JPH0689014B2 - トロンビン結合性物質およびその製法 - Google Patents

トロンビン結合性物質およびその製法

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JPH0689014B2 JP61010620A JP1062086A JPH0689014B2 JP H0689014 B2 JPH0689014 B2 JP H0689014B2 JP 61010620 A JP61010620 A JP 61010620A JP 1062086 A JP1062086 A JP 1062086A JP H0689014 B2 JPH0689014 B2 JP H0689014B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なトロンビン結合性物質、更に詳細に
は、血液の凝固に対する抗凝固系、線溶系に関与するこ
とから、医薬品、特に血栓症等の治療剤として有用なト
ロンビン結合性物質、並びにその製法に関する。
〔従来の技術〕
血液凝固調節機構の中で、蛋白分解酵素としてのトロン
ビンの果たす役割については種々研究がなされ、凝固系
のメカニズムに関してはほぼ解明されている。
近年、生体内において、線溶系、抗凝固系に作用すると
言われているプロテインＣをトロンビンが活性化するこ
と、その機構に補酵素的に働く因子がウサギ肺組織抽出
物に存在していることが、N.L.Esmon等により報告さ
れ、トロンボモジユリンと命名されている〔J.Biologic
al Chemistry,257（２）859〜864（1982）〕。
また、本発明者の１人である青木らはヒト胎盤より分離
した同様の性質を有する分子量約71,000（非還元状態）
のヒト・トロンボモジユリンを報告した（Thromb.Res.3
7,353−364,1985）。
更に、I.Maruyamaらはヒト胎盤より分離した分子量約7
5,000のヒト・トロンボモジユリンと、上記ウサギ・ト
ロンボモジユリンの活性を比較し、ヒト・トロンボモジ
ユリンの活性が等しい事を報告している〔J.Clin.Inves
t.75 987〜991,March1985〕。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らは、ヒト胎盤から、上記ヒト・トロンボモジ
ユリンを有利に単離、精製するための研究を行つていた
ところ、その研究の過程において、上記ヒト・トロンボ
モジユリンと異なる低分子量の物質で、これと同じ活性
を有する物質を単離することに成功し、本発明を完成し
た。
従つて、本発明は、新規なヒト由来のトロンビン結合性
物質及びその製法を提供するものである。
本発明のトロンビン結合性物質は、トロンビンと結合し
てプロテインＣの活性化を特異的に増強し、血液凝固時
間を延長することから、線溶促進剤、抗凝固剤として有
用である。
本発明のトロンビン結合性物質は、例えばヒト胎盤破砕
物を非イオン界面活性剤を含む緩衝液で抽出し、その抽
出物より、イオン交換クロマトグラフイー、トロンビン
−担体結合物を用いるアフイニテイクロマトグラフイー
または（および）ゲル過法によって分離した分画を分
子量分画することにより製造される。
すなわち、ヒト胎盤をシユークロース、ベンズアミジン
塩酸を含むトリス塩酸緩衝液等で洗浄した後、破砕して
均質化する。次いでこれを遠心分離等に付して沈澱物を
集め、これを上記緩衝液にトリトンＸ−100（オクトキ
シノールの商標名）、ルブロールPX（LubrolPX）（ポリ
ドカノールの商標名）等を加えたものを抽出する。この
抽出物をジイソプロピルフオスフオロートロンビン−ア
ガロース等のトロンビン−担体結合物を充填したカラム
に通して活性区分を吸着させ、塩化ナトリウム、EDTA、
ベンズアミジン塩酸、トリトンＸ−100を含むトリス塩
酸緩衝液で溶出することにより活性区分が得られる。ま
た上記抽出物をゲル過に付して活性区分を採取する方
法、あるいは両者を組合せる方法を採用することもでき
る。
この活性画分を、例えばLaemmiliの方法（Nature,227,6
80〜685,1970参照）に準じて、SDS−ポリアクリルアミ
ドゲルを用いる電気泳動法による分子量分画を行い、本
発明物質の分子量に相当するものを採取すれば本発明物
質が得られる。
斯くして得られる本発明のトロンビン結合性物質は次の
性質を有する。
（ａ）分子量 還元状態で 47,000±6,000 非還元状態で38,000±6,000 測定法： Laemmliの方法（Nature227,680−685,1970）に準じて、
５％尿素を含む7.5％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポ
リアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法により測定し
た。
標準蛋白としては、バイオラツドSDS−PAGEスタンダー
ド高分子用（日本バイオラツドラボラトリー社製）を用
いた。還元処理は、２％ジチオスレイトールを用い、10
0℃で３分間処理した。
（ｂ）等電点 PH4.9〜5.7 アンフオライトを用いる等電点電気泳働法により等電点
分画を測定した。
（ｃ）親和性 トロンビンに対し強い親和性を有する。ジイソプロピル
フオスフオロ−トロンビン−アガロース〔J.Biological
Chemistry:245,3059−3065,（1970）参照〕を用いるク
ロマト処理で本発明物質はほぼ100％吸着した。
（ｄ）活性 トロンビンと結合してプロテインＣを活性化する。
測定法1: プロテインＣ（7.32μＭ）５μｌ、本発明物質溶液５μ
ｌ（0.055A280/ml）、トロンビン（4U/ml）50μｌを、
0.1M塩化ナトリウム及び3.5mM塩化カルシウムを含む0.0
2Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）40μｌに溶解し、37℃で
０〜30分間インキュベートする。アンチトロンビンIII
（16.1μＭ）150μｌを加え、37℃で15分間インキユベ
ートし反応を停止させる。これにBoc−Leu−Ser−Thr−
Arg−MCA（Boc:t−ブチロキシカルボニル、MCA:4−メチ
ルクマリン−７−アミノ）（以下、MCA基質と称する）1
00μＭ（蛋白奨励会製）を含む緩衝液溶液250μｌを加
え、37℃で10分間反応させた後、20％酢酸500μｌを加
え反応を停止させ、遊離したAMC（７−アミノ−４−メ
チルクマリン）濃度を励起波長380nm、発光波長460nmで
螢光分光光度計により測定し、活性化されたプロテイン
Ｃ濃度を求めた。その結果を第１図に示す。
尚、本発明物質の活性単位は、上記MCA基質を用いる方
法により、単位時間当り1nmol/mlのAMC濃度を示した値
を１単位に設定した。
測定法2: プロテインＣ（7.32μＭ）５μｌ、本発明物質０〜５μ
ｌ（0.055A280/ml）、0.1M塩化ナトリウム0.5％LubrolP
X（シグマ社製）を含有する0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH
7.5）５〜０μｌ及びトロンビン（4U/ml）50μｌを、0.
1M塩化ナトリウム、3.5mM塩化カルシウムを含む0.02Mト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）40μｌに溶解し、37℃で30分
間インキュベートする。次いでアンチトロンビンIII150
μｌを加え37℃で15分間インキユベートし反応を停止さ
せる。以下測定法１と同様にしてMCA基質を用いて遊離
したAMC濃度を測定した。その結果を第２図に示す。
これらの結果から、本発明物質はトロンビンによるプロ
テインＣの活性化を促進することがわかる。
血液の凝固時間を延長する。
測定法： 牛トロンビン（持田製薬（株）製）（1U/ml）100μｌと
本発明物質又はヒト・トロンボモジユリン（ＯD280:0、
42,0.84）100μｌをフイブロカツプに入れ、37℃で30分
加温する。次いでヒトフイブリーゲン（2mg/ml）100μ
ｌを添加し、フイブロメーター（ベクトン・デイツキン
ソン社製）を作動させ、凝固時間を測定した。２回測定
した結果を第１表に示す。
この結果に示されるように、本発明物質の濃度が高くな
るに従つて凝固時間が延長することから、本発明物質は
血液の抗凝固作用を有することがわかる。
尚、ヒト・トロンボモジユリンと比較して約２倍の活性
を有することがわかる。
（ｅ）安定性 条 件 残存活性 １％β−メルカプトエタノール還元処理 0.2 変性剤 １％SDS 124 8M尿素 90 6Mグアニジウムクロリド 80 pH2 70 pH10 80 ペプシン処理 58 キモトリプシン処理 24 トリプシン処理 80 本物質（0.045OD）を上記各条件下25℃、150分処理し
た。処理後0.02Mトリス緩衝食塩水で100倍に希釈し、活
性を測定した。非処理の活性値から残存活性を算出し
た。ペプシンは終濃度2.5μg/ml（pH2.5）、キモトリプ
シン、トリプシンは終濃度2.5μg/ml（pH7.5）を用い37
℃で８時間処理した。
〔実施例〕
次に実施例を挙げて説明する。
実施例１ （１）ヒト胎盤約450g（１個分）を、0.25Mシユクロー
ス、1mMベンズアミジン塩酸、アプロチニン（トラジロ
ール）10U/ml,ジイソプロピルフルオロフオスフエート
（DFP）2mMを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）700m
lで洗浄した後、破砕し均質化する。均質化した溶液を3
0,000×ｇで40分間遠心分離して得られる沈澱物を分取
し、上記緩衝液に懸濁させ、再度遠心分離して沈澱物を
分取する。以上の操作を５回行つて分取した沈澱物を0.
25Mシユクロース、1mMベンズアミジン塩酸，トラジロー
ル10U/ml,DFP2mM及び0.5％（v/v）トリトンＸ−100（シ
グマ社製）を含有する0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
１で抽出する。
抽出液の吸光度は、A280:33.5、比活性は1.1単位/OD280
であつた。
（２）得られた抽出液500mlを、予め抽出に用いた緩衝
液で平衡化したDEAE−セフアデツクスカラム（φ2.5cm
×70cm）に付し、同緩衝液1.2lで洗浄する。
次いで溶出液として、1M塩化ナトリウム、0.1mM EDTA、
1mMベンズアミジン塩酸及び0.5％（v/v）LubrolPX（シ
グマ社製）を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）１
を用いて溶出した。
（３）得られた溶出液１を0.1M塩化ナトリウム,0.1mM
EDTA,0.5％（v/v）LubrolPXを含む0.02Mトリス塩酸緩
衝液10lに対し３回透析した。透析液を、同緩衝液で平
衡化したジイソプロピルフオスフオロートロンビン−ア
ガロースカラム（φ2.5cm×20cm）に付し、同緩衝液2l
で洗浄する。
次いで、0.1mM EDTA,1mMベンズアミジン塩酸,0.5％（v/
v）LubrolPXを含む0.02Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）の
0.1M〜1M塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出し、１分画14
mlずつ分取し活性区分を集めた。
活性区分の吸光度はA280＝0.294,比活性は21.4単位/OD
280であつた。
（４）活性区分100mlをミリポアCX−10（ミリポア社製
の吸引式限外濾過膜）を用い約5mlに濃縮し、次いで0.1
M塩化ナトリウム0.1mM EDTA,0.5％（v/v）LubrolPX及び
1mMベンズアミジン塩酸を含む0.02Mトリス塩酸緩衝液で
平衡化したウルトロゲルAcA34（LKB社製カラム（φ2.7c
m×100cm）に付し、同緩衝液で溶解出した。１分画10ml
づつ分取し活性区分を集めた。活性区分の吸光度はA280
＝0.008,比活性は540単位/OD280であつた。
（５）得られた活性区分をミリポアCX−10を用いて約5m
lまで濃縮し、これに20％SDS溶液5ml,0.01％ブロムフエ
ノールブルー1ml及び50％グリセロール1mlを加え100℃
で２分間加熱した。次いで、Laemmliの方法（Nature22
7,680〜685.1970）に準じて、５％尿素を含む7.5％SDS
ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に付し、活性
部分を切り取つた。これを、１％ツイーン80（ポリソル
ベート80）及び0.1M塩化ナトリウムを含む0.02Mリン酸
緩衝液（pH7.5）に浸し、４℃で24時間溶出した。
溶出液をミリポアCX−10を用いて約5mlまで濃縮した。
蛋白濃度140μg/ml（Brad fordの方法;Anal.Biochem.72
248.1976参照）。
実施例２ 実施例１の（２）工程の溶出剤を、1M塩化ナトリウム,
0.5％LubnolPX,0.1mM EDTA及び6M尿素を含む0.02Mトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.5）１に変えて溶出した。
溶出液の吸光度A280＝5.9,比活性3.1単位/OD280であつ
た。
尚、上記以外は実施例１と同様に処理して本発明物質を
得た。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は本発明トロンビン結合性物質のトロ
ンビンによるプロテインＣの活性化促進作用を示す。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の性質を有するヒト由来のトロンビン結
    合性物質。 （ａ） 分子量：還元状態で 47,000±6,000 非還元状態で38,000±6,000 （ｂ） 等電点:pH4.9〜5.7 （ｃ） 親和性：トロンビンに対し強い親和性を有す
    る。 （ｄ） 活 性：トロンビンと結合してプロテインＣ
    を活性化する。血液の凝固時間を延長する。 （ｅ） 安定性：変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム，尿
    素）に対して安定。 トリプシン処理（2.5μg/mlのトリプシンを用い37℃で
    ８時間）で80％の残存活性を示す。
  2. 【請求項２】ヒト胎盤破砕物を非イオン界面活性剤を含
    む緩衝液で抽出し、その抽出物より、イオン交換クロマ
    トグラフイー、トロンビン−担体結合物を用いるアフイ
    ニテイクロマトグラフイーまたは（および）ゲル過法
    によって分離した分画を分子量分画することを特徴とす
    る次の性質を有するトロンビン結合性物質の製法。 （ａ） 分子量：還元状態で 47,000±6,000 非還元状態で38,000±6,000 （ｂ） 等電点:pH4.9〜5.7 （ｃ） 親和性：トロンビンに対し強い親和性を有す
    る。 （ｄ） 活 性：トロンビンと結合してプロテインＣ
    を活性化する。血液の凝固時間を延長する。 （ｅ）安定性：変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム，尿
    素）に対して安定。 トリプシン処理（2.5μg/mlのトリプシンを用いて37℃
    で８時間）で80％の残存活性を示す。
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