JPH07250671A

JPH07250671A - ２−ケト−ｌ−グロン酸生成菌

Info

Publication number: JPH07250671A
Application number: JP4820895A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Imai; 紘今井; Takeshi Sakane; 健坂根; Ikuo Nogami; ▲いく▼雄野上
Original assignee: HAKKO KENKYUSHO; Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: HAKKO KENKYUSHO; Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-06-05
Filing date: 1995-03-08
Publication date: 1995-10-03
Anticipated expiration: 2012-01-22
Also published as: JP2574661B2

Abstract

(57)【要約】【目的】新規２−ケト−Ｌ−グロン酸生成菌の提供。【構成】極鞭毛を２本以上有する運動性桿菌で、グリ
セロールからジハイドロオキシアセトンを生成せず、イ
ソプレンユニット数１０のユビキノンを有し、生育にチ
アミン、リボフラビン、およびパントテン酸を必須に要
求するシュードモナス・ソルボソキシダンス。【効果】Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン酸
を収率よく与える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビタミンＣ(Ｌ−アス
コルビン酸)の合成前駆体として有用な２−ケト−Ｌ−
グロン酸を生成する細菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＣ合成前駆体として有用な２−
ケト−Ｌ−グロン酸は、ライヒシュタイン法[ヘルベチ
カ・キミカ・アクタ(Ｈelvetica Ｃhimica Ａcta)第
１７巻、３１１頁(１９３４)]によって工業的に生産さ
れてきた。しかし、この方法は工程数が多く、全体とし
ての収率の向上が期待できないため、もっと有効な生産
方法を見出すことが必要になってきた。ライヒシュタイ
ン法に代わる方法として、微生物により、グルコースか
ら５−ケト−グルコン酸を生成し、これを化学的または
微生物によりイドン酸とし、更にこれを微生物的に酸化
して２−ケト−Ｌ−グロン酸に導く方法(米国特許第２,
４２１,６１１号)やグルコースから微生物により２,５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生成し、化学的または、微
生物により２−ケト−Ｌ−グロン酸に還元する方法(特
公昭３９−１４４９３号、特公昭５３−２５０３３号、
特公昭５６−１５８７７号、特公昭５９−３５９２０
号)が検討されてきた。しかし、これらの方法に用いら
れる化学的還元工程は、立体特異的でなく、前者ではＤ
−グルコン酸を、後者では、２−ケト−Ｄ−グルコン酸
を副生し収率の低下をきたす。また、この工程を微生物
により行う場合は、還元エネルギー源として余分の炭素
源を供給せねばならない。

【０００３】また、Ｌ−ソルボースを出発原料として２
−ケト−Ｌ−グロン酸を製造する方法が知られており、
この場合は、酸化工程のみで、還元工程を含まずに製造
できる。この方法の例として今までに、グルコノバクタ
ー(Ｇluconobaster)属、シュードモナス属、セラチア
(Ｓerratia)属、アクロモバクター(Ａchromobacter)
属、アルカリゲネス(Ａlcaligenes)属の細菌を用いた方
法が知られている[バイオテクノロジー・アンド・バイ
オエンジニアリング(Ｂiotechnology and Ｂioengine
ering)第１４巻、７９９頁(１９７２)、特公昭４１−１
５９号、特公昭４１−１６０号、米国特許第３,０４３,
７４９号、特公昭４９−３９８３８号、中国微生物学
報、第２０巻、第２４６頁(１９８０)および第２１巻、
第１８５頁(１９８１)、ソ連特許第５２６,６６０号参
照]。しかし、これまでに公表されている菌株によるＬ
−ソルボースからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の生成収率
は極めて低く、到底工業的に利用し得るものではなかっ
た。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、Ｌ−ソ
ルボースから高収率で２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成す
る微生物株を得るため、日本国内で採取した土壌試料か
ら多数の菌株を分離し、検索した結果、従来の知見を遥
かに上回る収率(消費糖当り約８０％)を示す細菌、分離
菌株番号５２６−２１、５２６−２２および５２６−４
２の３菌株を見出した。これら３菌株について鋭意研究
を行い、今までに知られていないシュードモナス属の新
菌種であることを見出し、本発明を完成した。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、極鞭毛を２本
以上有する運動性桿菌で、グリセロールからジハイドロ
オキシアセトンを生成せず、イソプレンユニット数１０
のユビキノンを有し、生育にチアミン、リボフラビン、
およびパントテン酸を必須に要求するシュードモナス属
の新菌種であるシュードモナス・ソルボソキシダンスを
提供するものである。

【０００６】本発明の細菌は、シュードモナス・ソルボ
ソキシダンスに属し、Ｌ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−
グロン酸に酸化する能力を有する微生物であり、該微生
物またはその処理物を、Ｌ−ソルボースと接触させて、
２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成、蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造
法に用いることができる。

【０００７】本発明者らが見出した３菌株の分類学的性
状は、次の通りである。 (a)形態 (１)桿菌。０.３〜０.５×０.７〜１.４μm。 (２)多形性は認められない。 (３)運動性があり、２本以上の極鞭毛有する。 (４)胞子を形成しない。 (５)グラム陰性。 (６)非抗酸性。

【０００８】(b)生育の状態 (１)肉汁寒天平板培養: 生育中程度。円形、全縁、平
滑、乳白色の集落を形成する。 (２)肉汁寒天斜面培養: 生育中程度。糸状、平滑、乳白
色。 (３)肉汁液体培養: 生育中程度。沈澱を生じる。 (４)肉汁ゼラチン穿刺培養: 上部のみ生育するが、ゼラ
チンを液化しない。 (５)リトマスミルク: 酸性化するが、凝固、分解は認め
られない。

【０００９】(c)生理学的性質 (１)硝酸塩の還元は微弱。 (２)脱窒反応陰性。 (３)メチルレッド(ＭＲ)テストは弱陽性。 (４)フォーゲス・ブロスカウエル(ＶＰ)テストは弱陽
性。 (５)インドールを生成しない。 (６)硫化水素を生成しない。 (７)デンプンの加水分解は陰性。 (８)クエン酸の利用性は陰性。 (９)アンモニウム塩を窒素源として利用できる。 (１０)色素の生成は認められない。 (１１)ウレアーゼ陽性。 (１２)オキシダーゼ陽性。 (１３)カタラーゼ陽性。 (１４)１５〜３６℃で生育し、至適生育温度は３０℃付
近。pＨ５.５〜８.７で生育し、至適生育pＨは６.０〜
７.５。 (１５)好気的。 (１６)ヒュー・ライフソンのＯＦテストは酸化的。 (１７)Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコ
ース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラク
トース、麦芽糖、しょ糖、乳糖、トレハロースから微弱
に酸を生成するが、ガスは生成しない。Ｄ−ソルビッ
ト、Ｄ−マンニット、イノシット、グリセリン、デンプ
ンから酸、ガスを生成しない。

【００１０】(d)その他の性質 (１)ＤＮＡのグアニンとシトシン含量は約６７モル％で
ある。 (２)イソプレンユニット数１０のユビキノンを有する。 (３)グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生成
しない。 (４)生育にチアミン、リボフランビン、パントテン酸を
必須に要求し、ビオチン、カザミノ酸により生育を促進
される。

【００１１】以上の分類学的性状を、バージーズ・マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー
(Ｂergey's Ｍanual of Ｓystematic Ｂacteriolog
y)第１巻(１９８４年)に照合してみると、これら菌株は
いずれも、グラム陰性、極鞭毛を有する運動性桿菌で、
好気性、オキシダーゼ陽性であることから、シュードモ
ナス属の細菌種と考えるのが妥当である。生育にビタミ
ン、アミノ酸を要求すること、ＤＮＡのグアニンとシト
シンの含量が６７モル％であることから、この属のセク
ションＩＶに分類される。また、イソプレンユニット数
１０のユビキノンを有することから、このセクションの
シュードモナス・ディミニュータ(Ｐseudomonas dimin
uta)およびシュードモナス・ベシキュラリス(Ｐseudomo
nas vesicularis)に近縁な種と考えられる。しかしな
がら、鞭毛の着生数、糖の資化性等で、前記２菌種と異
なり、シュードモナス属の既知種の中に該当するものを
見出すことができず、この属の新菌種と判断した。そこ
でこれら３菌株をシュードモナス・ソルボソキシダンス
(Ｐseudomonas sorbosoxidans)と命名し、昭和６１年
(１９８６年)４月１１日に財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)
に、また昭和６１年(１９８６年)４月２６日に通商産業
省工業技術院微生物工業技術研究(ＦＲＩ)に寄託した。
これらの３菌株は、その後、昭和６２年４月３日にブタ
ペスト条約の下ＦＲＩに寄託した。３菌株の分離番号と
菌株保存機関の受託番号は次の通りである。分離菌株番号ＦＲＩ受託番号ＩＦＯ受託番号５２６−２１ＦＥＲＭＰ−８７５０ＩＦＯ１４５０１ (ＦＥＲＭＢＰ−１３３４) ５２６−２２ＦＥＲＭＰ−８７５１ＩＦＯ１４５０２ (ＦＥＲＭＢＰ−１３３５) ５２６−４２ＦＥＲＭＰ−８７５２ＩＦＯ１４５０３ (ＦＥＲＭＢＰ−１３３６)

【００１２】本発明の菌株としては、上記した３菌株は
勿論のこと、３菌株を紫外線やＸ線を照射したり、Ｎ−
メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ニトロ
ソグアニジン)、メチルメタンスルホン酸、ナイトロジ
ェンマスタードのような変異誘起剤で処理して得られる
変異株も有利に用いられる。その例としてシュードモナ
ス・ソルボソキシダンス５２６−２１からニトロソグア
ニジン処理によって誘導されたＳＢ−１５株を挙げるこ
とができる。ＳＢ−１５株はＬ−ソルボースから２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸生成能が増強されている他は、親株で
ある５２６−２１株と同じ分類学的性質を示した。ま
た、該ＳＢ−１５株は、昭和６２年４月２３日にＩＦＯ
に受託番号ＩＦＯ１４６０４として、昭和６２年５月１
日にＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１３５６とそれ
ぞれ寄託された。前記菌株のいずれかを、Ｌ−ソルボー
スを含有する培地で培養してもよく、またＬ−ソルボー
スに前記菌株の菌体処理物を作用させてもよい。

【００１３】本明細書中で用いる「菌体処理物」とは、前
記の菌株のいずれかを培養して得られる培養物の洗浄菌
体、アセトンパウダー、ポリアクリルアミドゲルまた
は、Ｋ−カラギーナン包括固定菌体等をいう。原料のＬ
−ソルボースは、培養当初から、使用する全量を培地に
加えてもよいし、何回かに分けるかまたは、連続的に培
養液に加えてもよい。Ｌ−ソルボースと前記細菌とを接
触させて行う反応では、Ｌ−ソルボースの濃度は、培地
に対して３〜３０％(Ｗ／Ｖ)、好ましくは、５〜２５％
(Ｗ／Ｖ)である。Ｌ−ソルボースと菌体処理物とを接触
させる方法としては、例えば、菌体処理物にＬ−ソルボ
ース、２−(Ｎ−モルフォリノ)エタンスルホン酸(ＭＥ
Ｓ)緩衝液(０.５Ｍ、pＨ６.５)およびＣaＣＯ₃を加え、
水で希釈して三角フラスコ中で振盪させる方法が挙げら
れる。Ｌ−ソルボースと前記菌体処理物を接触させて行
う反応のＬ−ソルボースの濃度は０.１〜１０％(Ｗ／
Ｖ)、好ましくは０.３〜３％(Ｗ／Ｖ)であり、菌体処理
物の量は、処理前の乾燥菌体として１〜３０mg／ml、好
ましくは３〜２０mg／mlである。反応液のpＨは、５.５
〜７.５に調製され、反応温度は約２０〜４０℃、反応
時間は約１〜１００時間である。

【００１４】前記細菌株の培養に用いられる培地は、こ
れらが利用し得る栄養源を含むものであれば、液状でも
固体状態でもよいが、大量のものを得るときには、液体
培地を用いるのが好ましい。該培地には、通常微生物の
培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩類、有機酸塩
および微量栄養素が用いられる。炭素源としては、原料
であるＬ−ソルボースを使用できるが、補助炭素源とし
て、例えばグルコース、グリセリン、ショ糖、乳糖、麦
芽糖、糖蜜等が使用される。窒素源としては、例えばア
ンモニウム塩、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、乾燥酵母、綿実粕、尿素等の無機お
よび有機の窒素含有物が挙げられる。また、無機塩類と
しては、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マグネシ
ウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛、銅および燐酸の
塩類が用いられる。微量栄養素としては、前記細菌株の
生育必須あるいは促進因子である、ビオチン、チアミ
ン、リボフラビン、パントテン酸およびアミノ酸類、ま
たはこれらを含有する天然物として適宜加えられる。培
養の手段は、静置培養でも、振盪培養あるいは通気撹拌
培養法等の手段を用いてもよいが、大量の処理は、いわ
ゆる深部通気撹拌培養によるのが望ましい。

【００１５】培養条件は、使用する菌株、培地の組成、
その他によっても異なり、要するに目的物が最も効率よ
く生産されるように、個々の場合に応じて選択すればよ
い。例えば、培養は２５〜３５℃において行うのがよ
く、培地のpＨは５〜９程度が望ましい。以上のような
条件下で、１０〜１２０時間培養することにより、２−
ケト−Ｌ−グロン酸が最高濃度に蓄積される。なお、こ
の場合、目的物の生成に伴ってpＨが低下するのが一般
的であるので、適当な塩基性物質、例えば苛性ソーダ、
苛性カリ、アンモニア等を添加して、常に微生物の２−
ケト−Ｌ−グロン酸生成に最も適したpＨに保持するの
もよく、また培地中に適当な緩衝剤を添加して、最適な
pＨが保持されるようにするのもよい。

【００１６】このようにして、培養液中、または反応液
中に生成、蓄積された２−ケト−Ｌ−グロン酸は、その
性状を利用したそれ自体公知の手段で分離、精製するこ
とができる。２−ケト−Ｌ−グロン酸は遊離の酸として
分離してもよく、またはナトリウム、カリウム、カルシ
ウム、アンモニウム等の塩として分離してもよい。分離
の方法としては、目的に反しない限り、いかなるもので
もよい。例えば、必要に応じて反応生成物から濾過、遠
心沈澱、あるいは活性炭処理等を行って菌体を除去した
後、この溶液をそのまま濃縮し、析出する結晶を濾取
し、更に再結晶させて目的物を取り出す方法、溶媒抽出
法、クロマトグラフィー法、塩析法等を単独または、適
宜組み合わせて、あるいは反復して利用することもでき
る。２−ケト−Ｌ−グロン酸が遊離型で得られる場合
は、これを適宜の方法によって、例えばナトリウム、カ
リウム、カルシウム、アンモニウム等の塩にしてもよ
く、また塩として得られる場合は、これを適宜の方法に
よって遊離型あるいは他の塩に変えてもよい。

【００１７】本発明の細菌を用いて得られる目的物が、
２−ケト−Ｌ−グロン酸であることは、例えば元素分
析、融点、旋光度、赤外線スペクトル等の物理化学的諸
性質の測定によって同定された。反応液、培養液中に生
成した２−ケト−Ｌ−グロン酸の定量は、スルホン化ポ
リスチレンゲル充填カラム(島津製作所製、ＳＣＲ−１
０１Ｈカラム、７.９mm×３０cm)を用いる高速液体クロ
マトグラフィー法(移動相:pＨ２.２の希硫酸、流量:０.
５ml／min、検出器:示差屈折計)で行い、標準品として
は、２−ケト−Ｌ−グロン酸ナトリウム１水塩の結晶を
使用した。また、２−ケト−Ｌ−グロン酸の検出は、薄
層クロマトグラフィー法で行った。セルロースプレート
(メルク社製)にサンプルをスポットし、フェノール:水:
ギ酸(７５:２５:５)の溶媒で室温下３時間展開後、プレ
ートを乾燥し発色させると、２−ケト−Ｌ−グロン酸
は、硝酸銀試薬では黒褐色の、o−フェニレンジアミン
試薬では黄色の、アニリンフタル酸試薬では桃色のスポ
ットをＲf値０.３付近に与えることにより検出された。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。なお、培地の％は、重量／容量％を示す。実施例１グルコース２％、ポリペプトン(大五栄養化学社製)１
％、酵母エキス０.２％、ＮaＣl ０.５％、寒天１.５％
(pＨ７.２)から成る試験管斜面培地上に２８℃、２日間
培養したシュードモナス・ソルボソキシダンス５２６−
２１(ＩＦＯ１４５０１、ＦＥＲＭＰ−８７５０)の菌
体１白金耳をグルコース２％、ポリペプトン１％、乾燥
酵母０.５％、ＣaＣＯ₃ ２％から成る培地２０mlを２０
０ml容の三角フラスコに分注して、１２１℃、１５分間
滅菌したものに接種し、２８℃、２日間振盪(２００rp
m)培養して、種培養液を得た。この種培養液２mlを、蒸
気滅菌した、ポリペプトン１％、カザミノ酸０.２％、
乾燥酵母０.５％、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ０.５％、Ｎa₂Ｓ₂Ｏ₃
・５Ｈ₂Ｏ０.０５％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０.０３％、ＭgＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ０.０５％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.１％、
ＭnＳＯ₄・nＨ₂Ｏ０.０００５％、チアミン塩酸塩０.０
００５％、ＣaＣＯ₃ ６％、濾過除菌したＬ−ソルボー
ス１５％から成る発酵培地２５mlを２００ml容の三角フ
ラスコ(滅菌済)に分注したものに接種して、２８℃、３
日間振盪培養した。得られた発酵液を高速液体クロマト
グラフィーにより分析したところ、５４.９mg／mlの２
−ケト−Ｌ−グロン酸(使用糖当りモル収率３４.０％)
を含んでいた。この発酵液１０００mlを遠心沈澱して、
菌体等の残渣を除去して得た上澄約９８０mlをアンバー
ライトＩＲ１２０(ローム・アンド・ハース社製、Ｈ
⁺型、５００ml)カラムに通し、ついで、約３００mlの脱
イオン水で洗浄した。この通過液と洗浄液を合わせて、
苛性ソーダでpＨ６.５に調製した後、５０℃で約５０ml
まで減圧下で濃縮した。この濃縮液を５℃に２４時間放
置することにより生じた無色柱状の結晶を濾取し、少量
の冷メタノールで洗浄後、室温、減圧下に五酸化燐上で
乾燥して３８.５gの２−ケト−Ｌ−グロン酸モノナトリ
ウム１水塩を得た。得られた結晶の分析値は、融点:１
４７〜１５５℃、元素分析値(Ｃ₆Ｈ₉Ｏ₇Ｎa・Ｈ₂Ｏ):
理論値(Ｃ;３０.７８％、Ｈ;４.７４％)、測定値(Ｃ;３
０.８４％、Ｈ;４.８９％)、比旋光度: [α]²⁴ _D−２３.
３°(Ｃ＝１.０、水)で、高速液体クロマトグラフィー
の保持時間と薄層クロマトグラフィーのＲf値と試薬に
より発色した色調は、標準品のそれらと一致した。

【００１９】実施例２前記実施例１と同じ方法で、シュードモナス・ソルボソ
キシダンス５２６−２２(ＩＦＯ１４５０２、ＦＥＲＭ
Ｐ−８７５１)の種培養液を得た。この種培養液２ml
を、前記実施例１で用いた発酵培地の成分の中でＮa₂Ｓ
₂Ｏ₃・５Ｈ₂Ｏを０.１％に変えた培地２５mlを２００ml
容三角フラスコに分注したものに接種して、３０℃、５
日間振盪培養した。得られた発酵液中には、７２.９mg
／mlの２−ケト−Ｌ−グロン酸が含まれていた。(使用
糖当りモル収率４５.１％)

【００２０】実施例３前記実施例１と同じ斜面培地に２８℃、２日間成育させ
たシュードモナス・ソルボソキシダンス５２６−４２
(ＩＦＯ１４５０３、ＦＥＲＭＰ−８７５２)の菌体１
白金耳を、グルコース２％、酵母エキス０.３％、コー
ンスチープリカー０.３％、カゼイン０.５％、ＣaＣＯ₃
２％から成る種培地２０mlを２００ml容三角フラスコ
に分注して、１２１℃、１５分間蒸気滅菌したものに接
種し、２８℃にて１日振盪培養して種培養液を得た。こ
の種培養液２mlをコーンスチープリカー２％、Ｎa₂Ｓ₂
Ｏ₃・５Ｈ₂Ｏ０.０５％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.１
％、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ ０.３％、ＦＭＮ０.０００１％、
ビオチン０.００００５％、ＣaＣＯ₃ ９％から成る培地
２０mlを分注した２００ml容マイヤーに分注し蒸気滅菌
したものに接種し、濾過除菌した４０％Ｌ−ソルボース
液を、接種直後に３ml、１６時間後に２ml、２４時間後
に３ml、４０時間後に２ml、４８時間後に３ml添加しな
がら３０℃、３日間振盪培養した。このようにして得ら
れた発酵液を高速液体クロマトグラフィーにより分析し
たところ、８５.４mg／mlの２−ケト−Ｌ−グロン酸(使
用糖当りモル収率５０.３％; 消費糖当りモル収率８６.
０％)が含まれていた。

【００２１】実施例４実施例１で得られたシュードモナス・ソルボソキシダン
ス５２６−２１(ＩＦＯ１４５０１、ＦＥＲＭＰ−８
７５０)の発酵液１０００mlから遠心沈澱して得た沈澱
物を約１００mlの冷生理食塩水(０.８５％)に懸濁し、
１０００rpm、５分間遠心して、主にＣaＣＯ₃から成る
沈澱物を除き、上澄を更に９０００rpm、１０分間遠心
沈澱して、洗浄菌体を得た。これを３５mlの冷生理食塩
水に懸濁したもの８mlに、Ｌ−ソルボース６００mg、２
−(Ｎ−モルフォリノ)エタンスルホン酸(ＭＥＳ)緩衝液
(pＨ６.５、０.５Ｍ)１mlとＣaＣＯ₃ ３６０mgを加え、
水で総量２０mlとし、２００ml容三角フラスコ中で３０
℃、２４時間振盪しながら反応させた。このようにして
得られた反応液中には、２１.５mg／mlの２−ケト−Ｌ
−グロン酸(使用糖当りモル収率６６.５％)が生成して
いた。

【００２２】実施例５シュードモナス・ソルボソキシダンス５２６−２１株を
Ｄ−ソルビット２.５％、ペプトン１％、酵母エキス１
％、炭酸カルシウム０.２％、寒天２％からなる斜面培
地に３０℃、３日間培養した。この菌体１白金耳をペプ
トン０.５％、酵母エキス０.５％、ＮaＣl ０.２％(pＨ
７.０)からなるＰＹ培地５mlを含む試験管に植菌し、２
８℃、１６時間振盪培養した。得られた培養液２mlに、
１mgのニトロソグアニジンを溶解したＰＹ培地１mlを加
え、２８℃で３０分間保温して変異剤処理した。この処
理液を１７０分間遠心分離(５０００rpm)して菌体を集
め、これを１０mlの新鮮なＰＹ培地に懸濁し遠心分離
(５０００rpm、１０分間)して、洗浄菌体を得た。次
に、これを５mlのＰＹ培地に懸濁し、２８℃で３時間振
盪培養した。得られた培養液をＰＹ培地で適当に希釈
後、その０.１mlをＬ−ソルボース１０％と寒天２％を
加えたＰＹ培地を含むプレート(直径９cm)に撒き、２８
℃で７日間培養した。生じたコロニー３５９個を各々上
記斜面培地に移植し２８℃、３日間培養した。各々の斜
面培地の菌体１白金耳をＬ−ソルボース１０％、コーン
スチープリカー２％、乾燥酵母０.３％、Ｎa₂Ｓ₂Ｏ₃・
５Ｈ₂Ｏ０.０２％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.１％、硫
安０.３％、ペプトン０.２％、ＣaＣＯ₃ ４％(pＨ６.
６)からなる培地３mlを含む試験管に植菌し、３０℃で
５日間振盪培養した。得られたこれらの培養液を１２０
００rpmで５分間遠心分離し培養液上清を得る。この上
清を希硫酸(０.３Ｎ)で５倍に希釈後、再度遠心分離(１
２０００rpm、５分間)して希釈上清を得た。これらの希
釈上清１μlをセルロースプレート(メルク社製・米国)
にスポットし、フェノール:水:ギ酸(７５:２５:５)の溶
媒系で室温で３時間展開した。このプレートを風乾後、
硝酸銀試薬で発色させた。Ｒf値３.０付近(２−ケト−
Ｌ−グロン酸に相当)に最も大きな黒褐色のスポットを
与えた株をＳＢ−１５株(ＩＦＯ−１４６０４、ＦＥＲ
ＭＢＰ−１３５６)として選択した。

【００２３】実施例６実施例５で得たシュードモナス・ソルボソキシダンスＳ
Ｂ−１５株をＤ−ソルビット２.５％、ペプトン１％、
酵母エキス１％、炭酸カルシウム０.２％、寒天２％(p
Ｈ７.０)からなる斜面培地に３０℃、３日間培養した。
この菌体１白金耳を、グルコース２％、ペプトン１％、
酵母エキス１％、炭酸カルシウム２％(pＨ６.８)から成
る培地２０mlを２００ml容の三角フラスコに接種し、３
０℃、２日間振盪培養(２００rpm)培養して、第１種培
養液を得た。第１種培養液１.５mlを上記と同じ培地を
含む同じフラスコに移植し、３０℃で２日間振盪培養
し、第２種培養を得た。得られた第２種培養液２mlを蒸
気滅菌した。乾燥酵母０.５％、コーンスチープリカー
２％、ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.１％、Ｎa₂Ｓ₂Ｏ₃・５Ｈ
₂Ｏ０.０５％、炭酸カルシウム４％、別滅菌したＬ−
ソルボース１０％からなる発酵培地２５mlを２００ml容
の三角フラスコ(滅菌済)に分注したものに移植して３０
℃で３日間振盪培養した。得られた発酵液を高速液体ク
ロマトグラフィーにより分析したところ、８２.０mg／m
lの２−ケト−Ｌ−グロン酸を含んでいた。なお、この
時、同じ方法で培養した親株５２６−２１株の２−ケト
−Ｌ−グロン酸生成量は４７.１mg／ml(使用糖当りモル
収率７６.１％)であった。

【００２４】実施例７シュードモナス・ソルボソキシダンスＳＢ−１５株を発
酵培地中のＬ−ソルボースとＣaＣＯ₃濃度をそれぞれ１
３％と６％にした以外は、実施例６と同じ方法で培養し
た。得られた発酵液を高速液体クロマトグラフィーによ
り分析したところ、８４.０mg／mlの２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸を含んでいた。なお、この時、同じ方法で培養し
た親株５２６−２１株の２−ケト−Ｌ−グロン酸蓄積量
は６３.８mg／ml(使用糖当りモル収率６０.０％)であっ
た。

【００２５】

【発明の効果】本発明のシュードモナス・ソルボソキシ
ダンスを用いることにより、Ｌ−ソルボースから２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸を収率よく製造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】極鞭毛を２本以上有する運動性桿菌で、
グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生成せ
ず、イソプレンユニット数１０のユビキノンを有し、生
育にチアミン、リボフラビン、およびパントテン酸を必
須に要求するシュードモナス・ソルボソキシダンス。