JPH0352480B2

JPH0352480B2 -

Info

Publication number: JPH0352480B2
Application number: JP58061102A
Authority: JP
Inventors: Toyohiko Nishimura; Kunio Ooyama
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1983-04-06
Filing date: 1983-04-06
Publication date: 1991-08-12
Also published as: JPS59186994A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はガン患者尿に特異的に存在する細胞形
質転換増殖因子（Transforming Growth
Factor 以下TGFと云う）を高純度に濃縮され
た形態で製造する方法に関する。TGFはヒト及
びげつ歯動物のガン細胞でつくられ、正常細胞に
形態学的に特異な変質をさせるポリペプタイドの
総称である。ヒト及び動物の正常細胞は軟寒天培
地においてはコロニーを形成しないが、これに
TGFを加えるとコロニー形成能を育つようにな
る。1978年ジ・ゼ・トダロら（Proc.Natl.Acad.
Sci75，4001（1978）により肉腫細胞の培養上清か
ら始めてこのものの存在が報告されて以来多数の
TGFがヒト及びげつ歯動物の組織培養ガン細胞
及びガン患者のガン組織からも発見されている。
（ロバーツ・エ・ビらProc.Natl.Acad.Sci.USA
77，3494（1980））。最近デイ・アル・タージツクら（J.Natl.
Cancer Inst.69，793（1982））及びジ・ゼ・トダ
ロら（Cancer Res.43，403（1983））はガン患者
の尿から分子量約30000〜35000の高分子型TGF
を抽出しているが詳しい物質は末だ明らかでな
い。本発明者らは高分子型TGFは正常人尿には存
在せず、ガン患者尿にのみ特異的に存在するこ
と、しかもこのものが正常細胞に対して前述のよ
うな生物学的活性を有する故、ガンに関する診断
および免疫学的問題の追究など医学的に極めて重
要な物質と考えて研究を重ね、このものの抽出、
分離、純化によりその生物学的活性及び物性を明
らかにするとゝもに本品の製造法の確立に成功し
た。すなわち、種々のガン患者の尿を集め透析を行
なつて無機イオンその他低分子物を除去し、凍
結、融解をくり返し不溶物を除き、凍結乾燥し、
弱酸性の水で抽出したものを材料とし、先ず前記
のデイ・アル・タージツクおよびジ・ゼ・トダロ
らの例に做いゲル濾過法によつて精製を行なつ
た。得られた活性分画の純化効率は第１，２表に
示すように十数倍で二十倍に満たず満足する結果
を得るに至らなかつた。そこで陽イオン交換体に
透析尿を流し中性塩による傾斜溶出を試みたとこ
ろ、ゲル濾過法と異なり意外の好結果を得た。す
なわち本法では純化効率100倍前後と云う好成績
であつた（第３，第４表）。さらに鋭意研究を続
けた結果、高分子TGFの疎水性を利用して。ア
ルキル基を結合させたシリカゲルを担体とするシ
ンクロパツク（SynChropak）RP−Ｐ（米国，
SynChrom社製）及びポリスチレン系ハイポーラ
スポリマーであるMCI Gel CHP20P（三菱化成
工業社製）を用いて逆相クロマトグラフイーを行
なつたところ、前記のイオン交換クロマトグラフ
イーと同様約100倍の純化効率を得た（第５，６
表）。さらに進んで上記イオン交換クロマトグラ
フイーと逆相クロマトグラフイーを組合せ実施し
た。そのの結果驚ろくべきことに200倍以上300倍
近くの純化効率を得（第７，８表）、これらの発
見を基に本発明を完成するに至つた。本発明は、ガン患者の尿を透析し、低分子物質
の除去された透析内液を、所望によりゲル濾過し
てTGF活性を示す分画を集めたのち、(1)陽イオ
ン交換体に該因子を吸着させ、ついで中性塩の濃
度勾配水溶液を用いて傾斜溶出するイオン交換ク
ロマトグラフイー；(2)疎水性基を有する担体に該
因子を吸着させ、ついで親水性中性有機溶媒の濃
度勾配水溶液を用いて傾斜溶出する逆相クロマト
グラフイー、の少くとも一方の操作に付して
TGF活性分画を採取することを特徴とするTGF
の製造法である。本発明においては、ガン患者の尿を原料として
用いる。ガンの種類はいずれでもよく、その例と
しては、肺ガン、絨毛腫瘍、胃ガン、咽頭ガン、
結腸ガン、乳ガン、黒色肉腫、卵巣ガンなどが挙
げられる。その尿から低分子の不純物を除くために、尿は
先ず水を透析外液として透析される。透析膜とし
ては分子量約10000以下の低分子物質を透過し、
それを超える高分子を透過しないものが望まし
く、そのような膜は種々市販されている。得られた透析内液は、凍結、融解を反復して不
純物を析出させ除去させたり、また遠心分離や数
μm程度の細孔を有するフイルターを通して微細
な沈澱の粒子を除くのが好ましい。また、所望により、透析内液をゲル濾過して
TGF活性を示す分画を集めてもよい。ゲル濾過
の担体としてはバイオゲル（Biogel）Ｐ−60，
Ｐ−100（米国、パイオラド社製）、セフアデツク
ス（Sephadex）Ｇ−50スーパー・フアイン
（フアルマシア・ジヤパン製）などを用いること
ができる。TGCF活性分画は後記する試験法によ
つて識別することができ、推定分子量28000〜
35000の位置に存在する。本発明では、上記の尿の透析内液、またはこれ
をゲル濾過して集めた活性分画をイオン交換クロ
マトグラフイー、逆相クロマトグラフイーの少く
とも一つの操作に付してTGF活性分画を採取す
る。イオン交換クロマトグラフイーは陽イオン交換
体を用いて行われる。陽イオン交換体としては、
天然または合成の高分子材料を基材とするものが
いずれも用いられ、その例としては、CM−セフ
アデツクス（Sephadex）Ｃ−25（フアルマシ
ア・ジヤパン社製）、CM−52（米国、ワツトマン
社製）、バイオ・レツクス（Bio−Rex）70（米
国、バイオ・ラド社製）、SP−セフアデツクス
（フアルマシア・ジヤパン社製）などが挙げられ
る。上記のゲル濾過を経または経ない透析内液は陽
イオン交換体のカラムに加えられ、その際TGF
は交換体に吸着される。ついで、吸着物は濃度を
逐次上昇勾配させた中性塩の水溶液を用いて傾斜
溶出する。中性塩は水溶性で、ペプタイドに悪影
響を及ぼすおそれのないものであればいずれも用
いうるが、塩化ナトリウムが最も好んで用いられ
る。逆相クロマトグラフイーは疎水性基を有する担
体を用いて行われる。その担体の例としては、シ
ンクロパツク（SynChropak）RP−Ｐシリー
ズ（米国，SynChrom社製）のような炭素鎖で修
飾されたシリカゲル、MCI Gel CHP20Pシリー
ズ（三菱化成工業(株)製）、アンバーライト
（Amberlite）XADシリーズ（米国、アンバーラ
イト社製）のようなポリスチレン系ハイポーラス
吸着樹脂などが挙げられる。それらのうち、特に
好ましいものはシンクロパツク RP−Ｐ〔Ｃ−
18〕、MCI CHP20P、アンバーライト XAD−
４などである。上記ゲル濾過を経または経ない透析内液は担体
のカラムに加えられTGFは担体に吸着される。
ついで吸着物は濃度を逐次上昇勾配させた親水性
中性有機溶媒の水溶液を用いて傾斜溶出される。
親水性中性有機溶媒の例としては、エタノール、
プロピルアルコールのような低級脂肪族アルコー
ル、アセトンのような低級脂肪族ケトン、アセト
ニトリルのような低級脂肪族ニトリルが挙げら
れ、好ましい例は、アセトニトリル、メタノー
ル、ｎ−プロピルアルコールである。イオン交換または逆相クロマトグラフイーによ
り得られる溶出液の画分は後記する試験法により
TGF活性が試験され、活性の画分が採取される。イオン交換と逆相クロマトグラフイーによる
TGFの精製操作はいづれか一方のみを用いても
よく、また一方の操作を前に行い、他の操作を後
に行つてもよい。かくして得られるTGFは白色粉末で、ニンヒ
ドリン反応陽性、分子量28000〜35000（ゲル濾過
法）、SDS−電気泳動において単一である、酸お
よび熱に対して安定性高く、トリプシン及びジチ
オスライトール処理により失活する。本発明により高度に精製されたTGFは、たと
えば、ガン検査用の試薬として有用であり、また
本品による正常細胞の変質を防止し、または変質
した細胞を正常化する作用を指標としてガンの予
防、治療剤をスクリーニングすることも期待され
る。次に本発明を実施例によりさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらによつてなんら限定される
ものではない。なお、ゲル濾過法についての成績
を参考例として示す。参考例１肺ガン患者の新鮮尿750mlを純水に対して分子
量カツト3500の透析膜（Spectrapor Por.3，米
国Spectrum Medical Ind.製）を用いて４℃．２
昼夜透析を行なつた。透析内液について凍結、融
解を２回くり返した後、10000×ｇにて45分間遠
心分離して不溶物を除き凍結乾燥した。この乾燥
粉末に1.5mlの0.5M酢酸水溶液を加え室温でホモ
ジナイザーにかけ凍結、融解を２回くり返した
後、12000×ｇにて25分間遠心分離を行ない抽出
上清を得た。遠心残渣はさらに1.0mlの0.5M酢酸
水を加え洗浄し遠心分離して上清を前記の抽出上
清に合した。ポリアクリルアミド系のバイオゲル
Ｐ−60フアイン（米国、バイオラド社製）をカ
ラムに詰め、（容量1.8cm×100cm）0.5M酢酸水で
平衡化後、樹脂上面に上記抽出液を載せ、下降法
で0.5M酢酸水で溶出した（流速12.5ml／時、温
度４℃）。溶出曲線を第１図に示す。TGF活性の
位置は推定分子量28000〜35000にあり、35.0mlの
活性分画を分取することができた。後記するTGF活性試験法において本活性分画
の20μlは正常細胞を変質し、コロニー形成能を示
した。【表】参考例２絨毛腫瘍患者尿6700mlを直ちに、参考例１と同
様に、純粋に対し透析した後、凍結、融解、凍結
乾燥、0.5M酢酸水溶液抽出を行い、抽出液22.3
mlを得た。セフアデツクスＧ−50スーパーフア
インをカラムに詰め（容量4.8cm×100cm）0.5M
酢酸水にて平衡化後、樹脂上面に上記抽出液を載
せ下降法で0.5M酢酸水で溶出した（流速65.0
ml／時、温度４℃）。TGF活性分画は推定分子量
28000〜35000の位置に溶出され、活性分画215ml
を得その5μlを前記TGF活性試験法にかけたとこ
ろNRK細胞は変質され、コロニーを形成した。【表】実施例１胃ガン患者尿450mlを0.02Mリン酸緩衝液（PH
7.5）20lに対して、分子量カツト3500の透析膜を
用いて４℃、２昼夜透析を行なつた。透析内液に
ついて10000Xg、40分間遠心分離して沈澱を除去
した。CM−セフアデツクス CC−25（フアルマ
シア・ジヤパン製）をカラム（容量3.2cm×32cm）
に詰め、0.02Mリン酸緩衝液（PH7.5）にて平衡
化した。本カラムに上記透析尿を通じ、TGFを
吸着させた後、同じ緩衝液でよく洗浄し、ついで
同緩衝液中0.02M〜1M塩化ナトリウムによる傾
斜溶出を行なつた、（流速16.5ml／時４℃）。溶出曲線を第２図に示す。TGF活性は1.2〜
1.4M塩化ナトリウム溶液の位置に溶出され、
38.5mlの活性分画を捕捉することができた。後記
するTGF活性試験法において本試料10μlを添加
することにより細胞は変質されコロニー形成能を
示した。【表】実施例２肺ガン患者尿1985mlを0.04Mリン酸緩衝液（PH
8.0）40lに対して透析し、5μmの細胞を有する膜
フイルター（日本ミリポア社製）で濾過して沈澱
を除去した。CM−52（英国，ワツトマン社製）
をカラム（容量4.2cm×64cm）に詰め、0.04Mリ
ン酸緩衝液（PH8.0）にて平衡化し、これに上記
透析尿を流下し、ついで同緩衝液中0.04Mより
1.5M濃度の塩化ナトリウムで傾斜溶出を行行な
つた。TFGは同緩衝液中塩化ナトリウム濃度0.7
〜1.1Mの位置に溶出された。活性分画132.9mlを
分取した。本分画10μlは正常細胞を変質し、コロ
ニー形成能を示した。【表】実施例３上咽頭ガン患者尿155mlを純水に対し４℃、２
昼夜透析を行つた後、透析内液について凍結、融
解を行ない不溶物を10000Xg、30分間遠心分離し
て除去し、凍結乾燥した。この乾燥粉末に1.0ml
の0.05％トリフロロ酢酸水を加え、室温でホモジ
ナイザーにかけ均一化した後凍結、融解しこれを
18000xgにて20分間遠心分離機にかけ抽出液を得
た、遠心沈澱はさらに0.5mlの0.05％トリフロロ
酢酸水で洗浄し遠心分離してその上清を上記の抽
出液と合わせた。アルキキ基（C18）を結合させ
たシリカゲル（シンクロパツク RP−Ｐ，米国，
SynChrom社製）をカラム（4.1mm×250mm）に詰
め0.05％トリフロロ酢酸で平衡化し、上記抽出液
0.25mlを滴下し吸着させ0.05％トリフロロ酢酸水
で洗浄後０〜90％アセトニトリル同溶液で傾斜溶
出を行なつた。溶出曲線を第３図に示す。TGF
活性はアセトニトリル濃度55〜80％の位置に溶出
された。その６回分の活性分画をとり、凍結乾燥
を行ない2.3mg（重量）の乾燥粉末を得た。本品
を2.0mlの生理食塩水に溶解し、その2μlをとり後
記のTGF活性試験法を行なつたところコロニー
形成能を示した。【表】本溶液1.0mlを用いシヨ糖濃度勾配等電点電気
泳動を実施した。装置はLKB110ml容量等電点電
気泳動用カラム（スウエーデン、LKB社製）ま
たPH傾斜はLKBアンホライン（同上社製）PH
3.5〜10及び同PH９〜11の等量混合物を使用し、
600V、０℃、48時間通電泳動を行ない、泳動後
1.2mlずつ分画し、各分画サンプル5μlを使用し後
記するTGF活性試験法を行ない第４図に示すよ
うにTGF活性が等電点9.5〜11にあることを究明
した。この活性分画を集め純水に対し透析後、凍
結乾燥して0.6mg（重量）の白色粉末状高純度
TGFを得た。本品についてジ・ゼ・トダロの方
法（，Natl，Cancer Inst，69(4)793（1982））に
もとずき安定性試験を行なつた。すなわち本品は
lM酢酸中37℃、24時間及び凍結乾燥、融解をく
り返しても失活しない。しかしトリプシン及びジ
チオスライトール溶液中にインキユベートすると
活性が失われた。また、前期の凍結乾燥粉末の生理食品水溶液に
ついて、SDS−電気泳動をPREP−DISC（生化学
工業(株)製）のpD−2/70を用いて行つた。10％ア
クリルアミド・0.03％ビスアクリルアミド・0.1
％SDSのゲルのカラム（容量70mm²×2.7cm）を用
い、泳動用緩衝液には0.1％SDS−0.1Mリン酸緩
衝液（PH7.2）を用い、溶出にも同緩衝液を用い
た。溶出速度は0.5ml／分とし、10mAの定電流で
泳動して第５図に示す結果を得た。同図中B.P.B.
はプロムフエノール・ブルー（分子量670）で本
色素は低分子の指標として用いられた。実施例４胃ガン患者尿250mlを純水に対して透析した後、
実施例１と同様に処理して1.0M酢酸水による抽
出液を得た。1.0M酢酸水で平衡化したパイオゲ
ルＰ−100（米国，バイオラド社製）カラム（容
量1.5cm×42cm）の樹脂上面に上記抽出液をのせ
下降法にて0.5M酢酸水で溶出した。（流速3.4
ml／時、４℃）TGF活性は推定分子量28000〜
35000の位置に溶出された。この分画はTGF活性
試験法においてコロニー形成能を示した。この分
画を凍結乾燥し、これに1.0mlの0.02％トリフ酢
酸水を加え溶解し、凍結、融解をくり返し、
15000×ｇにて20分間遠心分離し抽出上清を得た。
沈澱はさらに0.5mlの0.02％トリフロロ酢酸で洗
浄、遠心分離してその上清を上記抽出液と合し
た。ポリスチレン系ハイポーラスポリマーである
MCIGel CHP20Pをカラム（容量５mm×400mm）
に詰め、0.02％トリフロロ酢酸水で平衡化後、樹
脂上面より上記の抽出液を流し吸着させ、同溶液
で洗浄する。ついで0.02トリフロロ酢酸中０〜90
％ｎ−プロパノールの傾斜抽出を行ないｎ−プロ
パノール濃度30〜60％の位置にTGFが溶出され
た。この分画を分取し、凍結乾燥し、8.3mg（重
量）の乾燥粉末を得た。これを3.5mlの生理食塩
水にとかし、その2.5μlを後記のTGF活性試験に
かけたところ正常細胞は変質されコロニーを形成
した。【表】実施例５上咽頭ガン患者尿5600mlを0.01Mリン酸緩衝液
（PH7.0）に対し分子量カツト3500の透析膜を用い
て４℃、２昼夜透析した。透析内液について5μm
の細孔を有する膜フイルターを用いて濾過しバイ
オーレツクス 70（米国、バイオラド社製）にバ
ツチ法でTGFを吸着させる。吸着した樹脂を
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0）で洗浄後、1M塩化
ナトリウムを含む0.5Mリン酸緩衝液（PH9.0）を
用いてバツチ法でTGFを溶出した。抽出液を純
水に対して透析し、凍結乾燥した。この乾燥粉末
の1/10（重量）に1.0mlの0.05％トリフロロ酢酸
水を加え溶解し15000×ｇにて20分間遠心分離し
て抽出上清を得た。遠心沈澱はさらに0.5mlの
0.05％トリフロロ酢酸水で抽出、遠心分離した上
清を先の上清と合わせた。アルキル基（C4）を
結合させたシリカゲル（シンクロパツク RP−
Ｐ、米国，SynChrom社製）のカラム（容量4.1
mm×250mm）を0.05％トリクロロ酢酸水で平衡化
後、樹脂面より上記抽出液を通じ吸着させた。上
記酸性液で洗浄後、同溶液中０〜75％アセセトニ
トリルで傾斜溶出を行ないアセトニトリル濃度30
〜50％の位置にTGF活性分画2.8mlが分取され
た。この操作を10回繰り返し行ないその活性分画
を得た。これを凍結乾燥して2.5mlの生理食塩水
に溶解し後記するTGF活性試験にかけたところ
1μlで正常細胞は変質し、コロニー形成能を示し
た。【表】実施例６肺ガン患者尿1100mlを0.01Mリン酸緩衝液（PH
8.0）に対し分子量カツト10000の透析膜（三光純
薬社製）を用いて４℃で２昼夜透析を行なつた。
透析内液は12000×ｇにて60分間遠心分離し、沈
澱を除く。SP−セフアデツクス（フアルマシ
ヤ、ジヤパン社製）をカラム（容量4.5cm×33cm）
に詰め、0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）で平衡化
した後、上記透析内液を流下し、有効成分を吸着
させた後、同緩衝液で充分洗浄し、ついで同緩衝
液中、塩化ナトリウム0.01M〜1.5Mの傾斜溶出
を行なつた。（流速22.5ml／時、温度４℃、塩化
ナトリウム傾斜濃度緩衝液4.8l使用）。TGFは同
緩衝液中、塩化ナトリウム濃度0.6〜1.0Mの位置
に溶出され、活性分画62.0mlを得た。本活性分画
は後記のTGF活性試験法において、5μlで正常細
胞は変質されコロニーを形成した。本活性分画全
量をダイヤフロー分子篩膜PM−10（アミコン、
フアーイースト、リミツテツド社製（日本）を用
いて脱塩、濃縮をくり返し、1.2mlとし、これに
トリフロロ酢酸を加えて0.05％トリフロロ酢酸溶
液とした。アルキル基（C18）を結合させたシリカゲルを
担体とするシンクロパツク RP−Ｐ（シンクロー
ム社製）をカラム（容量4.1cm×2250cm）に詰め
0.05％トリフロロ酢酸で平衡化し、このカラム１
本に上記TGF、トリフロロ酢酸溶液の1/3を流し
吸着後0.05％トリフロロ酢酸水で洗浄した後、同
液中０〜90％アセトニトリルの傾斜溶出を行ない
アセトニトリル濃度55〜75％位置に溶出される活
性分画をとる。以上の操作を３回行ない前記の分
子篩膜による濃縮調整液全量を処理しTGF活性
分画7.9mlを分取した。本分画を凍結乾燥後、再
び3.0mlの生理食塩水に溶解し、この溶液をTGF
試験法にかけ0.4μlで正常細胞は変質されコロニ
ー形成能を示した。【表】 TGF活性試験法材料 (1) NRK−細胞（株49F） (2) ５％牛胎児血清及び１％非不可欠アミノ酸添
加ダルベツコ変法MEM培地 (3) 精製寒天（Agar Noble，Difco社製） (4) 直径60mmのペトリー皿操作 0.5％寒天含有の(1)の培地をペトリー皿一枚に
５mlずつ注加して下層培地とする。この上にNRK細胞１×10³個／mlを含む0.3％
寒天含有培地をペトリー皿一枚に２mlずつ層積し
上層培地とし、この上0.5mlの生理食塩水に溶解
した試料を加え、炭酸ガスインキユベーター中に
37℃で培養する。14日後に培養器から取り出し、
40倍のケンビ鏡でペトリ皿上の２mm×２mm視野を
10ケ所を無作為にえらび、細胞数10個以上よりな
るコロニーの数をかぞえその総数を成績とする。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例１におけるゲル濾過の溶出曲
線、第２図と第３図はそれぞれ実施例１のイオン
交換クロマトグラフイーと実施例３の逆相クロマ
トグラフイーにおける溶出曲線、第４図と第５図
はそれぞれ実施例３におけるシヨ糖濃度勾配等電
点電気泳動とSDS電気泳動の結果を示し、第５図
中B.P.B.はプロムフエノール・ブルーの略であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１ガン患者の尿を透析し、低分子物質の除去さ
れた透析内液を、(1)陽イオン交換体に該因子を吸
着させ、ついで中性塩の濃度勾配水溶液を用いて
傾斜溶出するイオン交換クロマトグラフイー；(2)
疎水性基を有する担体に該因子を吸着させ、つい
で親水性中性有機溶媒の濃度勾配水溶液を用いて
傾斜溶出する逆相クロマトグラフイー、の少なく
とも一方の操作に付して細胞形質転換増殖因子活
性分画を採取することを特徴とする細胞形質転換
増殖因子の製造法。２透析内液をゲルろ過して細胞形質転換増殖因
子活性を示す分画を集めたのち、所定の操作に付
する特許請求の範囲第１項記載の製造法。