JPH03504804A - 食品の保存方法及びそのための保存剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 製品の保存方法およびそのための新規組成物本発明は一般に酸化を防止し、シン グレット酸素（Ｓｉｎｇｌｅｔ　　ｏｘｙｇｅｎ）を抑圧し、カビの成長を抑制 して製品を保存する方法および組成物に関し、さらに詳細には、自然の食品に用 いることのできる方法および組成物に関する。

食品で最も広く使用されている保存用（防腐用）酸化防止剤の内で、化合物であ るブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン （ＢＩＴ）がある。ＢＩＴは、また、動物の餌、石油製品、合成ゴム、プラスチ ック、動物油、植物油および石鹸の酸化防止剤として使用されている。

ＢＨＡもＢＨＴも比較的無毒である；しかしながら、これらは天然に存在する化 合物ではなく本当の「自然ｊの食品に用いることはできない。

イーストおよびカビの成長を防止するのに最も広く用いられている保存用化合物 のうちに、ソルビン酸およびそのカリウム塩がある。これらの化合物は、比較的 無毒であるがこれらもまた天然には存在しなく本当の「自然ｊの食品には使用で きない。

酸化を防ぐことにより製品を保存する安全で効果的な安全で効果的な方法に対す る要求が存在している。また、そのような方法で用いる安全で効果的な組成物に 対する要求がある。

本発明の主な目的は、酸化を抑制し、シングレット酸素を抑圧し、カビの成長を 抑制して製品を保存する自然で、安全で効果的な方法を開示することである。

さらなる目的は、これらの方法で用いる新規な組成物および該組成物を調整する 簡単で安価な方法を開示することである。

本発明の方法は、複数の実施態様を取り得る。１つの実施態様では、酸化防止剤 であるシングレット酸素抑圧性でカビ成長抑制性の保存剤を製品に加える。さら に、第２の実施態様では、酸化防止剤であるシングレット酸素抑圧性でカビ成長 抑制性保存剤を製品中でその場で形成させる。

本発明の保存剤組成物は、遊離共役リノール酸（ＣＬＡ）、９．１１−オクタデ カジエン酸および１０．１２−オクタデカジエン酸を含むものである。ＣＬＡの 活性な形は、また、ＣＬＡの活性な異性体；その無毒な塩：その活性なエステル および他の活性な化学的誘導体；およびこれらの混合物を含有する組成物を含む 。これらの組成物が酸化防止剤であるということ、これらの組成物が、シングレ ット酸素を抑圧するということ、そして、これらの組成物が、カビの成長を抑制 するということのの理論からは予想できなかった。

本発明の組成物の遊離酸の形はリノール酸を蛋白質たとえばホエー蛋白質と反応 させることにより好ましく　ｉｔ型製造れ、その蛋白質は、リノール酸を約８５ ℃までの温度で所望の組成物に変換できる。遊離酸の無毒な塩Ｃよ、遊離酸を無 毒な塩基と反応させることにより作ること力（できる。

トリグリセリドエステルは、リノール酸を含むトリグリセリドたとえばコーン油 を、リノール酸を活性な物質に変換できる蛋白質たとえばホエー蛋白質と反応さ せることにより製造できる。同様な方法は、他のエステルたとえばメチルエステ ルまたはエチルエステルを製造するのに利用できる。

本発明の酸化防止剤およびカビ抑制化合物は、すべて新規であるというわけでは ない。遊離共役リノール酸（ＣＬＡ）は、油で揚げた肉から単離されていてワ仁 エル。

ハ（Ｙ、Ｌ、Ｈａ）　、エヌ、ケー、グリム（Ｎ、に、Ｇｉ　ｍ　ｍ　）および エム、ダブリュ、／クリザ（Ｍ、　Ｗ、　　Ｐ　ａｒ　ｉ　ｚ　ａ）により発癌 （Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ）第８巻、第１２号、第１８８１−１８８７頁（ １９ｓ　７）に抗発癌性物質として記載されている。それ以来、遊離共役リノー ル酸は、いくつかのプロセスチーズ（こも見（１だされている（ワ仁エル　／％ 、エヌ、ケー、グＩＪムおヨヒエム、ダブリュ、パリザ、Ｊ、Ａｇｒｉｃ、Ｆｏ 。

９８７）。しかしながら、ＣＬＡの無毒な塩たとえばナトリウム塩およびカリウ ム塩は新規な化合物であると信じられている。

図面を説明すると： 第１図は、リノール酸からのＣＬＡの形成のためのモデルを示している； 第２図は、リノール酸源（バター脂）とホエー蛋白質とを結合させることによっ て、生じたＣＬＡの含量の２５℃での貯蔵の影響を示している： 第３図は、他の酸化防止剤と比較したリノール酸の酸化へのＣＬＡの抑制効果を 示している；第４図は、シングレット酸素抑圧剤としてのＣＬＡを示している。

本発明の好ましい方法では、安全で有効な量の本発明の保存組成物の１種または それ以上を、製品に加えるかまたはリノール酸を活性な物質に変換することので きる蛋白質たとえばホエー蛋白質とリノール酸との反応により製品中のその場で 生じるようにする。

自然食品に用いるのに適するＣＬＡの１つの形は、リノール酸を含む天然の給源 たとえばバター脂とミルクホエー蛋白質とをほぼ当量で室温で反応させることに より好ましくは製造される。反応は、成分を単によく混合するだけで迅速に進行 する。第１図は、リノール酸からのＣＬＡの生成のモデルを示している。

好ましい製造方法の実施により得られたＣＬＡは、９゜１１−オクタデカジエン 酸および／または１０．１２−オクタデカジエン酸およびその活性な異性体を１ 種またはそれ以上を含んでいる。これは遊離していてもよくあるいはエステル結 合を介して化学的に結合していてもよい。熱安定性であるＣＬＡはそのままで使 用してもよく、あるいは塩の形で乾燥させ粉体として使用してよい。ＣＬＡは、 遊離の酸をアルカリ水酸化物とｐＨ約８〜９で化学的当量で反応させることによ り無毒な塩たとえばナトリウム塩またはカリウム塩に容易に変換される。

ＣＬＡおよびその活性な無毒な誘導体たとえば無毒な塩は、製品に加えてＢＨＡ またはＢＨＴ　（現在使用されている）の量とほぼ当量で遊離ラジカルによりま たはシングレット酸素により起こされる酸化を抑制できる。当然のこととして、 加えられる正確な量は、使用ＣＬＡの形、製品の性質、包装および貯蔵と使用の 条件に依存する。通常は、ＣＬＡおよびその無毒な塩の使用量は、製品の約ｌｐ ｐｍ　〜１．ＯＯＯｐｐｍの範囲となろう。ＢＨＡおよびＢＨＴの様に、ＣＬＡ は油溶性である。Ｂ　ＨＡおよびＢＨＴとは対照的に、ＣＬＡは人間の食べ物の 内の自然から得られる通常の成分（人の乳汁を含む）である。

そのカビ成長抑制特性に対して用いるとき、ＣＬＡまたはその活性な誘導体は、 保護すべき製品に安全で効果的な量で加える。当然のこととして、加えられる正 確な量は、使用ＣＬＡの形、製品の性質、包装および貯蔵と使用の条件に依存す る。通常は、ＣＬＡおよびその無毒な塩の使用量は、製品１グラム当たり約１． ０００ｐｐｍ　〜１０．０００ｐｐｍの範囲となろう。ＣＬＡおよびその無毒な 塩は、ソルビン酸またはソルビン酸カリウムと同様に同様な濃度で有効であろう 。

ＣＬＡが酸化防止剤として働く正確な機構またはシングレット酸を抑圧するよう に働く正確な機構は、分かつていない。しかしながら、遊離ラジカルおよびシン グレット酸素を何らか拘束し排除すると信じられている。酸化防止剤としてのＣ ＬＡの作用の可能な機構は、オサワおよびナミキ［！！業生物学化学（Ａｇｒｉ ｃ、　　　Ｂｉｏｌ。

（ｈｅｍ、）土ｉ：第７３５〜７３９頁、（１９８１）コの報告書に基づく。こ の報告書では、酸化防止活性を有する新規ジケトンが玉二左ユｌの葉から単離さ れｎ−トリトリアコンタン−１６，１８−ジオンであると化学的に決定されてい る。酸化防止活性を有する同様な新規なジケトンが、ＣＬＡを酸素にさらしたと き形成し得ることも提案されている。ジケトンは、分子状酸素および活性化され た酸素種とＣＬＡの共役二重結合系との反応から生じると思われる。ＣＬＡがカ ビの成長を抑制する機構は分かっていない。

リノール酸のどのような給源もＣＬＡを調整することに使用できるが、リノール 酸に富んだ給源たとえばコーン油またはサフラワー油を用いたとき最も高い収率 が得リノール酸をＣＬＡの活性な形に変換するのに用いられる好ましい蛋白質は 、スルフヒドリル基含んでいて当然容易に入手できるホエー蛋白質である。リノ ール酸をＣＬＡに変換できる他の蛋白質はそれほどの実験をすることなく当業者 により容易に決定できる。そのような蛋白質には、スルフヒドリル基を含む蛋白 質および非スルフヒドリル含有蛋白質かあ、る。

以下の例は、本発明の方法によるＣＬＡの製造およびリノール酸の酸化を防止す るＣＬＡの利用を説明するものである。

ＣＬＡの製造 ４０ｇのホエー蛋白質および４５ｇのリノール酸含有脂肪源（バター詣）を室温 でよく混合してから８５℃で５分間低温滅菌した。３０分後、この混合物を前記 したようにしてＣＬＡについて分析した。このようにしてできたＣＬＡは２５℃ で８週間まで安定であった（第２図参照）。

匠ｌ カリウム塩の製造 約５０ｇのＣＬＡを１００ｍ１の水に加え、ｐＨをＩＮのＫＯＨで８．５に調節 してから、凍結乾燥してＣＬ粉体であった。

例」。

ナトリウム塩の製造 約５０ｇのＣＬＡを１００ｍ１の水に加え、ｐＨをＩＮのＮａＯＨで８．５に調 節してから、凍結乾燥してＣＬＡのナトリウム塩を製造した。得られた生成物は 、白色の粉体であった。

匠１ 酸化の防止 燐酸塩緩衝液１０ｍ１　　（ｐＨ８，０，０，２モル）、エタノール１０．５ｍ ｌおよび水４．５ｍｌを含む反応媒体中のリノール酸ｔｏｏｍｇにリノール酸の アルカリ異性化により製造したＯ、１ｍｇのＣＬＡを加えた。得られた組成物を ４０℃で１５日間温装した。生じた過酸化物の測定は、過酸化物がシアン酸塩の 存在下でＦＣ−ｒ＋をＦｅ”に酸化して４８０ｎｍで最大吸収を示す色を与える チオシアン酸塩法により行った。得られた結果は、同様な量のＢＨＡで得られる ものに相当し、他の酸化防止剤よりも良好であった（第３図参照）。

Ａ１ カビの成長の防止 １％ＣＬＡカリウム塩をＹＭ寒天培地に加えたところ、同じ培地で同じ条件下で の１％ソルビン酸カリウムの場合よりもカビの成長をよく抑制した。

昨ｉ シングレット酸素抑圧 反応媒体は以下を含むようにした（アセトニトリル溶媒５ｍｌ当たり）： リノール酸（ＬＡ）：　　ＬＡ　（０，００７Ｍ）＋ｏ−ズベンガル（０，５ｘ 　１０−’Ｍ） ＣＬＡ　：　　ＣＬＡ　（０，００７Ｍ）＋ｏ−Ｘベンカ／Ｌ／（０，５ｘ　１ ０−’） ＬＡ十ＣＬＡ：　　ＬＡ　（０，００７Ｍ）＋ＣＬＡ（０，００７Ｍ）十ローズ ベンガル （０，５Ｘ１０″″’Ｍ） サンプルを時間を変えてタングステンランプ（６０Ｗ％距離１３ｃｍ）により照 射した。生じた過酸化物は、沃素測定法（過酸化物が沃素陰イオン（１−１）を 沃素酸塩（！２）に酸化して３５０ｎｍで最大吸収を示す黄色を与える）により 測定した。結果を第４図に示す。

ＣＬＡ異性体標準の製造　アルカリ異性化したリノール酸のメチルエステルから 結晶させることによりｔｌｏ。

ｃ１２−オクタデカジェノエートのメチルエステルを製造した。メチルｔ１０． ｔ１２−およびｃｌＯ，ｃ１２−オクタデカジェノエートを沃素および光異性化 によりｔｌｏ、ｃ１２−異性体から製造した。製造した１０゜１２−異性体は、 ＨＰＬＣの欄で下記したようにＩ［ｉ相半分取（ｎｏｒｍａｌ−ｐｈａｓｅ　　 ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ）ＨＰＬＣにより精製した。製造したメチル ｔｌｏ、ｃ１２−オクタデカジェノエートの典型的な半分取順相ＨＰＬＣプロフ ィールは、３成分（ビーク１．４０．１分；ビーク２．４７．５分：ビーク３． ６５．１分）を示し、これらは、それぞれ相対的な割合８９％、２％および９％ で存在した。ＧＣの欄に記載した条件を用いてこれらのビークをさらに毛管ＧＣ 分析したところビーク１は純度９５％より大きいメチルｔｌＯ。

ｃ１２−異性体であり、ビーク２および３は未知の不純物であることが分かった 。残りの１０．１２−幾何学的ＣＬＡ標準は、このＨＰＬＣ操作により同様に精 製した。

９．１１−オクタデカジエン酸異性体（ｃ、ｃ：　　ｃ。

ｔ：および１．１）を、リシノール酸またはりシネライシン酸から製造し、個々 の異性体をアーゲンティシラン（ａｒｇｅｎｔａｔ　１ｏｎ）ＨＰＬＣ法により 分離した。

ｋ人亘ＩＪ　この手順は、ＣＬＡの抽出とけん化を含む。１．０ｍｇのＰＢＡ　 （内部標準）を含むサンプル材料（１ｇ）を２：１のクロロポルム：メタノール （容量／容量）２０ｍｌと中間の速度でポリトロンホモジナイザー（Ｐｏｌｙｔ ｒｏｎ　　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）［プリンクマンインスツラメンツ、ウェス トバリー、ニューヨーク（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ。

ＹＮ）］中で６０秒間均質化させた。さらに１０ｍ１のクロロホルム：メタノー ル混合物を用いてポリトロンプローブをすすぎ、ホモゲネートに加え、１０ｍ１ の２度蒸留した水をそれに加えた。ミルクに対し、５ｇのサンルム：メタノール 混合物を用いた。ホモゲネートを、２゜００Ｏｒｐｍで３０分間（４℃）で遠心 分離した。有機層を分離し、無水Ｎａ　２　Ｓ　Ｏ＜で乾燥させてから、ロータ リーエバポレータにかけた。全脂肪含量を残留物から決定した。遊離脂肪酸は、 メタノール中に含むようにした１、ＯＮの水酸化ナトリウム（容量／容量）２ｍ ｌ中の脂肪抽出物をねじ込キャップ付きの試験管（１５ｘ　１゜５ｃｍ）中で加 熱することにより製造した。この溶液を１５分間、沸騰水浴中で加熱した後、水 に含むようにした５、５Ｎの硫酸（容量／容量）で酸性としてｐＨ１とした。遊 離脂肪酸を、ヘプタンで１回１０ｍ１とし３回抽出した。この有機抽出物を水洗 し、無水Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥させ、濾過後の溶剤をロータリーエバポレ ータを用いて真空下で除去した。

ＣＬＡ形成のこの手順の効果を調べた。リノール酸（２，０ｍｇ）をこの手順で 処理すると、ベックマンＤにより測定し、後述する半分取逆相ＨＰＬＣにより測 定して、ＣＬＡが検知されなかった。この発見は、ＣＬＡが我々の方法による抽 出／けん化の結果として形成されなかったということを示している。

止ｌ旦且旦ＩＨＰ　Ｌ　ＣにょるＣＬＡの分離と精製は、２つの溶剤送りモジュ ール（ベックマンモデル１，１０Ａ）を有するベックマンモデル４２１八マイク ロコントローラシステムと２チヤンネルＵＶ検知器［マイクロメリティツクス（ ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ）７８８モデル；ノークロスＧＡ　（Ｎｏｒｃｒｏ ｓｓ、ＧＡ）］を用いて室温で行った。溶離剤は２３５または２４５ｎｍで監視 した。ビーク領域は、スペクトラフィジックス４２７９積分器（Ｓｐｅｃｔｒａ 　　Ｐｈｙｓｉｃｓ　　４２７０ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）で記録した。サンプル 中のＣＬＡは、先に報告されたように（前記ハら）勾配移動相（アセトニトリル および水）を有する半分取逆相カラム（ウルトラスフイア−（Ｕｌ　ｔ　ｒａｓ ｐｈｅ　ｒｅ）−０ＤＳ。

５）ｍ、２５０ｘｌＯｍｍＳ　ｉ、ｄ、ベックマン）で分離した。個々の異性体 またはアルカリ異性化したリノール酸の精製は勾配系を用い順相半分取カラム（ ウルトラシル（Ｕｌｔ　ｒａｓ　ｉ　Ｉ）−ＮＨ２，５）ｍ、２５０Ｘ１０ｍｍ 、ｉ、ｄ、べγクマン）で行った。出発移動相（９９：１（容量／容量）ヘキサ ン：エタノール）およサンの割合と流量を１００％と４．０ｍｌ／分に２０分間 かけてそれぞれ直線的に増加させた。これらの条件はさらに４０分間保ってから 、１０分間で出発条件にもどした。系は、次の注入に先立ち少なくとも１０分間 再平衡させた。

ＣＬＡ　　　体の製造　三弗化硼素−メタノールを用い遊離酸の形からＣＬＡメ チルエステルを製造した。ＣＬＡメチルエステルのＰＴＡＤ誘導体を、ヤンング ら（Ａｎ９１公逝　積分器およびフレームイオン化検出器（ＦＩＤ）を有するガ スクロマトグラフを用いてＣＬＡメチルエステルまたはＰＴＡＤにより誘導した ＣＬＡメチルエステルのＧＣ分析を行った。使用カラムは、熔融シリカ毛管カラ ム：　６０ｍｘ０．３２ｍｍ％　ｉ、ｄ、０．２５）ｍフィルム厚さ。ＧＣ条件 はｓ　２　ｍ　ｌ　／分の直線ガス流速としキャリヤーガスとしてヘリウムを用 いたオンカラム注入系からなっていた。温度は次のようにプログラム化した。オ ーブン、２０℃／分で５０〜２００℃とし６０分間保った１インジエクター、注 入後１００℃／分で５０〜２００℃。検知器温度は、２５０℃であった。注入容 量は、１．０〜２．０）１の範囲で、０．５〜５゜ＧＣ二Ｍ玉旦量Ｇ　Ｃ−Ｍ　 Ｓ分析は、スーパーコワックス（Ｓｕｐｅｒｃｏｗａｘ）−１０毛管カラム（６ Ｑｍｘｏ、３２ｍ、ｉ、ｄ、　、２．５）ｍフィルム厚さ）およびスプリットレ ス注入器を用い自動化した質量分析系により行った。カラム温度は、ＧＣ分析の 欄に定めたようにプログラムした。電子衝撃（Ｅｌ）イオン化および化学イオン 化（ＣＩ）は、ソース温度として１００℃および７０ｅｖで行った。ＣＩガスク ロルは、試薬ガスとしてイソブタンを用いて得られた。ＣＬＡメチルエステルの ＰＴＡＤ誘導体の分析に対し、ＤＢ−５ガラス毛管カラム（３０ｍｘ０．３２ｍ ｍ、ｉ、ａ、　、１．Ｏｕｍフィルム厚さ）を温度プログラムで用いた二６０℃ にＩＣＤＣ−ＣＭＤディスクドライバーを有する系により分析した。

ＧＣ−ＦＴ／ＩＲ析　毛管カラム（６０ｍｘ０．３２ｍｍ、ｉ、ｄ、　、０．２ ５）ｍフィルム厚さ）を用いるニコレットモデル（Ｎｉｃｏｌｅｔ　　ｍｏｄｅ ｌ）６０Ｓ　　ＦＴ／ＩＲによりＧＣ−ＦＴ／ＩＲ分析を行った。

ＧＣ条件は、ＧＣ分析の条件と同じとした。

ＣＬＡ定量　サンプル中の個々のＣＬＡ異性体の定量は工率（ＣＦ）を得るため に、既知量の異性体とＰＢＡからなる参照混合物を抽出操作と逆相ＨＰＬＣ分析 にかけた。ＨＰＬＣからのプールしたＣＬＡおよびＰＢＡを、メチル化の後、毛 管ＧＣカラム（スーパーコワックスー１０）でクロマトグラフにかけた。個々の 異性体に対するＣＦは次のようにして計算した： ＣＦ＝　（面積、、／重量口）ｘ（重量、／面積、）（ここで、したつきＴＳは 内８部標準を表し、上つきＸは与えられたＣＬＡ異性体を表す。） ＣＦＸを用いて、サンプル中の各ＣＬＡ異性体の量を次の式により計算した： ｐｐ＋ｎ、＝［面積、／面積＋ｓ）　Ｘ重量（ｍ　ｇ　）　＋ｓ］　／サンプル （ｇｍ）］　ｘｃＦ、ｘ１０００は、他の飽和ま！＝は不飽和脂肪酸からのＣＬ Ａの分離をした。メチル化ＣＬＡビークの続＜ＧＣ分析は、７成分（ピーク１〜 ７）がリノール酸の後に溶離したことを示した：これらのピークはメチル化され アルカリ異性化されたリノール酸成分のピークと同じ保持時間を示した。

２つのアプローチを用いて異性体を確認した：　　（１）　ＣＬＡ異性体のＥＣ Ｌ値の測定；および（２）標準が得られないかまたは得るのが困難である未確認 ピークを含むアルカリ異性化したリノール酸またはＣＬＡサンプルのＥＣＬの測 定　クロマトグラムは、飽和脂肪酸標準のメチルエステル（Ｃ１６：０１Ｃ１７ ：０１Ｃ１８：　０１Ｃ２０：　０およびＣ２２：０）とメチル化したＣＬＡサ ンプルのＧＣプロフィールを示した。ＣＬＡメチルエステル異性体のＥＣＬ値を 、半対数方眼紙上に炭素数対保持時間をプロットすることにより定めた、。ＣＬ ＡメチルエステルのＥＣＬ値はピーク１に対する１９．４９〜ピーク７に対する ２０．０１の範囲だった。ＥＣＬ値および溶離の順番は、Ｌｏｏ−ｍガラス毛管 シラー（ｇｌａｓｓ　　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　　５ｉｌａｒ）１０ｃカラムで分 離したＣＬＡメチルエステルの幾何／位置異性体のいくつかに対して報告しであ る。ＥＣＬの差は、両力ラムで試験した異性体に対し０．０１〜０．０３ユニツ ト内で一定であった。相関係数（ｒ値）は、２つのカラムで得られる標準に対し ０．９９９５であった。我々が用いたカラムは、シラーＬＯｃカラムよりもほん の僅か極性が小さい。したがって、ＥＣＬデータは、比較できる。

ＣＬＡメチルエステル標準は、未同定ピークを含むメチル化ＣＬＡサンプルと共 にクロマトグラフにかけた。

標準ＣＬＡメチルエステルと共にクロマトグラフにかけたこれらピークに対し、 同一性はそのまま示す。この関係は、残りの未知のピークの同一性を定めるのに 用いた。

ＥＣＬ関係およびクロマトグラフの結果に従い、ビ−よび／またはｔ９．ａｌｌ −１ｔｌＯ，Ｃ１２−１ｃ９゜ｃｌｌ−１ｃｌＯ，Ｃ１２−およびｔ９．ｔｌｌ −および／またはｔｌＯ，ｔｌ２−オクタデカジェノエートのメチルエステルと して同定された。

ピーク２および４の０定　サンプルＣＬＡまたはアルカリ異性化したリノール酸 のメチルエステルを、ＧＣ−ＭＳおよびＧＣ−ＦＴ／ＩＲ分析にかけた。ピーク ２および４のＥｌ−ＭＳデータは同一であり、フラグメント（Ｍ／ｅ）６７　　 （ベースピーク）　、２９４　（Ｍ”）　、７４．５９および２６２を生じた； よって、これらの異性体はこの方法で区別できなかった。通常のＥＩイオン化条 件下では、二重結合は、フラグメンテ−シラン（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ） の前に、その初期の位置を決定するのを困難とするので、他はＣＩ−ＭＳを使用 し炭化水素鎖と脂肪酸の二重結合位置を同定した。ピーク２および４のＣＬＡメ チルエステルのＣＩ−ＭＳデータは分子量２９４（Ｍゝ＋１　：　２９５．１０ ０％）を示した。

ピーク２に対する典型的なＭ　／　ｅは、１１３（３％）、２１３（５％）、１ ３９（１％）および２３９（１２％）であり、ピーク４に対しては、９９（５％ ）、２２７（８％）、１２５　（１％）および２５３　（１３％）であった。

カルボキシル基から番号を付けて炭素１０と１１の二重結合の間および１２と１ ３の二重結合の間の開裂はＭ／ｅ１１３および２１３をそれぞれ生じた。８−９ および９をそれぞれ生じた。したがって、ピーク２は、メチルオクタデカジェノ エートの１０．１２−位置異性体と同定される。ピーク４は、炭素１１と１２と の間の二重結合の開裂から誘導されたＭ／ｅ９９、炭素１３と１４との間の二重 結合の開裂からのＭ　／　ｅ　２２７、炭素９と１０との間の単結合の開裂から 誘導されるＭ／ｅ１２５および炭素１５と１６との間の単結合の開裂からのＭ　 ／　Ｃ２５３を有していて、この化合物が１１．１３−位置異性体であることを 示していた。

さらに、ピーク１および５は、Ｍ／ｅ１２７．１９９．１５３および２２５を含 んでいて、９．１１−異性体を示していた。同様にして、ピーク３および６は、 Ｍ／ｅ１１３．１３９．２１３および２３９を含んでいて、１０．１２−異性体 であると同定された。ピーク７は、９゜１１−および１０．１２−異性体のＭ／ ｅを含んでいた。

ＰＴＡＤで誘導されたＣＬＡサンプル（メチルエステル）は、スーパーコワック スー１０カラムでクロマトグラフにかけた。ＣＬＡメチルエステルの全てのピー クは、未誘導のＣＬＡメチルエステルのピークと比べて、ＧＣプロフィールから なくなっていた。ＰＴＡＤは求電子性であり、したがって、ディールス・アルダ −反応により脂肪酸または炭化水素鎖の共役二重結合系と反応するだけなので、 ピーク１〜７は、ＣＬＡ位置異性体であると同定された。比較的に高い極性を有 するＣＬＡメチルエ条件下では溶離されなかった。スーパーコワックス−１０（ 極性）カラムをＤＢ−５（非極性）カラムに変え誘導体を溶離させた。前者のカ ラムで観察されるものとは異なる溶離パターンが得られた。この方法は、位置異 性体を同定できないであろうが、サンプル中の共役二重結合の存在を同定し、ス ーパーコワックスー１０カラムからのＧＣクロマトグラムでのサンプル中のＣＬ Ａメチルエステルの位置を示す。

ピーク２および４のＧＣ−ＦＴ／ＩＲスペクトル中の主な違いは１０００〜８０ ０　ｃ　ｍ−’の範囲にあった。９９０および９４５ｃｍ−’（ピーク２）での シャープな吸収および９９０ｃｍ−’（ピーク４）での広い吸収が観察され、ピ ーク２が、シス、トランス−異性体であり、ピーク４が、シス、シス−異性体で あることを示した。

スペクトル分析、コクロマトグラフィーおよびＥＣＬ値の結果に基づき、ピーク １〜７は、Ｃ９，ｔｌｌ−および／またはｔ９．ｃｌｌ−１ｃｌＯ，ｔｌ２−１ ｔ１０、Ｃ１２−１ｃ１１．Ｃ１３−１ｃ９．ｃｌｌ−１Ｃ１０、Ｃ１２−およ びｔ９．ｔｌｌ−および／またはｔｌｏ、ｔｌ２−オクタデカジェノエートのメ チルエステルであるとそれぞれ同定できた。

４月　個々のＣＬＡ異性体を分析する新しく開発したＧＣ／ＨＰＬＣ法を乳製品 およびビーフに適用した。ＰＢＡを含むＣＬＡサンプルを半分取逆相カラムで精 製した。

ＰＢＡは６．２分で、ＣＬＡは４０分で溶離した。２つのプールしたピークは無 水Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥させてから、有機溶剤を窒素の下で蒸発させた。

残留物をメチル化した後、ＧＣにより分析した。ＰＢＡはＨＰＬＣカラムで不純 物と共に共溶離されたが、これらの不純物は、ＧＣカラムでＣＬＡ異性体の分割 を干渉しなかった。

ピーク２（ｃｌＯ，ｔｌ、１−異性体）および４（Ｃ１１、Ｃ１３−異性体）の 定量は、これらの異性体のＣＦ値が残りの５つのＣＬＡ異性体の平均ＣＦ値と等 しく１とした仮定に基づく二〇、１７、Ｃ９，ｔｌｌ−異性体（ピーク１）；０ ．１６、ｔｌＯ，Ｃ１２−異性体（ピーク３）；ｏ、１７、Ｃ９，ｃｌＬ−異性 体（ピーク５）：０．１６、ｃｌＯ，Ｃ１２−異性体（ピーク６）；および０． １７、ｔ９．ｔｌｌ−またはｔｌＯ，ｔｌ２−異性体（ピーク７）。これらのチ ーズのうちで全ＣＬＡ含量は１６９．３ｐｐｍ（ブルーチーズ）〜１８１５ｐｐ ｍ　［チー７：’ｙイｔ７：　（ＣＨＥＥＳＥ　　ＷＨＩ　Ｚの）］　（７）範 囲だった。経時した自然のチーズのうちで、１０力月以上経時したパルメザンチ ーズは最も高＜　（６２２，２ｐｐｍ）で、１００日以上経時したブルーチーズ は、ＣＬＡが最も低い量（１６９，３ｐｐｍ）であり、経時期間とＣＬＡ含量と の間の確実な関係を示唆した。一般的に、加工チーズは自然のチーズよりも多い ＣＬＡを含んでいた。原乳（ｒａｗ　　ｍ１ｌｋ）および低温滅菌したは両者と も同様な量のＣＬＡを含んでいたことに注目することは興味深いことである。焼 いてひいたビーフが全ＣＬＡ９９４ｐｐｍを含んでいて、ひいただけのビーフは ５６１．７ｐｐｍを含んでいた。脂肪含量は４．０％（低温滅菌した全乳）〜３ ５．５％（クリームチーズ）の範囲だった。全脂肪に基づくと、ＣＬＡ含量は５ ４９゜８ｐｐｍ（ブルーチーズ）〜９２８９．７ｐｐｍ（焼いてひいたビーフ） の範囲だった。

個々の異性体の内で、ｔ９．ｔｌｌ−／ｌｌＯ，ｔｌ２−１ｃ９．ｔｌｌ　　／ １９．ｃ、１１−およびｔｌｏ。

ｃ１２−オクタデカジエン酸は全ての測定したサンプル中の全ＣＬＡの８９％よ りも多かった。１．１−異性体は、４９．８％（ひいただけのビーフ）〜７８． １％（クリームチーズ）の範囲だった；しかしながら、ミルクサンプルでは、Ｃ ＬＡの約１５％が１．１−異性体として存在した。残りのＣＬＡ異性体（ｃ９． ｃＬｌ−１ＣＩＱ、ｃ１２−１ｃｌＯ，ｔｌ２−１ｃ　１１．　ｃ　１３）はサ ンプル中の全ＣＬＡの１１％よりも少なかった。

ＣＬＡのもと　チーズおよびひいたビーフ中のＣＬＡの発生原因は知らていない 。ＣＬＡの形成は、次の（１）と（２）に帰せられよう・　（１）経時、熱処理 および蛋白質の性質によりＥこされるリノール酸の遊離ラジカル型の酸化：およ び（２）第−胃（ｒ　ｕ　ｍ　ｅ　ｎ　）でのリノ経時プロセスは、チーズまた はビーフの物理化学的な性質を変えて典型的な特性を与える０例は脂肪の酸化を 含んでいる。好気性条件下で、これは、加熱中に起こり得、グリセリドまたはホ スホリピド中のリノール酸の酸化が開始されアリルラジカルを形成し得る。ラジ カルは、共役二重結合系を形成する水素を必要とするその共鳴体の形成により安 定化する。水素は、蛋白質ラジカルを形成する蛋白質に帰せられる。これらのラ ジカルは、親油性傾城のアルファトコフェロールにより中和され得る。

リノール酸がアルブミンの存在下でＵＶ照射により酸化されたとき、９．１１− 共役リノール酸が、酸化生成物よりも生じることが公知であり、水素給源として の蛋白質の重要性を示唆している。ＣＬＡ形成での蛋白質の重要性は、ラクトア ルブミンとラクトグロブリンに富んだチーズがこれらに富んでない他のチーズよ りも有意的に高い量のＣＬＡを含んでいるという我々の発見によっても支持され ている。ホエー濃度に富んでいるチーズウイツツ（ＣＨＥＥＳＥ　　ＷＨＩＺＯ ）（表Ｉ）が、他ノ加工チーズの２倍ＣＬＡを含んでいた。ホエー蛋白質は水素 給源を与える比較的高いレベルのラクトアルブミンとラクトグロブリンを含んで いる。

第−胃でリノール酸およびリルン酸から異性化されたＣＬＡ異性体はチーズまた は肉牛のＣＬＡ含量に直接寄与し得る。有意量のＣＬＡが生全乳（ｒａｗｗｈ。

トランス異性体を有するミルクの共役ジエンＣｌ８ＩｌＷ肪酸と食物中のリノー ル酸との間にはっきりした相関関係が観察された。これらの共役脂肪酸はバター にも存在しく１〜４．５％）、牛の食物中のリルン酸含量に直接的に関連付けら れた。第一胃中の微生物によるリノール酸およびリルン酸の生物学的水素化（ｂ 　ｉ　ｏｈｙｄ　ｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）の間、シス−二重結合がかなり異性化 を受ける。このことは、炭素鎖と共に位置のシフト（位置異性化）または幾何学 的形状の変化または両者を含み得る。異性化は、速度制御段階であり、最終的な ＣＬＡの濃度を決定する。ミルクまたは反部動物の組織中で、異性体の割合は、 第一胃中の微生物の数によりもたらされ、微生物の数はリルン酸の量および／ま たは与えられるリルン酸により影響される。

位置／幾何異性体の形１ｉｉｔ９．ＬＬ−およびｔｌ、ｔｌ２−異性体およびｃ ９．ｔｌｌ−およびｔ９．ｃｌｌ−異性体はこの研究では別個に定量できなっか た。しかしながら、それぞれの１．１−異性体が、ビーク７の全量に同じように 寄与し、ビーク１のｃ９．ｔｌｌ−異性体と共に溶離したｔ９．ｃｌｌ−異性体 の全濃度がビーク２のｃｌＯ，ｔｌ２−異性体の濃度と同じであると仮定するな ら、次のような結論が引き出せるであろう：（１）９．１１−位置異性体のモル 濃度が１０．１２−位置およびｔｌｌ、ｃ１２−異性体の濃度は等しい；　（３ ）４つの主な異性体（ｔ９．ｔｌｌ−１ｃ９．ｔｌｌ−１ｔｌＯ，ｔｌ２−およ びｔｌＯ，ｃ１２−）および５つの少ない異性体（ｃ９．ｃｌｌ−１ｔ９．ｃｌ ｌ−１Ｃ１０、ｃ１２−１ｃｌＯ，ｔｌ２−およびｃｌｌ、ｃ１３−）がある： 　（４）比較的高濃度の（チーズ中の全ＣＬＡ６１〜７８．１％）１．１−異性 体がある。これらの結論は、リノール酸の異性化および／またはリノール酸の幾 何異性体（ｃ９−ｔｌｌ−１ｔ９．ｔｌ２およびｔ９．ｃ１２−異性体）により 説明されるであろう。

メチレンインターラブテッド炭素（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ　　１ｎｔｅｒｒｕｐｔ ｅｄ　　ｃａｒｂｏｎ）（炭素数１１）に不対電子を含むリノール酸ラジカルは 、安定化しプロトンシフトにより共鳴をつくる。シフトは、カルボキシル基また は炭化水素末端の方向で起こり、共役二重結合をつくる。９．１１−または１０ ．１２−異性体の形成の確率は、二重結合系からのカルボキシル基の距離に起因 しおよび／またはグリセリドまたはホスホリピド中のエステル化カルボキシル基 に起因して同じである。

理論的には、９．１１−および１０．１２−オクタデカジエン酸（ｃ９．ｃｌｌ ；ｃ９．ｔｌｌ；ｔ９．ｃｌｌ；ｔ９．ｔｌｌ；ｃｌＯ，ｃ１２；ｃｌＯ，ｔｌ ２；ｔｌｏ、ｃ１２およびｔｌＯ，ｔｌ２）の８種の可能な幾何異性体が、ｃ９ ．ｃ１２−オクタデカジエン酸の異け（Ｃ９，ｃｌｌ：Ｃ９，ｔｌｌ；ｔｌｏ、 Ｃ１２；およびｃｌｏ、Ｃ１２）が期待される。しかしながら、４つの異性体の うち、Ｃ９，ｔｌｌ−およびｔｌｏ、Ｃ１２−異性体は、共役二重結合の回りの ５個の炭素原子の共面特性と共鳴ラジカルの空間対立（ｓｐａｔｉａｌｃｏｎｆ ｌｉｃｔ）とに起因してＣ９，Ｃ１２−リノール酸のアルカリ異性化または自動 酸化中に圧倒的に生ず要因である。

サンプル中の９．１１−または１０．１２−オクタデカジエン酸の比較的に高い 分布は、長い加工時間または長い経時期間の間に、Ｃ９，ｔｌｌまたはｔｌｏ、 Ｃ１２−幾何異性体（熱力学的に優先される）のさらなる安定化からもたらされ る。さらには、リノール酸の幾何異性体（１９，ｔ１２−１ｃ９．ｔ１２−およ びｔ９．Ｃ１２−オクタデカジエン酸）の異性化の間に支配的に形成される９、 １１−または１０．１２−オクタデカジエン酸の１．１−異性体は、サンプル中 の最終的ＣＬＡ含量または異性体の最終的な割合に影響し得る。これらのリノー ル酸幾何異性体はミルク脂肪の１１％となり、ビーフ中のリノール酸含量の１３ ．６％となった。ミルクの場合、我々は、全ＣＬＡ含量の僅か１５％が他のサン プルの場合よりずっと低い１．１−異性体であることを観察した。これについて の理由は、第−胃微生物がＣ９゜ｔｌｌ−オクタデカジエン酸よりもＣ９，Ｃ１ ２−オクタデカジエン酸を優先的に異性化したからであろう。ミルクの後続する 低温滅菌は、ｃ、ｔ−異性体を１．　１−異性体の形に安定化させるのに十分で なかった。　リノール酸幾何異性体は、また、主要でない寄与要因（９゜１１− および１０．１２−１ｔ９．ｃｌｌ−およびＣ１１、ｔ１２−オクタデカジエン 酸のＣ，Ｃ−異性体）の分布に影響を与える。１１．１３−異性体は、ｃ、９． 　　Ｃ１２−オクタデカジエン酸からまたはその異性体から加工中に主要でない 生成物として生じ得る。

ＧＣと逆相ＨＰＬＣとを組み合わせる方法は、食品中のＣＬＡとその異性体を測 定するために用いることができる。このような情報が関心が持たれるべきである のは、次のことが与えられているからである：すなわち動物実験でのある条件下 でのＣＬＡの抗発癌性、ＣＬＡが人の乳汁、血清、胆汁および十二指腸汁から単 離されたという事実およびＣＬＡが有効な酸化防止剤でありカビ成長抑制剤であ るという我々の発見である。

ＣＬＡはチーズに自然に存在するが、トリグリセリド中でエステル化している。

カビの成長の抑制で効果的であるためには、ＣＬＡの遊離酸または塩が存在しな くてはならないと我々は信する。

本発明の精神と範囲から逸脱することなく多（の変更態様が可能であることは当 業者に容易に明らかであろう。

したがって、本発明は請求の範囲にのみによって制限される。

α　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　αＣＬＡ含量への貯 蔵（２５℃）効果 週 ３５０ｎｍでの吸光度 国際調査報告 Ｉｎ１ｒｒｌ＋＃むａｌｌａｌ＾”””１Ｏ−ＮＯＰＣＴ／ＬＩＳ９０１００６ ３０

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．製品中のカビの成長を抑制するか、酸化を防止するかまたはシングレット酸 素を抑圧することにより製品を保存する方法において、該製品に安全で有効な量 の活性形のＣＬＡを加えることを特徴とする製品を保存する方法。
2. ２．製品中のカビの成長を抑制するか、酸化を防止するかまたはシングレット酸 素を抑圧することにより製品を保存する方法において、９．１１−オクタデカジ エン酸；１０，１２−オクタデカジエン酸；これらの活性な異性体およびエステ ル；これらの無毒な塩；これらの他の活性な化学的誘導体およびこれらの混合物 から選択されるメンバーの有効量を該製品に加えることを特徴とする製品を保存 する方法。
3. ３．製品中のカビの成長を抑制するか、酸化を防止するかまたはシングレット酸 素を抑圧することにより製品を保存する方法において、十分なリノール酸および 該リノール酸を変換して９，１１−オクタデカジエン酸；１０，１２−オクタデ カジエン酸；これらの活性な異性体およびエステル；およびこれらの混合物から 選択されるメンバーの有効量をその場で形成し得る蛋白質を該製品に加えること を特徴とする製品を保存する方法。
4. ４．酸化防止剤、シングレット酸素抑圧およびカビの成長抑制特性を有する保存 剤を製造する方法において、リノール酸と、リノール酸を変換して９，１１−オ クタデカジエン酸；１０，１２−オクタデカジエン酸；これらの活性な異性体； およびこれらの混合物から選択される化合物の安全で有効な量とし得る蛋白質と を反応させることを特徴とする保存剤を製造する方法。
5. ５．酸化防止剤、シングレット酸素抑圧およびカビの成長抑制特性を有し、自然 の食品に用いる安全で有効な保存剤において、自然の給源からの蛋白質およびリ ノール酸から製造された９，１１−オクタデカジエン酸；１０，１２−オクタデ カジエン酸；これらの活性な異性体；これらの無毒な塩；これらの活性；活性な 化学的誘導体；およびこれらの混合物から本質的になる群から選択されたメンバ ーを含んでなることを特徴とする保存剤。
6. ６．９，１１−オクタデカジエン酸；１０，１２−オクタデカジエン酸；および これらの活性な異性体から選択されたメンバーの無毒な塩。
7. ７．９，１１−オクタデカジエン酸；１０，１２−オクタデカジエン酸；および これらの活性な異性体からなる群から選択されたメンバーのカリウム塩。
8. ８．９，１１−オクタデカジエン酸；１０，１２−オクタデカジエン酸；および これらの活性な異性体からなる群から選択されたメンバーのナトリウム塩。
9. ９．製品中への保存剤としてのＣＬＡの使用。
10. １０．自然産物中への保存剤としてのＣＬＡの使用。