada (número de acceso en GenBank M14162.1, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 318). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 12. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la 20 tabla 12 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la
25 apolipoproteína B humana en células HepG2 por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos en los que las células HepG2 se trataron con los compuestos de la tabla 12 en concentración 150 nM. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 12
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que 30 tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
271009
codificante 318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 75 319
271024
codificante 318 8031 GCTCACTGTTCAGCATCTGG 27 320
271029
codificante 318 8792 TGAGAATCTGGGCGAGGCCC N.D. 321
271040
codificante 318 11880 GTCCTTCATATTTGCCATCT 0 322
271047
codificante 318 12651 CCTCCCTCATGAACATAGTG 32 323
281639
codificante 318 9851 GACGTCAGAACCTATGATGG 38 324
281647
codificante 318 12561 TGAGTGAGTCAATCAGCTTC 73 325
Ejemplo 32
Inhibición antisentido de la apolipoproteína B humana - Desplazamiento sobre gen dirigido al número de acceso en GenBank M14162.1
35 Se llevó a cabo un "desplazamiento sobre gen" en el que se diseñó otra serie de oligonucleótidos para dirigir a las regiones del ARN de la apolipoproteína B humana (número de acceso en GenBank M14162.1, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 318) que están cerca del sitio diana de la SEQ ID NO: 319. Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 13. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 13 son
40 oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana
45 en células HepG2 por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Las dosis de tratamiento eran 50 nM y 150 nM y están indicadas en la tabla 13. Los datos son medias de dos experimentos. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 13
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. 150 nM % de INHIB. 50 nM SEQ ID NO
308622
codificante 318 3104 GCCTTCTGCTTGAGTTACAA 87 25 326
308623
codificante 318 3106 GCGCCTTCTGCTTGAGTTAC 71 62 327
308624
codificante 318 3108 TCGCGCCTTCTGCTTGAGTT 89 69 328
308625
codificante 318 3110 CTTCGCGCCTTCTGCTTGAG 83 64 329
308626
codificante 318 3116 AGTCTGCTTCGCGCCTTCTG 94 38 330
308627
codificante 318 3118 TCAGTCTGCTTCGCGCCTTC 89 67 331
308628
codificante 318 3120 CCTCAGTCTGCTTCGCGCCT 92 61 332
308629
codificante 318 3122 AGCCTCAGTCTGCTTCGCGC 95 77 333
5 Como se muestra en las tablas 12 y 13, las SEQ ID No 319, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, y 333 demostraron al menos 30% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo y por lo tanto son preferidas. Es más preferida la SEQ ID NO: 319. Las regiones diana de los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "segmentos diana preferidos" y por lo tanto son sitios preferidos para dirigir los compuestos de la presente descripción. Estos segmentos diana preferidos
10 se muestran en la tabla 18. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos mostrados en las tablas 12 y 13. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en el ácido nucleico diana particular, al que se une el oligonucleótido. También se muestran en la tabla 18 las especies en las que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.
Ejemplo 33
15 Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Dirigido a la secuencia genómica
Se diseñó otra serie de oligonucleótidos para dirigir a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B humana, usando la secuencia publicada (el complemento de los nucleótidos 39835 a 83279 de la secuencia con número de acceso a GenBank NT_022227.9, que representa una secuencia genómica, incorporada en la presente memoria 20 como SEQ ID NO: 334). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 14. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 14 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces
25 internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos en los que las células HepG2 se trataron con los oligonucleótidos 150 nM de la tabla 14. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
30 Tabla 14
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
301049
unión intrón:exón 334 904 TCTGTAAGACAGGAGAAAGA 41 335
301050
unión intrón:exón 334 913 ATTTCCTCTTCTGTAAGACA 22 336
301051
unión exón:intrón 334 952 GATGCCTTACTTGGACAGAC 27 337
301052
intrón 334 1945 AGAAATAGCTCTCCCAAGGA 13 338
301053
unión intron:exón 334 1988 GTCGCATCTTCTAACGTGGG 45 339
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
301054
unión exón:intrón 334 2104 TCCTCCATACCTTGCAGTTG 0 340
301055
intrón 334 2722 TGGCTCATGTCTACCATATT 49 341
301056
intrón 334 2791 CAGTTGAAATGCAGCTAATG 35 342
301057
intrón 334 3045 TGCAGACTAGGAGTGAAAGT 30 343
301058
intrón 334 3117 AGGAGGATGTCCTTTTATTG 27 344
301059
intrón 334 3290 ATCAGAGCACCAAAGGGAAT 12 345
301060
unión intrón:exón 334 3381 CCAGCTCAACCTGAGAATTC 17 346
301061
unión exón:intrón 334 3527 CATGACTTACCTGGACATGG 52 347
301062
intrón 334 3566 CCTCAGCGGACACACACACA 21 348
301063
intrón 334 3603 GTCACATCCGTGCCTGGTGC 41 349
301064
intrón 334 3864 CAGTGCCTCTGGGACCCCAC 60 350
301065
intrón 334 3990 AGCTGCAGTGGCCGATCAGC 50 351
301066
intrón 334 4251 GACCTCCCCAGCCACGTGGA 61 352
301067
intrón 334 4853 TCTGATCACCATACATTACA 45 353
301068
intrón 334 5023 ATTTCCCACTGGGTACTCTC 44 354
301069
intrón 334 5055 GGCTGAAGCCCATGCTGACT 44 355
301070
intrón 334 5091 GTTGGACAGTCATTCTTTTG 38 356
301071
intrón 334 5096 CACTTGTTGGACAGTCATTC 48 357
301072
intrón 334 5301 ATTTTAAATTACAGTAGATA 43 358
301073
intrón 334 5780 CTGTTCTCCACCCATATCAG 37 359
301074
unión intrón:exón 334 6353 GAGCTCATACCTGTCCCAGA 75 360
301075
intrón 334 6534 TTCAAGGGCCACTGCTATCA 52 361
301076
intrón 334 6641 CCAGTATTTCACGCCAATCC 36 362
301077
intrón 334 6661 GGCAGGAGGAACCTCGGGCA 55 363
301078
intrón 334 6721 TTTTAAAATTAGACCCAACC 22 364
301079
intrón 334 6727 TGACTGTTTTAAAATTAGAC 20 365
301080
intrón 334 6788 CCCAGCAAACACAGGTGAAG 25 366
301081
intrón 334 7059 GAGTGTGGTCTTGCTAGTGC 46 367
301082
intrón 334 7066 CTATGCAGAGTGTGGTCTTG 41 368
301083
intrón 334 7189 AGAAGATGCAACCACATGTA 29 369
301084
unión intrón:exón 334 7209 ACACGGTATCCTATGGAGGA 49 370
301085
unión exón:intrón 334 7365 TGGGACTTACCATGCCTTTG 11 371
301086
intrón 334 7702 GGTTTTGCTGCCCTACATCC 30 372
301087
intrón 334 7736 ACAAGGAGTCCTTGTGCAGA 40 373
301088
intrón 334 8006 ATGTTCACTGAGACAGGCTG 41 374
301089
intrón 334 8215 GAAGGTCCATGGTTCATCTG 0 375
301090
intrón 334 8239 ATTAGACTGGAAGCATCCTG 39 376
301091
intrón 334 8738 GAGATTGGAGACGAGCATTT 35 377
301092
unión exón:intrón 334 8881 CATGACCTACTTGTAGGAGA 22 378
301093
intrón 334 9208 TGGATTTGGATACACAAGTT 42 379
301094
intrón 334 9244 ACTCAATATATATTCATTGA 22 380
301095
intrón 334 9545 CAAGGAAGCACACCATGTCA 38 381
301096
unión intrón:exón 334 9563 ATACTTATTCCTGGTAACCA 24 382
301097
intrón 334 9770 GGTAGCCAGAACACCAGTGT 50 383
301098
intrón 334 9776 ACTAGAGGTAGCCAGAACAC 34 384
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
301099
intrón 334 10149 ACCACCTGACATCACAGGTT 24 385
301100
intrón 334 10341 TACTGTGACCTATGCCAGGA 55 386
301101
intrón 334 10467 GGAGGTGCTACTGTTGACAT 42 387
301102
intrón 334 10522 TCCAGACTTGTCTGAGTCTA 47 388
301103
intrón 334 10547 TCTAAGAGGTAGAGCTAAAG 7 389
301104
intrón 334 10587 CCAGAGATGAGCAACTTAGG 38 390
301105
intrón 334 10675 GGCCATGTAAATTGCTCATC 7 391
301106
intrón 334 10831 AAAGAAACTATCCTGTATTC 12 392
301107
unión intrón:exón 334 10946 TTCTTAGTACCTGGAAGATG 23 393
301108
unión exón:intrón 334 11166 CATTAGATACCTGGACACCT 29 394
301109
intrón 334 11337 GTTTCATGGAACTCAGCGCA 44 395
301110
intrón 334 11457 CTGGAGAGCACCTGCAATAG 35 396
301111
intrón 334 11521 TGAAGGGTAGAGAAATCATA 9 397
301112
unión exón:intrón 334 12111 GGAAACTCACTTGTTGACCG 25 398
301113
intrón 334 12155 AGGTGCAAGATGTTCCTCTG 46 399
301114
intrón 334 12162 TGCACAGAGGTGCAAGATGT 16 400
301115
intrón 334 12221 CACAAGAGTAAGGAGCAGAG 39 401
301116
intrón 334 12987 GATGGATGGTGAGAAATTAC 33 402
301117
intrón 334 13025 TAGACAATTGAGACTCAGAA 39 403
301118
intrón 334 13057 ATGTGCACACAAGGACATAG 33 404
301119
intrón 334 13634 ACATACAAATGGCAATAGGC 33 405
301120
intrón 334 13673 TAGGCAAAGGACATGAATAG 30 406
301121
codificante 334 14448 TTATGATAGCTACAGAATAA 29 407
301122
unión exón:intrón 334 14567 CTGAGATTACCCGCAGAATC 32 408
301123
intrón 334 14587 GATGTATGTCATATAAAAGA 26 409
301124
unión intrón:exón 334 14680 TTTCCAATGACCTGCATTGA 48 410
301125
intrón 334 15444 AGGGATGGTCAATCTGGTAG 57 411
301126
intrón 334 15562 GGCTAATAAATAGGGTAGTT 22 412
301127
intrón 334 15757 TCCTAGAGCACTATCAAGTA 41 413
301128
unión intrón:exón 334 15926 CCTCCTGGTCCTGCAGTCAA 56 414
301129
intrón 334 16245 CATTTGCACAAGTGTTTGTT 35 415
301130
intrón 334 16363 CTGACACACCATGTTATTAT 10 416
301131
unión intrón:exón 334 16399 CTTTTTCAGACTAGATAAGA 0 417
301132
unión exón:intrón 334 16637 TCACACTTACCTCGATGAGG 29 418
301133
intrón 334 17471 AAGAAAATGGCATCAGGTTT 13 419
301134
unión intrón:exón 334 17500 CCAAGCCAATCTGAGAAAGA 25 420
301135
unión exón:intrón 334 17677 AAATACACACCTGCTCATGT 20 421
301136
unión exón:intrón 334 17683 CTTCACAAATACACACCTGC 20 422
301137
intrón 334 18519 AGTGGAAGTTTGGTCTCATT 41 423
301138
intrón 334 18532 TTGCTAGCTTCAAAGTGGAA 44 424
301139
intrón 334 18586 TCAAGAATAAGCTCCAGATC 41 425
301140
intrón 334 18697 GCATACAAGTCACATGAGGT 34 426
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
301141
intrón 334 18969 TACAAGGTGTTTCTTAAGAA 38 427
301142
intrón 334 19250 ATGCAGCCAGGATGGGCCTA 54 428
301143
unión intrón:exón 334 19340 TTACCATATCCTGAGAGTTT 55 429
301144
intrón 334 19802 GCAAAGGTAGAGGAAGGTAT 32 430
301145
intrón 334 19813 AAGGACCTTCAGCAAAGGTA 36 431
301146
intrón 334 20253 CATAGGAGTACATTTATATA 23 432
301147
intrón 334 20398 ATTATGATAAAATCAATTTT 19 433
301148
intrón 334 20567 AGAAATTTCACTAGATAGAT 31 434
301149
intrón 334 20647 AGCATATTTTGATGAGCTGA 44 435
301150
intrón 334 20660 GAAAGGAAGGACTAGCATAT 39 436
301151
unión intrón:exón 334 20772 CCTCTCCAATCTGTAGACCC 28 437
301152
intrón 334 21316 CTGGATAACTCAGACCTTTG 40 438
301153
intrón 334 21407 AGTCAGAAAACAACCTATTC 11 439
301154
unión intrón:exón 334 21422 CAGCCTGCATCTATAAGTCA 31 440
301155
unión exón:intrón 334 21634 AAAGAATTACCCTCCACTGA 33 441
301156
intrón 334 21664 TCTTTCAAACTGGCTAGGCA 39 442
301157
intrón 334 21700 GCCTGGCAAAATTCTGCAGG 37 443
301158
intrón 334 22032 CTACCTCAAATCAATATGTT 28 444
301159
intrón 334 22048 TGCTTTACCTACCTAGCTAC 36 445
301160
intrón 334 22551 ACCTTGTGTGTCTCACTCAA 49 446
301161
intrón 334 22694 ATGCATTCCCTGACTAGCAC 34 447
301162
intrón 334 22866 CATCTCTGAGCCCCTTACCA 24 448
301163
intrón 334 22903 GCTGGGCATGCTCTCTCCCC 51 449
301164
intrón 334 22912 GCTTTCGCAGCTGGGCATGC 55 450
301165
intrón 334 23137 ACTCCTTTCTATACCTGGCT 47 451
301166
intrón 334 23170 ATTCTGCCTCTTAGAAAGTT 38 452
301167
intrón 334 23402 CCAAGCCTCTTTACTGGGCT 29 453
301168
intrón 334 23882 CACTCATGACCAGACTAAGA 35 454
301169
intrón 334 23911 ACCTCCCAGAAGCCTTCCAT 22 455
301170
intrón 334 24184 TTCATATGAAATCTCCTACT 40 456
301171
intrón 334 24425 TATTTAATTTACTGAGAAAC 7 457
301172
unión intrón:exón 334 24559 TAATGTGTTGCTGGTGAAGA 35 458
301173
unión exón:intrón 334 24742 CATCTCTAACCTGGTGTCCC 21 459
301174
intrón 334 24800 GTGCCATGCTAGGTGGCCAT 37 460
301175
intrón 334 24957 AGCAAATTGGGATCTGTGCT 29 461
301176
intrón 334 24991 TCTGGAGGCTCAGAAACATG 57 462
301177
intrón 334 25067 TCAAGACAGGAGCCACCTA 40 463
301178
intrón 334 25152 AGGATTCCCAAGACTTTGGA 38 464
301179
unión intrón:exón 334 25351 CAGCTCTAATCTAAAGACAT 22 465
301180
unión exón:intrón 334 25473 GAATACTCACCTTCTGCTTG 6 466
301181
intrón 334 26047 ATCTCTCTGTCCTCATCTTC 28 467
301182
intrón 334 26749 CCAACTCCCCCTTTCTTTGT 37 468
301183
intrón 334 26841 TCTGGGCCAGGAAGACACGA 68 469
301184
intrón 334 27210 TATTGTGTGCTGGGCACTGC 52 470
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
301185
unión intrón:exón 334 27815 TGCTTCGCACCTGGACGAGT 51 471
301186
unión exón:intrón 334 28026 CCTTCTTTACCTTAGGTGGC 37 472
301187
intrón 334 28145 GCTCTCTCTGCCACTCTGAT 47 473
301188
intrón 334 28769 AACTTCTAAAGCCAACATTC 27 474
301189
unión intrón:exón 334 28919 TGTGTCACAACTATGGTAAA 63 475
301190
unión exón:intrón 334 29095 AGACACATACCATAATGCCA 22 476
301191
unión intrón:exón 334 29204 TTCTCTTCATCTGAAAATAC 21 477
301192
intrón 334 29440 TGAGGATGTAATTAGCACTT 27 478
301193
unión intrón:exón 334 29871 AGCTCATTGCCTACAAAATG 31 479
301194
intrón 334 30181 GTTCTCATGTTTACTAATGC 40 480
301195
intrón 334 30465 GAATTGAGACAACTTGATTT 26 481
301196
unión intrón:exón 334 30931 CCGGCCATCGCTGAAATGAA 54 482
301197
unión exón:intrón 334 31305 CATAGCTCACCTTGCACATT 28 483
301198
intrón 334 31325 CGGTGCACCCTTTACCTGAG 28 484
301199
unión intrón:exón 334 31813 TCTCCAGATCCTAACATAAA 19 485
301200
intrón 334 39562 TTGAATGACACTAGATTTTC 37 486
301201
intrón 334 39591 AAAATCCATTTTCTTTAAAG 12 487
301202
intrón 334 39654 CAGCTCACACTTATTTTAAA 7 488
301203
unión intrón:exón 334 39789 GTTCCCAAAACTGTATAGGA 36 489
301204
unión exón:intrón 334 39904 AGCTCCATACTGAAGTCCTT 37 490
301205
intrón 334 39916 CAATTCAATAAAAGCTCCAT 31 491
301206
intrón 334 39938 GTTTTCAAAAGGTATAAGGT 28 492
301207
unión intrón:exón 334 40012 TTCCCATTCCCTGAAAGCAG 13 493
301208
unión exón:intrón 334 40196 TGGTATTTACCTGAGGGCTG 21 494
301209
intrón 334 40412 ATAAATAATAGTGCTGATGG 39 495
301210
intrón 334 40483 CTATGGCTGAGCTTGCCTAT 33 496
301211
intrón 334 40505 CTCTCTGAAAAATATACCCT 17 497
301212
intrón 334 40576 TTGATGTATCTCATCTAGCA 41 498
301213
intrón 334 40658 TAGAACCATGTTTGGTCTTC 35 499
301214
intrón 334 40935 TTTCTCTTTATCACATGCCC 29 500
301215
intrón 41066 TATAGTACATAAAACTTCA 1 501
301216
unión intrón:exón 334 41130 CTGGAGAGGACTAAACAGAG 49 502
Como se muestra en la tabla 14, las SEQ ID No 335, 339, 341, 342, 343, 347, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 367, 368, 370, 372, 373, 374, 376, 377, 379, 381, 383, 384, 386, 387, 388, 390, 395, 396, 399, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 408, 410, 411, 413, 414, 415, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 434, 435, 436, 438, 440, 441, 442, 443, 445, 446, 447, 449, 450, 451, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 463, 464, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 475, 479, 480, 482, 486, 489, 490, 491, 495, 496, 498, 499, y 502 demostraron al menos 30% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo, y por lo tanto son preferidas. Las regiones diana de los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "segmentos diana preferidos" y por lo tanto son preferidos para dirigir los compuestos de la presente descripción. Estos segmentos diana preferidos se muestran en la tabla 18. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos mostrados en la tabla 14. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en el ácido nucleico diana particular, al que se une el oligonucleótido.
5 También se muestran en la tabla 18 las especies en las que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.
Ejemplo 34
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Dirigido al número de acceso en GenBank AI249040.1
10 Se diseñó otra serie de oligonucleótidos para dirigir a diferentes regiones diana del ARN de la apolipoproteína B humana, usando la secuencia publicada (el complemento de la secuencia con número de acceso en GenBank AI249040.1, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 503). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 15. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 15 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20
15 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana en células HepG2 por PCR en tiempo real
20 cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos en los que las células HepG2 se trataron con los oligonucleótidos 150 nM de la tabla 15. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 15
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que 25 tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
REGIÓN SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
301218
3'UTR 503 484 ACATTTTATCAATGCCCTCG 23 504
301219
3'UTR 503 490 GCCAGAACATTTTATCAATG 35 505
301220
3'UTR 503 504 AGAGGTTTTGCTGTGCCAGA 51 506
301221
3'UTR 503 506 CTAGAGGTTTTGCTGTGCCA 61 507
301222
3'UTR 503 507 TCTAGAGGTTTTGCTGTGCC 14 508
301223
3'UTR 503 522 AATCACACTATGTGTTCTAG 26 509
301224
3'UTR 503 523 AAATCACACTATGTGTTCTA 33 510
301225
3'UTR 503 524 TAAATCACACTATGTGTTCT 3 511
301226
3'UTR 503 526 CTTAAATCACACTATGTGTT 39 512
301227
3'UTR 503 536 TATTCTGTTACTTAAATCAC 23 513
Como se muestra en la tabla 15, las SEQ ID No 505, 506, 507, 510, y 512 demostraron al menos 30% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo y por lo tanto son preferidas. Las regiones diana de los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "segmentos
30 diana preferidos" y por lo tanto son sitios preferidos para dirigir los compuestos de la presente descripción. Estos segmentos diana preferidos se muestran en la tabla 18. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos mostrados en la tabla 15. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en el ácido nucleico diana particular, al que se une el oligonucleótido. También se muestran en la tabla 18 las especies en las que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.
35 Ejemplo 35
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Variación en la posición del hueco
Se diseñó una serie de compuestos antisentido para dirigir a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B humana, usando secuencias publicadas (número de acceso en GenBank NM_000384.1, incorporada en el presente 40 documento como SEQ ID NO: 3). Los compuestos se muestran en la Tabla 16. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 16 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud. La región de "hueco" consiste en 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" compuestas de 2'metoxietil (2'-MOE)nucleótidos. El número de 2'-MOE-nucleótidos en cada lado del hueco varía de modo que el número total de 2'-MOE-nucleótidos es siempre igual a 10 y la longitud total del oligonucleótido quimérico es 20 nucleótidos. La estructura exacta de cada oligonucleótido se designa en la tabla 16 como "estructura del hueco" y los 2'-desoxinucleótidos están en negrilla. Una designación de 8-10-2, por ejemplo, indica que los primeros (los más 5') 5 8 nucleótidos y los últimos (los más 3') 2 nucleótidos son 2'-MOE-nucleótidos y los 10 nucleótidos en el hueco son 2'desoxinucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos mostrados en la tabla 16 son medias de tres experimentos en los
10 que se trataron células HepG2 con oligonucleótidos antisentido de la presente descripción con dosis de 50 nM y 150 nM. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 16
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi variable
nº de ISIS
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. 150 nM % de INHIB. 50 nM estructura del hueco SEQ ID NO
308631
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG. 94 74 0∼10∼10 224
308632
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 97 41 0∼10∼10 247
308634
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 67 45 10~10~0 224
308635
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 93 69 10~10~0 247
308637
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 95 79 1∼10∼9 224
308638
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 94 91 1~10~9 247
308640
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 96 76 2~10~8 224
308641
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 89 77 2∼10∼8 247
308643
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG. 96 56 3~10~7 224
308644
3 3249 GCCTCAGTCTCCTTCGCACC: 93 71 3∼10∼7 247
308646
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 76 50 4∼10∼6 224
308647
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 86 53 4~10~6 247
308649
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 91 68 6∼10∼4 224
308650
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 94 74 6~10~4 247
308652
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 95 73 7∼10∼3 224
308653
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 89 73 7∼10∼3 247
308655
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 83 84 8∼10∼2 224
308656
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 97 37 8~10~2 247
308658
3 5589 AGGTTACCAGCCACATGCAG 78 86 9∼10∼1 224
308659
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 93 70 9∼10∼1 247
308660
3 3254 TGGTAGCCTCAGTCTGCTTC 92 72 2~10~8 514
308662
3 3254 TGGTAGCCTCAGTCTGCTTC 83 76 8~10~2 514
Como se muestra en la tabla 16, las SEQ ID No 224, 247 y 514 demostraron al menos 30% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo con ambas dosis. Estos datos sugieren que los oligonucleótidos son eficaces con una serie de variaciones en la situación del hueco. Las regiones diana de los que 5 estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "segmentos diana preferidos" y por lo tanto son sitios preferidos para dirigir los compuestos de la presente descripción. Estos segmentos diana preferidos se muestran en la tabla 18. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos mostrados en la tabla 16. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en el ácido nucleico diana particular, al que se une el oligonucleótido. También se muestran en la tabla 18
10 las especies en las que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.
Ejemplo 36
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Variación en la posición del hueco de las SEQ ID No: 319 y 515
Se diseñaron una serie de compuestos antisentido basados en las SEQ ID No 319 y 515, con variaciones en la
15 estructura del hueco. Los compuestos se muestran en la Tabla 17. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el compuesto. Todos los compuestos de la tabla 17 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud. La región de "hueco" consiste en 2'desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" compuestas de 2'-metoxietil (2'-MOE)nucleótidos. El número de 2'-MOE-nucleótidos en cada lado del hueco varía de modo que el número total
20 de 2'-MOE-nucleótidos es siempre igual a 10 y la longitud total del oligonucleótido quimérico es 20 nucleótidos. La estructura exacta de cada oligonucleótido se designa en la tabla 17 como "estructura del hueco" y los 2'desoxinucleótidos están en negrilla. Una designación de 8-10-2, por ejemplo, indica que los primeros (los más 5') 8 nucleótidos y los últimos (los más 3') 2 nucleótidos son 2'-MOE-nucleótidos y los 10 nucleótidos en el hueco son 2'desoxinucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos mostrados en la tabla 17 son medias de tres experimentos en los que se trataron células HepG2 con oligonucleótidos antisentido de la presente descripción con dosis de 50 nM y 150 nM. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
Tabla 17
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi variable
nº de ISIS
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. 150 nM % de INHIB. 50 nM estructura del hueco SEQ ID NO
308630
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 89 69 0~10~10 319
30863
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 83 66 10∼10~0 319
308636
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 91 81 1~10~9 319
308639
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 94 86 2~10~8 319
308642
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 95 85 3~10∼7 319
308645
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 98 57 4~20~6 319
308648
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 89 78 6~10~4 319
308651
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 88 87 7~10~3 319
308654
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 90 81 8~10~2 319
308657
318 3121 GCCTCAGTCTGCTTCGCGCC 78 61 9~10~1 319
308661
318 3116 AGTCTGCTTCGCGCCTTCTG 91 70 2~10~8 515
308663
318 3116 AGTCTGCTTCGCGCCTTCTG 84 44 8~10∼2 515
10 Como se muestra en la tabla 17, las SEQ ID No , 319 y 515 demostraron al menos 44% de inhibición de la expresión de la apolipoproteína B humana en este ensayo para cualquiera de las dosis. Estos datos sugieren que los compuestos son eficaces con una serie de variaciones en la situación del hueco. Las regiones diana de los que estas secuencias preferidas son complementarias se denominan en el presente documento "segmentos diana preferidos" y por lo tanto son sitios preferidos para dirigir los compuestos de la presente descripción. Estos
15 segmentos diana preferidos se muestran en la tabla 18. Las secuencias representan el complemento inverso de los compuestos antisentido preferidos mostrados en la tabla 17. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en el ácido nucleico diana particular, al que se une el oligonucleótido. También se muestran en la tabla 18 las especies en las que se encontraron cada uno de los segmentos diana preferidos.
Tabla 18
20 Secuencia y posición de los segmentos diana preferidos identificados en la apolipoproteína B.
ID DE SITIO
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA COMP. INV DE SEQ ID NO ACTIVO EN SEQ ID NO
187342
3 199 GCGCCAGGGCCGAAGAGGAA 124 H. sapiens 516
187346
3 509 CAGGTATGAGCTCAAGCTGG 128 H. sapiens 517
187347
3 584 CATCCTGAACATCAAGAGGG 129 H. sapiens 518
187350
3 756 GGGCAGTGTGATCGCTTCAA 132 H. sapiens 519
187351
3 799 CACTTGCTCTCATCAAAGGC 133 H. sapiens 520
ID DE SITIO
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA COMP. INV DE SEQ ID NO ACTIVO EN SEQ ID NO
187352
3 869 CACACTGGACGCTAAGAGGA 134 H. sapiens 521
187356
3 1459 CGCTGAGCCACGCGGTCAAC 138 H. sapiens 522
187358
3 1859 TGTCCAAATTCTACCATGGG 140 H. sapiens 523
187359
3 2179 CAGCTGACCTCATCGAGATT 141 H. sapiens 524
187360
3 2299 GTCAAGTTCCTGATGGTGTC 142 H. sapiens 525
187362
3 2518 AGCTGCTTCTGATGGGTGCC 144 H. sapiens 526
187363
3 2789 GGGCATCATCATTCCGGACT 145 H. sapiens 527
187365
3 3100 CCTACTATCCGCTGACCGGG 147 H. sapiens 528
187367
3 3449 GGGCCACCTAAGTTGTGACA 148 H. sapiens 529
187368
3 3919 AGAACATGGGATTGCCAGAC 149 H. sapiens 530
187369
3 4089 CTCCACTTCAAGTCTGTGGG 150 H. sapiens 531
187371
3 5146 CAGAGCTTGGCCTCTCTGGG 152 H. sapiens 532
187372
3 5189 TGGCCGCTTCAGGGAACACA 153 H. sapiens 533
187374
3 6049 CAGCTGAGCAGACAGGCACC 155 H. sapiens 534
187375
3 6520 GGGAGAGACAAGTTTCACAT 156 H. sapiens 535
187377
3 6859 GTACTGCATCCTGGATTCAA 158 H. sapiens 536
187378
3 7459 GTGAGGTGACTCAGAGACTC 159 H. sapiens 537
187379
3 7819 TTGCAGAGCAATATTCTATC 160 H. sapiens 538
187380
3 7861 AAGCATTGGTAGAGCAAGGG 161 H. sapiens 539
187383
3 8589 CCGCTGGCTCTGAAGGAGTC 163 H. sapiens 540
187385
3 8829 TCTAGTCAGGCTGACCTGCG 165 H. sapiens 541
187387
3 9119 GGGCCACAGTGTTCTAACTG 166 H. sapiens 542
187388
3 10159 AATCAAGTGTCATCACACTG 167 H. sapiens 543
187390
3 10349 GGGTAGTCATAACAGTACTG 169 H. sapiens 544
187391
3 10699 AGAGCACACGGTCTTCAGTG 170 H. sapiens 545
187393
3 10839 TTACAGCTAGAGGGCCTCTT 172 H. sapiens 546
187398
3 12149 CACCGTGGGCATGGATATGG 176 H. sapiens 547
187399
3 12265 GGGAATCTGATGAGGAAACT 177 H. sapiens 548
187400
3 12380 TGTCAACAAGTACCACTGGG 178 H. sapiens 549
187403
3 12749 ACCTGGGATATACACTAGGG 181 H. sapiens 550
187406
3 13299 CCAAGTATAGTTGGCTGGAC 183 H. sapiens 551
187407
3 13779 TACATGAAGCTTGCTCCAGG 184 H. sapiens 552
197724
3 229 ATGTCAGCCTGGTCTGTCCA 185 H. sapiens 553
197725
3 269 GCACCTCCGGAAGTACACAT 186 H. sapiens 554
197726
3 389 CTGCAGCTTCATCCTGAAGA 187 H. sapiens 555
197727
3 449 TGAGGGCAAAGCCTTGCTGA 188 H. sapiens 556
197728
3 529 CCATTCCAGAAGGGAAGCAG 189 H. sapiens 557
197729
3 709 CGAGGAAGGGCAATGTGGCA 190 H. sapiens 558
197730
3 829 CCTTGTCAACTCTGATCAGC 191 H. sapiens 559
197731
3 849 AGCAGCCAGTCCTGTCAGTA 192 H. sapiens 560
197732
3 889 AGCATGTGGCAGAAGCCATC 193 H. sapiens 561
197733
3 1059 GAGAGCACCAAATCCACATC 194 H. sapiens 562
197734
3 1199 CCTCAGTGATGAAGCAGTCA 195 H. sapiens 563
197735
3 1349 GATAGATGTGGTCACCTACC 196 H. sapiens 564
197736
3 1390 CCTCAGCACAGCAGCTGCGA 197 H. sapiens 565
197737
3 1589 GATTCTGCGGGTCATTGGAA 198 H. sapiens 566
197738
3 1678 CAAAGCCATCACTGATGATC 199 H. sapiens 567
197739
3 1699 AGAAAGCTGCCATCCAGGCT 200 H. sapiens 568
197740
3 1749 CAGGAGGTTCTTCTTCAGAC 201 H. sapiens 569
197741
3 1829 GAGTCCTTCACAGGCAGATA 202 H. sapiens 570
197742
3 1919 TGCCAATATCTTGAACTCAG 203 H. sapiens 571
197743
3 2189 CATCGAGATTGGCTTGGAAG 204 H. sapiens 572
197744
3 2649 GGAGCTGGATTACAGTTGCA 205 H. sapiens 573
ID DE SITIO
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA COMP. INV DE SEQ ID NO ACTIVO EN SEQ ID NO
197745
3 2729 CAACATGCAGGCTGAACTGG 206 H. sapiens 574
197746
3 2949 ACATTACATTTGGTCTCTAC 207 H. sapiens 575
197747
3 3059 CTCAGGCGCTTACTCCAACG 208 H. sapiens 576
197748
3 3118 GGGACACCAGATTAGAGCTG 209 H. sapiens 577
197749
3 3189 GAGCTCCAGAGAGAGGACAG 210 H. sapiens 578
197750
3 3289 ATCGGCAGAGTATGACCTTG 211 H. sapiens 579
197751
3 3488 CAAGGGTGTTATTTCCATAC 212 H. sapiens 580
197752
3 3579 GACTCATCTGCTACAGCTTA 213 H. sapiens 581
197753
3 4039 GCAAATCCTCCAGAGATCTA 214 H. sapiens 582
197754
3 4180 CTCTCCTGGGTGTTCTAGAC 215 H. sapiens 583
197755
3 4299 ATGAAGGCTGACTCTGTGGT 216 H. sapiens 584
197756
3 4511 GGGACCACAGATGTCTGCTT 217 H. sapiens 585
197757
3 4660 CTGGCCGGCTCAATGGAGAG 218 H. sapiens 586
197758
3 4919 GCTGCGTTCTGAATATCAGG 219 H. sapiens 587
197759
3 5009 TGCTGACATCTTAGGCACTG 220 H. sapiens 588
197760
3 5109 AAGTGTAGTCTCCTGGTGCT 221 H. sapiens 589
197761
3 5212 CAAAATTCAGTCTGGATGGG 222 H. sapiens 590
197762
3 5562 GGGAAACTACGGCTAGAACC 223 H. sapiens 591
197763
3 5589 CTGCATGTGGCTGGTAACCT 224 H. sapiens 592
197764
3 5839 CCATGACCATCGATGCACAT 225 H. sapiens 593
197765
3 5869 ATGGGAAACTCGCTCTCTGG 226 H. sapiens 594
197766
3 5979 AGTCATCATCTCGTGTCTAG 227 H. sapiens 595
197767
3 6099 GAATACAGCCAGGACTTGGA 228 H. sapiens 596
197768
3 6144 GGCGTGGAGCTTACTGGACG 229 H. sapiens 597
197769
3 6249 GAGATGAGAGATGCCGTTGA 230 H. sapiens 598
197770
3 6759 AGTCTTGATGAGCACTATCA 231 H. sapiens 599
197771
3 6889 CTAAGTACCAAATCAGAATC 232 H. sapiens 600
197772
3 7149 GTCCATGAGTTAATCGAGAG 233 H. sapiens 601
197773
3 7549 AGGCCACAGTTGCAGTGTAT 234 H. sapiens 602
197774
3 7779 TCTGATTGGTGGACTCTTGC 235 H. sapiens 603
197775
3 7929 GAAGTCAGTCTTCAGGCTCT 236 H. sapiens 604
197776
3 8929 CCAGATTCTCAGATGAGGGA 237 H. sapiens 605
197778
3 10240 CATCTGTCATTGATGCACTG 238 H. sapiens 606
197779
3 10619 AGGAGATGTCAAGGGTTCGG 239 H. sapiens 607
197780
3 10659 GGAACTATTGCTAGTGAGGC 240 H. sapiens 608
197781
3 10899 CTCTCTCCATGGCAAATGTC 241 H. sapiens 609
197783
3 11979 CACCGTGACTTCAGTGCAGA 243 H. sapiens 610
197784
3 12249 ACTGAGTTGAGGGTCCGGGA 244 H. sapiens 611
197786
3 13958 CACATATGAACTGGACCTGC 245 H. sapiens 612
197787
3 14008 TCTGAACTCAGAAGGATGGC 246 H. sapiens 613
216825
3 3249 GGTGCGAAGCAGACTGAGGC 247 H. sapiens 614
216826
3 3 TCCCACCGGGACCTGCGGGG 248 H. sapiens 615
216827
3 6 CACCGGGACCTGCGGGGCTG 249 H. sapiens 616
216828
3 23 CTGAGTGCCCTTCTCGGTTG 250 H. sapiens 617
216829
3 35 CTCGGTTGCTGCCGCTGAGG 251 H. sapiens 618
216830
3 36 TCGGTTGCTGCCGCTGAGGA 252 H. sapiens 619
216831
3 37 CGGTTGCTGCCGCTGAGGAG 253 H. sapiens 620
216832
3 39 GTTGCTGCCGCTGAGGAGCC 254 H. sapiens 621
216833
3 43 CTGCCGCTGAGGAGCCCGCC 255 H. sapiens 622
216834
3 116 ACCGCAGCTGGCGATGGACC 256 H. sapiens 623
216835
3 120 CAGCTGGCGATGGACCCGCC 257 H. sapiens 624
216836
3 13800 GAACTTACTATCATCCTCTA 258 H. sapiens 625
216838
3 13854 TCCAATTGAACTTTCACATA 260 H. sapiens 626
ID DE SITIO
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA COMP. INV DE SEQ ID NO ACTIVO EN SEQ ID NO
216839
3 13882 AAAATTCAAACTGCCTATAT 261 H. sapiens 627
216840
3 13903 GATAAAACCATACAGTGAGC 262 H. sapiens 628
216841
3 13904 ATAAAACCATACAGTGAGCC 263 H. sapiens 629
216842
3 13908 AACCATACAGTGAGCCAGCC 264 H. sapiens 630
216843
3 13909 ACCATACAGTGAGCCAGCCT 265 H. sapiens 631
216844
3 13910 CCATACAGTGAGCCAGCCTT 266 H. sapiens 632
216845
3 13917 GTGAGCCAGCCTTGCAGTAG 267 H. sapiens 633
216846
3 13922 CCAGCCTTGCAGTAGGCAGT 268 H. sapiens 634
216847
3 13934 TAGGCAGTAGACTATAAGCA 269 H. sapiens 635
216848
3 13937 GCAGTAGACTATAAGCAGAA 270 H. sapiens 636
216849
3 13964 TGAACTGGACCTGCACCAAA 271 H. sapiens 637
216850
3 13968 CTGGACCTGCACCAAAGCTG 272 H. sapiens 638
216851
3 13970 GGACCTGCACCAAAGCTGGC 273 H. sapiens 639
216852
3 13974 CTGCACCAAAGCTGGCACCA 274 H. sapiens 640
216853
3 13978 ACCAAAGCTGGCACCAGGGC 275 H. sapiens 641
216854
3 13997 CTCGGAAGGTCTCTGAACTC 276 H. sapiens 642
216855
3 14012 AACTCAGAAGGATGGCATTT 277 H. sapiens 643
216856
3 14014 CTCAGAAGGATGGCATTTTT 278 H. sapiens 644
216857
3 14049 ATCAGGATCTGAGTTATTTT 279 H. sapiens 645
216858
3 14052 AGGATCTGAGTTATTTTGCT 280 H. sapiens 646
216859
3 14057 CTGAGTTATTTTGCTAAACT 281 H. sapiens 647
216860
3 14064 ATTTTGCTAAACTTGGGGGA 282 H. sapiens 648
216861
3 14071 TAAACTTGGGGGAGGAGGAA 283 H. sapiens 649
217030
3 14087 GGAACAAATAAATGGAGTCT 284 H. sapiens 650
224316
3 3230 GTTTGTAACTCAAGCAGAAG 285 H. sapiens 651
224317
3 3232 TTGTAACTCAAGCAGAAGGT 286 H. sapiens 652
224318
3 3234 GTAACTCAAGCAGAAGGTGC 287 H. sapiens 653
224319
3 3236 AACTCAAGCAGAAGGTGCGA 288 H. sapiens 654
224320
3 3238 CTCAAGCAGAAGGTGCGAAG 289 H. sapiens 655
224321
3 3240 CAAGCAGAAGGTGCGAAGCA 290 H. sapiens 656
224322
3 3242 AGCAGAAGGTGCGAAGCAGA 291 H. sapiens 657
224323
3 3244 CAGAAGGTGCGAAGCAGACT 292 H. sapiens 658
224324
3 3246 GAAGGTGCGAAGCAGACTGA 293 H. sapiens 659
224325
3 3248 AGGTGCGAAGCAGACTGAGG 294 H. sapiens 660
224326
3 3250 GTGCGAAGCAGACTGAGGCT 295 H. sapiens 661
224327
3 3252 GCGAAGCAGACTGAGGCTAC 296 H. sapiens 662
224328
3 3254 GAAGCAGACTGAGGCTACCA 297 H. sapiens 663
224329
3 3256 AGCAGACTGAGGCTACCATG 298 H. sapiens 664
224330
3 3258 CAGACTGAGGCTACCATGAC 299 H. sapiens 665
224331
3 3260 GACTGAGGCTACCATGACAT 300 H. sapiens 666
224332
3 3262 CTGAGGCTACCATGACATTC 301 H. sapiens 667
224333
3 3264 GAGGCTACCATGACATTCAA 302 H. sapiens 668
224334
3 3266 GGCTACCATGACATTCAAAT 303 H. sapiens 669
224335
3 3268 CTACCATGACATTCAAATAT 304 H. sapiens 670
224336
3 5582 CCTGAAGCTGCATGTGGCTG 305 H. sapiens 671
224337
3 5584 TGAAGCTGCATGTGGCTGGT 306 H. sapiens 672
224338
3 5586 AAGCTGCATGTGGCTGGTAA 307 H. sapiens 673
224339
3 5588 GCTGCATGTGGCTGGTAACC 308 H. sapiens 674
224340
3 5590 TGCATGTGGCTGGTAACCTA 309 H. sapiens 675
224341
3 5592 CATGTGGCTGGTAACCTAAA 310 H. sapiens 676
224342
3 5594 TGTGGCTGGTAACCTAAAAG 311 H. sapiens 677
224343
3 5596 TGGCTGGTAACCTAAAAGGA 312 H. sapiens 678
224344
3 5598 GCTGGTAACCTAAAAGGAGC 313 H. sapiens 679
ID DE SITIO
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA COMP. INV DE SEQ ID NO ACTIVO EN SEQ ID NO
224345
3 5600 TGGTAACCTAAAAGGAGCCT 314 H. sapiens 680
224346
3 5602 GTAACCTAAAAGGAGCCTAC 315 H. sapiens 681
224347
3 5604 AACCTAAAAGGAGCCTACCA 316 H. sapiens 682
224348
3 5606 CCTAAAAGGAGCCTACCAAA 317 H. sapiens 683
187366
318 3121 GGCGCGAAGCAGACTGAGGC 319 H. sapiens 684
187404
318 12651 CACTATGTTCATGAGGGAGG 323 H. sapiens 685
197777
318 9851 CCATCATAGGTTCTGACGTC 324 H. sapiens 686
197785
318 12561 GAAGCTGATTGACTCACTCA 325 H. sapiens 687
224349
318 3104 TTGTAACTCAAGCAGAAGGC 326 H. sapiens 688
224350
318 3106 GTAACTCAAGCAGAAGGCGC 327 H. sapiens 689
224351
318 3108 AACTCAAGCAGAAGGCGCGA 328 H. sapiens 690
224352
318 3110 CTCAAGCAGAAGGCGCGAAG 329 H. sapiens 691
224353
318 3116 CAGAAGGCGCGAAGCAGACT 330 H. sapiens 692
224354
318 3118 GAAGGCGCGAAGCAGACTGA 331 H. sapiens 693
224355
318 3120 AGGCGCGAAGCAGACTGAGG 332 H. sapiens 694
224356
318 3122 GCGCGAAGCAGACTGAGGCT 333 H. sapiens 695
224328
3 3254 GAAGCAGACTGAGGCTACCA 514 H. sapiens 696
224353
318 3116 CAGAAGGCGCGAAGCAGACT 515 H. sapiens 697
216862
334 904 TCTTTCTCCTGTCTTACAGA 335 H. sapiens 698
216866
334 1988 CCCACGTTAGAAGATGCGAC 339 H. sapiens 699
216868
334 2722 AATATGGTAGACATGAGCCA 341 H. sapiens 700
216869
334 2791 CATTAGCTGCATTTCAACTG 342 H. sapiens 701
216870
334 3045 ACTTTCACTCCTAGTCTGCA 343 H. sapiens 702
216874
334 3527 CCATGTCCAGGTAAGTCATG 347 H. sapiens 703
216876
334 3603 GCACCAGGCACGGATGTGAC 349 H. sapiens 704
216877
334 3864 GTGGGGTCCCAGAGGCACTG 350 H. sapiens 705
216878
334 3990 GCTGATCGGCCACTGCAGCT 351 H. sapiens 706
216879
334 4251 TCCACGTGGCTGGGGAGGTC 352 H. sapiens 707
216880
334 4853 TGTAATGTATGGTGATCAGA 353 H. sapiens 708
216881
334 5023 GAGAGTACCCAGTGGGAAAT 354 H. sapiens 709
216882
334 5055 AGTCAGCATGGGCTTCAGCC 355 H. sapiens 710
216883
334 5091 CAAAAGAATGACTGTCCAAC 356 H. sapiens 711
216884
334 5096 GAATGACTGTCCAACAAGTG 357 H. sapiens 712
216885
334 5301 TATCTACTGTAATTTAAAAT 358 H. sapiens 713
216886
334 5780 CTGATATGGGTGGAGAACAG 359 H. sapiens 714
216887
334 6353 TCTGGGACAGGTATGAGCTC 360 H. sapiens 715
216888
334 6534 TGATAGCAGTGGCCCTTGAA 361 H. sapiens 716
216889
334 6641 GGATTGGCGTGAAATACTGG 362 H. sapiens 717
216890
334 6661 TGCCCGAGGTTCCTCCTGCC 363 H. sapiens 718
216894
334 7059 GCACTAGCAAGACCACACTC 367 H. sapiens 719
216895
334 7066 CAAGACCACACTCTGCATAG 368 H. sapiens 720
216897
334 7209 TCCTCCATAGGATACCGTGT 370 H. sapiens 721
216899
334 7702 GGATGTAGGGCAGCAAAACC 372 H. sapiens 722
216900
334 7736 TCTGCACAAGGACTCCTTGT 373 H. sapiens 723
216901
334 8006 CAGCCTGTCTCAGTGAACAT 374 H. sapiens 724
216903
334 8239 CAGGATGCTTCCAGTCTAAT 376 H. sapiens 725
216904
334 8738 AAATGCTCGTCTCCAATCTC 377 H. sapiens 726
216906
334 9208 AACTTGTGTATCCAAATCCA 379 H. sapiens 727
216908
334 9545 TGACATGGTGTGCTTCCTTG 381 H. sapiens 728
216910
334 9770 ACACTGGTGTTCTGGCTACC 383 H. sapiens 729
216911
334 9776 GTGTTCTGGCTACCTCTAGT 384 H. sapiens 730
216913
334 10341 TCCTGGCATAGGTCACAGTA 386 H. sapiens 731
216914
334 10467 ATGTCAACAGTAGCACCTCC 387 H. sapiens 732
ID DE SITIO
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA COMP. INV DE SEQ ID NO ACTIVO EN SEQ ID NO
216915
334 10522 TAGACTCAGACAAGTCTGGA 388 H. sapiens 733
216917
334 10587 CCTAAGTTGCTCATCTCTGG 390 H. sapiens 734
216922
334 11337 TGCGCTGAGTTCCATGAAAC 395 H. sapiens 735
216923
334 11457 CTATTGCAGGTGCTCTCCAG 396 H. sapiens 736
216926
334 12155 CAGAGGAACATCTTGCACCT 399 H. sapiens 737
216928
334 12221 CTCTGCTCCTTACTCTTGTG 401 H. sapiens 738
216929
334 12987 GTAATTTCTCACCATCCATC 402 H. sapiens 739
216930
334 13025 TTCTGAGTCTCAATTGTCTA 403 H. sapiens 740
216931
334 13057 CTATGTCCTTGTGTGCACAT 404 H. sapiens 741
216932
334 13634 GCCTATTGCCATTTGTATGT 405 H. sapiens 742
216933
334 13673 CTATTCATGTCCTTTGCCTA 406 H. sapiens 743
216935
334 14567 GATTCTGCGGGTAATCTCAG 408 H. sapiens 744
216937
334 14680 TCAATGCAGGTCATTGGAAA 410 H. sapiens 745
216938
334 15444 CTACCAGATTGACCATCCCT 411 H. sapiens 746
216940
334 15757 TACTTGATAGTGCTCTAGGA 413 H. sapiens 747
216941
334 15926 TTGACTGCAGGACCAGGAGG 414 H. sapiens 748
216942
334 16245 AACAAACACTTGTGCAAATG 415 H. sapiens 749
216950
334 18519 AATGAGACCAAACTTCCACT 423 H. sapiens 750
216951
334 18532 TTCCACTTTGAAGCTAGCAA 424 H. sapiens 751
216952
334 18586 GATCTGGAGCTTATTCTTGA 425 H. sapiens 752
216953
334 18697 ACCTCATGTGACTTGTATGC 426 H. sapiens 753
216954
334 18969 TTCTTAAGAAACACCTTGTA 427 H. sapiens 754
216955
334 19250 TAGGCCCATCCTGGCTGCAT 428 H. sapiens 755
216956
334 19340 AAACTCTCAGGATATGGTAA 429 H. sapiens 756
216957
334 19802 ATACCTTCCTCTACCTTTGC 430 H. sapiens 757
216958
334 19813 TACCTTTGCTGAAGGTCCTT 431 H. sapiens 758
216961
334 20567 ATCTATCTAGTGAAATTTCT 434 H. sapiens 759
216962
334 20647 TCAGCTCATCAAAATATGCT 435 H. sapiens 760
216963
334 20660 ATATGCTAGTCCTTCCTTTC 436 H. sapiens 761
216965
334 21316 CAAAGGTCTGAGTTATCCAG 438 H. sapiens 762
216967
334 21422 TGACTTATAGATGCAGGCTG 440 H. sapiens 763
216968
334 21634 TCAGTGGAGGGTAATTCTTT 441 H. sapiens 764
216969
334 21664 TGCCTAGCCAGTTTGAAAGA 442 H. sapiens 765
216970
334 21700 CCTGCAGAATTTTGCCAGGC 443 H. sapiens 766
216972
334 22048 GTAGCTAGGTAGGTAAAGCA 445 H. sapiens 767
216973
334 22551 TTGAGTGAGACACACAAGGT 446 H. sapiens 768
216974
334 22694 GTGCTAGTCAGGGAATGCAT 447 H. sapiens 769
216976
334 22903 GGGGAGAGAGCATGCCCAGC 449 H. sapiens 770
216977
334 22912 GCATGCCCAGCTGCGAAAGC 450 H. sapiens 771
216978
334 23137 AGCCAGGTATAGAAAGGAGT 451 H. sapiens 772
216979
334 23170 AACTTTCTAAGAGGCAGAAT 452 H. sapiens 773
216981
334 23882 TCTTAGTCTGGTCATGAGTG 454 H. sapiens 774
216983
334 24184 AGTAGGAGATTTCATATGAA 456 H. sapiens 775
216985
334 24559 TCTTCACCAGCAACACATTA 458 H. sapiens 776
216987
334 24800 ATGGCCACCTAGCATGGCAC 460 H. sapiens 777
216989
334 24991 CATGTTTCTGAGCCTCCAGA 462 H. sapiens 778
216990
334 25067 TAGGTGGCTCCCTGTCTTCA 463 H. sapiens 779
216991
334 25152 TCCAAAGTCTTGGGAATCCT 464 H. sapiens 780
216995
334 26749 ACAAAGAAAGGGGGAGTTGG 468 H. sapiens 781
216996
334 26841 TCGTGTCTTCCTGGCCCAGA 469 H. sapiens 782
216997
334 27210 GCAGTGCCCAGCACACAATA 470 H. sapiens 783
216998
334 27815 ACTCGTCCAGGTGCGAAGCA 471 H. sapiens 784
216999
334 28026 GCCACCTAAGGTAAAGAAGG 472 H. sapiens 785
ID DE SITIO
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA COMP. INV DE SEQ ID NO ACTIVO EN SEQ ID NO
217000
334 28145 ATCAGAGTGGCAGAGAGAGC 473 H. sapiens 786
217002
334 28919 TTTACCATAGTTGTGACACA 475 H. sapiens 787
217006
334 29871 CATTTTGTAGGCAATG4GCT 479 H. sapiens 788
217007
334 30181 GCATTAGTAAACATGAGAAC 480 H. sapiens 789
217009
334 30931 TTCATTTCAGCGATGGCCGG 482 H. sapiens 790
217013
334 39562 GAAAATCTAGTGTCATTCAA 486 H. sapiens 791
217016
334 39789 TCCTATACAGTTTTGGGAAC 489 H. sapiens 792
217017
334 39904 AAGGACTTCAGTATGGAGCT 490 H. sapiens 793
217018
334 39916 ATGGAGCTTTTATTGAATTG 491 H. sapiens 794
217022
334 40412 CCATCAGCACTATTATTTAT 495 H. sapiens 795
217023
334 40483 ATAGGCAAGCTCAGCCATAG1 496 H. sapiens 796
217025
334 40576 TGCTAGATGAGATACATCAA 498 H. sapiens 797
217026
334 40658 GAAGACCAAACATGGTTCTA 499 H. sapiens 798
217029
334 41130 CTCTGTTTAGTCCTCTCCAG 502 H. sapiens 799
1217032
503 490 CATTGATAAAATGTTCTGGC 505 H. sapiens 800
217033
503 504 TCTGGCACAGCAAAACCTCT 506 H. sapiens 801
217034
503 506 TGGCACAGCAAAACCTCTAG 507 H. sapiens 802
217037
503 523 TAGAACACATAGTGTGATTT 510 H. sapiens 803
217039
503 526 AACACATAGTGTGATTTAAG 512 H. sapiens 804
Puesto que se ha encontrado por experimentación que estos "segmentos diana preferidos" están abiertos a, y por lo tanto son accesibles para, la hibridación con compuestos antisentido de la presente descripción, un experto en la materia reconocerá o podrá determinar, usando solo experimentación rutinaria, otros aspectos de la descripción que
5 abarcan otros compuestos que hibridan específicamente con estos segmentos diana preferidos y por consiguiente inhiben la expresión de la apolipoproteína B.
Según la presente descripción, los compuestos antisentido incluyen compuestos oligómeros antisentido, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), empalmes alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligómeros cortos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico
10 diana.
Ejemplo 37
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana - dosis-respuesta de los oligonucleótidos
Los 12 oligonucleótidos descritos en los ejemplos 29 y 31 se investigaron más en un estudio de dosis-respuesta. Los oligonucleótidos de control usados en este estudio eran ISIS 18076 (SEQ ID NO: 805) y ISIS 13650 (SEQ ID NO:
15 806).
Todos los compuestos en este estudio, incluyendo los controles eran oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato
20 (P=S) a lo largo de los oligonucleótidos. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.
En el experimento de dosis-respuesta, con los niveles de ARNm como criterio de valoración, se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido o los oligonucleótidos de control con dosis de 37, 75, 150, y 300 nM del oligonucleótido. Los datos se obtuvieron por PCR cuantitativa en tiempo real como se describe en otros ejemplos en la presente memoria, y son la media de dos experimentos con los niveles de ARNm en los grupos de tratamiento
25 normalizados con respecto a un grupo de control no tratado. Los datos se muestran en la Tabla 19.
Tabla 19
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Dosis-respuesta
Dosis
37 nM
75 nM 150 nM 300 nM
nº de ISIS
% inhibición SEQ ID NO
271009
82 91 94 96 319
281625
62 76 84 94 224
301014
75 90 96 98 249
301027
80 90 95 96 262
301028
70 79 85 92 263
301029
54 67 79 85 264
301030
64 75 87 92 265
301031
61 82 92 96 266
301034
73 87 93 97 269
301036
67 83 92 95 271
301037
73 85 89 96 272
301045
77 86 94 98 280
5 Ejemplo 38
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B humana - dosis-respuesta - Intervalo de dosis inferior
Los 7 oligonucleótidos descritos en los ejemplos 29, 31, 35 y 36 se investigaron más en un estudio de dosisrespuesta. Los oligonucleótidos de control usados en este estudio eran ISIS 18076 (SEQ ID NO: 805), ISIS 13650 (SEQ ID NO: 806), y ISIS 129695 (SEQ ID NO: 807).
10 Todos los compuestos en este estudio, incluyendo los controles eran oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de los oligonucleótidos. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.
15 En el experimento de dosis-respuesta, con los niveles de ARNm como criterio de valoración, se trataron células HepG2 con los oligonucleótidos antisentido o los oligonucleótidos de control con dosis de 12,5, 37, 75, 150 y 300 nM del oligonucleótido. Los datos se obtuvieron por PCR cuantitativa en tiempo real como se describe en otros ejemplos en la presente memoria, y son la media de dos experimentos con los niveles de ARNm en los grupos de tratamiento normalizados con respecto a un grupo de control no tratado. Los datos se muestran en la Tabla 20.
20 Tabla 20
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Dosis-respuesta
Dosis
12,5 nM
37 nM 75 nM 150 nM 300 nM
nº de ISIS
% inhibición SEQ ID No
271009
67 86 92 94 95 319
281625
44 66 83 85 94 224
301012
63 79 90 92 95 247
308638
42 73 91 96 97 247
308642
59 84 91 97 98 319
308651
57 76 84 90 88 319
308658
29 61 73 78 90 224
Ejemplo 39
Síntesis de ARN
En general, la química de la síntesis de ARN se basa en la incorporación selectiva de diferentes grupos protectores en reacciones intermedias estratégicas. Aunque el experto en la técnica entenderá el uso de grupos protectores en síntesis orgánica, una clase útil de grupos protectores incluye los éteres de sililo. En particular, se usan éteres de sililo voluminosos para proteger el 5'-hidroxilo en combinación con un grupo protector ortoéster lábil frente a ácidos en el 2'-hidroxilo. Este conjunto de grupos protectores se usa después en la tecnología de síntesis en fase sólida convencional. Es importante eliminar en último lugar el grupo protector ortoéster lábil frente a ácidos, después de todas las demás etapas sintéticas. Además, el uso pronto de los grupos protectores sililo durante la síntesis facilita la eliminación cuando se desea, sin la desprotección indeseada del 2'-hidroxilo.
Siguiendo este procedimiento para la protección secuencial del 5'-hidroxilo en combinación con la protección del 2'hidroxilo mediante grupos protectores que se eliminan de forma diferente y son químicamente lábiles de forma diferente, se sintetizaron los oligonucleótidos de ARN.
Los oligonucleótidos de ARN se sintetizan por pasos. Cada nucleótido se añade de forma secuencial (dirección de 3'- a 5'-) a un oligonucleótido unido a un soporte sólido. El primer nucleósido en el extremo 3' de la cadena está covalentemente unido a un soporte sólido. Se añaden el nucleótido precursor, un ribonucleósido fosforamidita y activador, acoplando la segunda base al extremo 5' del primer nucleósido. El soporte se lava y se remata cualquier grupo 5'-hidroxilo sin reaccionar con anhídrido acético para dar restos 5'-acetilo. Después el enlace se oxida al enlace más estable y finalmente deseado de P(V). Al final del ciclo de adición de nucleótidos, el grupo 5'-sililo se escinde con fluoruro. El ciclo se repite para cada nucleótido que sigue.
Siguiendo la síntesis, los grupos protectores metilo en los fosfatos se escinden en 30 min usando 2-carbamoil-2cianoetileno-1,1-ditiolato de disodio trihidrato (S2Na2) 1 M en DMF. La disolución de desprotección se lava del oligonucleótido unido al soporte sólido usando agua. Después, el soporte se trata con metilenamina al 40% en agua durante 10 min a 55ºC. Esto libera los oligonucleótidos de ARN a la disolución, desprotege las aminas exocíclicas y modifica los grupos 2'. Los oligonucleótidos se pueden analizar por HPLC de intercambio aniónico en esta etapa.
Los grupos 2'-ortoéster son los últimos grupos protectores que se eliminan. El grupo protector ortoéster de monoacetato de etilenglicol desarrollado por Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO), es un ejemplo de un grupo protector ortoéster útil que tiene las siguientes propiedades importantes. Es estable en las condiciones de síntesis del nucleósido fosforamidita y la síntesis del oligonucleótido. Sin embargo, después de la síntesis del oligonucleótido, el oligonucleótido se trata con metilamina que no solo escinde el oligonucleótido del soporte sólido sino que también elimina los grupos acetilo de los ortoésteres. Los sustituyentes 2-etil-hidroxilo resultantes en el ortoéster son menos atractores de electrones que el precursor acetilado. Como resultado, el ortoéster modificado se hace más lábil a la hidrólisis catalizada por ácido. Específicamente, la tasa de escisión es aproximadamente 10 veces más rápida después de eliminar los grupos acetilo. Por lo tanto, el ortoéster tiene suficiente estabilidad con el fin de ser compatible con la síntesis de oligonucleótidos y además, cuando es posteriormente modificado, permite llevar a cabo la desprotección en condiciones acuosas relativamente suaves compatibles con el producto oligonucleótido de ARN final.
Además, los métodos de síntesis de ARN son bien conocidos en la técnica (Scaringe, S. A. Ph.D. Thesis, University of Colorado, 1996; Scaringe, S. A., et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821; Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191; Beaucage, S. L. and Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; Dahl, B. J., et al., Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641; Reddy, M. P., et al., Tetrahedron Lett., 1994, 25, 4311-4314; Wincott, F. et al., Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313; Griffin, B. E., et al., Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331).
Los compuestos de ARN antisentido (oligonucleótidos de ARN) de la presente invención se pueden sintetizar por métodos de la presente memoria o adquirir en Dharmacon Research, Inc (Lafayette, CO). Una vez sintetizados, los compuestos de ARN antisentido complementario se pueden entonces reasociar de forma estable por métodos conocidos en la técnica para formar compuestos antisentido bicatenarios (dúplex)Por ejemplo, se pueden formar dúplex combinando 30 μl de cada una de las cadenas complementarias de los oligonucleótidos de ARN (disolución de oligonucleótido de ARN 50 !M) y 15 μl de 5X tampón de reasociación (acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM) seguido de calentamiento durante 1 min a 90°C, después 1 h a 37°C. Los compuestos antisentido en forma de dúplex resultantes se pueden usar en kits, ensayos, cribados, u otros métodos para investigar la función de un ácido nucleico diana.
Ejemplo 40
Diseño y cribado de compuestos antisentido en forma de dúplex dirigidos a la apolipoproteína B
Se diseñan una serie de dúplex de ácido nucleico que comprenden los compuestos antisentido de la presente invención y sus complementarios para dirigirlos a la apolipoproteína B. La secuencia de bases nucleicas de la cadena antisentido del dúplex comprende al menos una parte de un oligonucleótido descrito en la presente memoria.
Los extremos de las cadenas se pueden modificar por la adición de una o más bases nucleicas naturales o modificadas para formar un extremo saliente. Después se diseña la cadena del mismo sentido del ARN de doble cadena y se sintetiza como el complemento de la cadena antisentido y también puede contener modificaciones o adiciones en los extremos. Por ejemplo, en una realización, ambas cadenas del dúplex del ARNdc serían
5 complementarias alrededor de las bases nucleicas centrales, cada una con extremos salientes en uno o ambos extremos. Las cadenas antisentido y del mismo sentido del dúplex comprenden de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos, o de aproximadamente 19 a 23 nucleótidos. Alternativamente, las cadenas antisentido y del mismo sentido comprenden 20, 21 ó 22 nucleótidos.
Por ejemplo, un dúplex que comprende una cadena antisentido que tiene la secuencia
10 CGAGAGGCGGACGGGACCG y que tiene un extremo saliente de dos bases nucleicas de desoxitimidina (dT) tendría la siguiente estructura:
Cadena antisentido
Complemento
En otra realización, un dúplex que comprende una cadena antisentido que tiene la misma secuencia CGAGAGGCGGACGGGACCG se puede preparar con extremos romos (sin extremo saliente en ninguna cadena)
15 como se muestra:
Cadena antisentido
Complemento
Las cadenas de ARN de los dúplex se pueden sintetizar por métodos descritos en la presente memoria o se pueden adquirir en Dharmacon Research Inc., (Lafayette, CO). Una vez sintetizadas, las cadenas complementarias se reasocian de forma estable. Se toman partes alícuotas de las cadenas individuales y se diluyen hasta una 20 concentración 50 !M. Una vez diluidas, se combinan 30 !l de cada cadena con 15 !l de una disolución 5X de tampón de reasociación. La concentración final de dicho tampón es acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7,4, y acetato de magnesio 2 mM. El volumen final es 75 !l. Esta disolución se incuba durante 1 min a 90ºC y después se centrifuga durante 15 s. El tubo se deja asentar durante 1 h a 37ºC momento en el que se usan los dúplex de ARNdc en la experimentación. La concentración final de los dúplex de ARNdc es 20 !M. La disolución
25 se puede almacenar congelada (-20ºC) y congelar-descongelar hasta 5 veces.
Una vez preparados, se evalúa la capacidad de los compuestos antisentido en dúplex de modular la expresión de la apolipoproteína B.
Cuando las células alcanzan 80% de confluencia, se tratan con los compuestos antisentido en dúplex de la invención. Para células cultivadas en placas de 96 pocillos, los pocillos se lavan una vez con 200 μl de medio OPTI
30 MEM-1 reducido en suero (Gibco BRL) y después se tratan con 130 μl de OPTI-MEM-1 que contiene 12 μg/ml de LIPOFECTIN (Gibco BRL) y el compuesto antisentido dúplex deseado en una concentración final de 200 nM. Después de 5 h de tratamiento, el medio se sustituye por medio de nueva aportación. Las células se recogen 16 h después del tratamiento, momento en el que el ARN se aísla y se mide la reducción de la diana por RT-PCR.
Ejemplo 41
35 Diseño de ensayos fenotípicos y estudios in vivo para usar los inhibidores de la apolipoproteína B
Ensayos fenotípicos
Una vez que se han identificado los inhibidores de la apolipoproteína B por los métodos descritos en la presente memoria, los compuestos se investigan más en uno o más ensayos fenotípicos, cada uno con criterios de valoración medibles que predicen la eficacia en el tratamiento de un estado patológico o afección particular. Los ensayos 40 fenotípicos, kits y reactivos para usar son bien conocidos por los expertos en la materia y se usan en la presente memoria para investigar la función y/o la asociación de la apolipoproteína B con la salud y la enfermedad. Los ensayos fenotípicos representativos, que se pueden adquirir en uno o varios proveedores comerciales, incluyen aquellos para determinar la viabilidad celular, citotoxicidad, proliferación o supervivencia celular (Molecular Probes, Eugene, OR; PerkinElmer, Boston, MA), ensayos basados en proteína, incluyendo ensayos enzimáticos (Panvera,
45 LLC, Madison, WI; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ; Oncogene Research Products, San Diego, CA), regulación celular, transducción de señales, inflamación, procesos oxidativos y apoptosis (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI), acumulación de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ensayos de angiogénesis, ensayos de formación de tubos, ensayos de citoquinas y hormonas y ensayos metabólicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
50 En un ejemplo no limitante, las células que se determina que son adecuadas para un ensayo fenotípico particular (es decir, células MCF-7 seleccionadas para estudios de cáncer de mama; adipocitos para estudios de obesidad) se tratan con inhibidores de apolipoproteína B identificados en los estudios in vitro, así como compuestos de control, en las concentraciones óptimas que son determinadas por los métodos descritos antes. Al final del periodo de tratamiento, las células tratadas y no tratadas se analizar por uno o más métodos específicos para el ensayo para determinar los resultados fenotípicos y criterios de valoración.
Los criterios de valoración fenotípicos incluyen cambios en la morfología celular a lo largo del tiempo o dosis de tratamiento así como cambios en los niveles de componentes celulares tales como proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, hormonas, sacáridos o metales. Las mediciones del estado celular que incluyen pH, estadio del ciclo celular, absorción o excreción de indicadores biológicos por la célula, son también criterios de valoración de interés.
El análisis del genotipo de la célula (medición de la expresión de uno o más genes de la célula) después de tratamiento, también se usa como un indicador de la eficacia o potencia de los inhibidores de la apolipoproteína B. Los genes distintivos, o aquellos genes que se sospecha que están asociados con un estado patológico, afección o genotipo específicos, se miden tanto en las células tratadas como en las no tratadas.
Estudios In Vivo
Los sujetos individuales de los estudios in vivo descritos en el presente documento son animales vertebrados de sangre caliente, que incluyen seres humanos.
El ensayo clínico se somete a controles rigurosos que aseguran que los individuos no se ponen en riesgo de forma innecesaria y que están completamente informados de su función en el estudio.
Para tener en cuenta los efectos psicológicos de recibir los tratamientos, se les da a los voluntarios aleatoriamente placebo o inhibidor de apolipoproteína B. Además, para prevenir que los médicos no sean imparciales, no se les informa de si la medicación que están administrando es un inhibidor de apolipoproteína B o un placebo. Usando este procedimiento de aleatorización, cada voluntario tiene la misma probabilidad de que le den el nuevo tratamiento o el placebo.
Los voluntarios recibieron el inhibidor de apolipoproteína B o el placebo durante un periodo de 8 semanas, midiéndose los parámetros biológicos asociados con el estado patológico o la afección indicada al principio (medición de los valores iniciales antes de cualquier tratamiento), al final (después del tratamiento final), y a intervalos regulares durante el periodo de estudio. Dichas mediciones incluyen los niveles de moléculas de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína B o niveles de proteína apolipoproteína B en fluidos corporales, tejidos u órganos comprados con los niveles antes de tratamiento. Otras mediciones incluyen, pero sin limitar, índices del estado patológico o afección que se va a tratar, peso corporal, presión sanguínea, título del suero de indicadores farmacológicos de la enfermedad o toxicidad así como mediciones ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción).
La información registrada para cada paciente incluye la edad (años), género, altura (cm), historia familiar del estado patológico o afección (si/no), valoración de la motivación (algo/moderada/grande) y número y tipo de regímenes de tratamiento previos para la enfermedad o afección indicadas.
Los voluntarios que toman parte en este estudio son adultos sanos (edad de 18 a 65 años) y participan aproximadamente el mismo número de hombres y mujeres en este estudio. Los voluntarios con determinadas características se distribuyen de forma igualitaria en el tratamiento con placebo y con inhibidor de apolipoproteína B. En general, los voluntarios tratados con placebo tienen poca o no tienen respuesta al tratamiento, mientras que los voluntarios tratados con el inhibidor de la apolipoproteína B presentan tendencias positivas en su índice del estado patológico o afección al final del estudio.
Ejemplo 42
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B de conejo por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
Se diseñó una serie de oligonucleótidos para dirigir a diferentes regiones del ARN de la apolipoproteína B de conejo, usando las secuencias publicadas (número de acceso en GenBank X07480.1, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 808, número de acceso en GenBank M17780.1, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 809, y se obtuvo una secuencia usando los cebadores descritos previamente (Tanaka, Journ. Biol. Chem., 1993, 268, 12713-12718) que representan el ARNm de la apolipoproteína B de conejo, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 810). Los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 21. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el oligonucleótido. Todos los compuestos en la tabla 21 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas. Se analizó el efecto de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de conejo en hepatocitos primarios de conejo por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los hepatocitos primarios de conejo se trataron con los compuestos 150 mM de la tabla 21. Para la apolipoproteína B de conejo los cebadores de la PCR eran:
5 cebador directo: AAGCACCCCCAATGTCACC (SEQ ID NO: 811) cebador inverso: GGGATGGCAGAGCCAATGTA (SEQ ID NO: 812) y la sonda para PCR era: FAM- TCCTGGATTCAAGCTTCTATGTGCCTTCA -TAMRA (SEQ ID NO: 813) donde FAM (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante indicador fluorescente) y TAMRA (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) es el colorante atenuador. Los datos son medias de dos experimentos. Si está presente, "N.D." indica "no hay datos".
10 Tabla 21
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de conejo por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
nº de ISIS
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA % de INHIB. SEQ ID NO
233149
808 1 TGCTTGGAGAAGGTAAGATC 0 814
233150
810 1 GCGTTGTCTCCGATGTTCTG 20 815
233151
809 13 TAATCATTAACTTGCTGTGG 20 816
233152
808 22 TCAGCACGTAGCAATGCATT 0 817
233153
808 31 GCCTGATACTCAGCACGTAG 0 818
233154
809 31 CAATTGAATGTACTCAGATA 18 819
233155
808 51 ACCTCAGTGACTTGTAATCA 47 820
233156
809 51 CACTGGAAACTTGTCTCTCC 23 821
233157
809 71 AGTAGTTAGTTTCTCCTTGG 0 822
233159
808 121 TCAGTGCCCAAGATGTCAGC 0 823
233160
810 121 ATTGGAATAATGTATCCAGG 81 824
233161
809 130 TTGGCATTATCCAATGCAGT 28 825
233162
808 151 GTTGCCTTGTGAGCAGCAGT 0 826
233163
810 151 ATTGTGAGTGGAGATACTTC 80 827
233164
809 171 CATATGTCTGAAGTTGAGAC 8 828
233165
808 181 GTAGATACTCCATTTTGGCC 0 829
233166
810 181 GGATCACATGACTGAATGCT 82 830
233167
808 201 TCAAGCTGGTTGTTGCACTG 28 831
233168
808 211 GGACTGTACCTCAAGCTGGT 0 832
233169
808 231 GCTCATTCTCCAGCATCAGG 14 833
233170
809 251 TTGATCTATAATACTAGCTA 23 834
233172
810 282 ATGGAAGACTGGCAGCTCTA 86 835
233173
808 301 TTGTGTTCCTTGAAGCGGCC 3 836
233174
809 301 TGTGCACGGATATGATAACG 21 837
233175
810 306 GACCTTGAGTAGATTCCTGG 90 838
233176
810 321 GAAATCTGGAAGAGAGACCT 62 839
233177
808 331 GTAGCTTTCCCATCTAGGCT 0 840
233178
808 346 GATAACTCTGTGAGGGTAGC 0 841
233179
810 371 ATGTTGCCCATGGCTGGAAT 65 842
233180
809 381 AAGATGCAGTACTACTTCCA 13 843
233181
808 382 GCACCCAGAATCATGGCCTG 0 844
233182
809 411 CTTGATACTTGGTATCCACA 59 845
233183
810 411 CAGTGTAATGATCGTTGATT 88 846
233184
810 431 TAAAGTCCAGCATTGGTATT 69 847
233185
810 451 CAACAATGTCTGATTGGTTA 73 848
233186
810 473 GAAGAGGAAGAAAGGATATG 60 849
233187
810 481 TGACAGATGAAGAGGAAGAA 66 850
233188
810 500 TTGTACTGTAGTGCATCAAT 74 851
233189
809 511 GCCTCAATCTGTTGTTTCAG 46 852
233190
810 520 ACTTGAGCGTGCCCTCTAAT 69 853
233191
809 561 GAAATGGAATTGTAGTTCTC 31 854
Ejemplo 43
Inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B de conejo por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi - Estudio de dosis y respuesta
Un subconjunto de oligonucleótidos antisentido del ejemplo 42 se investigó más en estudios de dosis y respuesta.
5 Las dosis de tratamiento eran 10, 50, 150 y 300 nM. ISIS 233160 (SEQ ID NO: 824), ISIS 233166 (SEQ ID NO: 830), ISIS 233172 (SEQ ID NO: 835), ISIS 233175 (SEQ ID NO: 838), y ISIS 233183 (SEQ ID NO: 846) se analizaron según su efecto en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de conejo en hepatocitos primarios de conejo por PCR en tiempo real cuantitativa, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos son medias de dos experimentos y se muestran en la tabla 22.
10 Tabla 22
Inhibición de los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de conejo por oligonucleótidos fosforotioato quiméricos que tienen alas 2'-MOE y un hueco desoxi
Porcentaje de inhibición
nº de ISIS
300 nM 150 nM 50 nM 10 nM
233160
80 74 67 33
233166
73 79 81 66
233172
84 81 76 60
233175
93 90 85 67
233183
80 81 71 30
Ejemplo 44
15 Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B en ratones LDLr-/-- Dosis-Respuesta
Los ratones deficientes en el receptor de LDL (ratones LDLr(-/-)), una cepa que no puede modificar el ARNm de la apolipoproteína B y por lo tanto sintetiza exclusivamente apolipoproteína B-100, tienen niveles de colesterol LDL y apolipoproteína B-100 notablemente elevados y desarrollan aterosclerosis extensa.
Se usaron ratones LDLr(-/-) adquiridos en Taconic (Germantown, NY) para evaluar el potencial de los
20 oligonucleótidos antisentido para disminuir los niveles de ARNm o proteína de apolipoproteína B, así como criterios de valoración fenotípicos asociados con la apolipoproteína B. Los ratones LDLr(-/-) se separaron en grupos de machos y hembras. Se administró a los ratones LDLr(-/-) por vía intraperitoneal, dos veces a la semana durante 6 semanas, 10, 25 ó 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID NO: 109) o ISIS 270906 (SEQ ID NO: 856) que es ISIS 147764 con 4 apareamientos de bases erróneos, o disolución salina o 20 mg/kg de atorvastatina. Al terminar el
25 estudio, los animales se sacrificaron y se evaluaron varios marcadores fenotípicos.
ISIS 147764 era capaz de reducir los niveles de colesterol, triglicéridos y ARNm de una forma dependiente de la dosis tanto en los ratones macho como hembra, mientras que ISIS 270906 con 4 apareamientos de bases erróneos no era capaz de hacer esto. Los resultados del estudio se resumen en la tabla 23.
Tabla 23
Efectos del tratamiento con ISIS 147764 en ratones LDLr-/- macho y hembra en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B, enzimas hepáticas, colesterol y triglicéridos
Dosis
Enzimas hepáticas IU/l Lipoproteínas mg/dl % de ARNm control
Nº de ISIS
mg/kg AST ALT COL. HDL LDL TRIG.
Machos
Disolución Salina
68,4 26,6 279,2 125,4 134,7 170,6 100,0
147764
10 57.6 29,8 314,2 150,0 134,7 198,6 61,7
25
112,6 78,8 185,0 110,6 66,2 104,2 30,7
50
163,6 156,8 165,6 107,8 51,2 113,4 16,6
270906
50 167,4 348,0 941,0 244,2 541,9 844,8 N.D.
Atorvastatina
20 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 110,9
Hembras
Disolución Salina
65,0 23,4 265,8 105,8 154,9 121,4 100,0
147764
1,0 82,0 27,2 269,6 121,0 127,8 140,8 64,2
25
61,4 32,2 175,8 99,5 68,9 100,4 41,3
50
134,6 120,4 138,2 92,2 45,9 98,0 18,5
270906
50 96,0 88,6 564,6 200,0 310,0 240,4 N.D.
Atorvastatina
20 N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. 109,0
5 Ejemplo 45
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B en macacos cangrejeros
Los macacos cangrejeros alimentados con una dieta aterogénica desarrollan aterosclerosis con muchas similitudes con la aterosclerosis de seres humanos. Los macacos cangrejeros hembra comparten varias similitudes en las lipoproteínas y el sistema cardiovascular con seres humanos. Además de estas características, hay similitudes en la
10 biología reproductiva. Las hembras cangrejeras tienen un ciclo menstrual de 28 días como el de las mujeres. Se han medido las concentraciones de hormonas a lo largo del ciclo menstrual de macacos cangrejeros, y la duración de las fases folicular y lútea, así como las concentraciones de estradiol y progesterona en el plasma a lo largo del ciclo, también son notablemente similares a los de las mujeres.
Los macacos cangrejeros (machos o hembras) se pueden usar para evaluar el potencial de los oligonucleótidos
15 antisentido para reducir los niveles de proteína o ARNm de la apolipoproteína B, así como criterios de valoración fenotípicos asociados con la apolipoproteína B incluyendo, pero sin limitar, indicadores cardiovasculares, aterosclerosis, enfermedades lipídicas, obesidad, y formación de placa. Un estudio podía incluir monos hipercolesterolémicos inducidos y normales alimentados con dietas que son normales o con alto contenido en lípidos y colesterol. La administración a los macacos cangrejeros puede ser en una variedad de regímenes, siendo uno por
20 vía subcutánea de 10-20 mg/kg de compuesto oligomérico durante 1-2 meses. Los parámetros que se pueden observar durante el periodo de ensayo podrían incluir: colesterol total en el plasma, colesterol LDL, colesterol HDL, triglicéridos, contenido de colesterol en la pared arterial y engrosamiento de la íntima coronaria.
Ejemplo 46
Secuenciación del segmento diana preferido de la apolipoproteína B de macacos cangrejeros (Macaca fascicularis)
25 Se amplificó una parte del ARNm de la apolipoproteína B de macaco cangrejero que no está disponible en la técnica. Las posiciones de 2920 a 3420 de la secuencia de ARNm de la apolipoproteína B humana (número de acceso en GenBank NM_000384.1, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 3) contienen el segmento diana preferido con el cual hibrida ISIS 301012 y se amplificó y secuenció el correspondiente segmentos del ARNm de la apolipoproteína B del macaco cangrejero. El sitio con el que hibrida ISIS 301012 en la
30 apolipoproteína B humana se amplificó poniendo los cebadores 5' en la posición 2920 y 3' en la posición 3420. Se adquirieron hepatocitos de macaco cangrejero en In Vitro Technologies (Gaithersburg, MD). Se produjeron fragmentos de 500 pb usando ADNc de hepatocitos 1º humanos y de macaco cangrejero y se produjeron por transcripción inversa del ARN total seguido de 40 ciclos de amplificación por PCR. Después de la purificación en gel de los amplicones humano y de macaco cangrejero, se realizaron las reacciones de secuenciación directa e inversa
35 de cada producto mediante Retrogen (se usó el kit de Invitrogen para crear el ADN, monocatenario y proporcionar los reactivos para la reacción de PCR con Amplitaq). La secuencia del macaco cangrejero se incorpora en la presente memoria como SEQ ID NO: 855 y es idéntica en el 96% a las posiciones de 2920 a 3420 del ARNm de la apolipoproteína B humana.
Ejemplo 47
Efectos de la inhibición antisentido del gen de la apolipoproteína B (ISIS 281625 y 301012) en ratones transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOB100)
Los ratones transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOB100) tienen el gen de la apolipoproteína B humana "introducido de sustitución". Estos ratones expresan niveles altos de la apolipoproteína B100 humana que da como resultado ratones con niveles elevados en el suero de colesterol LDL. Estos ratones son útiles para identificar y evaluar compuestos para reducir los niveles elevados de colesterol LDL y el riesgo de aterosclerosis. Cuando se alimentaron con una dieta alta en grasa y colesterol, estos ratones desarrollan una acumulación lipídica significativa debajo del endotelio y en la media, y tienen lesiones ateroscleróticas significativamente más complejas que los animales de control.
Los ratones C57BL/6NTac-TgN(APOB100) se dividieron en dos grupos, un grupo que recibía el tratamiento con oligonucleótido y los animales de control que recibían tratamiento con disolución salina. Después de ayunar durante la noche, se administró a los ratones por vía intraperitoneal dos veces por semana, disolución salina o 25 mg/kg de ISIS 281625 (SEQ ID No: 224) o ISIS 301012 (SEQ ID No: 247) durante 8 semanas. Al terminar el estudio y 48 h después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de ARNm diana en el hígado, niveles de colesterol y triglicéridos y niveles de enzimas hepáticas. Además, se midieron los niveles de apolipoproteína B endógena de ratón en el hígado para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B humana.
Tras el tratamiento con ISIS 281625 o ISIS 301012, los niveles de AST y ALT eran mayores, aunque todavía no superaban los valores normales (∀300 IU/l). Los niveles de colesterol eran ligeramente mayores con respecto al tratamiento con disolución salina, mientras que los niveles de triglicéridos eran ligeramente menores. El tratamiento con cualquiera de esos oligonucleótidos dirigidos a la apolipoproteína B humana que es expresada en estos ratones, disminuyó notablemente los niveles de ARNm de la apolipoproteína humana, mientras que los niveles de la apolipoproteína B endógena de ratón no se afectaron, indicando que estos oligonucleótidos presentan especificidad por la apolipoproteína B humana. Los resultados de los estudios comparativos se muestran en la tabla 24.
Tabla 24
Efectos del tratamiento con ISIS 281625 y 301012 en ratones en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B, enzimas hepáticas, colesterol y triglicéridos.
Nº de ISIS
Disolución salina
281625 301012
Enzimas hepáticas IU/l
AST
70,3 265,8 208,4
ALT
32,8 363,8 137,4
Lipoproteínas mg/dl
COL.
109,5 152,0 145,1
HDL
67,3 84.6 98,6
LDL
30,2 49,8 36,6
TRIG.
194,5 171,1 157,8
% de ARNm control
ARNm humano
100,0 45,2 23,7
ARNm de ratón
100,0 111,0 94,6
Después de 2 y 4 semanas de tratamiento con ISIS 301012, los niveles de colesterol LDL se redujeron significativamente a 22 mg/dl y 17 mg/dl, respectivamente.
Los niveles de la proteína apolipoproteína B en el hígado también se evaluaron al final del periodo de tratamiento de 8 semanas. Se aisló la proteína hepática y se sometió a análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos específicos para la proteína apolipoproteína B humana o de ratón (US Biologicals, Swampscott, MA y Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, respectivamente). El análisis de inmunotransferencia de las muestras de proteínas hepáticas puso de manifiesto una reducción de la expresión de ambas formas de apolipoproteína B humana, la apolipoproteína B-100 y la apolipoproteína B-48. Los niveles de apolipoproteína B de ratón en el hígado no habían cambiado significativamente, de acuerdo con el análisis de inmunotransferencia.
También se recogieron muestras de suero a las 2, 4, 6 y 8 semanas y se evaluó la expresión de la apolipoproteína B usando un kit de ELISA específico para la apolipoproteína B humana (ALerCHEK Inc., Portland, ME). La cuantificación de la proteína apolipoproteína B humana en el suero por ELISA puso de manifiesto que el tratamiento con ISIS 281625 reducía la proteína apolipoproteína B humana en el suero en 31, 26, 11 y 26% a las 2, 4, 6 y 8
semanas, respectivamente, con respecto a los animales tratados con disolución salina. El tratamiento con ISIS 301012 redujo la proteína apolipoproteína B humana en el suero en 70, 87, 81 y 41% a las 2, 4, 6 y 8 semanas, respectivamente, con respecto a los animales de control tratados con disolución salina. El suero de los ratones transgénicos también se sometió a análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos específicos contra 5 apolipoproteína B tanto humana como de ratón (US Biologicals, Swampscott, MA y Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, respectivamente). El análisis de inmunotransferencia de las muestras de suero tomadas de los animales, muestra un patrón similar de expresión de la apolipoproteína B humana, con una reducción significativa en el suero de la proteína apolipoproteína B después de 2, 4 y 6 semanas de tratamiento y una ligera reducción a las 8 semanas. La apolipoproteína B de ratón en el suero no cambió significativamente, de acuerdo con el análisis de
10 inmunotransferencia.
Ejemplo 48
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 233172, 233175, 281625, 301012, y 301027) en ratones C57BL/6
Los ratones C57BL/6, una cepa presentada como susceptible a la formación de placa aterosclerótica inducida por
15 hiperlipidemia, se usaron en los siguientes estudios para evaluar la toxicidad en ratones de varios oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B humana o de ratón.
Los ratones C57BL/6 se dividieron en dos grupos, uno que recibía tratamiento con oligonucleótido y animales de control que recibían tratamiento con disolución salina. Después de ayunar durante la noche, se administró a los ratones por vía intraperitoneal dos veces por semana, disolución salina o 25 mg/kg de uno de varios oligonucleótidos
20 durante 2 semanas. Los oligonucleótidos antisentido usados en el presente estudio eran ISIS 233172 (SEQ ID NO: 835) y ISIS 233175 (SEQ ID NO: 838), ambos dirigidos a la apolipoproteína B de conejo, y ISIS 281625 (SEQ ID NO: 224), ISIS 301012 (SEQ ID NO: 247), y ISIS 301027 (SEQ ID NO: 262), dirigidos a la apolipoproteína B humana. Al terminar el estudio y 48 h después de las inyecciones finales, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de enzimas hepáticas, peso corporal, peso del hígado, y peso del bazo.
25 Los niveles de las enzimas hepáticas en ratones eran menores con respecto al tratamiento con disolución salina para tres de los oligonucleótidos antisentido. Sin embargo, el oligonucleótido para conejo ISIS 233175 y el oligonucleótido para ser humano ISIS 301027 produjeron ambos niveles drásticamente mayores de las enzimas hepáticas, indicando toxicidad. Para todos los oligonucleótidos ensayados, el cambio en el peso corporal, del hígado y bazo era pequeño. Los resultados de los estudios comparativos se muestran en la tabla 25.
30 Tabla 25
Efectos de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B humana o de ratón en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B, enzimas hepáticas, colesterol y triglicéridos.
Nº de ISIS
Disolución salina
233172 233175 281625 301012 301027
Enzimas hepáticas
AST IU/l
104,5 94,3 346,7 89,5 50,6 455,3
ALT IU/l
39,5 43,3 230.2 36,2 21,2 221,3
Peso corporal
21,2 21,3 21,5 20,9 21,3 21,2
Hígado
1,1 1,3 1,4 1,2 1,1 1,3
Bazo
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Ejemplo 49
35 Evaluación de la evolución del oligonucleótido con dos dosis diferentes
Los ratones C57BL/6, una cepa presentada como susceptible a la formación de placa aterosclerótica inducida por hiperlipidemia, se usaron en los siguientes estudios para evaluar la toxicidad en ratones de varios oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B humana.
Los ratones hembra C57BL/6 se dividieron en dos grupos, uno que recibía tratamiento con oligonucleótido y
40 animales de control que recibían tratamiento con disolución salina. Después de ayunar durante la noche, se administró a los ratones por vía intraperitoneal dos veces por semana, disolución salina o 25 mg/kg o 50 mg/kg de ISIS 281625 (SEQ ID No: 224), ISIS 301012 (SEQ ID NO: 247), o ISIS 301027 (SEQ ID NO: 262). Después de 2 semanas, se tomó una muestra de sangre de la cola de los ratones y se evaluaron las enzimas hepáticas. Después de 4 semanas y al terminar el estudio, los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de enzimas hepáticas.
45 Para ISIS 281625 y ISIS 301012, los niveles de AST y ALT permanecieron cercanos a los de la disolución salina, con cualquiera de las dosis después de 2 semanas. Después 4 semanas, los niveles de AST y ALT mostraron un aumento moderado frente a los animales tratados con disolución salina para la dosis más baja, pero un aumento grande para la dosis más alta. ISIS 301027, administrado con cualquiera de las dosis, mostró un pequeño aumento de los niveles de AST y ALT después de 2 semanas y un gran aumento de los niveles de AST y ALT después de 4 semanas. Los resultados de los estudios se resumen en la tabla 26.
Tabla 26
Niveles de AST y ALT en ratones tratados con ISIS 281625, 301012 ó 301027 después de 2 y 4 semanas
AST (IU/l)
ALT (IU/l)
2 semanas
4 semanas 2 semanas 4 semanas
Disolución salina
49,6 63,2 22,4 25,2
Nº de ISIS
Dosis (mg/kg)
281625
25 40,8 75 21,2 31,8
50
44,4 152,4 30,8 210,4
301012
25 37,2 89,8 22,4 24,8
50
38,4 107.4 23,2 29,2
301027
25 55,4 537,6 27,2 311,2
50
64 1884 34,8 1194
Ejemplo 50
Efectos de la inhibición antisentido de la apolipoproteína B (ISIS 147483 y 147764) en ratones ob/ob
10 La leptina es una hormona producida por la grasa que regula el apetito. Las deficiencias en esta hormona tanto en seres humanos como en animales no humanos, conduce a la obesidad. Los ratones ob/ob tienen una mutación en el gen de la leptina que da como resultado leptina e hiperglucemia. Como tal, estos ratones son un modelo útil para la investigación de la obesidad y la diabetes, y los tratamientos diseñados para tratar estas afecciones.
Ratones ob/ob que recibía una dieta alta en grasa, alta en colesterol (60% de kcal de grasa complementada con
15 0,15% de colesterol) se trataron con uno de los varios oligonucleótidos para evaluar su efecto en los criterios de valoración fenotípicos relacionados con la apolipoproteína B en ratones ob/ob. Después de ayunar durante la noche, se administró a los ratones de cada grupo por vía intraperitoneal, dos veces por semana, 50 mg/kg de ISIS 147483 (SEQ ID No: 79) o 147764 (SEQ ID NO: 109) o los controles ISIS 116847 (SEQ ID NO: 857) o 141923 (SEQ ID NO: 858) o disolución salina, durante 6 semanas. Al terminar el estudio y 48 h después de las inyecciones finales, los
20 animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de ARNm diana en el hígado, niveles de colesterol y triglicéridos, niveles de enzimas hepáticas, niveles de glucosa en el suero y niveles de PTEN.
ISIS 147483 y 147764 ambos eran capaces de disminuir los niveles de ARNm de la apolipoproteína B, así como los niveles de glucosa, colesterol y triglicéridos. Los resultados de los estudios comparativos se muestran en la tabla 27.
Tabla 27
25 Efectos del tratamiento con ISIS 147483 y 147764 en ratones ob/ob en los niveles de ARNm de apolipoproteína B, colesterol, lípidos, triglicéridos, enzimas hepáticas, glucosa y PTEN.
Nº de ISIS
Disolución salina
116847 141923 147483 147764
Glucosa mg/dl
269,6 135,5 328,5 213,2 209,2
Enzimas hepáticas
IU/l
AST 422,3 343,2 329,3 790,2 406,5
ALT
884,3 607,5 701,7 941,7 835,0
Lipoproteínas
mg/dl
COL. 431,9 287,5 646,3 250,0 286,3
TRIG.
128,6 196,5 196,5 99,8 101,2
ARNm
% del control
ApoB
100,0 77,0 100,0 25,2 43,1
PTEN
100,0 20,0 113,6 143,2 115.3
Ejemplo 51
Inhibición antisentido de la apolipoproteína B en ratones alimentados con dieta alta en grasa: efectos dependientes del tiempo
En una realización adicional de la invención, se comparó la inhibición del ARNm de la apolipoproteína B en ratones
5 con la concentración de oligonucleótido en el hígado, colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL. Se evaluaron ratones macho C57B1/6 que recibían una dieta con alto contenido en grasa (60% de grasa) a lo largo del curso de 6 semanas, con inyecciones por vía intraperitoneal dos veces por semana, de 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID NO: 109) o 50 mg/kg del oligonucleótido de control ISIS 141923 (SEQ ID NO: 858). Los animales de control recibieron tratamiento con disolución salina. Los animales se sacrificaron después de 2 días, 1, 2, 4 y 6 semanas de
10 tratamiento. Cada grupo de tratamiento en cada tiempo de medición consistía en 8 ratones.
La expresión de la diana en el hígado se midió por la PCR en tiempo real como se ha descrito por otros ejemplos en la presente memoria y se expresa como porcentaje de inhibición con respecto a los ratones tratados con disolución salina. Los niveles de colesterol total, LDL y HDL se midieron por análisis clínico rutinario usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY) y se presentan en mg/dl. Los resultados de los animales
15 tratados con disolución salina se muestran para la comparación. El oligonucleótido intacto en el tejido hepático se midió por electroforesis en gel capilar y se presenta como microgramos de oligonucleótidos por gramo de tejido. Todos los resultados son la media de 8 animales y se muestran en la tabla 28.
Tabla 28
Correlación entre la concentración de fármaco en el hígado, la expresión de ARNm de la apolipoproteína B y los 20 lípidos en el suero durante el tratamiento con ISIS 147764
Periodo de tratamiento
nº de ISIS
2 días 1 semana 2 semanas 4 semanas 6 semanas
% de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B
141923 9 4 7 0 0
147764
50 57 73 82 88
Oligonucleótido intacto !g/g
141923 58 61 152 261 631
147764
85 121 194 340 586
Colesterol total mg/dl
disolución salina 105 152 144 180 191
141923
99 146 152 169 225
147764
101 128 121 75 73
Colesterol LDL
disolución salina 8 32 28 50 46
mg/dl
141923 8 27 27 38 56
147764
7 19 14 7 7
Colesterol HDL mg/dl
disolución salina 74 117 114 127 141
141923
70 116 122 128 166
147764
76 107 105 66 64
Estos resultados ilustran que la inhibición del ARNm de la apolipoproteína B por ISIS 147764 ocurría en el espacio de 2 días de tratamiento, aumentaba con los tratamientos sucesivos y persistía durante 6 semanas de tratamiento. La cuantificación de los niveles de oligonucleótido en el hígado pone de manifiesto una fuerte correlación entre la 25 extensión de la inhibición de la diana y la concentración de fármaco en el hígado. Además, a las 1, 2, 3 y 4 semanas de tratamiento, se observa una correlación inversa entre la inhibición del ARNm diana y los niveles de colesterol (total, HDL y LDL), disminuyendo los niveles de colesterol al hacerse mayores el porcentaje de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B. Las muestras de suero se sometieron a análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo para detectar la proteína apolipoproteína B de ratón (Gladstone Institute, San Francisco, CA). La
30 expresión de la proteína sigue el mismo patrón que el del ARNm, con la proteína apolipoproteína B notablemente reducida en el espacio de 48 h y disminuida a lo largo del periodo de tratamiento de 6 semanas.
Los tratamientos con oligonucleótido descritos en este ejemplo se hicieron por duplicado para investigar la extensión con la que persisten los efectos de ISIS 147764 después de cesar el tratamiento. Los ratones se trataron como se ha descrito, y se sacrificaron 1, 2, 4, 6 y 8 semanas después de cesar el tratamiento con oligonucleótido. Se
35 analizaron los mismos parámetros y los resultados se muestran en la tabla 29.
Tabla 29
Correlación entre la concentración de fármaco en el hígado, expresión de ARNm de la apolipoproteína B y lípidos en el suero después de cesar la dosificación
Periodo de tratamiento
nº de ISIS
1 semana 2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas
% de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B
141923 15 2 7 11 7
147764
82 78 49 37 19
Oligonucleótido intacto ug/g
141923 297 250 207 212 128
147764
215 168 124 70 43
Colesterol total mg/dl
disolución salina 114 144 195 221 160
141923
158 139 185 186 151
147764
69 67 111 138 135
Colesterol LDL mg/dl
disolución salina 21 24 34 37 22
141923
24 24 32 32 24
147764
14 14 18 24 21
Colesterol HDL mg/dl
disolución salina 86 109 134 158 117
141923
121 105 135 136 108
147764
51 49 79 100 94
Estos datos demuestran que tras terminar el tratamiento con el oligonucleótido, los efectos de ISIS 147764, incluyendo la inhibición del ARNm de la apolipoproteína B, y disminución del colesterol, persisten durante hasta 8 semanas. Los análisis de inmunotransferencia demuestran que la proteína apolipoproteína B sigue un patrón similar al observado para los niveles de expresión del ARNm.
Ejemplo 52
Efectos de la inhibición antisentido del gen de la apolipoproteína B humana por 301012 en ratones transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOB100): estudio de la dosificación
Los ratones transgénicos C57BL/6NTac-TgN(APOB100) tienen el gen de la apolipoproteína B humana "introducido de sustitución". Estos ratones expresan niveles altos de la apolipoproteína B humana que da como resultado ratones con niveles elevados en el suero de colesterol LDL. Estos ratones son útiles para identificar y evaluar compuestos para reducir los niveles elevados de colesterol LDL y el riesgo de aterosclerosis. Cuando se alimentaron con una dieta alta en grasa y colesterol, estos ratones desarrollan una acumulación lipídica significativa debajo del endotelio y en la media, y tienen lesiones de placa aterosclerótica significativamente más complejas que los animales de control.
Se llevó a cabo un estudio a largo plazo de inhibición de la apolipoproteína B humana por ISIS 301012 en ratones C57BL/6NTac-TgN(APOB100) (Taconic, Germantown, NY) durante un periodo de 3 meses. Se administró a los ratones por vía intraperitoneal dos veces por semana, 10 ó 25 mg/kg de ISIS 301012 (SEQ ID No: 247) durante 12 semanas. Los animales a los que se inyectó disolución salina sirvieron como controles. Cada grupo de tratamiento comprendía 4 animales.
Después de 2, 4, 6, 8 y 12 semanas de tratamiento, se recogieron muestras de suero con el propósito de medir la proteína apolipoproteína B humana. La proteína en el suero se cuantificó usando un kit de ELISA específico para la apolipoproteína B humana (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Los datos se muestran en la tabla 30 y cada resultado representa la media de 4 animales. Los datos están normalizados respecto a los animales de control tratados con disolución salina.
Tabla 30
Reducción de la apolipoproteína B humana en el suero de ratones transgénicos después del tratamiento con ISIS 301012
% de reducción en la proteína apolipoproteína B en el suero
Dosis de oligonucleótido mg/kg
2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas 12 semanas
10
76 78 73 42 85
25
80 87 86 47 79
Estos datos ilustran que después de 2, 4, 6 ó 12 semanas de tratamiento con ISIS 301012, el nivel de proteína apolipoproteína B humana en el suero de ratones transgénicos ha disminuido en aproximadamente 80%, demostrando que además de inhibir la expresión del ARNm, ISIS 301012 inhibe eficazmente la expresión de la proteína apolipoproteína B humana en ratones que llevan el transgén de la apolipoproteína B humana. La proteína 5 apolipoproteína B en el suero también se evaluó por análisis de inmunotransferencia, usando un anticuerpo dirigido contra la proteína apolipoproteína B humana (US Biologicals, Swampscott, MA). Este análisis muestra que los niveles de proteína apolipoproteína B humana, tanto de la forma apolipoproteína B-100 como apolipoproteína B-48, disminuyen a las 2, 4, 6 y 12 semanas de tratamiento. El análisis de inmunotransferencia usando una anticuerpo específico para la apolipoproteína B de ratón (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) pone de manifiesto
10 que no hay un cambio significativo en la expresión de la proteína de ratón en el suero.
Al principio del tratamiento (inicio) y después de 2, 4, 6 y 8 semanas de tratamiento, se recogieron muestras de suero y se midieron los niveles de colesterol total, HDL y LDL por análisis clínico rutinario usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY), y estos datos se presentan en la tabla 31. Los resultados se presentan como mg/dl y representan la media de 4 animales. También se muestran los animales de control de
15 disolución salina.
Tabla 31
Efectos de ISIS 301012 en los lípidos del suero en ratones transgénicos con apolipoproteína B humana
Periodo de tratamiento
Tratamiento
Inicio 2 semanas 4 semanas 6 semanas 8 semanas
Colesterol total mg/dl
Disolución salina 120 110 129 121 126
10
115 97 111 120 122
25
107 101 107 124 147
Colesterol HDL mg/dl
Disolución salina 67 61 69 62 64
10
70 69 78 72 79
25
64 73 76 80 91
Colesterol LDL mg/dl
Disolución salina 39 41 50 45 47
10
35 20 23 37 33
25
33 19 19 37 44
Estos datos demuestran que el colesterol LDL disminuye por el tratamiento con 10 ó 25 mg/kg de ISIS 147764 20 durante las primeras 4 semanas de tratamiento.
El estudio se terminó 48 h después de las inyecciones finales en las 8 semanas de tratamiento, cuando los animales se sacrificaron y se evaluaron los niveles de ARNm diana en el hígado, niveles de proteína apolipoproteína B en el hígado y colesterol en el suero y niveles de enzimas hepáticas. Además, se midió la expresión de los niveles de apolipoproteína B de ratón endógenos en el suero para evaluar cualquier efecto de ISIS 301012 en la expresión del
25 ARNm de la apolipoproteína B.
Se midieron los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana y de ratón en los hígados de los animales tratados durante 12 semanas de tratamiento, por PCR en tiempo real como se describe en la presente memoria. Cada resultado representa la media de los datos de 4 animales. Los datos se normalizaron respecto a los controles con disolución salina y se muestran en la tabla 32.
30 Tabla 32
Efectos de ISIS 301012 en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B humana y de ratón en ratones transgénicos
% inhibición
Dosis de ISIS 301012
especies de ARNm medidas
10 mg/kg 25 mg/kg
apolipoproteína B humana
65 75
apolipoproteína B de ratón
6 6
Estos datos demuestran que después de 12 semanas de tratamiento con ISIS 301012, el ARNm de la apolipoproteína B humana se reduce tanto como el 75% en los hígados de ratones transgénicos, mientras que el 35 ARNm de la apolipoproteína B del hígado de ratón no era afectada. Además, el análisis por ELISA de la proteína apolipoproteína B en hígados de ratones transgénicos puso de manifiesto una reducción de 80% y 82% en la proteína humana después de 10 y 20 mg/kg de ISIS 301012, respectivamente. El análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo dirigido contra la apolipoproteína B humana también demuestra una reducción de la expresión
de la apolipoproteína B humana, tanto de la forma apolipoproteína B-100 como de la apolipoproteína B-48, en los hígados de ratones transgénicos. El análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo dirigido contra la proteína apolipoproteína B de ratón (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) pone de manifiesto que la expresión de la proteína de ratón en el hígado no cambia significativamente.
También se midieron los niveles de ALT y AST en el suero usando el analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY) y mostraron que después del tratamiento con ISIS 301012, los niveles de AST y ALT aumentaron, aunque no superaron los niveles normales (-300 IU/l), indicando falta de toxicidad debido al tratamiento con ISIS 301012.
Ejemplo 53
Evaluación de los efectos inmunoestimuladores in vitro de ISIS 301012
La actividad inmunoestimuladora se define por la producción de citoquinas tras exposición a un agente proinflamatorio. En una realización adicional de la invención, se ensayaron la actividad inmunoestimuladora o proinflamatoria de ISIS 301012. Estos estudios los realizaron en MDS Pharma Services (Saint Germain sur l'Arbresle, Francia). Se recogió sangre entera de ratones B6C3F1 sin tratamiento previo, que no habían sido expuestos conscientemente a tratamiento vírico, químico o de radiación. Las células de la sangre cultivadas se expusieron a ISIS 301012 0,5, 5 ó 50 μM durante un periodo de 14 a 16 h. Oligonucleótidos antisentido que se sabe que tienen actividad proinflamatoria sirvieron como controles positivos. Cada tratamiento se realizó por triplicado. Al final del periodo de tratamiento, se recogieron los líquidos sobrenadantes y se llevó a cabo el análisis de citoquinas usando un método de citometría de flujo con el kit CBA de inflamación de ratón (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Los resultados pusieron de manifiesto que ISIS 301012 no estimula la liberación de ninguna de las citoquinas ensayadas, que eran la interleuquina 12p70 (IL-12p70), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), interferón gamma (IFN-gamma), interleuquina 6 (IL-6), proteína quimioatractora de macrófagos 1 (MCP-1) e interleuquina 10 (IL-10). Por lo tanto, ISIS 301012 no tiene actividad inmunoestimuladora, según se determinó por el ensayo inmunoestimulador in vitro.
Ejemplo 54
Análisis comparativo genómico de la apolipoproteína B
Se llevó a cabo un análisis genómico comparativo de las secuencias de la apolipoproteína B de ser humano, ratón y mono e ilustró que las secuencias de apolipoproteína B son conservadas entre especies. La organización de los genes de la apolipoproteína B humana y de ratón también se conservan. Los genes humano y de ratón están compuestos por 29 y 26 exones, respectivamente. El ARNm de ratón tiene una homología de aproximadamente 81% con la secuencia humana. La secuencia completa y la estructura génica del gen de la apolipoproteína B en primates no humanos no se ha identificado. Sin embargo, como se ilustra en el ejemplo 46, un fragmento de 500 pares de bases que contiene la secuencia diana de ISIS 301012 presenta una identidad de aproximadamente 96% con la secuencia humana.
El sitio de unión para ISIS 301012 está dentro de la región codificante, en el exón 22 del ARNm de la apolipoproteína B humana. Cuando se compararon los sitios de unión de ISIS 301012 de ser humano, ratón y mono, se observó una diversidad de secuencia significativa. Aunque la conservación total de la secuencia entre la de ser humano y la de mono a lo largo de la región de 500 nucleótidos era aproximadamente de 96%, el sitio de unión de ISIS 301012 de la secuencia de mono contiene 2 apareamientos erróneos con respecto a la secuencia humana. Igualmente, aunque la secuencia de ARNm de la apolipoproteína B de ratón tiene una homología de aproximadamente 81% con la humana, en el sitio de unión de ISIS 301012, hay 5 nucleótidos divergentes. Las comparaciones de secuencias para el sitio de unión de ISIS 301012 para las secuencias de la apolipoproteína B humana, de ratón y de mono se muestran en la tabla 33. Los nucleótidos mal apareados con respecto a la secuencia diana de ISIS 301012 están subrayados.
Tabla 33
Comparación del sitio de unión de ISIS 301012 entre las secuencias de apolipoproteína B humana, de mono y de ratón
Especies
nº de apareamientos erróneos secuencia diana de ISIS 301012
Ser humano
0 aggtgcgaagcagactgagg
Mono
2 aggtgtaaagcagactgagg
Ratón
5 aggagtgcagcagtctgaag
La secuencia diana con la que el oligonucleótido antisentido de ratón ISIS 147764 hibrida está en el exón 24 del gen de la apolipoproteína B de ratón. Las comparaciones de secuencias para el sitio de unión de ISIS 147764 en las secuencias de la apolipoproteína B de ratón y humana, se muestran en la tabla 34. Los nucleótidos mal apareados
con respecto a la secuencia diana de ISIS 147764 están subrayados. Tabla 34 Comparación del sitio de unión de ISIS 147764 entre las secuencias de apolipoproteína B de ratón y humana
Especies
nº de apareamientos erróneos sitio de unión de ISIS 147764
Ser humano
5 gcattgacatdttcagggac
Ratón
0 gcatggacttcttctggaaa
5 Ejemplo 55
Análisis BLAST de ISIS 301012
Se determinó el número de regiones en el genoma humano con las que hibridará ISIS 301012 con complementariedad perfecta. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se determinó usando los programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineamientos
10 locales básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). Este análisis evaluaba la complementariedad de secuencia en regiones genómicas o pre-ARNm y en secuencias codificantes.
En regiones genómicas, ISIS 301012 muestra una complementariedad de secuencia perfecta con el gen de la apolipoproteína B solo. No se encontraron secuencias dianas con un apareamiento erróneo con respecto a ISIS
15 301012. Se encuentran dos apareamientos erróneos entre la secuencia diana de ISIS 301012 y el gen de heparanasa, y se encuentran 3 apareamientos erróneos entre la secuencia diana de ISIS 301012 y 28 sitios genómicos únicos.
En las secuencias de ARN, se encuentra una complementariedad de secuencia perfecta entre ISIS 301012 y el ARNm de la apolipoproteína B y 3 marcadores de secuencia expresados que llevan una similitud moderada con el
20 precursor de la apolipoproteína B humana. Se encuentra un solo apareamiento erróneo entre ISIS 301012 y un marcador de secuencia expresado similar a la forma de la cadena ligera de miosina del músculo liso.
Ejemplo 56
Inhibición antisentido de la apolipoproteína B en hepatocitos humanos primarios: estudios de dosis-respuesta
Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B humana se ensayaron en estudios de dosis
25 respuesta en hepatocitos humanos primarios. Los hepatocitos humanos primarios precultivados en placa se adquirieron en InVitro Technologies (Baltimore, MD). Las células se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) complementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), 100 unidades/ml y 100 μg/ml de estreptomicina (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA).
Los hepatocitos primarios humanos se trataron con ISIS 301012 (SEQ ID NO: 247) 10, 50, 150 ó 300 nM. Las
30 células no tratadas y las células tratadas con el oligonucleótido de control desordenado ISIS 113529 (CTCTTACTGTGCTGTGGACA, SEQ ID NO: 859) sirvieron como dos grupos de células de control. ISIS 113529 es un oligonucleótidos quimérico ("gápmero") de 20 nucleótidos de longitud, compuesto por una región de "hueco" que consta de diez 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada a ambos lados (direcciones 5' y 3') por “alas” de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE) nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos
35 (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todas las citidinas son 5metilcitidinas.
Los oligonucleótidos se introdujeron en las células mediante transfección mediada por LIPOFECTIN como se describe en otros ejemplos de la presente memoria. Las células se recogieron tanto 24 como 48 h después del tratamiento con oligonucleótido, y se aislaron tanto el ARN como la proteína. Además, se recogió el medio de cultivo
40 de las células tratadas para el análisis por ELISA de la secreción de la proteína apolipoproteína B.
La expresión del ARNm de la apolipoproteína B se determinó por PCR en tiempo real de las muestras de ARN como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Cada resultado representa 6 experimentos. Los datos se normalizan respecto a las células de control no tratadas y se muestran en la tabla 35.

Tabla 35 Inhibición del ARNm de la apolipoproteína B por oligonucleótidos antisentido en hepatocitos primarios humanos
% de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B
nº de ISIS
Dosis de oligonucleótido
Tratamiento (horas) 301012 113529
10 nM
24 65 N.D.
48
33 N.D.
50 nM
24 75 N.D.
48
48
N.D.
150 nM
24 90 16
48
78 5
300 nM
24 89 10
48
72 18
Estos datos demuestran que ISIS 301012 inhibe la expresión de la apolipoproteína B de una forma dependiente de 5 la dosis en hepatocitos humanos primarios.
Se midió la proteína apolipoproteína B secretada al medio celular cultivado en las muestras tratadas con el oligonucleótido 50 y 150 nM, usando un kit de ELISA específico de la proteína diana (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Cada resultado representa 3 experimentos. Los datos se normalizan respecto a las células de control no tratadas y se muestran en la tabla 36.
10 Tabla 36
Inhibición de la secreción de la proteína apolipoproteína B de hepatocitos humanos primarios por ISIS 301012
% de cambio en la secreción de la proteína apolipoproteína B
nº de ISIS
Dosis
Tratamiento (horas) 301012 113529
150 nM
24 -57 +6
48
-75 +4
300 nM
24 -41 -2
48
-48 -5
Las muestras de proteínas de las dosis de 50, 150 and 300 nM después de 24 h y las dosis de 150 y 300 nM después de 48 h, se sometieron a análisis de inmunotransferencia como se describe en otros ejemplos en la
15 presente memoria, usando el anticuerpo específico de la proteína apolipoproteína B humana adquirido en US Biological (Swampscott, MA). El análisis de inmunotransferencia demuestra que la proteína apolipoproteína B en hepatocitos humanos disminuye de una forma dependiente de la dosis después del tratamiento con oligonucleótido antisentido con ISIS 301012.
Se llevó a cabo un experimento adicional para ensayar los efectos de ISIS 271009 (SEQ ID NO: 319), ISIS 281625
20 (SEQ ID NO: 224) y ISIS 301027 (SEQ ID NO: 262) en el ARNm de la apolipoproteína B humana en hepatocitos humanos primarios. Las células se cultivaron como se describe en la presente memoria, y se trataron con ISIS 271009, ISIS 281625 o ISIS 301027, 5, 10, 50 ó 150 nM durante un periodo de 24 h. Los oligonucleótidos de control ISIS 13650 (SEQ ID NO: 806) y ISIS 113529 (SEQ ID NO: 859) se usaron en concentración 50 o 150 nM. Se evaluó la expresión del ARNm de la apolipoproteína B humana por PCR en tiempo real como se describe en otros ejemplos
25 en la presente memoria. Se midió la proteína apolipoproteína B secretada al medio celular cultivado en las muestras tratadas con el oligonucleótido 50 y 150 nM, usando un kit de ELISA específico de la proteína diana (ALerCHEK Inc., Portland, ME).
Los datos mostrados en la tabla 37, representan la media de 2 experimentos y están normalizados con respecto a las células de control. Cuando está presente, un "+" indica que la expresión génica era mayor.

Tabla 37 Inhibición antisentido del ARNm de la apolipoproteína B humana por ISIS 271009, ISIS 281625 y ISIS 301027
Dosis de oligonucleótido
ISIS 271009 ISIS 281625 ISIS 301027 ISIS 13650 ISIS 113529
% de inhibición de la expresión del
5 nM +4 8 11 N.D. N.D.
ARNm de la apolipoproteína B
10 nM 5 22 37 N.D. N.D.
50 nM
52 49 50 38 0
150 nM
81 52 70 26 14
% de inhibición de la secreción de
50 nM 17 18 21 N.D. N.D.
la proteína apolipoproteína B
150 nM 32 18 32 +18 +1
Estos datos demuestran que ISIS 271009, ISIS 281625 y ISIS 301027 inhiben la expresión del ARNm de la 5 apolipoproteína B de una forma dependiente de la dosis en hepatocitos humanos primarios. ISIS 271009 y ISIS 301027 inhiben la secreción de proteína apolipoproteína B de las células de una forma dependiente de la dosis.
Ejemplo 57
Efectos de los oligonucleótidos antisentido de la apolipoproteína B-100 en la expresión de la apolipoproteína(a)
La lipoproteína (a) [Lp(a)] contiene dos proteínas distintas unidas por disulfuro, la apolipoproteína (a) y la
10 apolipoproteína B (Rainwater and Kammerer, J. Exp. Zool., 1998, 282, 54-61). Se ensayaron los efectos de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B en la expresión del componente apolipoproteína (a) de la partícula de lipoproteína (a) en hepatocitos humanos primarios.
Los hepatocitos humanos primarios (Invitro Technologies, Baltimore, MD), cultivados y transfectados como se describe en la presente memoria, se trataron con concentraciones 5, 10, 50 ó 150 nM de ISIS 271009 (SEQ ID NO:
15 319), 281625 (SEQ ID NO: 224), 301012 (SEQ ID NO: 247) o 301027 (SEQ ID NO: 262). Las células también se trataron con concentraciones 50 ó 150 nM de los oligonucleótidos de control ISIS 113529 (SEQ ID NO: 859) o ISIS 13650 (SEQ ID NO: 806). Las células no tratadas sirvieron de control. Después de 24 h de tratamiento con el oligonucleótido, se midió la expresión del ARNm de la apolipoproteína (a) por PCR cuantitativa en tiempo real como se describe en otros ejemplos en la presente memoria.
20 Las sondas y cebadores para la apolipoproteína (a) humana se diseñaron para hibridar con una secuencia de apolipoproteína (a) humana, usando la información de la secuencia publicada (número de acceso en GenBank NM_005577.1, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 860). Para la apolipoproteína (a) humana los cebadores de la PCR eran:
cebador directo: CAGCTCCTTATTGTTATACGAGGGA (SEQ ID NO: 861)
25 cebador inverso: TGCGTCTGAGCATTGCGT (SEQ ID NO: 862) y la sonda de la PCR era: FAM-CCCGGTGTCAGGTGGGAGTACTGC-TAMRA (SEQ ID NO: 863) donde FAM es el colorante fluorescentes y TAMRA es el colorante atenuador.
Los datos son la media de 3 experimentos y se expresan como porcentaje de inhibición con respecto a los controles no tratados. Los resultados se muestran en la tabla 38. Un "+" o "-" que precede al número indica que la expresión
30 de la apolipoproteína(a) había aumentado o disminuido, respectivamente, después de tratamiento con los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 38
Efectos de los oligonucleótidos antisentido de la apolipoproteína B en la expresión de la apolipoproteína (a) Estos resultados ilustran que ISIS 301012 no inhibía la expresión de la apolipoproteína (a) en hepatocitos humanos primarios. ISIS 271009 inhibía la expresión de la apolipoproteína (a) con la dosis más alta. ISIS 281625 y ISIS 301027 disminuían los niveles de ARNm de apolipoproteína(a).
% de cambio en la expresión del ARNm de la apolipoproteína (a) después de inhibición antisentido de la apolipoproteína B
Dosis de
nº de ISIS
oligonucleótido
271009 281625 301012 301027 13650 113529
5 nM
+70 -9 +34 -16 N.D. N.D.
10 nM
+31 -23 +86 -45 N.D. N.D.
50 nM
+25 -34 +30 -39 -68 +14
150 nM
-47 +32 +38 -43 -37 -9
Ejemplo 58
5 Inhibición de la secreción de partículas de lipoproteína (a) con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B-100
Se evaluó la secreción de partículas de lipoproteína (a), que están compuestas de una molécula de apolipoproteína
(a) unida covalentemente a una molécula de apolipoproteína B, en hepatocitos humanos primarios tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos al componente apolipoproteína B de la lipoproteína (a).
10 Hepatocitos humanos primarios (InVitro Technologies, Baltimore, MD), cultivados y transfectados como se describe en la presente memoria, se trataron durante 24 h con 50 ó 150 nM de ISIS 271009 (SEQ ID NO: 319), 281625 (SEQ ID NO: 224), 301012 (SEQ ID NO: 247) o 301027 (SEQ ID NO: 262). Las células también se trataron con concentración 150 nM de los oligonucleótidos de control ISIS 113529 (SEQ ID NO: 859) o ISIS 13650 (SEQ ID NO: 806). Las células no tratadas sirvieron de control. Después de 24 h de tratamiento con el oligonucleótido, se midió la
15 cantidad de lipoproteína (a) en el medio de cultivo recogido de las células tratadas, usando un kit de ELISA disponible en el comercio (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Los resultados son la media de 3 experimentos y se expresan como el porcentaje de cambio en la secreción de lipoproteína (a) con respecto a los controles no tratados. Los datos se muestran en la Tabla 39. Un "+" o "-" que preceden al número indica que la secreción de partículas de lipoproteína (a) aumentó o disminuyó, respectivamente, después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido
20 dirigidos a la apolipoproteína B.
Tabla 39
Inhibición de la secreción de partículas de lipoproteína (a) con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B
% de cambio en la secreción de lipoproteína (a)
Dosis de oligonucleótido
nº de ISIS
271009
281625 301012 301027 13650 113529
50 nM
-25 -26 -27 -33 N.D. N.D.
150 nM
-42 -24 -37 -44 +14 +14
25 Estos datos demuestran que la inhibición antisentido de la apolipoproteína B, un componente de la partícula de lipoproteína (a), puede reducir la secreción de lipoproteína (a) de hepatocitos humanos primarios. Además, esta reducción en la secreción de lipoproteína (a) no es necesariamente simultánea con una disminución de la expresión de ARNm de apolipoproteína (a), como se muestra en el ejemplo 57.
Ejemplo 59
30 Derivados con apareamientos erróneos y truncados de ISIS 301012
Como se demuestra en la presente memoria, ISIS 301012 (SEQ ID NO: 247) reduce los niveles de ARNm de la apolipoproteína B en líneas celulares humanas cultivadas igual que en los hepatocitos humanos primarios. En una realización adicional de la invención, se llevó a cabo un estudio usando derivados de la secuencia de nucleótidos de ISIS 301012. Se diseñó una serie de oligonucleótidos que contenían de 1 a 7 apareamientos erróneos de bases, 35 empezando en el centro de la secuencia de ISIS 301012. Esta serie se diseñó para introducir la pérdida consecutiva de emparejamientos de bases de Watson-Crick entre ISIS 301012 y su secuencia diana de ARNm. Estos compuestos se muestran en la Tabla 40. Los compuestos antisentido con nucleótidos mal apareados con respecto a ISIS 301012 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que contiene diez 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada por ambos lados (direcciones 5' y 3')
40 por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE)-nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido.
Se diseñó un derivado adicional de ISIS 301012 que comprendía la secuencia de ISIS 301012 con 2'MOEnucleótidos a lo largo del oligonucleótido (2'-MOE uniforme). Este compuesto tiene 20 nucleótidos de longitud, con enlaces fosforotioato a lo largo del oligonucleótido. Este compuesto también se muestra en la tabla 40.
45 Se trataron células HepG2 con los compuestos de la tabla 40 con 50 ó 150 nM, durante un periodo de 24 h, después de lo cual se aisló el ARN y se midió la expresión diana por PCR en tiempo real como se describe en la presente memoria. Células no tratadas sirvieron de control. Los resultados se muestran en la tabla 40 y están normalizados con respecto a las muestras de control.
Tabla 40
Efectos de los oligonucleótidos con apareamientos erróneos ISIS 301012 y un 2'MOE-oligonucleótido uniforme en la expresión de la apolipoproteína B en células HepG2
% de cambio en la expresión del ARNm de la apolipoproteína B
nº de ISIS
SECUENCIA nº de apareamientos erróneos Dosis de oligonucleótido SEQ ID NO
50
150
301012
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 0 -44 -75 247
Serie con apareamientos erróneos, oligonucleótidos quiméricos
332770
GCCTCAGTCTTCTTCGCACC 1 +7 -22 864
332771
GCCTCAGTCTTATTCGCACC 2 +37 +37 865
332772
GCCTCAGTATTATTCGCACC 3 +99 +84 866
332773
GCCTCATTATTATTCGCACC 4 +75 +80 867
332774
GCCTCATTATTATTAGCACC 5 +62 +66 868
332775
GCCTCATTATTATTATCACC 6 -1 +10 869
332776
GCCTAATTATTATTATCACC 7 +10 +20 870
2'-MOE-oligonucleótido uniforme
332769
GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 0 -11 -14 247
5 Los resultados del tratamiento de células HepG2 con los compuestos de la tabla 40 ponen de manifiesto que ninguno de los compuestos presenta la inhibición dependiente de la dosis observada después de tratamiento con la secuencia de ISIS 301012 original. ISIS 332770, que tiene solo una sustitución de timidina a citosina en el centro del oligonucleótido, era 3 veces menos potente que ISIS 301012. Sustituciones de nucleótidos adicionales anulan la inhibición antisentido de la expresión de la apolipoproteína B.
10 Los oligonucleótidos fosforotioato quiméricos son metabolizados in vivo predominantemente por escisión endonucleolítica. Se diseñó una serie de oligonucleótidos por truncado de la secuencia de ISIS 301012 en incrementos de 1 ó 2 bases desde el extremo 5' y/o 3'. Los oligonucleótidos truncados representan los posibles productos que resultan de la escisión endonucleolítica. Estos compuestos se muestran en la Tabla 41. Los compuestos en la tabla 41 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de diferentes longitudes, compuestos de
15 una región de "hueco" central que consiste en 2'-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos extremos por 2'metoxietil (2'-MOE)nucleótidos. La estructura exacta de cada oligonucleótido quimérico se designa en la tabla 41 como "estructura quimérica". Por ejemplo, una designación 4~10~4 indica que los primeros 4 (los más 5') y los últimos 4 (los más 3' ) son 2'-MOE-nucleótidos, y los 10 nucleótidos en el hueco son 2'-desoxinucleótidos. Los 2'MOE-nucleótidos se indican en negrilla. Los enlaces internucleósidos (cadena principal) son fosfodiéster (P=O) entre
20 nucleótidos resaltados; todos los demás enlaces internucleósidos son fosforotioato (P=S).
Se ensayó en estos compuestos su capacidad para reducir la expresión del ARNm de la apolipoproteína B. Se trataron células HepG2 con cada uno de los compuestos antisentido de la tabla 41, en concentración 10, 50 ó 150 nM, durante un periodo de 24 h, después de lo cual se aisló el ARN y se midió la expresión diana por PCR en tiempo real como se describe en la presente memoria. Células no tratadas sirvieron de control. Los resultados se muestran
25 en la tabla 41 y están normalizados con respecto a las muestras de control no tratadas.

Tabla 41 Efecto de los mutantes truncados de ISIS 301012 en la expresión de la apolipoproteína B en células HepG2
% de cambio en la expresión del ARNm de la apolipoproteína B
nº de ISIS
SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA SECUENCIA Estructura quimérica Dosis de oligonucleótido SEQ ID NO
10
50 150
301012
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCACC 5~10~5 -51 -72 -92 247
331022
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCAC 5~10~4 -33 -49 -87 871
332777
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTCGCA 5~10~3 -27 -53 -80 872
332778
3 3249 GCCTCAGTCTGCTTC 5~10~0 -11 -20 -58 873
332780
3 3248 CCTCAGTCTGCTTCGCAC 4~10~4 -3 -43 -74 874
332781
3 3247 CTCAGTCTGCTTCGCA 3~10~3 -9 -35 -60 875
332782
3 3246 TCAGTCTGCTTCGC 2~10~2 -16 -16 -69 876
332784
3 3249 GCCTCAGTCT 5~5~0 +12 -1 +7 877
332785
3 3238 GCTTCGCACC 0~5~5 +5 -2 - 4 878
Los resultados en la tabla 41 ilustran que la inhibición de la apolipoproteína B depende de la longitud de secuencia, 5 así como de la complementariedad de secuencia y la dosis, como se demuestra en la tabla 41, pero las versiones truncadas de ISIS 301012 son capaces en cierta medida de inhibir la expresión del ARNm de la apolipoproteína B.
Ejemplo 60
Diseño y cribado de los ARNdc que se dirigen a la apolipoproteína B humana
Se diseñó una serie de dúplex de ácido nucleico que comprendían los compuestos antisentido de la presente
10 descripción, y sus complementos para dirigirse a la apolipoproteína B y se muestran en la tabla 42. Todos los compuestos de la tabla 42 son oligorribonucleótidos de 20 nucleótidos de longitud con enlaces internucleósidos fosfodiéster (cadena principal) a lo largo del compuesto. Los compuestos se prepararon con extremos romos. La tabla 41 muestra la cadena antisentido de los ARNdc, y la cadena del mismo sentido se sintetiza como complemento de la cadena antisentido. Se muestra que estas secuencias contienen uracilo (U) pero un experto en la técnica
15 apreciará que el uracilo (U) generalmente es sustituido por timina (T) en las secuencias de ADN. El "sitio diana" indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular, al que se une el compuesto. Un subconjunto de los compuestos en la tabla 42 son los equivalentes de ARN de los oligonucleótidos antisentido descritos en la presente memoria, y cuando se aplique, esto se indica por el nº de ISIS del oligonucleótido de ADN en la columna de "ARN equivalente a nº de ISIS"

Tabla 42 ARNdc dirigidos a la apolipoproteína B humana
nº de ISIS
Región SEQ ID NO DE LA DIANA SITIO DIANA Secuencia SEQ ID NO ARN equivalente a nº de ISIS
342855
codificante 3 3249 GCCUCAGUCUGCUUCGCACC 247 301012
342856
3' UTR 3 13903 GCUCACUGUAUGGUUUUAUC 262 301027
342857
codificante 3 5589 AGGUUACCAGCCACAUGCAG 224 308361
342858
codificante 3 669 GAGCAGUUUCCAUACACGGU 130 270991
342859
codificante 3 1179 CCUCUCAGCUCAGUAACCAG 135 270996
342860
codificante 3 2331 GUAUAGCCAAAGUGGUCCAC 34 147797
342861
codificante 3 3579 UAAGCUGUAGCAGAUGAGUC 213 281614
342862
5' UTR 3 6 CAGCCCCGCAGGUCCCGGUG 249 301014
342863
5' UTR 3 116 GGUCCAUCGCCAGCUGCGGU 256 301021
342864
3' UTR 3 13910 AAGGCUGGCUCACUGUAUGG 266 301031
342865
3' UTR 3 13970 GCCAGCUUUGGUGCAGGUCC 273 301038
342866
codificante 3 426 UUGAAGCCAUACACCUCUUU 879 Ninguno
342867
codificante 3 3001 UGACCAGGACUGCCUGUUCU 880 Ninguno
342868
codificante 3 5484 GAAUAGGGCUGUAGCUGUAA 881 Ninguno
342869
codificante 3 6662 UAUACUGAUCAAAUUGUAUC 882 Ninguno
342870
codificante 3 8334 UGGAAUUCUGGUAUGUGAAG 883 Ninguno
342871
codificante 3 9621 AAAUCAAAUGAUUGCUUUGU 883 Ninguno
342872
codificante 3 10155 GUGAUGACACUUGAUUUAAA 885 Ninguno
342873
codificante 3 12300 GAAGCUGCCUCUUCUUCCCA 886 Ninguno
342874
codificante 3 113629 GAGAGUUGGUCUGAAAAAUC 887 Ninguno
Se ensayaron los efectos de los ARNdc de la tabla 42 en el ARNm de la apolipoproteína humana en células HepG2.
5 Las células HepG2 se trataron con compuestos de ARNdc 100 nM mezclados con LIPOFECTIN 5 μg/ml (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) durante un periodo de 16 h. En el mismo experimento, las células HepG2 también se trataron con un subconjunto de oligonucleótidos antisentido 150 nM descritos en la presente memoria mezclados con LIPOFECTIN 3,75 μg/ml; estos compuestos se indican en la Tabla 43. Los oligonucleótidos de control incluían ISIS 18078 (GTGCGCGCGAGCCCGAAATC, SEQ ID NO: 888). ISIS 18078 es un oligonucleótido quimérico
10 ("gápmero") de 20 nucleótidos de longitud, compuesto de una región de "hueco" central que consiste en 9 2'desoxinucleótidos, que está flanqueada en los extremos 5' y 3' por un "ala" de 5 nucleótidos y un "ala" de 6 nucleótidos, respectivamente. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE)-nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todas las citidinas son 5-metilcitidinas. El dúplex de ISIS 263188 (CUUCUGGCAUCCGGUUUAGTT, SEQ ID NO: 889) y su
15 complementario también se usan como control. ISIS 263188 es un oligoribonucleótido de 21 nucleótidos de longitud siendo los 2 nucleótidos del extremo 3'-oligodesoxirribonucleótidos (TT) y con enlaces internucleósido fosfodiéster (cadena principal) a lo largo del compuesto.
Las células se trataron durante 4 h, después de lo cual se midió la expresión del ARNm de la apolipoproteína B humana como se describe en los ejemplos en la presente memoria. Los resultados se normalizaron con respecto a
20 las células de control no tratadas, las cuales no se trataron con LIPOFECTIN u oligonucleótido. Los datos son la media de 4 experimentos y se presentan en la tabla 43.

Tabla 43 Inhibición del ARNm de la apolipoproteína B por los ARNdc en células HepG2
nº de ISIS
Dosis % inhibición SEQ ID No
342855
100 nM 53 247
342856
100 nM 34 262
342857
100 nM 55 224
342858
100 nM 44 130
342859
100 nM 23 135
342860
100 nM 34 34
342861
100 nM 42 213
342862
100 nM 16 249
342863
100 nM 34 256
342864
100 nM 53 266
342865
100 nM 50 273
342866
100 nM 12 879
342867
100 nM 26 880
342868
100 nM 36 881
342869
100 nM 78 882
342870
100 nM 71 883
342871
100 nM 9 883
342872
100 nM 2 885
342873
100 nM 53 886
342874
100 nM 73 887
281625
150 nM 79 224
301012
150 nM 77 247
301014
150 nM 88 249
301021
150 nM 67 256
301027
150 nM 79 262
301028
150 nM 85 263
301029
150 nM 77 264
301030
150 nM 70 265
301031
150 nM 73 266
301037
150 nM 80 272
301038
150 nM 84 273
301045
150 nM 77 280
263188
150 nM 26 888
18078
150 nM 13 889
Ejemplo 61
5 Inhibición antisentido de la apolipoproteína B en hepatocitos primarios de macaco cangrejero
Como se demostró en el ejemplo 46, la región que contiene el sitio diana con el que hibrida ISIS 301012 comparte una identidad de 96% con la correspondiente región de la secuencia de ARNm de la apolipoproteína B del macaco cangrejero. ISIS 301012 contiene dos nucleótidos mal apareados con respecto a la secuencia de ARNm de la apolipoproteína B del macaco cangrejero con la que hibrida. En un aspecto adicional de la descripción, se diseñaron 10 oligonucleótidos para dirigirse al ARNm de la apolipoproteína B de mono, usando la secuencia parcial de la apolipoproteína B del macaco cangrejero descrita en la presente memoria (SEQ ID NO: 855) y una parte adicional de la secuencia de ARN de la apolipoproteína B de macaco cangrejero, incorporada en la presente memoria como SEQ ID NO: 890. El sitio diana indica el número del primer nucleótido (más 5') en la secuencia diana particular a la que se une el oligonucleótido. Para ISIS 326358 (GCCTCAGTCTGCTTTACACC, SEQ ID NO: 891) el sitio diana es 15 el nucleótido 168 de la SEQ ID NO: 855 y para ISIS 315089 (AGATTACCAGCCATATGCAG, SEQ ID NO: 892) el sitio diana es el nucleótido 19 de la SEQ ID NO: 890. ISIS 326358 e ISIS 315089 son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros") de 20 nucleótidos de longitud, compuestos de una región de "hueco" central que consiste en 10 2'desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (direcciones 5' y 3') por "alas" de 5 nucleótidos. Las alas están compuestas por 2'-metoxietil (2'-MOE)-nucleótidos. Los enlaces internucleosídicos (cadena principal) son 20 enlaces fosforotioato (P=S) a lo largo de todo el oligonucleótido. Todos los residuos de citidina son 5-metilcitidinas.
ISIS 326358 e ISIS 315089 son los equivalentes del macaco cangrejero de los oligonucleótidos antisentido para la apolipoproteína B humana ISIS 301012 (SEQ ID NO: 247) e ISIS 281625 (SEQ ID NO: 224), respectivamente.
Se comparó la inhibición antisentido de ISIS 301012 con la de ISIS 326358, que tiene una correspondencia perfecta con la secuencia de la apolipoproteína B del macaco cangrejero con la que hibrida ISIS 301012. Se analizó el efecto 5 de los compuestos en los niveles de ARNm de la apolipoproteína B del macaco cangrejero en hepatocitos primarios de macaco cangrejero adquiridos en Vitro Technologies (Gaithersburg, MD). Los hepatocitos primarios de macaco cangrejero precultivados en placa se adquirieron en InVitro Technologies (Baltimore, MD). Las células se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) complementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), 100 unidades/ml y 100 μg/ml de estreptomicina (Invitrogen
10 Corporation, Carlsbad, CA).
Los hepatocitos primarios de macaco cangrejero se trataron con oligonucleótidos antisentido 10, 50, 150 ó 300 nM durante 48 h. ISIS 113529 (SEQ ID NO: 859) se usó como un oligonucleótido de control. Las células no tratadas también sirvieron de control. Los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de macaco cangrejero se cuantificaron por PCR en tiempo real usando los cebadores de la apolipoproteína B humana y GAPDH y las sondas descritas en
15 los ejemplos en la presente memoria. Los resultados, mostrados en la tabla 44, son la media de 6 experimentos y se expresan como porcentaje de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B normalizados con respecto a las células de control no tratadas.
Tabla 44
Inhibición del ARNm de la apolipoproteína B del macaco cangrejero por ISIS 301012 e ISIS 326358
% de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B
nº de ISIS
Dosis de oligonucleótido
Tiempo de tratamiento 326358 301012 113529
(horas)
10 nM
24 35 24 N.D.
48
85 76 N.D.
50 nM
24 66 60 N.D.
48
88 77 N.D.
150 nM
24 61 56 5
48
82 88 42
300 nM
24 64 61 19
48
87 86 13
Estos datos demuestran que tanto ISIS 326359 como ISIS 301012 (a pesar de dos apareamientos erróneos con la secuencia de la apolipoproteína B del macaco cangrejero) pueden inhibir la expresión del ARNm de la apolipoproteína B en hepatocitos primarios de macaco cangrejero, de una forma dependiente de la dosis y del tiempo.
25 Se midió la proteína apolipoproteína B secretada por hepatocitos primarios de macaco cangrejero tratados con oligonucleótido 150 y 300 nM por ELISA, usando un kit específico de proteína apolipoproteína B (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Cada resultado representa la media de 3 experimentos. Los datos se normalizan respecto a las células de control no tratadas y se muestran en la tabla 45.
Tabla 45
30 Reducción de la proteína apolipoproteína B secretada por hepatocitos de macaco cangrejero después de tratamiento con oligonucleótido antisentido
% de reducción de la proteína apolipoproteína B secretada
nº de ISIS
Dosis de oligonucleótido
Tiempo de tratamiento (horas) 326358 301012 113529
150 nM
24 21 31 11
48
29 25 18
300 nM
24 17 10 12
48
35 17 8
Estos resultados demuestran que la inhibición antisentido por ISIS 301012 e ISIS 326358 conduce a una disminución de la secreción de la proteína apolipoproteína B de hepatocitos de macaco cangrejero primarios cultivados.
Además, la proteína se aisló de los hepatocitos de macaco cangrejero primarios tratados con oligonucleótido y se sometieron a análisis de inmunotransferencia para evaluar mejor la expresión de la proteína apolipoproteína B. La inmunotransferencia se realizó como se describe en la presente memoria, usando un anticuerpo contra la proteína apolipoproteína B humana (US Biologicals, Swampscott, MA). El análisis de inmunotransferencia de la expresión de la apolipoproteína B después del tratamiento con oligonucleótido antisentido con ISIS 326358 e ISIS 301012 pone de manifiesto una reducción sustancial de la expresión de la apolipoproteína B.
En un aspecto adicional de la descripción, se comparó la inhibición antisentido por ISIS 281625 con la de ISIS 315089, que es una correspondencia perfecta con la secuencia de la apolipoproteína B del macaco cangrejero con la que hibrida ISIS 281625. Hepatocitos primarios de macaco cangrejero, cultivados como se describe en la presente memoria, se trataron con ISIS 315089 o ISIS 281625, 10, 50, 150 ó 300 nM durante 24 h. Las células se trataron con el oligonucleótido de control ISIS 13650 (SEQ ID NO: 806) 150 y 300 nM o con ISIS 113529 (SEQ ID NO: 859) 300 nM. Las células no tratadas también sirvieron de control. Se cuantificaron los niveles de ARNm de la apolipoproteína B en los hepatocitos primarios de macaco cangrejero usando la PCR en tiempo real con cebadores y sonda humanos como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los resultados, mostrados en la tabla 46, son la media de 3 experimentos y se expresan como porcentaje de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B normalizados con respecto a las células de control no tratadas. Cuando está presente, un "+" que precede al valor indica que aumentó la expresión de ARNm.
Tabla 46
Inhibición antisentido de la expresión del ARNm de la apolipoproteína B en hepatocitos de macaco cangrejero
% de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B
nº de ISIS
Dosis de oligonucleótido
315089 281625 13650 113529
10 nM
70 +5 N.D. N.D.
50 nM
83 41 N.D. N.D.
150 nM
81 35 +50 N.D.
300 nM
82 69 33 28
Estos datos demuestran que tanto ISIS 315089 como ISIS 281625 pueden inhibir la expresión del ARNm de la apolipoproteína B en hepatocitos primarios de macaco cangrejero, de una forma dependiente de la dosis.
Se midió la proteína apolipoproteína B secretada por hepatocitos primarios de macaco cangrejero tratados con ISIS 315089 e ISIS 281625, 50 y 150 nM, por ELISA usando un kit específico de la proteína apolipoproteína B (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Cada resultados representa la media de 3 experimentos. Los datos se normalizan respecto a las células de control no tratadas y se muestran en la tabla 47.
Tabla 47
Reducción de la proteína apolipoproteína B secretada por hepatocitos de macaco cangrejero después de tratamiento con oligonucleótido antisentido
% de reducción de la secreción de proteína apolipoproteína B de mono
nº de ISIS
Dosis de oligonucleótido
315089 281625 13650 113529
50 nM
11 6 16 N.D.
150 nM
25 13 13 12
Estos resultados demuestran que la inhibición antisentido por ISIS 315089 150 mM conduce a una disminución de la secreción de la proteína apolipoproteína B de hepatocitos de macaco cangrejero primarios cultivados.
También se ensayaron los efectos de ISIS 271009 (SEQ ID NO: 319) e ISIS 301027 (SEQ ID NO: 262) en el ARNm de la apolipoproteína B y expresión de proteína en hepatocitos primarios de macaco cangrejero. Las células cultivadas como se describe en la presente memoria, se trataron con ISIS 271009 o ISIS 301027, 10, 50 y 150 nM durante 24 h. Las células se trataron con el oligonucleótido de control ISIS 113529 (SEQ ID NO: 859) 150 nM. Las células no tratadas también sirvieron de control. Se cuantificaron los niveles de ARNm de la apolipoproteína B en los hepatocitos primarios de macaco cangrejero usando la PCR en tiempo real con cebadores y sonda humanos como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los resultados, mostrados en la tabla 48, son la media de 2
experimentos y se expresan como porcentaje de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B normalizados con respecto a las células de control no tratadas. Tabla 48 Inhibición antisentido de la expresión del ARNm de la apolipoproteína B en hepatocitos de macaco cangrejero
% de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B
nº de ISIS
Dosis de oligonucleótido
271009 301027 113529
10 nM
42 40 N.D.
50 nM
66 54 N.D.
150 nM
69 67 11
Estos datos demuestran que tanto ISIS 271009 como ISIS 301027 pueden inhibir la expresión del ARNm de la apolipoproteína B en hepatocitos primarios de macaco cangrejero, de una forma dependiente de la dosis.
Se midió la proteína apolipoproteína B secretada por hepatocitos primarios de macaco cangrejero tratados con ISIS 271009 e ISIS 301027, 50 y 150 nM, por ELISA usando un kit específico de la proteína apolipoproteína B (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Cada resultados representa la media de 3 experimentos. Los datos se muestran como porcentaje de reducción de la proteína secretada, normalizados con respecto a las células de control no tratadas y se muestran en la tabla 49. Cuando está presente, un "+" indica que la secreción de proteína era mayor.
Tabla 49
Reducción de la proteína apolipoproteína B secretada por hepatocitos de macaco cangrejero después de tratamiento con oligonucleótido antisentido
% de reducción de la secreción de proteína apolipoproteína B de mono
nº de ISIS
Dosis de oligonucleótido
271009 301027 13650 113529
50 nM
+30 25 N.D. N.D.
150 nM
26 31 +1 15
Estos resultados demuestran que la inhibición antisentido por ISIS 315089 e ISIS 281625 conduce a una disminución de la secreción de la proteína apolipoproteína B de hepatocitos de macaco cangrejero primarios cultivados.
Ejemplo 62
Métodos para evaluar la esteatosis hepática
La esteatosis hepática se refiere a la acumulación de lípidos en el hígado o "hígado graso", que es producida con frecuencia por el consumo de alcohol, diabetes e hiperlipidemia. Se evaluó en los hígados de animales tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B la presencia de esteatosis. La esteatosis se evalúa por análisis histológico de tejido hepático y medida de los niveles de triglicéridos en el hígado.
El tejido reseccionado del hígado se sumerge inmediatamente en compuesto de inmersión Tissue Tek OCT (Ted Pella, Inc., Redding, CA) y se congela en una suspensión de hielo seco de 2-metil-butano. Las secciones de tejido se cortan con un grosor de 4-5 μm y después se fijan en formalina tamponada neutra al 5%. Las secciones de tejido se tiñen con hematoxilina y eosina siguiendo procedimientos histológicos estándar para visualizar los núcleos y citoplasma, respectivamente, y rojo oleoso O de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Newcomers Supply, Middleton, WI) para visualizar los lípidos.
Alternativamente, los tejidos se fijan en formalina tamponada neutra al 10%, se sumergen en parafina, se cortan en secciones de 4-5 μm de grosor, se desparafinan y se tiñen con hematoxilina y eosina, todo de acuerdo con procedimientos histológicos estándar.
También se usa la cuantificación del contenido de triglicéridos para evaluar la estatosis. Los niveles de triglicéridos en los tejidos se miden usando un ensayo GPO de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Ejemplo 63
Efectos de la inhibición antisentido por ISIS 301012 en ratones magros: estudio a largo plazo
La toxicidad de ISIS 301012 (SEQ ID NO: 247) se investiga en un estudio de 3 meses, a largo plazo, en ratones. Se administra a ratones CD-1 macho y hembra, de 2 meses de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) 2, 5, 12,5, 25 ó 50 mg/kg de ISIS 301012 dos veces por semana durante la primera semana, y después cada 4 días. Los ratones se mantienen con una dieta de roedores estándar. Los animales con disolución salina u oligonucleótido de control sirven como controles y las inyecciones siguen el mismo esquema. Cada grupo de tratamiento contiene de 6 a 10 ratones de cada sexo, y cada grupo de tratamiento está por duplicado, un grupo para terminar el estudio en 1 mes, el otro para terminar el estudio en 3 meses. Después de los periodos de tratamiento de 1 ó 3 meses, los ratones son sacrificados y se evalúa la expresión de la diana en el hígado, los niveles de lípidos en el suero y los indicadores de toxicidad. Se obtienen muestras de hígado, se aísla el ARN y se mide la expresión del ARNm de la apolipoproteína B por la PCR en tiempo real como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los lípidos en el suero, incluyendo el colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL y triglicéridos se evaluaron mediante análisis clínicos rutinarios usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY). También se calcularon las relaciones de colesterol LDL a colesterol HDL y de colesterol total a colesterol HDL. El análisis de ALT y AST en el suero, infiltrados inflamatorios en el tejido y gránulos basófilos en el tejido proporcionan una evaluación de las toxicidades relacionadas con el tratamiento. La esteatosis hepática, o acumulación de lípidos en el hígado, se evalúa mediante análisis histológicos de rutina con tinción con rojo oleoso O y la medición de triglicéridos en el tejido hepático, usando un ensayo GPO de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
El estudio de toxicidad también incluye grupos de animales que se dejan recuperar tras cesar el tratamiento con oligonucleótido. Se tratan ratones CD-1 tanto machos como hembras (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con 5, 10, 50 mg/kg de ISIS 301012 dos veces por semana durante la primera semana y después cada 4 días. Los animales a los que se inyectó disolución salina y oligonucleótido de control sirven como controles. Cada grupo de tratamiento incluye 6 animales por sexo. Después de 3 meses de tratamiento, los animales permanecen sin tratamiento durante 3 meses adicionales, después de los cuales se sacrifican. Se evalúan los mismos parámetros que en los ratones sacrificados inmediatamente después de 3 meses de tratamiento.
Después de 1 mes de tratamiento, la cuantificación por PCR en tiempo real pone de manifiesto que los niveles de ARNm de la apolipoproteína B en el hígado se reducen en 53%. Además, se observaron las toxicidades de dosisrespuesta esperadas. Los niveles de ALT y AST, medidos por procedimientos clínicos rutinarios en un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY), son mayores en ratones tratados con 25 ó 50 mg/kg de ISIS 301012. Los tejidos se prepararon para el análisis por procedimientos histológicos rutinarios. Se observaron gránulos basófilos en el hígado y tejido de riñón con dosis de ISIS 301012 superiores a 12,5 mg/kg. Se observaron infiltrados linfohistocitarios en diferentes tejidos con dosis mayores de 12,5 mg/kg de ISIS 301012. La tinción de las secciones de tejido con rojo oleoso O pone de manifiesto que no hay estatosis después de los tratamientos con oligonucleótido.
Ejemplo 64
Efectos de la inhibición antisentido por ISIS 301012 en macacos cangrejeros magros: estudio a largo plazo
Como se describe en el ejemplo 45, se usan macacos cangrejeros (machos o hembras) para evaluar el potencial de los oligonucleótidos antisentido para reducir los niveles de proteína o ARNm de la apolipoproteína B, así como criterios de valoración fenotípicos asociados con la apolipoproteína B incluyendo, pero sin limitar, indicadores cardiovasculares, aterosclerosis, enfermedades lipídicas, obesidad y formación de placa. Por consiguiente, en una realización adicional de la invención, se investigan los efectos de ISIS 301012 (SEQ ID NO: 247) en un estudio a largo plazo en la expresión de la apolipoproteína B y los lípidos en el suero en macacos cangrejeros. Dicho estudio a largo plazo también se usa para evaluar la toxicidad de los compuestos antisentido.
Se tratan macacos cangrejeros machos y hembra con 2, 4 ó 12 mg/kg de ISIS 301012 por vía intravenosa, o con 2 ó 20 mg/kg por vía subcutánea con una frecuencia de cada dos días la primera semana, y después cada 4 días, durante periodos de 1 y 3 meses de tratamiento. Los animales tratados con disolución salina sirven como controles. Cada grupo de tratamiento incluye de 2 a 3 animales de cada sexo.
Con un intervalo de un mes y a los 3 meses de la terminación del estudio, se sacrifican los animales y se evalúa la expresión de la diana en el hígado, los niveles de lípidos en suero y los indicadores de toxicidad. Se obtienen muestras de hígado, se aísla el ARN y se mide la expresión del ARNm de la apolipoproteína B por la PCR en tiempo real como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los lípidos en el suero, incluyendo el colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL y triglicéridos se evaluaron mediante análisis clínicos rutinarios usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY). También se calcularon las relaciones de colesterol LDL a colesterol HDL y de colesterol total a colesterol HDL. El análisis de ALT y AST en el suero, infiltrados inflamatorios en el tejido y gránulos basófilos en el tejido proporcionan una evaluación de las toxicidades relacionadas con el tratamiento. La esteatosis hepática, o acumulación de lípidos en el hígado, se evalúa mediante análisis histológicos de rutina con tinción con Oil Red O y la medición de triglicéridos en el tejido hepático, usando un
ensayo GPO de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Los grupos de tratamiento adicionales, consistían en 2 animales por sexo, que se tratan con disolución salina (0 mg/kg), 12 ó 20 mg/kg de ISIS 301012 con una frecuencia de cada dos días durante la primera semana, y después cada 4 días, durante un periodo de 3 meses. Después del periodo de tratamiento, los animales no reciben tratamiento durante 3 meses adicionales. Estos grupos de tratamiento están dirigidos al estudio de los efectos de la inhibición de la apolipoproteína B 3 meses después de cesar el tratamiento. Al final del periodo de recuperación de 3 meses, los animales se sacrifican y se evalúan los mismos parámetros que en los animales sacrificados inmediatamente después de 1 y 3 meses de tratamiento.
Los resultados procedentes del intervalo de un mes del tratamiento a largo plazo, se muestran en la Tabla 50 y están normalizados con respecto a animales tratados con disolución salina, para el ARNm y respecto a los valores de referencia no tratados, para los niveles de lípidos. Los niveles en suero de colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL, concentración de partículas de LDL y triglicéridos se midieron por espectroscopia de resonancia magnética nuclear mediante Liposcience (Raleigh, NC). Además, la concentración de oligonucleótido intacto en el hígado se midió mediante electroforesis en gel capilar y se presenta como microgramos de oligonucleótido por gramo de tejido hepático. Cada resultado representa el promedio de los datos de 4 animales (2 machos y 2 hembras).
Tabla 50
Efectos de la inhibición antisentido por ISIS 301012 en macacos cangrejeros magros:
Administración intravenosa
Inyección subcutánea
2 mg/kg
4 mg/kg 12 mg/kg 3,5 mg/kg 20 mg/kg
% de cambio de la expresión de la apolipoproteína B normalizado respecto a la disolución salina
-45 -76 -96 N.D. -94
Concentración del oligonucleótido antisentido μg/g
92 179 550 N.D. 855
Parámetros lipídicos, % de cambio normalizado frente al valor de referencia no tratado
Disolución salina 2 mg/kg 4 mg/kg 12 mg/kg 3,5 mg/kg 20 mg/kg
Colesterol total
+1 -6 -2 -2 +5 -5
Colesterol LDL
+17 +15 +9 +3 -4 -16
Colesterol HDL
-11 -23 -15 -8 +13 +5
LDL/HDL
+62 +94 +38 +44 -15 -19
Colesterol total/HDL
+30 +44 +22 +21 -7 -10
Triglicérido
+37 +26 +32 +15 +1 -3
Concentración de partículas de LDL
+15 +8 +8 -11 -14 -21
Estos datos muestran que ISIS 301012 inhibe la expresión de la apolipoproteína B de una manera dependiente de la dosis en una especie de primates y de forma concomitante disminuye los niveles de lípidos con dosis más altas de ISIS 301012. Además, estos resultados demuestran que el oligonucleótido antisentido se acumula en el hígado de una forma dependiente de la dosis.
No se observó esteatosis hepática, o acumulación de lípidos en el hígado, después de 4 semanas de tratamiento con las dosis indicadas. Se observó una toxicidad esperada relacionada con la dosis, con las dosis más altas de 12 y 20 mg/kg, incluyendo un incremento transitorio de 1,2-1,3 veces en el tiempo de la tromboplastina parcial activada (APTT), durante las primeras 4 horas y gránulos basófilos en el hígado y el riñón (tal y como se determinó con un examen histológico de rutina con muestras de tejidos). No se observaron cambios funcionales en el riñón.
En un experimento similar, monos cangrejeros machos y hembras recibieron una dosis intravenosa de ISIS 301012 de 4 mg/kg, cada dos días durante la primera semana y después cada 4 días. Los grupos de animales se sacrificaron después de la primera dosis y la cuarta dosis, así como los días 11, 15 y 23 después de la cuarta dosis y la dosis final. Se aisló el ARN del hígado y se evaluaron los niveles de ARNm de la apolipoproteína B por PCR en tiempo real como se describe en la presente memoria. Los resultados de este experimento demuestran una reducción del 40% en la expresión del ARNm de la apolipoproteína B después de una dosis intravenosa única de 4 mg/kg de ISIS 301012. Además, después de 4 dosis de ISIS 301012 de 4 mg/kg, el ARNm diana se redujo en aproximadamente 85% y se mantuvo una reducción del 50% en el ARNm diana hasta 16 días después del cese del tratamiento con el oligonucleótido antisentido.
Ejemplo 65
Análisis de micromatrices: patrones de expresión génica en ratones magros frente a ratones alimentados con alto contenido de grasa
Ratones C57B1/6 se dividieron en los siguientes grupos, que consistían en 5 animales cada uno: (1) ratones con dieta magra, a los que se inyecta disolución salina (control magros); (2) ratones con una dieta con alto contenido en grasa; (3) ratones con una dieta con alto contenido en grasa a los que se inyectan 50 mg/kg del oligonucleótido de control 141923 (SEQ ID NO: 858); (4) ratones con una dieta con alto contenido en grasa a los que se les dan 20 mg/kg de atorvastatina de calcio (Lipitor®, Pfizer Inc.); (5) ratones con una dieta con alto contenido en grasa a los que se inyectan 10, 25 ó 50 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID NO: 109). Los tratamientos con disolución salina y oligonucleótido se administraron por vía intraperitoneal dos veces por semana durante 6 semanas. La atorvastatina se administró diariamente durante 6 semanas. Al terminar el estudio, se aislaron muestras de hígado de cada animal y se aisló el ARN para la evaluación cualitativa por transferencia Northern, micromatriz de ADN y PCR en tiempo real cuantitativa. La evaluación por transferencia Northern y la PCR en tiempo real cuantitativa se realizaron como se describe en otros ejemplos en la presente memoria.
Para el análisis de micromatrices de ADN, se prepararon muestras de hibridación a partir de 10 μg de ARN total aislado de cada hígado de ratón de acuerdo con el manual técnico de análisis de expresión de Affymetrix (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Las muestras se hibridaron con un chip de genes de ratón que contenía aproximadamente 22.000 genes, que posteriormente se lavó, se tiñó doblemente usando Fluidics Station 400 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) como define el protocolo del fabricante. Se hizo un barrido de los chips teñidos de la intensidad celular de la sonda con el escáner GeneArray (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Se calcularon los valores de las señales de cada conjunto de sondas usando el software de Affymetrix Microarray Suite v5.0 (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Se hizo el perfil de cada condición a partir de 5 muestras biológicas por grupo, un chip por muestra. El número de cambios de la expresión se computó usando la media geométrica de los valores de la señal Microarray Suite v5.0. El análisis estadístico usaba ANOVA de una vía seguido de 9 comparaciones por parejas. Todos los grupos se compararon con el grupo de alto contenido de grasa para determinar los cambios en la expresión génica que resultan del tratamiento con ISIS 147764. Los datos de las micromatrices se interpretaron usando una agrupación jerárquica para visualizar los patrones de expresión génica globales.
Los resultados de los análisis de micromatrices pusieron de manifiesto que el tratamiento con ISIS 147764 lleva el perfil de expresión génica en los ratones alimentados con alto contenido en grasa al perfil observado en los ratones magros. El análisis por PCR en tiempo real confirmó la reducción de la expresión del ARNm para los siguientes genes implicados en el metabolismo de lípidos: lipasa hepática, casete de unión a ATP sintasa de ácidos grasos, miembro 2 de la subfamilia D (ALD), proteína de unión a ácidos grasos intestinales 2, estearoil-CoA desaturasa-1 y HMG CoA reductasa.
Se evaluaron los niveles de ARNm de la apolipoproteína B de ratón y de colesterol en el suero como se describe en la presente memoria, para confirmar la inhibición antisentido por ISIS 147764 e ISIS 147483. Tanto los niveles de ARNm como los de colesterol disminuyeron de una forma dependiente de la dosis después de tratamiento con ISIS 147764 o ISIS 147483, como se demuestra en otros ejemplos en la presente memoria. La dosis de 50 mg/kg de ISIS 147483 aumentó los niveles de ALT y AST. Las dosis de 10, 25 y 50 mg/kg de ISIS 147764 y las dosis de 10 y 25 mg/kg de ISIS 147483 no elevaron significativamente los niveles de ALT o AST.
Ejemplo 66
Evaluación de la esteatosis hepática en animales tratados con oligonucleótidos antisentido de la apolipoproteína B
Se evaluó en los hígados de animales tratados con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B la presencia de esteatosis. La esteatosis se evalúa por análisis histológico de tejido hepático y medida de los niveles de triglicéridos en el hígado.
Evaluación de la esteatosis en animales alimentados con alto contenido en grasa, tratados con ISIS 147764 durante 6 semanas
Se evaluó en el tejido hepático de animales tratados con ISIS 147764 (SEQ ID NO: 109) y de control descritos en el ejemplo 21, la esteatosis al terminar el estudio después de 6 semanas de tratamiento. Se tiñeron secciones de tejido con rojo oleoso O y hematoxilina para visualizar los lípidos y núcleos respectivamente. También se tiñeron secciones de tejidos con hematoxilina y eosina para visualizar los núcleos y el citoplasma, respectivamente. El análisis histológico de secciones de tejidos teñidas por cualquiera de los métodos puso de manifiesto que no había diferencia en la esteatosis entre los animales tratados con disolución salina y los tratados con ISIS 147764, demostrando que un tratamiento de 6 semanas con ISIS 147764 no conduce a la acumulación de lípidos en el hígado.
Evaluación de la esteatosis después de tratamiento a largo plazo con inhibidor de la apolipoproteína B en animales alimentados con alto contenido en grasa
Se trataron ratones macho C57B1/6 dos veces por semana con inyecciones intraperitoneales de 25 mg/kg de ISIS 147764 (SEQ ID NO: 109) o 25 mg/kg de ISIS 141923 (SEQ ID NO: 858) durante 6, 12 y 20 semanas. Los animales tratados con disolución salina sirvieron como controles. Cada grupo de tratamiento contenía 4 animales. Los animales se sacrificaron a las 6, 12 y 20 semanas y se obtuvo tejido hepático para el análisis histológico y la 5 medición del contenido de triglicéridos en el tejido. Los resultados pusieron de manifiesto que no había diferencias significativas en el contenido de triglicéridos del tejido hepático cuando se comparan los animales tratados con ISIS 147764 con los animales tratados con disolución salina. Además, los análisis histológicos de la sección de tejido hepático demuestran que la esteatosis se reduce a las 12 y 20 semanas después de tratamiento de los ratones alimentados con alto contenido en grasa, con ISIS 147764, en comparación con los animales de control de
10 disolución salina que recibieron una dieta con alto contenido en grasa.
Evaluación de la estatosis en ratones magros
También se evaluó la acumulación de lípidos en el tejido hepático en ratones magros. Ratones macho C67B1/6 (Charles River Laboratories (Wilmington, MA) de 6 a 7 semanas de edad, se mantuvieron con una dieta de roedor estándar y se trataron dos veces por semana con inyecciones intraperitoneales de 25 ó 50 mg/kg de 147764 (SEQ
15 ID NO: 109) o 147483 (SEQ ID NO: 79) durante 6 semanas. Los animales tratados con disolución salina sirvieron como controles. Cada grupo de tratamiento estaba compuesto de 4 animales. Los animales se sacrificaron después del periodo de tratamiento de 6 semanas, momento en el que se recogieron el tejido hepático y el suero.
Se midieron los niveles de ARNm de la apolipoproteína B por PCR en tiempo real, como se describe en otros ejemplos en la presente memoria. Los datos mostrados en la tabla 51, representan la media de 4 animales y se
20 presentan como la inhibición con respecto a los controles tratados con disolución salina. Los resultados demuestran que tanto ISIS 147483 como ISIS 147764 inhiben la expresión del ARNm de la apolipoproteína B en ratones magros, de una forma dependiente de la dosis.
Tabla 51
Inhibición antisentido de ARNm de la apolipoproteína B en ratones magros
Tratamiento y dosis
ISIS
ISIS
147483
147764
25 mg/kg
50 mg/kg 25 mg/kg 50 mg/kg
% de inhibición del ARNm de la apolipoproteína B
79 91 48 77
El colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL y triglicéridos en el suero se midieron por análisis clínico rutinario usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY). Las enzimas hepáticas ALT y ALT en el suero también se midieron usando el analizador clínico Olympus. Estos resultados demuestran que ISIS 147764 disminuye los lípidos en el suero con respecto a los animales de control tratados con disolución salina. Los niveles
30 de ALT y AST no superan el intervalo normal para ratones (300 IU/l), indicando falta de toxicidad asociada al tratamiento. Los resultados son la media de los datos de 4 animales y se muestran en la tabla 52.
Tabla 52
Niveles de lípidos y enzimas hepáticas en el suero en ratones magros tratados con ISIS 147764 e ISIS 147483
Tratamiento y dosis
Disolución salina
ISIS 147483 ISIS 147764
25
50 25 50
mg/kg
mg/kg
mg/kg
mg/kg
Lípidos en el suero
Colesterol total mg/dl
164 153 183 114 57
Colesterol LDL mg/dl
25 26 39 29 18
Colesterol HDL mg/dl
127 117 131 79 38
Triglicéridos mg/dl
121 138 127 80 30
Enzimas hepáticas
ALT IU/l
105 73 57 47 48
AST IU/l
109 78 72 81 101
35 Se preparó tejido hepático por métodos histológicos rutinarios para evaluar la estatosis, como se describe en la presente memoria. El examen de muestras de tejido teñidas con rojo oleoso O o hematoxilina y eosina, pone de manifiesto que el tratamiento de ratones magros con oligonucleótidos antisentido para apolipoproteína B no produce estatosis.
Estudio de 6 meses para evaluar mejor la estatosis en ratones tratados con oligonucleótidos antisentido para la apolipoproteína B
Se usa un tratamiento a largo plazo de ratones con oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B para evaluar los efectos tóxicos y farmacológicos del tratamiento prolongado con compuestos antisentido. Se tratan ratones C57B1/6 tanto machos como hembras a los 2 meses de edad con 2, 5, 25 ó 50 mg/kg de oligonucleótido antisentido de la apolipoproteína B. Los tratamientos se administran por vía intraperitoneal cada 2 días durante la primera semana y después cada 4 días. Los ratones con disolución salina solo u oligonucleótido de control sirven como grupos de control. Cada grupo de tratamiento contiene de 25 a 30 ratones. Después de 6 meses de tratamiento, se sacrifica un subconjunto de ratones en cada grupo de tratamiento. Al resto de los ratones se les deja un periodo de recuperación de 3 meses sin tratamiento, después de lo cual se sacrifican. Se mide la expresión del ARNm de la apolipoproteína B por PCR en tiempo real como se describe para otros métodos en la presente memoria. También se prepara tejido hepático para medir el contenido de triglicéridos usando el ensayo GPO de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se recoge suero y se evalúa el contenido de lípidos, incluyendo el colesterol total, colesterol LDL, colesterol HDL y triglicéridos, usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY). También se miden las enzimas hepáticas ALT y AST en el suero, usando también el analizador clínico. Las muestras de suero se someten a análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo dirigido a la apolipoproteína B (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Los tejidos hepático, de riñón y otros se preparan por procedimientos rutinarios para los análisis histológicos. Se evalúa en los tejidos la presencia de gránulos basófilos e infiltrado inflamatorios. La esteatosis se evalúa por tinción con rojo oleoso O de las secciones de tejido hepático.
Ejemplo 67
Un modelo de ratón para la formación de placa aterosclerótica: ratones transgénicos para la apolipoproteína B que carecen del gen del receptor de LDL
El receptor de LDL es responsable de eliminar las partículas de LDL que contienen apolipoproteína B. Sin el receptor de LDL, los animales no pueden eliminar eficazmente las partículas de LDL que contienen apolipoproteína B del plasma. Por lo tanto los niveles en el plasma de apolipoproteína B y colesterol LDL son notablemente elevados. Se usan tanto ratones que expresan el transgén de la apolipoproteína B humana (TgN-hApoB +/+) como ratones deficientes para el receptor de LDL (LDLr -/-) como modelos animales de desarrollo de placa aterosclerótica. Cuando el genotipo de deficiencia de receptor de LDL se combina con el genotipo transgénico de apolipoproteína B humana (TgN-hApoB +/+; LDLr -/-), se desarrollan rápidamente placas ateroscleróticas. Los ratones con este contexto genético se usan para investigar la capacidad de los compuestos para prevenir la aterosclerosis y la formación de placa.
Ratones macho TgN-hApoB +/+;LDLr -/-se tratan dos veces por semana con 10 ó 20 mg/kg de oligonucleótidos antisentido para la apolipoproteína B durante 12 semanas. Los grupos de control se tratan con disolución salina o con oligonucleótido de control. El colesterol total en el suero, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos se miden a las 2, 4, 6, 8 y 12 semanas mediante análisis clínico rutinario usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY). Se mide la proteína apolipoproteína B humana en el suero a las 2, 4, 6, 8 y 12 semanas usando un kit de ELISA (ALerCHEK Inc., Portland, ME). El ARNm de la apolipoproteína humana y de ratón en el hígado se mide a las 12 semanas. Los resultados del estudio de 12 semanas sirven para evaluar el comportamiento farmacológico de ISIS 301012 en un modelo doblemente transgénico.
Además, se lleva a cabo un estudio de 4 meses en ratones TgN-hApoB +/+;LDLr -/-, con las condiciones de tratamiento usadas en el estudio de 12 semanas. Los ratones se tratan durante 4 meses con oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la apolipoproteína B humana para evaluar la capacidad de dichos compuestos para prevenir la formación de placa aterosclerótica. Al final del periodo de tratamiento de 4 meses, los ratones se anestesian y se perfunden con formalina al 10%. Se aísla el árbol arterial perfundido y se examina la presencia de placas ateroscleróticas. Se sumergen en parafina secciones del árbol arterial y se preparan para el análisis histológico usando modelos rutinarios. El colesterol total en el suero, colesterol HDL, colesterol LDL y triglicéridos se miden a las 2, 4, 6, 8, 12 y 16 semanas mediante análisis clínico rutinario usando un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc., Melville, NY). Se mide la proteína apolipoproteína B humana en el suero a las 2, 4, 6, 8, 12 y 16 semanas usando un kit de ELISA (ALerCHEK Inc., Portland, ME). Se mide el ARNm de apolipoproteína humana y de ratón en el hígado a las 16 semanas por PCR en tiempo real.
Ejemplo 68
Modelos de conejo para estudiar la formación de placa aterosclerótica
Se usa la variedad de conejo Watanabe con hiperlipidemia heredable (WHHL) como modelo para la formación de placa aterosclerótica. También se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda con una dieta con alto contenido en grasa como modelo de la formación de placa aterosclerótica. El tratamiento de los conejos WHHL o los conejos blancos de Nueva Zelanda alimentados con alto contenido en grasa, con compuestos antisentido para la apolipoproteína B, se usa para ensayar su potencial como tratamientos terapéuticos o profilácticos para la enfermedad de placa aterosclerótica. Se inyecta a los conejos 5, 10, 25 ó 50 mg/kg de oligonucleótidos antisentido dirigidos a la apolipoproteína B. Los animales tratados con disolución salina sola o un oligonucleótido de control sirven como controles. A lo largo del tratamiento se recogen muestras de suero y se evalúan los niveles de proteína apolipoproteína B por ELISA (kit de ALerCHEK Inc., Portland, ME) y los lípidos en el suero (colesterol, colesterol LDL, colesterol VLDL, colesterol HDL, triglicéridos) por análisis clínico rutinario. El contenido de triglicéridos del tejido hepático se mide usando un ensayo GPO de triglicéridos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se obtienen tejidos de hígado, riñón, corazón, aorta y otros tejidos y se procesan para el análisis histológico usando procedimientos rutinarios. Se examina en los tejidos de hígado y riñón las pruebas de gránulos basófilos e infiltrados inflamatorios. Se evalúa en el tejido hepático la esteatosis usando teñido con rojo oleoso O. Además, se examinan secciones aórticas teñidas con rojo oleoso O y hematoxilina para evaluar la formación de lesiones ateroscleróticas.
Ejemplo 69
Suministro oral de inhibidores de la apolipoproteína B
Los oligonucleótidos se pueden formular para el suministro in vivo en una forma farmacéutica aceptable, p. ej., como formulaciones parenterales o no parenterales. Las formulaciones parenterales incluyen formulaciones intravenosa (IV), subcutánea (SC), intraperitoneal (IP), intravítrea e intramuscular (IM), así como formulaciones para el suministro por inhalación pulmonar, administración intranasal, administración tópica, etc. Las formulaciones no parenterales incluyen formulaciones para el suministro por el canal alimentario, p. ej., administración oral, administración rectal, instilación intrayeyunal etc. La administración rectal incluye administración como un enema o un supositorio. La administración oral incluye la administración de una cápsula, una cápsula de gel, una píldora, un elixir, etc.
En algunas realizaciones, se puede administrar un oligonucleótido a un sujeto por una vía de administración oral. El sujeto puede ser un animal o un ser humano (hombre). Un sujeto animal puede ser un mamífero, tal como un ratón, rata, ratón, una rata, un perro, un cobaya, un mono, un primate no humano, un gato o un cerdo. Los primates no humanos incluyen monos y chimpancés. Un sujeto animal adecuado puede ser un animal experimental, tal como un ratón, rata, ratón, una rata, un perro, un mono, un primate no humano, un gato o un cerdo.
En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un paciente humano que necesita tratamiento terapéutico como se discute con más detalle en la presente memoria. En algunas realizaciones, el sujeto puede necesitar la modulación de la expresión de uno o más genes como se discute con más detalle en la presente memoria. En algunas realizaciones particulares, el sujeto puede necesitar la inhibición de la expresión de uno o más genes como se discute con más detalle en la presente memoria. En particular, el sujeto puede necesitar la modulación, es decir, inhibición o potenciación, de la apolipoproteína B con el fin de obtener las indicaciones terapéuticas discutidas con más detalle en la presente memoria.
En algunas realizaciones, las formulaciones de oligonucleótidos no parenterales (p. ej., orales) según la presente invención, producen una biodisponibilidad potenciada del oligonucleótido. En este contexto, el término "biodisponibilidad" se refiere a una medición de la porción de un fármaco administrado que llega al sistema circulatorio (por ejemplo, la sangre, especialmente el plasma sanguíneo) cuando se emplea un modo particular de administración para suministrar el fármaco. La biodisponibilidad potenciada se refiere a la capacidad de un modo de administración particular de suministrar el oligonucleótido al plasma de la sangre periférica de un sujeto, con respecto a otro modo de administración. Por ejemplo, cuando se usa un modo de administración no parenteral (p. ej., un modo oral) para introducir el fármaco en un sujeto, la biodisponibilidad para ese modo de administración se puede comparar con un modo diferente de administración, p. ej., un modo de administración IV. En algunas realizaciones, el área bajo la curva de la concentración del compuesto en el plasma sanguíneo (AUC0) después de la administración no parenteral (p. ej. oral, rectal, intrayeyunal) se puede dividir entre el área bajo la curva de la concentración de fármaco en el plasma después de administración intravenosa (i.v.) (AUCiv) para proporcionar un cociente adimensional (biodisponibilidad relativa, RB) que representa la fracción de compuesto absorbida por una ruta no parenteral comparado con la ruta IV. Se dice que la biodisponibilidad de una composición está potenciada en comparación con la biodisponibilidad de otra composición, cuando la biodisponibilidad relativa de la primera composición (RB1) es mayor que la biodisponibilidad relativa de la segunda composición (RB2).
En general, la biodisponibilidad se correlaciona con la eficacia terapéutica cuando la eficacia terapéutica de un compuesto está relacionada con la concentración sanguínea obtenida, incluso si el sitio de acción final del fármaco es intracelular (van Berge-Henegouwen et al., Gastroenterol., 1977, 73, 300). Se han usado estudios de biodisponibilidad para determinar el grado de absorción intestinal de un fármaco, midiendo el cambio en los niveles del fármaco en la sangre periférica después de una dosis oral (DiSanto, Chapter 76 In: Remington=s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 1451-1458).
En general, se dice que la biodisponibilidad de una composición oral está "potenciada" cuando su biodisponibilidad relativa es mayor que la biodisponibilidad de una composición que consiste sustancialmente en el oligonucleótido puro, es decir, el oligonucleótido en ausencia de un potenciador de la penetración.
La biodisponibilidad en el órgano se refiere a la concentración de un compuesto en un órgano. La biodisponibilidad en un órgano se puede medir en sujetos de ensayo por una variedad de medios, tales como mediante radiografía de todo el cuerpo. La biodisponibilidad en un órgano se puede modificar, por ejemplo, potenciar, con una o más modificaciones de un oligonucleótido, mediante el uso de uno o varios compuestos vehículos o excipientes, etc., tal y como se describe con más detalle en esta memoria. En general, un aumento de la biodisponibilidad se traducirá en un aumento de la biodisponibilidad de un órgano.
Las composiciones de oligonucleótidos orales según la presente invención, pueden comprender uno o más "potenciadores de la penetración en la mucosa" conocidos también como "potenciadores de la absorción" o simplemente como "potenciadores de la penetración". Por consiguiente, algunas realizaciones de la invención comprenden al menos un oligonucleótido en combinación con al menos un potenciador de la penetración. En general, un potenciador de la penetración es una sustancia que facilita el transporte de un fármaco a través de la o las membranas mucosas asociadas con el modo de administración deseado, p. ej., membranas del epitelio intestinal. Por consiguiente, es deseable seleccionar uno o más potenciadores de la penetración que faciliten la absorción de un oligonucleótido, sin interferir con la actividad del oligonucleótido, y de modo que el oligonucleótido se pueda introducir en el cuerpo de un animal sin efectos secundarios inaceptables tales como toxicidad, irritación o respuestas alérgicas.
Las realizaciones de la presente invención proporcionan composiciones que comprenden uno o más potenciadores de la penetración farmacéuticamente aceptables y métodos de uso de dichas composiciones, que producen la biodisponibilidad mejorada de los oligonucleótidos administrados por modos de administración no parenterales. Hasta ahora, se han usado algunos potenciadores de la penetración para mejorar la biodisponibilidad de determinados fármacos. Véase Muranishi, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 y Lee et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91. Se ha encontrado que la absorción y el suministro de oligonucleótidos, moléculas relativamente complejas que se sabe que son difíciles de administrar a animales y el hombre, se pueden mejorar mucho incluso cuando se administran por medios no parenterales por el uso de una serie de diferentes clases de potenciadores de la penetración.
En algunas realizaciones, las composiciones para la administración no parenteral incluyen una o más modificaciones de oligonucleótidos naturales (es decir, desoxirribosil-oligonucleótidos completamente fosfodiéster y ribosiloligonucleótidos completamente fosfodiéster). Dichas modificaciones pueden aumentar la afinidad de unión, estabilidad de nucleasa, permeabilidad celular o tisular, distribución tisular, u otra propiedad biológica o farmacocinética. Se pueden hacer modificaciones en la base, el conector o el azúcar, como se discute en general como más detalle en la presente memoria, en relación con la química de los oligonucleótidos. En algunas realizaciones de la invención, las composiciones para administrar a un sujeto, y en particular las composiciones orales para administrar a un sujeto animal o humano, comprenderán oligonucleótidos modificados que tienen una o más modificaciones para potenciar la afinidad, estabilidad, distribución tisular u otras propiedades biológicas.
Los conectores modificados adecuados incluyen conectores fosforotioato. En algunas realizaciones de acuerdo con la invención, el oligonucleótido tiene al menos un conector fosforotioato. Los enlaces fosforotioato proporcionan estabilidad frente a nucleasas, así como características de unión de proteínas plasmáticas al oligonucleótido. La estabilidad frente a nucleasas es útil para aumentar la vida útil in vivo de los oligonucleótidos, mientras que la unión a proteínas plasmáticas disminuye la tasa de aclaramiento de primer paso del oligonucleótido a través de la excreción renal. En algunas realizaciones según la presente invención, el oligonucleótido tiene al menos dos conectores fosforotioato. En algunas realizaciones en las que el oligonucleótido tiene exactamente n nucleósidos, el oligonucleótidos tiene de 1 a n-1 enlaces fosforotioato. En algunas realizaciones en las que el oligonucleótido tiene exactamente n nucleósidos, el oligonucleótidos tiene n-1 enlaces fosforotioato. En otras realizaciones en las que el oligonucleótido tiene exactamente n nucleósidos, y n es par, el oligonucleótidos tiene de 1 a n/2 enlaces fosforotioato, o cuando n es impar, de 1 a (n-1)/2 enlaces fosforotioato. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene enlaces fosfodiéster (PO) y fosforotioato (PS) que alternan. En otras realizaciones, el oligonucleótido tiene un tramo de dos o más enlaces PO consecutivos y al menos un tramo de dos o más enlaces PS. En otra realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos dos tramos de enlaces PO interrumpidos por al menos un enlace PS.
En algunas realizaciones, al menos uno de los nucleósidos está modificado en la unidad de azúcar de ribosilo por una modificación que imparte estabilidad a la nucleasa, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa. En algunos casos, la modificación del azúcar incluye una modificación 2', p. ej. el 2'-OH del azúcar ribosilo se reemplaza o sustituye. Los reemplazos adecuados para el 2'-OH incluyen 2'-F y 2'-arabino-F. Las sustituciones adecuadas para el OH incluyen 2'-O-alquilo, p. ej. 2-O-metilo y 2'-O-alquilo sustituido, p. ej. 2'-Ometoxietilo, 2'-O-aminopropilo, etc. En algunas realizaciones, el oligonucleótido contiene al menos una modificación 2'. En algunas realizaciones, el oligonucleótido contiene al menos 2 modificaciones 2'. En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos una modificación 2' en cada uno de los extremos (es decir, los nucleósidos 3' y 5' terminales tienen cada uno las mismas o diferentes modificaciones 2'). En algunas realizaciones, el oligonucleótido tiene al menos dos modificaciones 2' secuenciales en cada extremo del oligonucleótido. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden además al menos un desoxinucleósido. En realizaciones particulares, los oligonucleótidos comprenden un tramo de desoxinucleósidos de modo que el tramo es capaz de activar la escisión por la RNasa (p. ej., RNasa H) de un ARN con el que es capaz de hibridar el oligonucleótido. En algunas realizaciones, un tramo de desoxinucleósidos capaz de activar la escisión mediada por la RNasa del ARN comprende de aproximadamente 6 a aproximadamente 16, p. ej. de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 desoxinucleósidos consecutivos.
Las composiciones orales para la administración de composiciones de oligonucleótidos no parenterales de la presente invención, se pueden formular en diferentes formas de dosificación tales como, pero sin limitar, comprimidos, cápsulas, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. La expresión "suministro alimentario" abarca, p. ej., la administración oral, rectal, endoscópica y sublingual/bucal. Un requisito común para estos modos de administración es la absorción en alguna parte o en todo el tracto digestivo y la necesidad de la penetración eficaz en la mucosa del ácido o ácidos nucleicos así administrados.
El suministro de un fármaco por la mucosa oral, como es el caso de la administración bucal y sublingual, tiene varias características deseables, incluyendo, en muchos casos, una elevación más rápida de la concentración plasmática del fármaco que por el suministro oral (Harvey, capítulo 35 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, page 711).
Se puede usar la endoscopia para el suministro de fármaco directamente en una parte interior del tracto alimentario. Por ejemplo, la colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (CPRE) aprovecha la gastroscopia extendida y permite el acceso selectivo al tracto biliar y al conducto pancreático (Hirahata et al., Gan To Kagaku Ryoho, 1992, 19(10 Suppl.), 1591). Las composiciones farmacéuticas, incluyendo las formulaciones de liposomas, se pueden suministrar directamente en porciones del canal digestivo, tales como, p. ej., el duodeno (Somogyi et al., Pharm. Res., 1995, 12, 149) o la submucosa gástrica (Akamo et al., Japanese J. Cancer Res., 1994, 85, 652) por medios endoscópicos. También se pueden usar dispositivos de lavado gástrico (Inoue et al., Artif. organs, 1997, 21, 28) y dispositivos de alimentación endoscópica percutánea (Pennington et al., Ailment. Pharmacol. Ther., 1995, 9, 471) para el suministro alimentario directo de las composiciones farmacéuticas.
En algunas realizaciones, las formulaciones de oligonucleótidos se pueden administrar por el ano en el recto o el intestino inferior. Se pueden usar supositorios rectales, enemas de retención o catéteres rectales para este propósito y pueden ser preferidos cuando de lo contrario puede ser difícil conseguir la observancia del paciente (p. ej., en aplicaciones pediátricas y geriátrica, o cuando el paciente está vomitando o está inconsciente). La administración oral puede producir niveles en la sangre más rápidos y más altos que la ruta oral. (Harvey, capítulo 35 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, page 711). Debido a que aproximadamente el 50% del fármaco que es absorbido del recto no pasará el hígado, la administración por esta vía reduce significativamente el potencial del metabolismo de primer paso (Benet et al., capítulo 1 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996).
Un método ventajoso de las composiciones de oligonucleótidos de administración no parenteral es el suministro oral. Algunas realizaciones usan diferentes potenciadores de la penetración con el fin de realizar el transporte de oligonucleótidos y otros ácido nucleicos a través de las membranas mucosa y epitelial. Los potenciadores de la penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías: tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Por consiguiente, algunas realizaciones comprenden composiciones de oligonucleótidos orales que comprenden al menos un miembro que consiste en tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Otras realizaciones comprenden el oligonucleótido oral que comprende al menos un ácido graso, p. ej., ácido cáprico o láurico, o combinaciones o sales de los mismos. Otras realizaciones comprenden métodos para potenciar la biodisponibilidad oral de un oligonucleótido, comprendiendo el método la coadministración del oligonucleótido y al menos un potenciador de la penetración.
Otros excipientes que se pueden añadir a las composiciones de oligonucleótidos orales incluyen tensioactivos (o "agentes tensioactivos"), que son entidades químicas que, cuando se disuelven en una disolución acuosa reducen la tensión superficial de la disolución o la tensión interfases entre la disolución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se potencia la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa digestiva y otras membranas epiteliales. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, los tensioactivos incluyen, por ejemplo, laurilsulfato sódico, éter de laurilo y polioxietileno-9 y éter de cetilo y polioxietileno-20 (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252).
Los ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración y se pueden usar en composiciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido ndecanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerilo, 1dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas y sus mono y di-glicéridos y/o sus sales fisiológicamente aceptables (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651).
En algunas realizaciones, las composiciones de oligonucleótidos para el suministro oral comprenden al menos dos fases discretas, cuyas fases pueden comprender partículas, cápsulas, cápsulas de gel, microesferas, etc. Cada fase puede contener uno o más oligonucleótidos, potenciadores de la penetración, tensioactivos, bioadhesivos, agentes efervescentes, u otros adyuvantes, excipientes o diluyentes. En algunas realizaciones, una fase comprende al menos un oligonucleótidos y al menos un potenciador de la penetración. En algunas realizaciones, una primera fase comprende al menos un oligonucleótido y al menos un potenciador de la penetración, mientras que una segunda fase comprende al menos un potenciador de la penetración. En algunas realizaciones, una primera fase comprende al menos un oligonucleótido y al menos un potenciador de la penetración, mientras que una segunda fase comprende al menos un potenciador de la penetración y sustancialmente no comprende oligonucleótido. En algunas realizaciones, al menos una fase se mezcla con al menos un retardante de la degradación, tal como un recubrimiento o una matriz, que retrasa la liberación del contenido de esta fase. En algunas realizaciones, al menos una fase, en algunas realizaciones, una primera fase comprende al menos un oligonucleótido, al menos un potenciador de la penetración, mientras que una segunda fase comprende al menos un potenciador de la penetración y un retardante de la liberación. En realizaciones particulares, un oligonucleótido oral comprende una primera fase que comprende partículas que contienen un oligonucleótido y un potenciador de la penetración, y una segunda fase que comprende partículas recubiertas con un agente retardante de la liberación y contienen potenciador de la penetración.
Una variedad de sales biliares también funcionan como potenciadores de la penetración para facilitar la absorción y la biodisponibilidad de los fármacos. Las funciones fisiológicas de la bilis incluyen el facilitar la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, NY, 1996, pages 934-935). Diferentes sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como potenciadores de la penetración. Por lo tanto la expresión "sal biliar" incluye cualquiera de los componentes naturales de la bilis así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares de la invención incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o sus sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido deshidrocólico (deshidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (glicocolato de sodio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sodio), ácido taurocólico (taurocolato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sodio), ácido quenodesoxicólico (CDCA, quenodesoxicolato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidrofusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y éter de laurilo y polioxietileno9 (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 782783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579).
En algunas realizaciones, los potenciadores de la penetración útiles en algunas realizaciones de la presente invención, son mezclas de compuestos potenciadores de la penetración. Uno de dichos potenciadores de la penetración es una mezcla de UDCA (y/o CDCA) con ácidos cáprico y/o láurico o sales de los mismos, p. ej., de sodio. Dichas mezclas son útiles para potenciar el suministro de sustancias biológicamente activas a través de las membranas mucosas, en particular de la mucosa intestinal. Otras mezclas de potenciadores de la penetración comprenden aproximadamente 5-95% de ácidos biliares o sal(es) de UDCA y/o CDCA con 5-95% de ácido cáprico y/o láurico. Los potenciadores de la penetración particulares son mezclas de las sales sódicas de UDCA, ácido cáprico y ácido láurico, en una relación de aproximadamente 1:2:2, respectivamente. Otro de dichos potenciadores de la penetración es una mezcla de ácido cáprico y láurico (o sales de los mismos) en una relación de 0,01:1 a 1:0,01 (base en moles). En realizaciones particulares, el ácido cáprico y el ácido láurico están presentes en relaciones molares de aproximadamente 0,1:1 a aproximadamente 1:0,1, en particular de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 1:0,5.
Otros excipientes incluyen agentes quelantes, es decir, compuestos que eliminan iones metálicos de la disolución formando complejos con los mismos, con el resultado de que se potencia la absorción de los oligonucleótidos a través de la mucosa digestiva y otras mucosas. En relación con su uso como potenciadores de la penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de que también sirven como inhibidores de DNasa, ya que la mayoría de las ADN nucleasas caracterizadas requieren un ion metálico divalente para la catálisis y por lo tanto son inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315). Los agentes quelantes de la invención incluyen, pero sin limitar, etilendiaminatetraacetato de sodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (p. ej., salicilato, 5-metoxisalicilato y homovanilato de sodio), derivados de N-acilo del colágeno, derivados de laureth-9 y N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43).
Como se usa en la presente memoria, los potenciadores de la penetración no tensioactivos no quelantes se pueden definir como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que, no obstante, potencian la absorción de oligonucleótidos a través de la mucosa digestiva y otras membranas mucosas (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1). Esta clase de potenciadores de la penetración incluye, pero sin limitar, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil-y 1alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco de sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621).
También se pueden añadir agentes que potencian la captación de oligonucleótidos a nivel celular a las composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar lípidos catiónicos tales como la lipofectina (Junichi et al., patente de EE.UU. nº 5.705.188), derivados de glicerol catiónicos y moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731).
Algunas composiciones de oligonucleótidos orales también incorporan compuesto vehículo en la formulación. Como se usa en la presente memoria, el "compuesto vehículo" o "vehículo" se puede referir a un ácido nucleico o análogo del mismo, que puede ser inerte (es decir, no tiene actividad biológica por sí mismo) o puede ser necesario para el transporte, reconocimiento o ruta de activación o mediación, o es reconocido como un ácido nucleico por procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad del ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto vehículo, típicamente con un exceso de esta última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otros depósitos extracirculatorios, supuestamente debido a la competición entre el compuesto vehículo y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un oligonucleótido parcialmente fosforotioato en tejido hepático se puede reducir cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4acetamido-4'-isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 5; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177).
Un "vehículo farmacéutico" o un "excipiente" puede ser un disolvente farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para suministrar uno o varios ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la forma de administración planeada en mente, de modo que proporcione el volumen, consistencia, etc. deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los vehículos farmacéuticos típicos incluyen, pero sin limitar, agentes aglutinantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (p. ej., lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato sódico, acetato sódico, etc.); disgregantes (p. ej., almidón, glicolato sódico de almidón, EXPLOTAB); y agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato sódico, etc.).
Las composiciones orales de oligonucleótidos pueden contener adicionalmente otros componentes auxiliares encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmacéuticamente activos tales como, por ejemplo, agentes antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en la formulación física de diversas formas farmacéuticas de la composición de la presente invención, tales como colorantes, agentes de sabor, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deberían interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. A continuación se describen realizaciones adicionales de la invención:
1.
Un compuesto antisentido de 8 a 50 bases nucleicas de longitud, en el que dicho compuesto específicamente hibrida con los nucleótidos 2920-3420 expuestos en la SEQ ID NO: 3 e inhibe la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B humana después de 16 a 24 h en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en un cultivo en una concentración 150 nM.
2.
El compuesto antisentido de la realización 1, en el que dicho compuesto específicamente hibrida con los nucleótidos 3230-3288 expuestos en la SEQ ID NO: 3 e inhibe la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B humana después de 16 a 24 h en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en un cultivo en una concentración 150 nM.
3.
El compuesto antisentido de la realización 2, que es un oligonucleótido antisentido.
4.
El compuesto antisentido de la realización 3, en el que el oligonucleótido antisentido es un compuesto mimético de oligonucleótido.
5.
El compuesto antisentido de la realización 2, de 12 a 30 bases nucleicas de longitud.
6.
El compuesto antisentido de la realización 5, de 14 a 20 bases nucleicas de longitud.
7.
El compuesto antisentido de la realización 4, en el que el compuesto mimético de oligonucleótido comprende al menos un enlace fosforotioato.
8.
El compuesto antisentido de la realización 4, en el que el compuesto mimético de oligonucleótido comprende al menos un resto de 2'-O-metoxietil-azúcar.
9.
El compuesto antisentido de la realización 4, en el que el compuesto mimético de oligonucleótido comprende al menos una 5-metilcitosina.
10.
El compuesto antisentido de la realización 2, en el que el compuesto antisentido es un compuesto antisentido quimérico.
11.
El compuesto antisentido de la realización 10, en el que el compuesto antisentido quimérico es un compuesto antisentido fosforotioato quimérico.
12.
El compuesto antisentido de la realización 11, en el que el compuesto antisentido fosforotioato quimérico comprende alas de 2'-metoxietoxil-nucleótido y un hueco de 2'-desoxinucleótidos.
13.
El compuesto antisentido de la realización 12, en el que el compuesto antisentido fosforotioato quimérico comprende 10 2'-desoxinucleótidos.
14.
El compuesto antisentido de una cualquiera de las realizaciones 1-13, en el que dicho compuesto antisentido inhibe la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B humana después de 16 a 24 h en al menos 50%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivo en una concentración 150 nM.
15.
El compuesto antisentido de una cualquiera de las realizaciones 1-13, en el que al menos una base nucleica está covalentemente unida a un conjugado.
16.
Una composición que comprende el compuesto antisentido de una cualquiera de las realizaciones 1-13, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
17.
La composición de la realización 16, que además comprende un sistema de dispersión coloidal.
18.
Una composición que comprende un compuesto antisentido de cualquiera de las realizaciones 1-13, hibridado con una cadena complementaria.
19.
La composición de la realización 18, en la que la hibridación del compuesto antisentido con la cadena complementaria forma al menos un extremo romo.
20.
La composición de la realización 19, en la que la hibridación del compuesto antisentido con la cadena complementaria forma al menos dos extremos romos.
21.
Un compuesto oligonucleótido antisentido de 8 a 50 base nucleicas de longitud, que comprende al menos 8 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 247.
22.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 21, en el que el compuesto oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 247.
23.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 22, de 12 a 30 bases nucleicas de longitud.
24.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 23, de 14 a 20 bases nucleicas de longitud.
25.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 24, en el que el compuesto oligonucleótido antisentido tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 247.
26.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 25, en el que el compuesto oligonucleótido antisentido es un compuesto mimético de oligonucleótido.
27.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 26, en el que el compuesto mimético de oligonucleótido es un compuesto oligonucleótido fosforotioato quimérico.
28.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 27, en el que el compuesto oligonucleótido fosforotioato quimérico comprende alas de 2'-metoxietoxil-nucleótido y un hueco de 2'-desoxinucleótidos.
29.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 28, en el que el compuesto oligonucleótido fosforotioato quimérico comprende 10 2'-desoxinucleótidos.
30.
El compuesto oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las realizaciones 21-29, en el que al menos un oligonucleótido está covalentemente unido a un conjugado.
31.
Una composición que comprende el compuesto oligonucleótido antisentido de una cualquiera de las realizaciones 21-29, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
32.
La composición de la realización 31, que además comprende un sistema de dispersión coloidal.
33.
Una composición que comprende un compuesto oligonucleótido de cualquiera de las realizaciones 22-29, hibridado con una cadena complementaria.
34.
La composición de la realización 33, en la que la hibridación del compuesto oligonucleótido con la cadena
complementaria forma al menos un extremo romo.
35.
La composición de la realización 34, en la que la hibridación del compuesto oligonucleótido con la cadena complementaria forma al menos dos extremos romos.
36.
Un método para inhibir la expresión de la apolipoproteína B en células o tejidos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un compuesto de la realización 2, en condiciones tales que se inhiba la expresión de la apolipoproteína B.
37.
Un método para inhibir la expresión de la apolipoproteína B en células o tejidos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un compuesto de la realización 21, en condiciones tales que se inhiba la expresión de la apolipoproteína B.
38.
El método de la realización 36 o realización 37, en el que las células o tejidos se ponen en contacto in vivo.
39.
El método de la realización 38, en el que dicho contacto comprende la etapa de administrar el compuesto a un animal.
40.
El método de la realización 39, en el que el animal es un ser humano.
41.
El método de la realización 40, en el que el ser humano tiene una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B, y se administra una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto.
42.
El método de la realización 41, en el que el ser humano tiene una afección asociada con el metabolismo anómalo de lípidos.
43.
El método de la realización 41, en el que el ser humano tiene una afección asociada con el metabolismo anómalo del colesterol.
44.
El método de la realización 41, en el que el ser humano tiene una enfermedad cardiovascular.
45.
El método de la realización 44, en el que la enfermedad cardiovascular es la aterosclerosis.
46.
El método de la realización 41, en el que el ser humano tiene una afección metabólica anómala asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
47.
El método de la realización 46, en el que la afección metabólica anómala es la hiperlipidemia.
48.
El método de la realización 41, en el que el ser humano tiene diabetes.
49.
El método de la realización 41, en el que el ser humano es obeso.
50.
El método de la realización 40, en el que se administra una cantidad eficaz del compuesto para prevenir una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
51.
El método de la realización 40, en el que se administra una cantidad eficaz del compuesto para retrasar una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
52.
Un método para prevenir o retrasar el inicio de un aumento de los niveles de glucosa en un animal, que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 1.
53.
Un método para prevenir o retrasar el inicio de un aumento de los niveles de glucosa en un animal, que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 22.
54.
El método de la realización 52 o realización 53, en el que el animal es un ser humano.
55.
El método de la realización 54, en el que los niveles de glucosa son niveles de glucosa en el suero o el plasma.
56.
Un método para modular los niveles de colesterol en el suero en un animal, que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 1 ó 21.
57.
El método de la realización 56, en el que el animal es un ser humano.
58.
Un método para modular los niveles de lipoproteína en un animal, que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 1.
59.
Un método para modular los niveles de lipoproteína en un animal, que comprende administrar a dicho animal
una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 22.
60.
El método de la realización 58 o realización 59, en el que el animal es un ser humano.
61.
El método de la realización 60, en el que la lipoproteína es VLDL.
62.
El método de la realización 60, en el que la lipoproteína es HDL.
63.
El método de la realización 60, en el que la lipoproteína es LDL.
64.
El método de una cualquiera de las realizaciones 39, 52, 53, 56, 58 y 59, en el que el compuesto se administra por vía intravenosa.
65.El método de una cualquiera de las realizaciones 39, 52, 53, 56, 58 y 59, en el que el compuesto se administra por vía subcutánea.
66.
Un compuesto oligonucleótido antisentido de 20 bases nucleicas de longitud que tiene una secuencia de bases nucleicas como se expone en la SEQ ID NO: 247 y que comprende 5-metilcitidina en las bases nucleicas 2, 3, 5, 9, 12, 15, 17, 19 y 20, en el que cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato, las bases nucleicas 1-5 y 16-20 comprenden una modificación 2'-metoxietoxilo, y las bases nucleicas 6-15 son desoxinucleótidos.
67.
El compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 66, en el que un oligonucleótido está covalentemente unido a un conjugado.
68.
Una composición que comprende el compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 66, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
69.
La composición de la realización 68, que además comprende un sistema de dispersión coloidal.
70.
Una composición que comprende el compuesto oligonucleótido antisentido de la realización 66, hibridado con una cadena complementaria.
71.
Un método para inhibir la expresión de la apolipoproteína B en células o tejidos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un compuesto de la realización 66, de modo que se inhiba la expresión de la apolipoproteína B.
72.
El método de la realización 72 o realización 71, en el que las células o tejidos se ponen en contacto in vivo.
73.
El método de la realización 72, en el que dicho contacto comprende la etapa de administrar el compuesto a un animal.
74.
El método de la realización 73, en el que el animal es un ser humano.
75.
El método de la realización 74, en el que el ser humano tiene una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B, y se administra una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto.
76.
El método de la realización 75, en el que el ser humano tiene una afección asociada con el metabolismo anómalo de lípidos.
77.
El método de la realización 75, en el que el ser humano tiene una afección asociada con el metabolismo anómalo del colesterol.
78.
El método de la realización 75, en el que el ser humano tiene una enfermedad cardiovascular.
79.
El método de la realización 78, en el que la enfermedad cardiovascular es la aterosclerosis.
80.
El método de la realización 75, en el que el ser humano tiene una afección metabólica anómala asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
81.
El método de la realización 80, en el que la afección metabólica anómala es la hiperlipidemia.
82.
El método de la realización 75, en el que el ser humano tiene diabetes.
83.
El método de la realización 75, en el que el ser humano es obeso.
84.
El método de la realización 74, en el que se administra una cantidad eficaz del compuesto para prevenir una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
85.
El método de la realización 74, en el que se administra una cantidad eficaz del compuesto para retrasar una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
86.
Un método para prevenir o retrasar el inicio de un aumento de los niveles de glucosa en un ser humano, que comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 66.
87.
El método de la realización 86, en el que los niveles de glucosa son niveles de glucosa en el suero.
88.
El método de la realización 86, en el que los niveles de glucosa son niveles de glucosa en el plasma.
89.
Un método para modular los niveles de colesterol en el suero en un ser humano, que comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 66.
90.
Un método para modular los niveles de lipoproteína en un ser humano, que comprende administrar a dicho ser humano una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto de la realización 66.
91.
El método de la realización 90, en el que la lipoproteína es VLDL.
92.
El método de la realización 90, en el que la lipoproteína es HDL.
93.
El método de la realización 90, en el que la lipoproteína es LDL.
94.
El método de una cualquiera de las realizaciones 73-93, en el que el compuesto se administra por vía intravenosa.
95.
El método de una cualquiera de las realizaciones 73-93, en el que el compuesto se administra por vía subcutánea.
96.
El método de una cualquiera de las realizaciones 73-93, en el que el compuesto se administra por vía oral.
97.
Un kit que comprende un compuesto de una cualquiera de las realizaciones 1-15, 21-30 y 66-67.
98.
Un compuesto que comprende una primera cadena de bases nucleicas hibridada con una segunda cadena de bases nucleicas, cada cadena de 8 a 50 bases nucleicas de longitud, comprendiendo dicha primera cadena de bases nucleicas una secuencia de al menos 8 bases nucleicas contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, comprendiendo dicha segunda cadena de bases nucleicas una secuencia suficientemente complementaria de dicha primera cadena para permitir la hibridación estable, inhibiendo dicho compuesto la expresión del ARNm de la apolipoproteína B humana después de 16 a 24 h en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivo en una concentración 100 nM.
99.
El compuesto de la realización 98, en el que la primera cadena comprende una secuencia de 12 a 30 bases nucleicas contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3.
100.
El compuesto de la realización 98, en el que la primera cadena comprende una secuencia de 20 bases nucleicas contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3.
101.
El compuesto de las realizaciones 98, 99 ó 100, en el que la segunda cadena comprende una secuencia perfectamente complementaria de al menos 8 bases nucleicas contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3.
102.
El compuesto de la realización 101, en el que la segunda cadena comprende una secuencia perfectamente complementaria de 12 a 30 bases nucleicas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3.
103.
El compuesto de la realización 101, en el que la segunda cadena comprende una secuencia perfectamente complementaria de 20 bases nucleicas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3.
104.
El compuesto de cualquiera de las realizaciones 98-103, en el que al menos una cadena comprende ARN.
105.
El compuesto de cualquiera de las realizaciones 98-104, en el que al menos una cadena comprende uno o más desoxinucleósidos.
106.
El compuesto de cualquiera de las realizaciones 98-105, en el que las cadenas hibridadas forman al menos un extremo saliente.
107.
El compuesto de la realización 106, en el que el extremo saliente comprende al menos una base modificada.
108.
El compuesto de cualquiera de las realizaciones 98-107, en el que dicho compuesto inhibe la expresión del ARNm que codifica la apolipoproteína B humana después de 16 a 24 h en al menos 50%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivo en una concentración 100 nM.
109.
Una vesícula que comprende un compuesto de cualquiera de las realizaciones 98-108.
110.
La vesícula de la realización 109, en la que la vesícula es un liposoma.
111.
Una composición que comprende el compuesto de una cualquiera de las realizaciones 98-108, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
112.
La composición de la realización 111, que además comprende un sistema de dispersión coloidal.
113.
Un método para inhibir la expresión de la apolipoproteína B en células o tejidos, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el compuesto de una cualquiera de las realizaciones 98-108, en condiciones tales que se inhiba la expresión de la apolipoproteína B.
114.
El método de la realización 113, en el que las células o tejidos se ponen en contacto in vivo.
115.
El método de la realización 114, en el que dicho contacto comprende la etapa de administrar el compuesto a un animal.
116.
El método de la realización 115, en el que el animal es un ser humano.
117.
El método de la realización 116, en el que el ser humano tiene una afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B, y se administra una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz del compuesto.
118.
El método de la realización 117, en el que dicha afección está asociada con el metabolismo anómalo de lípidos.
119.
El método de la realización 117, en el que dicha afección está asociada con el metabolismo anómalo del colesterol.
120.
El método de la realización 117, en el que dicha afección es una la enfermedad cardiovascular.
121.
El método de la realización 120, en el que la enfermedad cardiovascular es la aterosclerosis.
122.
El método de la realización 117, en el que dicha afección es una afección metabólica anómala asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
123.
El método de la realización 122, en el que la afección metabólica anómala asociada con la expresión de la apolipoproteína B es la hiperlipidemia.
124.
El método de la realización 117, en el que la afección es la diabetes.
125.
El método de la realización 117, en el que la afección es la obesidad.
126.
El método de la realización 116, en el que se administra una cantidad eficaz del compuesto para prevenir una afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
127.
El método de la realización 126, en el que se administra una cantidad eficaz del compuesto para retrasar una afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
128.
Un método para reducir la secreción de lipoproteína (a) por hepatocitos, que comprende:
(a)
poner en contacto hepatocitos con una cantidad de una composición que comprende un compuesto no catalítico de 8 a 50 bases nucleicas de longitud, que hibrida específicamente con el ARNm que codifica la apolipoproteína B humana e inhibe la expresión del ARNm después de 16 a 24 h en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivo en una concentración 150 nM, en el que dicha cantidad es eficaz para inhibir la expresión de la apolipoproteína B en los hepatocitos; y
(b)
medir la secreción de la lipoproteína (a) por los hepatocitos.
129.
El método de la realización 128, en el que el compuesto no catalítico hibrida específicamente con los nucleótidos 3230-3288 expuestos en la SEQ ID NO: 3.
130.
El método de la realización 129, en el que el compuesto no catalítico comprende una secuencia de bases nucleicas como se expone en la SEQ ID NO: 247.
131.
El método de cualquiera de las realizaciones 128-130, en el que el compuesto no catalítico es un mimético de oligonucleótido antisentido.
132.
Un método para tratar una afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B humana en un primate, que comprende administrar al primate una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto no catalítico de 8 a 50 bases nucleicas de longitud que hibrida específicamente con ARNm que codifica la apolipoproteína B humana e inhibe la expresión del ARNm después de 16 a 24 h en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivo en una concentración 150 nM.
133.
El método de la realización 132, en el que el primate es un ser humano.
134.
El método de la realización 133, en el que la afección se selecciona del grupo que consiste en metabolismo anómalo de lípidos, metabolismo anómalo del colesterol, enfermedad cardiovascular, hiperlipidemia, diabetes y obesidad.
135.
Un método para reducir la expresión de la apolipoproteína B en el hígado de un animal, que comprende administrar al animal entre 2 mg/kg y 20 mg/kg de un compuesto no catalítico de 8 a 50 bases nucleicas de longitud que hibrida específicamente con el ARNm que codifica la apolipoproteína B humana en al menos 30%, en células HepG2 al 80% de confluencia en cultivos en una concentración 150 nM.
136.
El método de la realización 135, en el que el compuesto se administra por vía subcutánea.
137.
El método de la realización 135, en el que el compuesto se administra por vía intravenosa.
138.
El método de la realización 135, en el que el compuesto se administra por vía oral.
139.
El método de una cualquiera de las realizaciones 135-138, en el que la administración al animal se repite.
140.
El método de una cualquiera de las reivindicaciones 135-139, en el que el animal es un ser humano.
141.
Uso de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, 21-30, 66-67 y 98-108, en la producción de un medicamento.
142.
Uso de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, 21-30, 66-67 y 98-108, en un medicamento para alterar el metabolismo de lípidos.
143.
Uso de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, 21-30, 66-67 y 98-108, en un medicamento para una enfermedad o afección asociada con la expresión de la apolipoproteína B.
144.
Un método para fabricar un compuesto de una cualquiera de las realizaciones 98-108, que comprende hibridar específicamente in vitro una primera cadena de bases nucleicas que comprende una secuencia de al menos 8 bases nucleicas contiguas de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3 con una segunda cadena de bases nucleicas que comprende una secuencia suficientemente complementaria de dicha primera cadena de forma que permite la hibridación estable.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Genzyme Corporation
<120> MODULACION ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE LA APOLIPOPROTEÍNA B
<130> P055617EP
<150> US 60/426,234
<151>
<150> PCT/US03/015493
<151>
<150> PCT/US03/036411
<151>
<150> EP 03789763.4
<151>
<160> 892
<210> 1
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 1
tccgtcatcg ctcctcaggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 2
atgcattctg cccccaagga 20
<210> 3
<211> 14121
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (129)..(13820)
<400> 3
<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador PCR
<400> 4
tgctaaaggc acatatggcc t
21
<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador PCR
<400> 5
ctcaggttgg actctccatt gag
23
<210> 6 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Sonda PCR
<400> 6
cttgtcagag ggatcctaac actggccg
28
<210> 7 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador PCR
<400> 7
gaaggtgaag gtcggagtc
19
<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador PCR
<400> 8
gaagatggtg atgggatttc
20
<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Sonda PCR
<400> 9
caagcttccc gttctcagcc
20
<210> 10 <211> 2354 <212> ADN <213> Mus musculus
<400> 10
<210> 11
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador PCR
<400> 11
cgtgggctcc agcattcta
<210> 12
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador PCR
<400> 12
agtcatttct gcctttgcgt c
<210> 13
<211> 22
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sonda PCR
<400> 13
ccaatggtcg ggcactgctc aa
<210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador PCR
<400> 14
ggcaaattca acggcacagt
<210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Cebador PCR
<400> 15
gggtctcgct cctggaagat
<210> 16
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Sonda PCR
<400> 16 aaggccgaga atgggaagct tgtcatc 27
<210> 17
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 17 ccgcaggtcc cggtgggaat 20
<210> 18
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 18 accgagaagg gcactcagcc 20
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 19 gcctcggcct cgcggccctg 20
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 20 tccatcgcca gctgcggtgg 20
<210> 21
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 21 cagcgccagc agcgccagca 20
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 22
gcccgccagc agcagcagca
<210> 23
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 23
cttgaatcag cagtcccagg
<210> 24
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 24
cttcagcaag gctttgccct
<210> 25
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 25
tttctgttgc cacattgccc
<210> 26
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 26
ggaagaggtg ttgctccttg
<210> 27
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 27 tgtgctacca tcccatactt
<210> 28
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 28 tcaaatgcga ggcccatctt
<210> 29
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 29 ggacacctca atcagctgtg
<210> 30
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 30 tcagggccac caggtaggtg
<210> 31
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 31 gtaatcttca tccccagtgc
<210> 32
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 32 tgctccatgg tttggcccat
<210> 33
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 33
gcagccagtc gcttatctcc
<210> 34
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 34
gtatagccaa agtggtccac
<210> 35
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 35
cccaggagct ggaggtcatg
<210> 36
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 36
ttgagccctt cctgatgacc
<210> 37
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 37
atctggaccc cactcctagc
<210> 38
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 38 cagacccgac tcgtggaaga
<210> 39
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 39 gccctcagta gattcatcat
<210> 40
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 40 gccatgccac cctcttggaa
<210> 41
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 41 aacccacgtg ccggaaagtc
<210> 42
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 42 actcccagat gccttctgaa
<210> 43
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 43 atgtggtaac gagcccgaag
<210> 44
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 44
ggcgtagaga cccatcacat
<210> 45
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 45
gtgttaggat ccctctgaca
<210> 46
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 46
cccagtgata gctctgtgag
<210> 47
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 47
atttcagcat atgagcccat
<210> 48
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 48
ccctgaacct tagcaacagt
<210> 49
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 49 gctgaagcca gcccagcgat
<210> 50
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 50 acagctgccc agtatgttct
<210> 51
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 51 cccaataaga tttataacaa
<210> 52
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 52 tggcctacca gagacaggta
<210> 53
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 53 tcatacgttt agcccaatct
<210> 54
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 54 gcatggtccc aaggatggtc
<210> 55
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 55
agtgatggaa gctgcgatac
<210> 56
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 56
atgagcatca tgcctcccag
<210> 57
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 57
gaacacatag ccgaatgccg
<210> 58
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 58
gtggtgccct ctaatttgta
<210> 59
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 59
cccgagaaag aaccgaaccc
<210> 60
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 60 tgccctgcag cttcactgaa
<210> 61
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 61 gaaatcccat aagctcttgt
<210> 62
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 62 agaagctgcc tcttcttccc
<210> 63
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<210> 162
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 162 tccattccct atgtcagcat
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 163 gactccttca gagccagcgg
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<211> 20
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<213> Secuencia Artificial
<220>
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 186
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 187
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<400> 189
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 199
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 200
agcctggatg gcagctttct
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 201
gtctgaagaa gaacctcctg
<210> 202
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 202
tatctgcctg tgaaggactc
<210> 203
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 203 ctgagttcaa gatattggca
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 209
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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caaggtcata ctctgccgat
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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gtatggaaat aacacccttg
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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cctgatattc agaacgcagc
<210> 220
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 220
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 221
agcaccagga gactacactt
<210> 222
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 222
cccatccaga ctgaattttg
<210> 223
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 223
ggttctagcc gtagtttccc
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 224
aggttaccag ccacatgcag
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 230
tcaacggcat ctctcatctc
<210> 231
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 231
tgatagtgct catcaagact
<210> 232
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 232
gattctgatt tggtacttag
<210> 233
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 233
ctctcgatta actcatggac
<210> 234
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 234
atacactgca actgtggcct
<210> 235
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 235
gcaagagtcc accaatcaga
<210> 236
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<210> 238
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<210> 239
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<210> 240
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 240 gcctcactag caatagttcc
<210> 241
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 241
gacatttgcc atggagagag
<210> 242
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 242
ctgtctccta ccaatgctgg
<210> 243
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 243
tctgcactga agtcacggtg
<210> 244
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 244
tcccggaccc tcaactcagt
<210> 245
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 245
gcaggtccag ttcatatgtg
<210> 246
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 246
gccatccttc tgagttcaga
<210> 247
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 247 gcctcagtct gcttcgcacc
<210> 248
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 248 ccccgcaggt cccggtggga
<210> 249
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 249 cagccccgca ggtcccggtg
<210> 250
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 250 caaccgagaa gggcactcag
<210> 251
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 251 cctcagcggc agcaaccgag
<210> 252
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 252
tcctcagcgg cagcaaccga
<210> 253
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 253
ctcctcagcg gcagcaaccg
<210> 254
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 254
ggctcctcag cggcagcaac
<210> 255
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 255
ggcgggctcc tcagcggcag
<210> 256
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 256
ggtccatcgc cagctgcggt
<210> 257
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 257
ggcgggtcca tcgccagctg
<210> 258
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 258 tagaggatga tagtaagttc
<210> 259
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 259 aaatgaagat ttcttttaaa
<210> 260
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 260 tatgtgaaag ttcaattgga
<210> 261
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 261 atataggcag tttgaatttt
<210> 262
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 262 gctcactgta tggttttatc
<210> 263
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 263
ggctcactgt atggttttat
<210> 264
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 264
ggctggctca ctgtatggtt
<210> 265
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 265
aggctggctc actgtatggt
<210> 266
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 266
aaggctggct cactgtatgg
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 267
ctactgcaag gctggctcac
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 268
actgcctact gcaaggctgg
<210> 269
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 269 tgcttatagt ctactgccta
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 270 ttctgcttat agtctactgc
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 271 tttggtgcag gtccagttca
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 272 cagctttggt gcaggtccag
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 274
tggtgccagc tttggtgcag
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 275
gccctggtgc cagctttggt
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 276
gagttcagag accttccgag
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<213> Secuencia Artificial
<220>
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<400> 277
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<211> 20
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<213> Secuencia Artificial
<220>
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<400> 278
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 279
aaaataactc agatcctgat
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 280 agcaaaataa ctcagatcct
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 281 agtttagcaa aataactcag
<210> 282
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 282 tcccccaagt ttagcaaaat
<210> 283
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 283 ttcctcctcc cccaagttta
<210> 284
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 284 agactccatt tatttgttcc
<210> 285
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 285
cttctgcttg agttacaaac
<210> 286
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 286 20
accttctgct tgagttacaa
<210> 287
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 287 20
gcaccttctg cttgagttac
<210> 288
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 288 20
tcgcaccttc tgcttgagtt
<210> 289
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 289 20
cttcgcacct tctgcttgag
<210> 290
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 290
tgcttcgcac cttctgcttg
<210> 291
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 291 tctgcttcgc accttctgct
<210> 292
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 292 agtctgcttc gcaccttctg
<210> 293
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 293 tcagtctgct tcgcaccttc
<210> 294
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 294 cctcagtctg cttcgcacct
<210> 295
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 295 agcctcagtc tgcttcgcac
<210> 296
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 296
gtagcctcag tctgcttcgc
<210> 297
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 297
tggtagcctc agtctgcttc
<210> 298
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 298
catggtagcc tcagtctgct
<210> 299
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 299
gtcatggtag cctcagtctg
<210> 300
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 300
atgtcatggt agcctcagtc
<210> 301
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 301
gaatgtcatg gtagcctcag
<210> 302
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 302 ttgaatgtca tggtagcctc
<210> 303
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 303 atttgaatgt catggtagcc
<210> 304
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 304 atatttgaat gtcatggtag
<210> 305
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 305 cagccacatg cagcttcagg
<210> 306
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 306 accagccaca tgcagcttca
<210> 307
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 307
ttaccagcca catgcagctt
<210> 308
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 308
ggttaccagc cacatgcagc
<210> 309
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 309
taggttacca gccacatgca
<210> 310
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 310
tttaggttac cagccacatg
<210> 311
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 311
cttttaggtt accagccaca
<210> 312
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 312
tccttttagg ttaccagcca
<210> 313
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 313
gctcctttta ggttaccagc
<210> 314
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 314
aggctccttt taggttacca
<210> 315
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 315
gtaggctcct tttaggttac
<210> 316
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 316
tggtaggctc cttttaggtt
<210> 317
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 317
tttggtaggc tccttttagg
<210> 318
<211> 13993
<212> ADN
<213> H. sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1).. (13692)
<400> 318
5
<210> 319 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
10
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido <400> 319
gcctcagtct gcttcgcgcc
20
15
<210> 320 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 320 gctcactgtt cagcatctgg
<210> 321
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 321 tgagaatctg ggcgaggccc
<210> 322
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 322 gtccttcata tttgccatct
<210> 323
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 323 cctccctcat gaacatagtg
<210> 324
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 324 gacgtcagaa cctatgatgg
<210> 325
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 325
tgagtgagtc aatcagcttc
<210> 326
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 326
gccttctgct tgagttacaa
<210> 327
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 327
gcgccttctg cttgagttac
<210> 328
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 328
tcgcgccttc tgcttgagtt
<210> 329
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 329
cttcgcgcct tctgcttgag
<210> 330
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 330
agtctgcttc gcgccttctg
<210> 331
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 331 tcagtctgct tcgcgccttc 20
<210> 332
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 332 cctcagtctg cttcgcgcct 20
<210> 333
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 333 agcctcagtc tgcttcgcgc 20
<210> 334
<211> 43445
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 334
<210> 335
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 335
tctgtaagac aggagaaaga 20
<210> 336
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 336
atttcctctt ctgtaagaca 20
<210> 337
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 337
gatgccttac ttggacagac
<210> 338
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 338
agaaatagct ctcccaagga
<210> 339
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 339
gtcgcatctt ctaacgtggg
<210> 340
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 340
tcctccatac cttgcagttg
<210> 341
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
*<400> 341
tggctcatgt ctaccatatt
<210> 342
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 342 cagttgaaat gcagctaatg
<210> 343
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 343 tgcagactag gagtgaaagt
<210> 344
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 344 aggaggatgt ccttttattg
<210> 345
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 345 atcagagcac caaagggaat
<210> 346
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 346 ccagctcaac ctgagaattc
<210> 347
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 347 catgacttac ctggacatgg
<210> 348
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 348
cctcagcgga cacacacaca
<210> 349
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 349
gtcacatccg tgcctggtgc
<210> 350
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 350
cagtgcctct gggaccccac
<210> 351
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 351
agctgcagtg gccgatcagc
<210> 352
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 352
gacctcccca gccacgtgga
<210> 353
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 353 tctgatcacc atacattaca
<210> 354
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 354 atttcccact gggtactctc
<210> 355
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 355 20 ggctgaagcc catgctgact
<210> 356
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 356 20 gttggacagt cattcttttg
<210> 357
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 357 20 cacttgttgg acagtcattc
<210> 358
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<400> 405
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 426
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cagcctgcat ctataagtca
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 447
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 448
catctctgag ccccttacca
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 451
actcctttct atacctggct
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
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<223> Oligonucleótido Antisentido
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<210> 454
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 454 cactcatgac cagactaaga
<210> 455
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 455 acctcccaga agccttccat
<210> 456
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 456 ttcatatgaa atctcctact
<210> 457
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 457
tatttaattt actgagaaac
<210> 458
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 458
taatgtgttg ctggtgaaga
<210> 459
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 459
catctctaac ctggtgtccc
<210> 460
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 460
gtgccatgct aggtggccat
<210> 461
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 461
agcaaattgg gatctgtgct
<210> 462
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 462
tctggaggct cagaaacatg
<210> 463
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 463 tgaagacagg gagccaccta
<210> 464
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 464 aggattccca agactttgga
<210> 465
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 465 cagctctaat ctaaagacat
<210> 466
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 466 gaatactcac cttctgcttg
<210> 467
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 467 atctctctgt cctcatcttc
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 468
ccaactcccc ctttctttgt
<210> 469
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 469
tctgggccag gaagacacga
<210> 470
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 470
tattgtgtgc tgggcactgc
<210> 471
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 471
tgcttcgcac ctggacgagt
<210> 472
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 472
ccttctttac cttaggtggc
<210> 473
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 473
gctctctctg ccactctgat
<210> 474
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 474 aacttctaaa gccaacattc
<210> 475
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 475 tgtgtcacaa ctatggtaaa
<210> 476
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 476 agacacatac cataatgcca
<210> 477
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 477 ttctcttcat ctgaaaatac
<210> 478
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 478 tgaggatgta attagcactt
<210> 479
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 479
agctcattgc ctacaaaatg
<210> 480
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 480
gttctcatgt ttactaatgc
<210> 481
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 481
gaattgagac aacttgattt
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<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 482
ccggccatcg ctgaaatgaa
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 483
catagctcac cttgcacatt
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 484
cggtgcaccc tttacctgag
<210> 485
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 485 tctccagatc ctaacataaa
<210> 486
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 486 ttgaatgaca ctagattttc
<210> 487
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 487 aaaatccatt ttctttaaag
<210> 488
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 488 cagctcacac ttattttaaa
<210> 489
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 490
agctccatac tgaagtcctt
<210> 491
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 491 caattcaata aaagctccat
<210> 492
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 492 gttttcaaaa ggtataaggt
<210> 493
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 493 ttcccattcc ctgaaagcag
<210> 494
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 494 tggtatttac ctgagggctg
<210> 495
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 495 ataaataata gtgctgatgg
<210> 496
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 496 ctatggctga gcttgcctat
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 497 ctctctgaaa aatataccct
<210> 498
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 498 ttgatgtatc tcatctagca
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 499 tagaaccatg tttggtcttc
<210> 500
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 500 tttctcttta tcacatgccc
<210> 501
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 501
tatagtacac taaaacttca
20
5
<210> 502 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
10
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 502
15
ctggagagga ctaaacagag 20
20
<210> 503 <211> 568 <212> ADN <213> H. sapiens
25
<220> <221> característica_misc <222> 44, 99, 156, 468 <223> n = A,T,C o G
<400> 503
30 35
<210> 504 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido Antisentido
40
<400> 504 acattttatc aatgccctcg 20
45
<210> 505 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
50
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido <400> 505
gccagaacat tttatcaatg
<210> 506
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 506
agaggttttg ctgtgccaga
<210> 507
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 507
ctagaggttt tgctgtgcca
<210> 508
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 508
tctagaggtt ttgctgtgcc
<210> 509
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 509
aatcacacta tgtgttctag
<210> 510
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 510
aaatcacact atgtgttcta
<210> 511
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 511 taaatcacac tatgtgttct
<210> 512
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 512 cttaaatcac actatgtgtt
<210> 513
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 513 tattctgtta cttaaatcac
<210> 514
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 514 tggtagcctc agtctgcttc
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 515 agtctgcttc gcgccttctg
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<212> ADN
<213> H. sapiens
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<213> H. sapiens
<400> 518
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<213> H. sapiens
<400> 520
cacttgctct catcaaaggc
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<213> H. sapiens
<400> 521
cacactggac gctaagagga
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<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 522
cgctgagcca cgcggtcaac
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<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 523
tgtccaaatt ctaccatggg
<210> 524
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<213> H. sapiens
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<211> 20
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<400> 531
ctccacttca agtctgtggg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
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<212> ADN
<213> H. sapiens
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<212> ADN
<213> H. sapiens
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<213> H. sapiens
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<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 539
aagcattggt agagcaaggg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 540
ccgctggctc tgaaggagtc
<210> 541
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 541
tctagtcagg ctgacctgcg
<210> 542
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 542
gggccacagt gttctaactg
<210> 543
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 543
aatcaagtgt catcacactg
<210> 544
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 544
gggtagtcat aacagtactg
<210> 545
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 545
agagcacacg gtcttcagtg
<210> 546
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
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<211> 20
<212> ADN
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<211> 20
<212> ADN
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<211> 20
<212> ADN
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<211> 20
<212> ADN
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 553
atgtcagcct ggtctgtcca
<210> 554
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 554 gcacctccgg aagtacacat
<210> 555
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<210> 556
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<210> 557
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 561
agcatgtggc agaagccatc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 562
gagagcacca aatccacatc
<210> 563
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 563
cctcagtgat gaagcagtca
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 564
gatagatgtg gtcacctacc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 565
cctcagcaca gcagctgcga
<210> 566
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 566
gattctgcgg gtcattggaa
<210> 567
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 567
caaagccatc actgatgatc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 568 agaaagctgc catccaggct
<210> 569
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<210> 570
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 570 gagtccttca caggcagata
<210> 571
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 571 tgccaatatc ttgaactcag
<210> 572
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 572 catcgagatt ggcttggaag
<210> 573
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 573 ggagctggat tacagttgca
<210> 574
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 574 caacatgcag gctgaactgg
<210> 575
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 575
acattacatt tggtctctac
<210> 576
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 578 gagctccaga gagaggacag
<210> 579
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 580 caagggtgtt atttccatac
<210> 581
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 583
ctctcctggg tgttctagac
<210> 584
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 584 20
atgaaggctg actctgtggt
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 585
gggaccacag atgtctgctt
<210> 586
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 586
ctggccggct caatggagag
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 587
gctgcgttct gaatatcagg
<210> 588
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 588
tgctgacatc ttaggcactg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 589 20
aagtgtagtc tcctggtgct
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 590 20 caaaattcag tctggatggg
<210> 591
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 597
ggcgtggagc ttactggacg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 598 gagatgagag atgccgttga
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 600 ctaagtacca aatcagaatc
<210> 601
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 601 gtccatgagt taatcgagag
<210> 602
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<210> 603
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 605
ccagattctc agatgaggga
<210> 606
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 606
catctgtcat tgatgcactg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 607
aggagatgtc aagggttcgg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 608
ggaactattg ctagtgaggc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 609
ctctctccat ggcaaatgtc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 610
caccgtgact tcagtgcaga
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 611
actgagttga gggtccggga
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 612
cacatatgaa ctggacctgc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 613
tctgaactca gaaggatggc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 614
ggtgcgaagc agactgaggc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 615
tcccaccggg acctgcgggg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 616 20
caccgggacc tgcggggctg
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<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 617
ctgagtgccc ttctcggttg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 618
ctcggttgct gccgctgagg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 627
aaaattcaaa ctgcctatat
<210> 628
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 628
gataaaacca tacagtgagc
<210> 629
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 629
ataaaaccat acagtgagcc
<210> 630
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 630
aaccatacag tgagccagcc
<210> 631
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 631
accatacagt gagccagcct
<210> 632
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 632
ccatacagtg agccagcctt
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 633
gtgagccagc cttgcagtag
<210> 634
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 634
ccagccttgc agtaggcagt
<210> 635
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 635
taggcagtag actataagca
<210> 636
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 636
gcagtagact ataagcagaa
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 637
tgaactggac ctgcaccaaa
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 638
ctggacctgc accaaagctg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 639
ggacctgcac caaagctggc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 640
ctgcaccaaa gctggcacca
<210> 641
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 649
taaacttggg ggaggaggaa
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 650
ggaacaaata aatggagtct
<210> 651
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 651
gtttgtaact caagcagaag
<210> 652
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 652
ttgtaactca agcagaaggt
<210> 653
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 653
gtaactcaag cagaaggtgc
<210> 654
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 654
aactcaagca gaaggtgcga
<210> 655
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 655
ctcaagcaga aggtgcgaag
<210> 656
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 656
caagcagaag gtgcgaagca
<210> 657
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 657
agcagaaggt gcgaagcaga
<210> 658
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 658
cagaaggtgc gaagcagact
<210> 659
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 659
gaaggtgcga agcagactga
<210> 660
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 660
aggtgcgaag cagactgagg
<210> 661
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 661
gtgcgaagca gactgaggct
<210> 662
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 662
gcgaagcaga ctgaggctac
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 663 gaagcagact gaggctacca
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 664 agcagactga ggctaccatg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<210> 666
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 666 gactgaggct accatgacat
<210> 667
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 670 ctaccatgac attcaaatat
<210> 671
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 671
cctgaagctg catgtggctg
<210> 672
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 672
tgaagctgca tgtggctggt
<210> 673
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 673
aagctgcatg tggctggtaa
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 674
gctgcatgtg gctggtaacc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 675 20
tgcatgtggc tggtaaccta
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 676
catgtggctg gtaacctaaa
<210> 677
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 677
tgtggctggt aacctaaaag
<210> 678
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 678
tggctggtaa cctaaaagga
<210> 679
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 679
gctggtaacc taaaaggagc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 680
tggtaaccta aaaggagcct
<210> 681
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 681
gtaacctaaa aggagcctac
<210> 682
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 682
aacctaaaag gagcctacca
<210> 683
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 683
cctaaaagga gcctaccaaa
<210> 684
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 684
ggcgcgaagc agactgaggc
<210> 685
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 685 cactatgttc atgagggagg
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 686 ccatcatagg ttctgacgtc
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 690 aactcaagca gaaggcgcga
<210> 691
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<210> 692
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
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<210> 693
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 693
gaaggcgcga agcagactga
<210> 694
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 694
aggcgcgaag cagactgagg
<210> 695
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 695
gcgcgaagca gactgaggct
<210> 696
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 696
gaagcagact gaggctacca
<210> 697
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 697
cagaaggcgc gaagcagact
<210> 698
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 698
tctttctcct gtcttacaga
<210> 699
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 699
cccacgttag aagatgcgac
<210> 700
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 700
aatatggtag acatgagcca
<210> 701
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 701
cattagctgc atttcaactg
<210> 702
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 702
actttcactc ctagtctgca
<210> 703
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 703
ccatgtccag gtaagtcatg
<210> 704
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 704
gcaccaggca cggatgtgac
<210> 705
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 705
gtggggtccc agaggcactg
<210> 706
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 706
gctgatcggc cactgcagct
<210> 707
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 707 tccacgtggc tggggaggtc
<210> 708
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 708 tgtaatgtat ggtgatcaga
<210> 709
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 709 gagagtaccc agtgggaaat
<210> 710
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 710 agtcagcatg ggcttcagcc
<210> 711
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 711 caaaagaatg actgtccaac
<210> 712
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 712 gaatgactgt ccaacaagtg
<210> 713
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 713 tatctactgt aatttaaaat
<210> 714
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 714 ctgatatggg tggagaacag
<210> 715
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 715
tctgggacag gtatgagctc
<210> 716
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 716
tgatagcagt ggcccttgaa
<210> 717
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 717
ggattggcgt gaaatactgg
<210> 718
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 718 20
tgcccgaggt tcctcctgcc
<210> 719
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 719
gcactagcaa gaccacactc
<210> 720
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 720
caagaccaca ctctgcatag
<210> 721
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 721
tcctccatag gataccgtgt
<210> 722
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 722
ggatgtaggg cagcaaaacc
<210> 723
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 723
tctgcacaag gactccttgt
<210> 724
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 724
cagcctgtct cagtgaacat
<210> 725
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 725 20
caggatgctt ccagtctaat
<210> 726
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 726
aaatgctcgt ctccaatctc
<210> 727
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 727
aacttgtgta tccaaatcca
<210> 728
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 728 20
tgacatggtg tgcttccttg
<210> 729
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 729 20 acactggtgt tctggctacc
<210> 730
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 730 gtgttctggc tacctctagt
<210> 731
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 731 tcctggcata ggtcacagta
<210> 732
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 732 atgtcaacag tagcacctcc
<210> 733
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 733 tagactcaga caagtctgga
<210> 734
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 734 cctaagttgc tcatctctgg
<210> 735
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 735 tgcgctgagt tccatgaaac
<210> 736
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 736 ctattgcagg tgctctccag
<210> 737
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 737
cagaggaaca tcttgcacct
<210> 738
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 738
ctctgctcct tactcttgtg
<210> 739
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 739
gtaatttctc accatccatc
<210> 740
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 740
ttctgagtct caattgtcta
<210> 741
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 741
ctatgtcctt gtgtgcacat
<210> 742
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 742
gcctattgcc atttgtatgt
<210> 743
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 743
ctattcatgt cctttgccta
<210> 744
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 744
gattctgcgg gtaatctcag
<210> 745
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 745
tcaatgcagg tcattggaaa
<210> 746
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 746
ctaccagatt gaccatccct
<210> 747
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 747
tacttgatag tgctctagga
<210> 748
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 748
ttgactgcag gaccaggagg
<210> 749
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 749
aacaaacact tgtgcaaatg
<210> 750
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 750
aatgagacca aacttccact
<210> 751
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 751 ttccactttg aagctagcaa
<210> 752
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 752 gatctggagc ttattcttga
<210> 753
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 753 acctcatgtg acttgtatgc
<210> 754
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 754 ttcttaagaa acaccttgta
<210> 755
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 755 taggcccatc ctggctgcat
<210> 756
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 756 aaactctcag gatatggtaa
<210> 757
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 757 ataccttcct ctacctttgc
<210> 758
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 758 tacctttgct gaaggtcctt
<210> 759
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 759
atctatctag tgaaatttct
<210> 760
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 760
tcagctcatc aaaatatgct
<210> 761
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 761
atatgctagt ccttcctttc
<210> 762
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 762
caaaggtctg agttatccag
<210> 763
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 763
tgacttatag atgcaggctg
<210> 764
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 764
tcagtggagg gtaattcttt
<210> 765
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 765
tgcctagcca gtttgaaaga
<210> 766
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 766
cctgcagaat tttgccaggc
<210> 767
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 767
gtagctaggt aggtaaagca
<210> 768
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 768
ttgagtgaga cacacaaggt
<210> 769
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 769
gtgctagtca gggaatgcat
<210> 770
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 770
ggggagagag catgcccagc
<210> 771
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 771
gcatgcccag ctgcgaaagc
<210> 772
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 772
agccaggtat agaaaggagt
<210> 773
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 773 aactttctaa gaggcagaat
<210> 774
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 774 tcttagtctg gtcatgagtg
<210> 775
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 775 agtaggagat ttcatatgaa
<210> 776
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 776 tcttcaccag caacacatta
<210> 777
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 777 atggccacct agcatggcac
<210> 778
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 778 catgtttctg agcctccaga
<210> 779
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 779 taggtggctc cctgtcttca
<210> 780
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 780 tccaaagtct tgggaatcct
<210> 781
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 781
acaaagaaag ggggagttgg
<210> 782
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 782
tcgtgtcttc ctggcccaga
<210> 783
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 783
gcagtgccca gcacacaata
<210> 784
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 784
actcgtccag gtgcgaagca
<210> 785
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 785
gccacctaag gtaaagaagg
<210> 786
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 786
atcagagtgg cagagagagc
<210> 787
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 787
tttaccatag ttgtgacaca
<210> 788
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 788
cattttgtag gcaatgagct
<210> 789
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 789
gcattagtaa acatgagaac
<210> 790
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 790
ttcatttcag cgatggccgg
<210> 791
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 791
gaaaatctag tgtcattcaa
<210> 792
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 792
tcctatacag ttttgggaac
<210> 793
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 793
aaggacttca gtatggagct
<210> 794
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 794
atggagcttt tattgaattg
<210> 795
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 795 ccatcagcac tattatttat
<210> 796
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 796 ataggcaagc tcagccatag
<210> 797
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 797 tgctagatga gatacatcaa
<210> 798
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 798 gaagaccaaa catggttcta
<210> 799
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 799 ctctgtttag tcctctccag
<210> 800
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 800 cattgataaa atgttctggc
<210> 801
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 801 tctggcacag caaaacctct
<210> 802
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 802 tggcacagca aaacctctag
<210> 803
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 803
tagaacacat agtgtgattt
<210> 804
<211> 20
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 804
aacacatagt gtgatttaag
<210> 805
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 805
ctttccgttg gacccctggg
<210> 806
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 806
tcccgcctgt gacatgcatt
<210> 807
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 807
ttctacctcg cgcgatttac
<210> 808
<211> 432
<212> ADN
<213> O. cuniculus
<400> 808
<210> 809
<211> 660
<212> ADN
<213> O. cuniculus
<400> 809
<210> 810 15 <211> 543
<212> ADN
<213> O. cuniculus
<220>
20 <221> característica_misc
<222> (45)
<223> n = a, c, g, o t
<220>
25 <221> característica_misc
<222> (118)
<223> n = a, c, g, o t
<220>
30 <221> característica_misc
<222> (148)
<223> n = a, c, g, o t
<220>
35 <221> característica_misc
<222> (173)
<223> n = a, c, g, o t
<220>
40 <221> característica_misc
<222> (180)
<223> n = a, c, g, o t
<400>
810
<400>
814 tgcttggaga aggtaagatc
10
<210> 811 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
15
<220> <223> Cebador <400> 811
aagcaccccc aatgtcacc
19
20
<210> 812 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
25
<220> <223> Cebador
<400> 812
30
gggatggcag agccaatgta 20
35
<210> 813 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Sonda
40
<400> 813
tcctggattc aagcttctat gtgccttca
29
45
<210> 814 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
50
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<210> 815
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 815 gcgttgtctc cgatgttctg
<210> 816
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 816 taatcattaa cttgctgtgg
<210> 817
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 817 tcagcacgta gcaatgcatt
<210> 818
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 818 gcctgatact cagcacgtag
<210> 819
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 819 caattgaatg tactcagata
<210> 820
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 820
acctcagtga cttgtaatca
<210> 821
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 821
cactggaaac ttgtctctcc
<210> 822
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 822
agtagttagt ttctccttgg
<210> 823
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 823
tcagtgccca agatgtcagc
<210> 824
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 824
attggaataa tgtatccagg
<210> 825
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 825 ttggcattat ccaatgcagt
<210> 826
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 826 gttgccttgt gagcagcagt
<210> 827
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 827 attgtgagtg gagatacttc
<210> 828
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 828 catatgtctg aagttgagac
<210> 829
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 829 gtagatactc cattttggcc
<210> 830
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 830 ggatcacatg actgaatgct
<210> 831
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 831
tcaagctggt tgttgcactg
<210> 832
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 832
ggactgtacc tcaagctggt
<210> 833
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 833
gctcattctc cagcatcagg
<210> 834
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 834
ttgatctata atactagcta
<210> 835
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 835
atggaagact ggcagctcta
<210> 836
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 836 ttgtgttcct tgaagcggcc
<210> 837
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 837 tgtgcacgga tatgataacg
<210> 838
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 838 gaccttgagt agattcctgg
<210> 839
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 839 gaaatctgga agagagacct
<210> 840
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 840 gtagctttcc catctaggct
<210> 841
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 841 gataactctg tgagggtagc
<210> 842
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 842
atgttgccca tggctggaat
<210> 843
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 843
aagatgcagt actacttcca
<210> 844
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 844
gcacccagaa tcatggcctg
<210> 845
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 845
cttgatactt ggtatccaca
<210> 846
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 846
cagtgtaatg atcgttgatt
<210> 847
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 847 taaagtccag cattggtatt
<210> 848
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 848 caacaatgtc tgattggtta
<210> 849
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 849 gaagaggaag aaaggatatg
<210> 850
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 850 tgacagatga agaggaagaa
<210> 851
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 851 ttgtactgta gtgcatcaat
<210> 852
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 852 gcctcaatct gttgtttcag
<210> 853
<211> 20
<212> ADN <213> Secuencia Artificial
5
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 853
10 15
acttgagcgt gccctctaat <210> 854 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido Antisentido 20
20
<400> 854 gaaatggaat tgtagttctc
20
25
<210> 855 <211> 479 <212> ADN <213> M. fascicularis
30
<220> <221> característica_misc <222> (7) <223> n = A,T,C o G
35
<220> <221> característica_misc <222>(469)..(474) <223> n = A,T,C o G
40
<220> <221> característica_misc <222> (476)..( 479) <223> n = A,T,C o G
<400> 855
<210> 856
<211> 20
<212> ADN 50 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 856 gtccctcaac atctgaatgc
<210> 857
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 857 ctgctagcct ctggatttga
<210> 858
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 858 ccttccctga aggttcctcc
<210> 859
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 859 ctcttactgt gctgtggaca
<210> 860
<211> 13938
<212> ADN
<213> H. sapiens
<400> 860
<210> 861
<211> 25
<212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador PCR
<400> 861
cagctcctta ttgttatacg aggga
25
<210> 862 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Cebador PCR
<400> 862
tgcgtctgag cattgcgt
18
<210> 863 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Sonda PCR
<400> 863
cccggtgtca ggtgggagta ctgc
24
<210> 864 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 864
gcctcagtct tcttcgcacc
20
<210> 865 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 865
gcctcagtct tattcgcacc
20
<210> 866 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 866 gcctcagtat tattcgcacc
<210> 867
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 867 gcctcattat tattcgcacc
<210> 868
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 868 gcctcattat tattagcacc
<210> 869
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 869 gcctcattat tattatcacc
<210> 870
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 870 gcctaattat tattatcacc
<210> 871
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 871 gcctcagtct gcttcgcac
<210> 872
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 872
gcctcagtct gcttcgca 18
<210> 873
<211> 15
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 873
gcctcagtct gcttc 15
<210> 874
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 874
cctcagtctg cttcgcac 18
<210> 875
<211> 16
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 875 16
ctcagtctgc ttcgca 16
<210> 876
<211> 14
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 876
tcagtctgct tcgc 14
<210> 877
<211> 10
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 877 gcctcagtct 10
<210> 878
<211> 10
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 878 gcttcgcacc 10
<210> 879
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 879 uugaagccau acaccucuuu 20
<210> 880
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 880 ugaccaggac ugccuguucu 20
<210> 881
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 881 gaauagggcu guagcuguaa 20
<210> 882
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 882 uauacugauc aaauuguauc 20
<210> 883
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 883
uggaauucug guaugugaag
<210> 884
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 884
aaaucaaaug auugcuuugu
<210> 885
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 885
gugaugacac uugauuuaaa
<210> 886
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 886
gaagcugccu cuucuuccca
<210> 887
<211> 20
<212> ARN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 887
gagaguuggu cugaaaaauc
<210> 888
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 888
gtgcgcgcga gcccgaaatc
20
5
<210> 889 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 889
15
cuucuggcau ccgguuuagt t 21
<210> 890 <211> 466 <212> ADN <213> M. fascicularis
25
<220> <221> característica_misc <222> 9 <223> n = A,T,C o G
<400> 890
35
<210> 891 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 891
gcctcagtct gctttacacc
20
45
<210> 892 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Oligonucleótido Antisentido
<400> 892
agattaccag ccatatgcag
20
55

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un compuesto oligonucleótido antisentido de 20 bases nucleicas de longitud que tiene una secuencia de bases nucleicas como se expone en la SEQ ID NO: 247 y que comprende 5-metilcitidina en las bases nucleicas 2, 3, 5, 9, 12, 15, 17, 19 y 20, en el que cada enlace internucleósido es un enlace fosforotioato, las bases nucleicas 1-5 y 16-20 comprenden una modificación 2'-metoxietoxilo, y las bases nucleicas 6-15 son desoxinucleótidos.
  2. 2.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de la reivindicación 1, en el que el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable.
  3. 3.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de la reivindicación 2, en el que la sal farmacéuticamente aceptable es una sal formada con el sodio catiónico.
  4. 4.
    Una composición que comprende el compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las realizaciones 1 a 3, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  5. 5.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4, para usar en la terapia o profilaxis de una enfermedad.
  6. 6.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4, para usar en el tratamiento de la hipercolesterolemia en un ser humano.
  7. 7.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4, para usar en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular, tal como la aterosclerosis, en un ser humano.
  8. 8.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4, para usar en el tratamiento de la hiperlipidemia en un ser humano.
  9. 9.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4, para usar en el tratamiento de la diabetes en un ser humano.
  10. 10.
    El compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de la reivindicación 4, para usar en el tratamiento de la obesidad en un ser humano.
  11. 11.
    Uso del compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar un medicamento para tratar la hipercolesterolemia en un ser humano.
  12. 12.
    Uso del compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar un medicamento para tratar una enfermedad cardiovascular, tal como la aterosclerosis, en un ser humano.
  13. 13.
    Uso del compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar un medicamento para tratar la hiperlipidemia en un ser humano.
  14. 14.
    Uso del compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar un medicamento para tratar la diabetes en un ser humano.
  15. 15.
    Uso del compuesto oligonucleótido antisentido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para preparar un medicamento para tratar la obesidad en un ser humano.
  16. 16.
    El compuesto oligonucleótido antisentido o la composición de la reivindicación 6, o el uso de la reivindicación 11, en el que la hipercolesterolemia es hipercolesterolemia familiar.
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