JPH0358794A - 酵母による異種遺伝子産物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、カビ酸性プロテアーゼのシグナルペプチド及
び前駆体領域を用いた、酵母でのタンパク質若しくはペ
プチド等の異種遺伝子産物の菌体外への製造法に関する
。

［従来の技術およびその課題コ 近年の遺伝子工学的技術の進歩【こより有用な遺伝子産
物を人工の組換え体により生産することが可能になり、
広く利用され始めている。

タンパク質若しくはペプチド等（以下「異種遺伝子産物
」という）の遺伝子組換え法による生産においては、こ
れら異種遺伝子産物を菌体外に分泌生産することが、次
の点で有意義である。

（１）菌体内の過剰蓄積がなく宿主の増殖に影響を与え
にくい。

（２）培地中に蓄積するために生産量を上げることがで
きる。

（３）菌体内プロテアーゼにＪこる分解がない。

（４）分泌されるタンパク質の種類がそれほど多くなく
精製が簡単である。

従来から、あるタンパク質が分泌生産されるためには、
そのアミノ末端側に約２０個のアミノ酸からなるシグナ
ルペプチドと呼ばれる配列が必要であることが知られて
いる（　Ｂｌｏｂｅｌ，Ｇ．　ａｎｄ　Ｄｏｂｂｅｒｓ
ｔｅｉｎ，Ｂ．；　Ｊ．　ＣｅｌｌＢｊｏｌ．，６７，
　８３５　（１９７５））。そこでこれらのシグナルを
用いたタンパク質の分泌生産が多くの研究者により研究
されてきた（安藤忠彦、坂口健二編、微生物学基礎講座
８遺伝子工学）特にこれらの研究は、アミラーゼやブロ
テアーゼなどの工業用酵素を多量に分泌することが知ら
れている枯草菌を中心に進められており、枯草菌を宿主
とした分泌ベクターが開発され、報告されている。　こ
の分泌ベクターの構造としては、通常のベクターに必要
な複製起点や選択マーカー遺伝子のほがに、強力なプロ
モーターにより転写が制御されたシグナルペブチドをコ
ードするＤＮＡ部分と、その下流に目的タンパク質の遺
伝子を接続したものが挙げられる。　この分泌ベクター
のシグナル配列としては、ハシラス　アミロリキファシ
エンス（　Ｂａｓｉ］］．ｏｓ　　ａｍｙｌｏｌｉｑｅ
ｆａｃｉｅｎｃｅ　）　　（　Ｐａｌｖａ，Ｔ　ｅｔ　
ａｌ：　Ｇｅｎｅ，］９．４３（１９８］））および枯
草菌（　Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）のα−アミラーゼ
　　（　　Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．ｅｔ　　ａｌ．：　
　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ］．，］．５６，　３２７（１
９８３））、アルカリ性プロテアーゼ（　Ｖａｎｓａｎ
ｔｈａ，Ｎ．　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．：
　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．，１６５，８３７　（１９
８６））および中性プロテアーゼ（　Ｈｏｎｊｏ，Ｍ．
　ｅｔ　ａｌ：　Ｔｈｅ　３ｒｄ　Ｉｎｔｅｒ−ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔ
ｊ．ｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ］ｏｇｙ　ｏｆ
　Ｂａｃｉｌｌｉ　ａｔ　Ｓｔａｎｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ
．，Ａｂｓｔｒａｃｔ，　ｐ．５２（１９８５））やハ
シラス　ライケンフオルミス（　Ｂ．１ｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ　）由来のべニシリナーゼ（　Ｆｕｊｉｊ，
Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
］．　，　１２８．　２９９７（１９８２））のものな
どが利用されている。　また、枯草菌を用いて、分泌さ
れる異種遺伝子産物の例としては、大腸菌由来のβ−ラ
クタマーゼやスタフィロコッカス　アウレウス（　Ｓｔ
ａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）由来のプ
ロテインＡなどがあり、これらの場合、培養１リットル
当りゴー３ｇ程度のタンパク質が菌体外に生産されるこ
とが報告されている（　Ｖａｎｓａｎｔｈａ，Ｎ．　ａ
ｎｄ　　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏ１．，１６５，８３７　（１９８６））。

このように微生物、特に原核細胞に由来する遺伝子の分
泌発現には、枯草菌を宿主とする分泌ベクター系が非常
に有効であったが、この系を用いてヒトの遺伝子産物を
生産させる場合、例えば或長ホルモンを分泌生産させる
と最大でも培養１リットル当り１０ｍｇ程度しか分泌生
産できず、真核生物由来の遺伝子産物を分泌生産させる
ことは現在のところ困難である。

真核生物における分泌生産の宿主として最近カビに興味
がもたれている（坂口健二：”糸状菌”、ｐ：１９２，
　　安藤忠彦、坂口健二編、微生物学基礎請座８遺伝子
工学）。　特にアスベルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）属のものは、工業用酵素の生産に用いられ、培養１
リッｊ・ル当りＪＯｇ以」二のタンパク質が生産される
系も知られている。例えば、最近アスペルギルスのα−
アミラーゼ遺伝子がセルフクローニングされ、培養１リ
ットル当り１０数ｇのタンパク質の生産が報告された（
ノボ・インダス１・リー、特開昭６３−２７２９８８号
）。

しかしながら異種遺伝子の発現系としてカビは、形質転
換効率の低さや現在使用できるプロモーターの数の少な
さ、さらに発現機構の詳細についての研究がほとんどな
されていないといった多くの問題点を抱えている。

また他方、真核微生物の宿主ベクター系として酵母（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）も
良く知られている。この系では、主として解糖系に関係
する酵素の遺伝子の強力なプロモーターの利用も進めら
れており、さらに遺伝解析のしやすさから遺伝子発現や
増殖制御のメカニズムについての実験材料として供され
ている。

ところが、代表的酵母であるパン酵母 （　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ　）は、ほとんどタンパク質を生産しないことから分
泌生産の宿主としては、あまり注目を集めていない。

しかし最近、カビ　リゾパス（　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　）
由来のグルコアミラーゼ（　Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｔ　ｅ
ｔ　ａｌ．：　Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．　３０．　５１５（１９８９）　）
やムコール（　Ｍｕｃｏｒ　）由来の酸性プロテアーゼ
（　Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．：　Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ，　２１０，　４６２（１９
８７））がパン酵母（　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）で培養１リットル当り２０
０　　ｍｇ以上分泌生産されることが報告され、パン酵
母の分泌能が従来考えられていたよりもかなり高いこと
が証明された。

しかし、パン酵母の分泌ベクターとしては、α−ファク
ターを利用したもののみ広く利用されているに過ぎず（
　Ｂｒａｂｅ，Ａ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．：Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８１．
　４６４２（１９８４））、未た工業的に利用するには
不十分な状況であった。

［課題を解決するための手段コ 本発明者らは、パン酵母等の酵母の有する分泌タンパク
質が少ないという欠点は、逆に異種遺伝子産物の生産に
おいては夾雑タンパクが少ないという大きな利点になる
ことに着目し、酵母において異種遺伝子生産物の分泌量
を増大せしめることができれば優れた分泌ベクター系が
得られると考え研究を進めた。

カビで生産される酸性プロテアーゼは、チモーゲン（前
駆体、プロ体）として生産され、その後プロ領域が自己
分解あるいは他のプロテアーゼにより取り除くことによ
り成熟プロテアーゼとして十分な活性を示すようになる
のであるが、前記の如くリゾパス由来の酸性プロテアー
ゼ等がパン酵母において効率よく分泌されることから、
リゾパス酸性プロテアーゼのプロ領域は、活性のモジュ
レイターとしての機能のほかに、分泌およびタンパク質
の安定化に重要な役割を担っていると推定した。

本発明者らは、これらの知見に基づき、リゾパスの有す
るシグナル配列等を目的異種遺伝子産物の遺伝子に接続
させ、これで宿主酵母細胞を形質転換させたところ、異
種遺伝子産物を効率良く宿主酵母細胞外に分泌させるこ
とができることを見出し本発明を完或した。

したがって本発明は、糸状菌リゾプスニベウス（　Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ　）由来の酸性プロテアー
ゼのシグナルペブチド及び前駆体領域をコードする遺伝
子の下流に目的異種遺伝子産物をコードする遺伝子を接
続してキメラ遺伝子を作製し、このキメラ遺伝子を組み
込んだ組換ベクターで宿主酵母細胞を形質転換し、当該
宿主酵母細胞を培養することを特徴とする異種遺伝子産
物の製造法である。

本発明のシグナルペプチド及び前駆体領域は、次式工の
アミノ酸配列で表わされる：Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　
Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　
　Ｖａｌ２０ Ａｌａ　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　
　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ３０ Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　　
Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　　Ｉｌｅ４０ Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　Ａｓｎ
　　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ５０ Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ６０ Ａｌａ　ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ＳｅｒＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ
　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ（６６）（Ｉ） （式中、Ｎｅｔ（１）−Ａｌａ（２１）がシグナルペブ
チドを示し、Ａｌａ（２２）−Ｇｌｕ（６６）が前駆体
領域を示す） この、ペプチド配列（Ｉ）をコードする遺伝子配列は、
糸状菌リゾブスニベウス （　Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｖｅｕｓ　）に属する酸性
プロテア−１０− ーゼ生産菌から、常法により次の方法で得ることができ
る。　すなわち、酸性プロテアーゼ生産菌から公知の方
法によりその全ＤＮＡを取得し、これをＳａｕ３ＡＩ等
の制限酵素【こよって切断してＤＮＡ断片を得、この断
片から酸性プロテアーゼ生産菌の遺伝子ライブラリーを
得る。　次いて、酸性プロテアーゼをコードする　ＤＮ
Ａを検出し、ファージベクターおよび／またはプラスミ
ドベクターを用い、合成ＤＮＡによる部位特異的変異法
等で必要な制限酵素切断部泣を加え、また、酸性プロテ
アーゼの不用なアミノ酸をコードするＤＮＡを削除する
ことにより得られる。

この、シグナルペブチド及び前駆体領域をコードする遺
伝子の下流にペブチドをコードする遺伝子を接続するこ
とも、公知の方法により行なうことができる。

すなわち、ｃＤＮＡを常法により取Ｉ号シ、これに必要
により所要制限酵素切断部位およびリンカーを付加した
後、前記で得られたシ１１ グナルペプチド及び前駆体領域（１〉をコードするＤＮ
Ａと常法によりラ・イゲーションすることにより行なわ
れる。

上記の如くして得られたキメラ遺伝子を紹み込まれた発
現ベクターで宿主酵［３を形質転換し、この宿主酵ＪＯ
を、常法により培養することにより培養物中から目的の
異種遺伝子産物を得ることができる。

宿主酵母の形質転換も公知の方法に従って行なうことが
できる。

なお、形質転換された宿主酵母の培養も一般的な培養条
件によりおこなわれるが、特に好ましい培養法としては
、約３　０　’Ｃ程度の温度条件で、ＹＰＤ培地（〕％
酵母エキス、２％　ポリペブトン、２％フドウ糖）等を
用いる振盪培養法が挙げられる。

本発明により得られる例としては、リゾプス酸性プロテ
アーゼＴ自身及びリゾプスリボヌクレアーゼＲｈを始め
、アミラーゼ、リパーゼ等を挙げることができるがそれ
以外てあ１２− っても構わない。

なお、本発明において、前駆体領域を持たないリゾプス
酸性プロテアーゼ■をパン酵旬中で発現させた場合、以
下の実施例で示されるように菌体内外共に活性及びタン
パク質は認められない。　又、リゾプスリボヌクレアー
ゼＲｈの場合、シグナルペプチドを有するたけてはパン
ｌＷ母において極少量（培養液１リットル当り約７μｇ
）のりボヌクレアーセ’Ｒｈを分泌生産するに過ぎない
が、前駆体領域を導入することによりそれの生産量は飛
躍的に増加する。例えばリゾプス酸性プロテアーゼでは
、培養液１リットル当り約５０ｍｇ、またリボヌクレア
ーゼ叶においては、培養液１リットル当り約４．　０　
ｍ　ｇの目的タンパク質の生産が認められた。

［発明の効果］ 以−１−のように、本発明はリゾブス由来酸性プロテア
ーゼの前駆体プロ領域の下流に目的とずるタンパク質あ
るいは、ペプチドをっな１３ ぐことにより、パン酵母による菌体外への有用タンパク
質の製造を可能とならしめるものである。

［実施例］ 以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明する。

実施例　１ 変異酸性プロテアーゼ遺伝子の作製： 酸性プロテアーゼの前駆体領域中に変異を持つ遺伝子を
以下に示す方法により作製した。

（］．）プラスミドｐＹＰＲ　　２７３１の作製（］）
　　リゾプス遺伝子ライブラリーの作製酸性プロテアー
ゼ生産菌　（　Ｒ．　　ｎｉｖｅｕｓＹａｍａｚａｋｉ
　ＩＦＯ　４８１０）からハインズらの方法（Ｈｙｎｅ
ｓ，　Ｍ．　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃ．　Ｃ
ｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．　ｅ，　１９３０）に
より全ＤＮＡを単離した。

このＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解し、蔗糖
密度勾配遠心法により８〜１５ｋｂの画分を集めた。　
この８〜１５ｋｂのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ処理したベ
クター　ｐＢＲ１４ ３２２とＴ４リガーゼて結合し、大腸菌ＪＡ２２１を形
質転換して、アンピシリン耐性形質転換体としてリゾプ
スの遺伝子ライブラリーを取得した。　大腸菌の形質転
換は常法を用いた。

（２）遺伝子ライブラリーのスクリーニング 形質転換体を選択するために、酸性プロテアーゼ遺伝子
検出用のブローブを作製した。

プローブの作製は、酸性プロテアーゼのＮ末端アミノ酸
配列の一部であるＭ　ｅ　ｔ　−　Ｖ　ａ　１−Ａｓｐ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−
Ｔｙｒの部分について、そのアミノ酸配列に対応するコ
ドンから、３’−ＴＡＧＣＡＮＣＴＰＡＴＰＣＴＱＴＴ
−５゛のｌ７個の塩基からなる３２種の合成ＤＮＡオリ
ゴマ−（１７−ｍｅｒプローブ）と、３’−ＴＴＡＣＴ
ＰＣＡＰＣＴＮＡＴ５゛の１４個の塩基からなる１６種
の合成ＤＮＡオリゴマー（１４−ｍａｒブローブ）−１
５一 を合成した。ここてＮは任意の塩基てあり、ＰはＡ又は
Ｇであり、ＱはＴまたはＣを示す。

これらのＤＮＡオリゴマーを［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとＴ
４ボリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、酸性プロ
テアーゼ遺伝子検出用プローブとして用いた。　酸性プ
ロテアーゼ遺伝子を持ったクローンを選択するためのコ
ロニーハイブリダイゼーションは、グルンスタインとホ
グネスの方法（　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，　Ｍ．ａｎｄ　
Ｄ．　Ｓ．　Ｈｏｇｎｅｓｓ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，　ｖｏｌ．　７２
．　３９６１）を若干改良した方法により、４２゜Ｃ、
４８時間で行った。　約２万個のクローンをスクリーニ
ングした結果、前述の１４ｍｅｒプローブと１７ｍｅｒ
プローブの両者にハイブリダイズするクローンとして、
プラスミド　ｌ）ＰＲ０７を持つクローンが選抜された
。ｐＰＲ○７は、７　．　４ｋｂのリゾブス由来のＤＮ
Ａ断片を持つ。尚、ｐＰＲ○７をもつ大腸菌ＪＡ２　２
　１のクローンはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　
Ｓ　ＡＭ　　７　６　０と命名され、１６ー 微工研にＦＥＲＭ　　Ｐ−９５１９の寄託番号を得て寄
託されている。

（３）酸性プロテアーゼ構造遺伝子からイントロン配列
の除去 染色体由来の酸性プロテアーゼ遺伝子には、６４塩基か
らなるイントロンが含まれている。

このイントロンを染色体由来の遺伝子から除くために、
主に前に示したゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）らの方法に従い
、化学合成したオリゴヌクレオチド断片を用いて部位特
異的変異（　ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ　）法を実施した。　尚、以下で用いた操作
は特に示さない限り、マニアチス（　Ｔ．　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ：　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｖｅｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８２）に従
った。

当該酸性プロテアーゼの染色体遺伝子を含むブラスミド
　ｐＰＲＯ７を制限酵素ＳｐｈＩおよびＳａｌ　Ｉで処
理し、イントロンを含む１．４ｋｂのＳｐｈＩ−Ｓａｌ
Ｉ　　ＤＮＡ断片を得た。　得られたＤＮＡ断片は、Ｍ
１　３ｍ１７ー ｐ１９（宝酒造社より購入）のｓｐｈ：ｔ−Ｓａｌ　Ｉ
部位に挿入し、組換え体一本鎖ＤＮＡを得た。次に、得
られた一本鎖ＤＮＡと、５’−ＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＧ
ＡＴＧＣＡＡＡＣＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧ−３’の構造を
持つ合成オリゴヌクレオチドＡ２００との混合液を６　
０　’Ｃて２０分間処理した後、順次３０℃で３０分、
４℃て３０分およびｏ　’ｃで２０分間各々保持するこ
とにより、一本鎖ＤＮＡと合成オリゴヌクレオチドＡ２
００を結合させた。その後、上記反応液にクレノウ・フ
ラグメント（　Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　）と
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰおよびデオキシリボヌク
レオチド混合液を加え、１２゜Ｃで１６時間反応させた
後、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。形質転換株は、
通常のブラークハイプリダイゼーションの手法により選
択した。即ち、［γ３２Ｐ］ＡＴＰて標識した上記合成
りオゴヌクレオチドＡ２００をプローブとして、変異の
起こった遺伝子を含むブラー１８− クを選択した。このプラークから一本鎖及び複製型のフ
ァーシＩ３−７を調製した。

（　４．　）　　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ　Ｉ切断部位を持つ遺
伝子の構築 このようにして得られたイントロンのない酸性プロテア
ーゼ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧの５′側上流に、制
限酵素ＥｃｏＲＩの切断認識部位を、同じく部位特異的
変異法を用いて挿入した。

化学合或したオリゴヌクレオチドＡ２１１は、５’−Ｇ
ＡＡＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡ−３’の
構造を持つ。　この合或オリゴヌクレオチドＡ２１１と
上記（３）で得られた一本鎖ファージＢ−７を用いて再
びゾラーらの方法に従い、部位特異的変異法を行った。

その結果、当該酸性プロテアーゼ遺伝子の翻訳開始コド
ンＡＴＧの直前にＥｃｏＲＩの切断詔識配列を持った遺
伝子を含む目的のファージＢＣ−　１を得た。

（５）発現ベクターの製造 以上のようにして得られたファーシＢＣ１は、翻訳開殆
コドンＡＴＧの直前に ＥｃｏＲＩ切断部位が挿入され、イントロンを欠いた酸
性プロテアーゼ遺伝子の前半部分を含んでいる。　この
ＤＮＡを用いて酵母由来のグリセロアルデヒド３−リン
酸脱水酵素（ＧＡＰ）遺伝子の発現調節部位（プロモー
ター）に酸性プロテアーゼ遺伝子を直接結合した発現ベ
クターを製造した。

本ベクターの製造にあたっては、ｐＹｇａｐ　８７（本
プラスミドはＳＢＭＩＳＩと命名され、ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−３８２として１９８３年１０月５日に工業技術院微
生物工業技術研究所にブダペスト条約の規定に基づいて
国際寄託されている）と　ｐＹＧＩＦＬｍ２ｔ２（本プ
ラスミドばエシェリヒア・コリ　ＳＢＭ　　２７４と命
名され　ＦＥＲＭ　　Ｐ７７２７としてゴー　９　８　
４年７月ｌ７日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託され、更に、１９８８年１２月２６日にＢＰ−２２１
６として国際寄託に移管されている）を出発プラスミド
として用いた。

即ち、ｐＹＧ工ＦＬｍ２１２に唯一存在するＢ　ａ　ｍ
　Ｉ−｛　Ｉ切断部位を制限酵素で開裂後、ＤＮＡポリ
メラーゼ■を用いて付着末端（スティッキングエンド）
をフィル・イン（Ｆｉｌ］ｉｎ）　Ｌた。続いて、その
部位にＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＴＩＴ（５’−ＣＡＡＧＣＴＴ
Ｇ−３’）リンカーを挿入することによりＨｉｎｄｍ切
断部位を持つプラスミドｐＹＧＩＦＬｍ２３２Ｈを製造
した・　また、ｐｙｇａｐ　　８７に、前に示したとの
と同様の部位特異的変異法を用いてＧＡＰ構造遺伝子の
翻訳開始コドンＡＴＧの直前にＥｃｏＲ工制限酵素の切
断認識部位を作製し、ブラスミドｐＹｇａｐ８７Ｅを製
造した。プラスミドｐＹＧＩＦＬｍ　　２１．２ＨをＥ
ｃｏＲＩて完全に切断し、さらに反応時間を調整するこ
とによりＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで部分的に切断した後
、８　．　０　ｋｂの断片を分離した。また、Ｔ）Ｙｇ
ａｐ８７ＥをＥｃｏＲＩと２１ Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＪＩて切断後、ＧＡＰ遺伝子のプロ
モーター領域を含む１．１．ｋｂの断片を分離した。

この断片と上記の８　．　０　ｋｂの断片とをライゲー
ションした後、大腸菌を形質転換してそこからプラスミ
ドｐＹＧＩＦＬｍ２２２を得た。

このようにして製造された、ｐ　Ｙ　Ｇ　Ｉ　Ｆ　Ｌｍ
２２２と複製型ファーシＢＣ−　１をＥｃｏＲ王とＳａ
ｌ王で消化した｛麦、それぞれ、約８ｋｂと約０　．　
７　ｋｂの断片を回収した。

これらのＤＮＡ断片をライケーションして得られたプラ
スミドをｐＹＰＲ２７３と命名した。　さらにこのｐＹ
ＰＲ２７３をＳａｌＩて切断し、それとは別にｐＰＲ○
７の酸性プロテアーゼ遺伝子の後半部分を含む約２．３
ｋｂのＳａｌ　Ｉ断片を回収してライゲーションを行っ
た。その結果、Ｓ　ａ　ｌ工断片の挿入方法により二種
類のベクターがえられた。

そのうち、酸性プロテアーゼ遺伝子が正しく結合したも
のを制限酵素による解析で選択し、ｐＹＰＲ２７３１と
命名したく第］図参照）。

一２２ （１ｉ）デレーション酸性プロテアーゼ遺伝子の構築方
法 デレーション酸性プロテアーゼ遺伝子は、ウラシルを含
む１本鎖Ｍ１３ファージを用いた部位特異的変異法（い
わゆるクンケル法）の手法を用いて行った。この方法は
、バイオラド社がすてにキット化して発売しており（　
ＭＵＴＡＧＥＮＥＴＭ　ＩＮ　ＶＩＴＲＯ　ＭＵＴＡＧ
ＥＮＥＳＩＳ　ＫＩＴ，ＢＩＤ−ＲＡＤ）これを用いて
説明書に記された方法に従い変異ＤＮＡを作製した。詳
しくは以下のごとくである。

はじめに酸性プロテアーゼ遺伝子の１部を持ちウラシル
を含む１本鎖Ｍ１３ファージを調製した（第２図参照）
。　つまりプラスミドｐＹＰＲ２７３１を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳａｌ　王で切断し酸性プロテアーゼ遺伝子
の５′側の遺伝子の１部を含む約０．６ｋｂのＤＮＡ断
片を得た。　得られたＤＮＡ断片は、Ｍ１３ｍｐｌ９（
バイオラド社部位特異的変異法キット中に含まれている
）のＥｃｏＲＩ−２３− −ＳａｌＩ部位に挿入し大腸菌ＭＶ１１９０株（△ｌａ
ｃ−ｐｒｏＡＢ　）．　ｔｈｉ，　ｓｕｐＥ，Δ（ｓｒ
ｉｒｅｃＡ）３０６：：ＴｎｌＯ（ｔｅｔｒ）［　Ｆ７
：ｔｒａＤ３６，　ｐｒｏＡＢ，１ａｃＩｑＺΔ旧５］
）を用いてファージＩＩ）ＩＭＰＲ１を調製する。　ま
たこれと同様にブラスミドｐＹＰＲ２７３　１を制限酵
素ＳａｌＩで切断し得られる酸性プロテアーゼ遺伝子の
３′側の１部を含む約２ｋｂのＤＮＡをＭ　１　３　ｍ
ｐｌ９のＳａｌＩ部位に挿入することによりファージｐ
ＩＭＰＲ２を調製した。　これらのファージをもとにし
てウラシルを含む１本鎖プラスミドｌ；）ＩＭＰＲ１−
Ｕ，ｐ　ＩＭＰＲ２−Ｕをそれぞれ調製した。　すなわ
ち、ｕｎｇ−，ｄｕｔ一株であるＣＪ２３６株（ｄｕｔ
，ｕｎｇ，　ｔｈｉ，　ｒｅｌＡ；　ｐｃＪ１０５（Ｃ
ｍｒ））を１晩培養後、３０μｇ　／　ｍ　１のクロラ
ムフェニコールを含むＬ培地（１リットル当り、１０ｇ
　トリプトン、５ｇ　酵母エキス、５ｇ　塩化ナトリウ
ム：オートクレープ殺菌）に１０μｌ植菌し、６時間培
養する。　１−３Ｘ１０６のフ−２４ ァーシを加え、３７゜Ｃて１晩培養し、その培養液を遠
心分離にかけ上清を集める。　１７４量の酢酸アンモニ
ウム／ポリエチレングリコール溶液（３．５Ｍ　　酢酸
アンモニウム、２０％ポリエチレングリコール８０００
　）を加え、水浴中で３０分以上静置する。遠心分離後
沈澱を２００μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ．｝リス塩酸　
ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、水浴中に３０
分静置する。　遠心分離により不溶物を除き、フェノー
ルで１回、フェノール／クロロホルム（フェノール：ク
ロロホルム：イソアミルアルコール＝２４＝２４：１）
で２回、さらにクロロホルムで２回抽出し、その水層部
を回収してエタノール沈澱する。　さいごに１０−２０
μｌのＴＥを加えてファージＤＮＡ試料とした。

変異処理は、Ｏ．ｌｐｍｏｌｅのファージＤＮＡと２−
３ｐｍｏｌｅの変異ブライマ−（合戊ＤＮＡ）に１μｌ
の１０倍アニーリング緩衝液（　２００ｍＭ　トリス塩
酸　ｐＨ−２５− ７．４．２０ｍＭ塩化マグネシウム、５００ｍＭ塩化ナ
トリウム）と蒸留水を加えて１０μ１にする。　７５℃
で５分間熱処理し、更に４０分以上かけて３０゜Ｃまで
徐々に冷却する。　１０倍合成緩衝液（５ｍＭ各デオキ
シ核酸三リン酸、１０ｍＭ　ＡＴＰ、１００ｍＭ　　｝
リス塩酸（ｐＨ７．４）　、５０ｍＭ塩化マグネシウム
、２０ｍＭ　ジチオスレイトール）を１μ１、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼを１μｌ、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを
１μｌ加え、水浴中で５分間反応後、更に２５゜Ｃで５
分間、３７゜Ｃて９０分間反応する。

９０μ１のＴＥを加え保存する。　このＤＮＡ溶液の３
−１０μｌを用い７ＭＶ１１９０を形質転換する。　形
質転換後、Ｌ培地の寒天上に広げ、３７゜Ｃで１晩培養
後、単一プラークを３ｍｌのＬ培地（０．１％のＭＶ１
１９０培養液を含む）に植菌し、６時間培養して１本鎖
ファージおよび複製型（２本鎖）ファージを調製する。

　目的の変異が起こつ２６− ているＤＮＡの選択は、変異により制限酵素サイトが新
しく作成される場合はそれをマーカーとして、それ以外
のものは、無作為に単一ファーシを選んでそれぞれ１本
鎖ＤＮＡを調製しＤＮＡ塩基配列を調べることにより選
択、確認した。ＤＮＡの塩基配列は、デヱボン社の全自
動ＤＮＡシークエンサーを用い説明書に従って行った。

（ｉｉｉ）前駆体領域を持たない酸性プロテアーゼ遺伝
子の構築 前駆体領域を持たない酸性プロテアーゼ遺伝子の構築は
、酸性プロテアーゼ遺伝子の前駆体領域に対応する部分
の前後に新しく制限酵素サイトを導入し、そのサイトを
用いて組換えることにより作製した（第１表参照）。

つまり、シグナル領域と前駆体領域の接続部位に合成Ｄ
ＮＡ　　Ａ２１９（５’−ＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＡ
ＣＧＧＣＡＡＧ−３’）を用い、Ｘ　ｈ．　Ｏ　Ｉ制限
酵素認識部位を持つファージｐＩＭ２１．９を作製した
。　さらにこ２７一 のファーシから前駆体領域と成熟体領域の接続部位に合
成ＤＮＡ　　Ａ２２０　（５’−ＣＡＡ　Ｃ　Ｃ　Ｇ　
Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ．．　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ａ．　Ｇ　Ｔ　Ｇ　
Ｇ　Ｃ−３″）を用いてＢ　ａ　ｍ　Ｈ王制限酵素サイ
トをもつファージｐＩＭ２１．９−２２０を構築した。

こうしてできたｐ王Ｍ２１．９−２２０力）ら複製型（
２本鎖）ＤＮＡを調製した。　このＤＮＡ約１μｇを１
−５ユニットの制限酵素ＸｈｏＩおよびＢ　ａ　ｍ　Ｈ
　Ｉて同時に切断復、さらに５−１０ユニッＩ・のマン
グビーンヌクレアーゼで平滑末端にし、宝酒造から発売
されているライゲーションキットを用いて自己ライケー
ション行い、前駆体領域だけを完全に欠＜ｐＩＭ２１．
９−２２０△１を得ることができた。　一方ｐＹＰＲ２
　７　３　１においてＳａｌ　Ｉ　　の２ｋｂ断片中の
酸性プロテアーゼ構造遺伝子に直接関係ない領域を除く
ため、ウラシルを含む１本鎖ファージｒ，ＩＭＰＲ２Ｕ
と変異合成ＤＮＡ　Ａ］７８　（５’−ＧＣＣＡＡＴＴ
ＡＡＧＴＣＧＡ．ＣＴＡＣＴＴＴＴ２８− Ｃ（，−３’）を用いて酸性プロテアーゼ遺伝子の翻訳
停止コドンの直下流に制限酵素Ｓａ］−■の認識部位を
持つブラスミドｐＩＭ］７８を作製した。　このプラス
ミドから、酸性プロテアーゼ遺伝子の１部を含む約０．
５ｋ．ｂのＳａｌ　Ｉ断片をｐＹＰＲ２７３１の約２ｋ
ｂのＳａｌ　Ｉ断片と置き換えることにより、酸性プロ
テアーゼ遺伝子直下流に酵母のグリセルアルデヒド　３
−リン酸脱水素酵素遺伝子のターミネーター領域が接続
したプラスミドｐＹＰＲ２８３１を得た。　さらに、こ
のプラスミド中に２カ所あるＳａｌ■のうちＥｃｏＲＩ
から離れている方のＳａｌ　Ｉ認識部位（酸性プロテア
ーゼ遺伝子とグリセルアルデヒド　３−リン酸脱水素酵
素遺伝子のターミネーター領域が接続点〉をＴ４−ＤＮ
Ａポリメラーゼと４種のデオキシ核酸三リン酸を用いて
フィルインしたプラスミドｐＹＰＲ２８３１△Ｓを作製
した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ、Ｓａｌ　Ｉで切断
しｐ　Ｉ　Ｍ　２　１．　９　−　２　２０△１のＥｃ
ｏＲＩ−Ｓａ］丁　０．６ｋｂ断片とライゲーションし
た。　こうずることにより前駆体領域を全て除いた酸性
プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＹＰＲ２８４１
を構築した。

（ｊｖ）前駆体領域の一部を削除した酸性プロテアーゼ
遺伝子の構築 前駆体領域の一部を削除した酸性プロテアーゼ遺伝子は
、合或ＤＮＡを用い、遺伝子の一部をループアウトする
ことにより作製した。

前述のウラシルを含む１本鎖ファージｐＩＭＰ　Ｒ　１
．　−　Ｕおよび合成ＤＮＡ　Ａ３０８　（５”ＧＣＴ
ＧＣＡＣＣＣＡＡ．ＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ
ＧＣＡＣＴＴ−３’）を用いて前述の部位特異的変異法
によりＮ末端のメチオニンから数えて２２番目のアラニ
ンから４０番目のブロリンまでのアミノ酸残基１９個を
除いたファージプラスミドｐＩＭ３０８を作製した。ま
た、別の合成ＤＮＡＡ３　１０　（５’−ＧＣＡＣＴＴ
ＡＡＴＡＡＧＧＣＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＧＣＴ
ＣＴ−３’）を用いてＮ末端から５１番目のアラニンか
ら６５番目のスレオニンまて“の１５個のアミノ酸残基
を除いたファージプラスミドｐＩＭ３１０も同様に作製
した。この２種類のファージＤＮＡをそれぞれＥｃｏＲ
■およびＳａｌＩの両方で切断し、酸性プロテアーゼ遺
伝子の一部を含む約０．６ｋｂの断片を分離した。　こ
の断片を、前述のブラスミドｐＹＰＲ２８３１ΔＳのＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ　　７．５ｋｂの断片とライゲーシ
ョンし、パン酵母で複製、選択が可能なプラスミドｐＹ
ＰＲ２８４２およびｐＹＰＲ２８４３を得た。

（Ｖ）前駈体領域の一部あるいは全領域を欠く酸性プロ
テアーゼ遺伝子によるパン酵母での活性発現の検討 前述の前駆体領域の一部あるいは全領域を欠く酸性プロ
テアーゼ遺伝子を含むパン酵母で選択が可能なブラスミ
ドｐＹＰＲ２８４１、−３１ ｐＹＰＲ２８４２およびｐＹＰＲ２８４３を用いてパン
酵母Ｒ２７−７Ｃ−ＩＢ　（ＭＡＴα，ｔｒｐｌ，ｕｒ
ａ３，ｈｉｓ３，ｌｕｅ２　）を形質転換し、トリプト
ファンの要求性でそれぞれのブラスミドによる形質転換
体、Ｒ−２８４１、Ｒ一２８４２およびＲ−２８４３を
選択した。

さらに対照として酸性プロテアーゼ全領域を含むブラス
ミドｐＹＰＲ２８３１および酸性プロテアーゼ遺伝子を
含まないｐＹＥ２０９（このプラスミドは、酵母の発現
ブラスミドのベクターのみからなり、前記ｐＹＧＩＦＬ
ｍ２２２をＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで部分的に分解後、
ＧＡＰプロモーター等を含まない約７ｋｂの断片を回収
し、セルフライゲーションさせることにより得られる）
を用い形質転換体パン酵母Ｒ−２８３１およびＲ−２０
９を取得した。

形質転換は、塩化リチウムを用いたイトウらの方法（Ｉ
ｔｏ，Ｈ，　ｅｔ　ａｌ，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
，　１５３，（１９８３））で行った。　得られた形質
転換体を５ｍｌのＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％３
２− ボｙノペプトン、２％フドウ糖）に１白金耳稙菌し、４
８時間振とう培養後の培養上清を用いて酸性プロテアー
ゼの活性を測定した。

酸性プロテアーゼの活性測定は、ヘモグロビンを基質と
して行った。すなわち２％ヘモグロビンを含む０．１Ｍ
酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．０）１００μ１にパン酵
母培養液の上漬１００μｌ加え３７℃で６０分間反応さ
せた後、０．４Ｍ　　トリクロロ酢酸を２００μｌ加え
、水浴中て５分間静置する。　反応液を遠心分離し、そ
の上清２０μｌに０．４Ｍの炭酸ナトリウム８０μ１加
え中和する。

この試料中のタンパク質量を、ピアス社のタンパク質定
量キットを用いて測定し、１分間にｌｍｇのタンパク質
を遊離する活性を１単位として酸性プロテアーゼの活性
を求めた。

その結果、完全な前駆体領域をもつ酸性プロテアーゼ遺
伝子による形質転換体は、約２０００ユニットの活性を
示したが前駆体領域の一部あるいは全領域を欠く酸性プ
ロテアーゼ遺伝子により形質転換したパン酵母はその活
性を検出できなかった。

さらに上述の活性測定法よりも感度の良い方法としてカ
ゼインを含む平板寒天培地（０．６７％のイースト　ナ
イトロゲンベース（ＤＩＦＣＯ社）、２％ブドウ糖、１
％ハンマーステンカゼイン（ＭＥＲＣＫ社）２％寒天、
および各０．００１％のロイセン、ヒスチジン、ウラシ
ル）でのハロー形或により酸性プロテアーゼ生産能を調
べたが、３７℃１週間でもＲ−２８４１＜Ｒ−２８４２
およびＲ−２８４３株は、ハロー形成が全く認められな
かった。

このことから酸性プロテアーゼ遺伝子の分泌発現には、
この前駆体領域が重要な役割を担っていることが明かと
なった。

（以下余白　） ＝３４ 第 表 合成ＤＮＡ名 ＤＮＡ塩基配列 変異部位 ＡＩ７８　　　５゜−ＧＯＪｔＴＴＡＡｌ７Ｑ弘ＣＴＡ
［ＴＩ’ｌ了［１−３’　　　　　　　Ｓａ１１部位の
導入Ａ２１９　　　５’−ＧＡＡＧＣＩＥＴＱＪｕＱｍ
県嘘３’　　　　　　　　　ＸｈｏＩ部位の導入Ａ　２
２０　　５’−ＣＡＡＣＥＡＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＣ
−３゜　　　　　　　　８ａｍ＋Ｉ　Ｔ部位の導入Ａ３
［１ｆｌ　　　５’　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−３’　　　２２−４０ま’ｆｆ）７？：／ｌ＃ｌ
ｌＩｌｌＭＡ　３１０　　　５’　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−３’　　　５１−６５までのアミノ
酸の削除実　　施　　例　　２ リゾブスリボヌクＩ／アーゼＲｈ遺伝子の分泌発現： （ｉ）リゾブスリボヌクレアーゼＲｈの　ＣＤＮＡの取
得 ０．５％　ＲＮＡを含むボテトーデキストローズ培地（
　Ｄｉｆｃｏ）　４　０　０ｍｌで３　０　００、２日
間振盪培養したりゾブスニベウスヤマザキ株（工Ｆ○４
８１０）の菌体をガラス濾過器で集菌後、蒸留水で菌体
を２−３回洗浄する。

この菌体を液体窒素中で凍結後、金鎚で破＝３５− 砕し、２０ｍｌの４Ｍグアニシウムイソチオシアネート
溶４　（　　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ
．１８９の方法て精製したもの）と２０ｍｌの滅菌水、
２０ｍｌのフコニノーノレ：ク口ロボノレム：イソアミ
ルアルコール（２４−：２４：１）の溶液を加え良く混
合する。　その後液体窒素中で凍結、流水中で融解を２
度繰り返す。　さらにその状態で１　８　０ｒｐｍ　３
　０ｍｉｎ混合を行なった後、　３，０００ｒｐｍで　
３０ｍｉｎ遠心し、上清に対しＣｓＣｌをＩｇ／２．５
ｍｌの割合で加える。　この溶液約８．５ｍｌを、５．
７ＭＣｓＣｌ／０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７．５）溶
液］．．２ｍｌの入った遠心管に重層し、３　０　Ｋ］
５゜Ｃて２２時間遠心する。　沈澱を２５０μ１の１　
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／　５ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ／　：
Ｉ％ＳＤＳ溶液に懸濁し、クロロホルム＝１−ブタノー
ル（４：］．）溶液２５０μ１で抽出ずる。水層を別に
試験管に移し、有機層に２　５　０　μｌの１　０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ／　５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ／］％ＳＤＳ溶
液を加え再度抽出する。水−３６− 層を前のものと合わせ、０．１容量の３Ｍ酢酸アンモニ
ウム溶液、２．２容量のエタノールを加えてエタノール
沈殿を行なう。　エタノール沈殿は２度繰り返す。　こ
の操作で、約Ｌｏｇの菌体から３．７３ｍｇの全ＲＮＡ
が得られた。この全ＲＮＡを常法どおりオリゴｄＴセル
ロースカラムにかけ、２３３μｇのポリＡ　　ＲＮＡを
得た。このボリＡ　ＲＮＡ２μｇに対しベーリンガーマ
ンハイム社のｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡ合或
を行なった。このｃＤＮＡに対し、ＥｃｏＲＩリンカー
を両末端に連結後、λｇｔｌｏに連結し、ｃＤＮＡ　ラ
イブラリーを作製した。　このｃＤＮＡ　　ライブラリ
ーに対し、すてに取得している　Ｒ　Ｎａｓｅ　Ｒｈを
コードするゲノミックＤＮＡをプローブとしてプラーク
ハイプリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼー
ションのフィルターにはハイボンドーＮ　（　Ｈｙｂｏ
ｎｄ−Ｎ　；アマーシャム社）を用い、ハイブリダイゼ
ーションの条件はアマーシャー３７− ム社の説明書に従った。その結果５個の陽性クローンを
得た。　このうち押入断片の最も大きいものについて、
ぞの末端塩基配列を決定したところ、Ｒ　Ｎａｓｅ　Ｒ
ｈのＮ末端から３６番目のアミノ酸から下流をコードし
ているｃＤＮＡであることが明らかとなった。

そこでこのｃＤＮＡをプローフとしてさらにｃＤＮＡ　
ライブラリーをスクリーニングし、新たに８個の陽性プ
ラークを得た。このうち挿入断片の最も長いものについ
て塩基配列を決定した。その結果、ＲＮａｓｅ　Ｒｈの
Ｎ末端アミノ酸より１４ベース上流までをコードするｃ
ＤＮＡであることが明らかとなった。

この遺伝子をｐＵｃ１１８の　ＥｃｏＲＩ部位に挿入し
て、ｐＵＣ　１　１．　８　　Ｒｈ２−８を得た。

なお、本プラスミドにより形質転換された大腸菌は、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　Ｃｏｌｉ　Ｓ　Ａ　Ｍ　　１　
３　８６と命名され、工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第１０８５１号（ＦＥＲＭＴ）−　１　０
　８　５　１．　）として寄託されている。

３８− （ｉｉ）リゾプスリボヌクレアーゼＲｈ遺伝子のパン酵
母での発現のためのブラスミドの構築 リゾプスリボヌクレアーゼＲｈをそのままの形で発現さ
せるために、完全長のリゾブスリボヌクレアーゼＲｈｃ
ＤＮＡ遺伝子を含むｐＵｃ１　１８Ｒｈ２−８からＳａ
ｌ　ＩおよびＥｃｏＲＩ部分分解により０．８ｋｂのリ
ゾプスリボヌクレアーゼＲｈｃＤＮＡ遺伝子を含む断片
を分離し、前述の］）ＹＰＲ２８３１からの７．５ｋｂ
のＥｃｏＲエーＳａｌＩ断片とライゲーションすること
によりパン酵母のグリセルアルデヒド　３−リン酸脱水
素酵素遺伝子由来の強力なプロモーターの下流にリゾプ
スリボヌクレアーゼＲｈ遺伝子がつながった、パン酵母
で複製、選択が可能なブラスミドｐＹＧＲｈ２−８を構
築した（第３図参照）。　また、リゾプス酸性プロテア
ーゼ遺伝子の前駆体領域を利用するために前述のウラシ
ルを含む１本鎖ファージｐＩＭＰＲ１−−３９− Ｕおよび合成ＤＮＡ　　Ａ３０３　（５’−ＧＣＣＡＧ
ＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＣＴＡＧ−３′）を用い、酸性
プロテアーゼ遺伝子の前駆体領域の復ろに制限酵素Ｂａ
ｍＨ工認識部位を導入したプラスミドｐ工Ｍ３０３を構
築した。　それとは別に完全長のリゾプスリボヌクレア
ーゼＲｈｃＤＮＡ遺伝子を含むｐＵＣ１　１　８Ｒｈ２
−８からＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部分分解により０．
８ｋｂのリゾプスリボヌクレアーゼＲｈｃＤＮＡ遺伝子
を含む断片を分離し、Ｍ　１　３　ｍ　ｐ　１　９のＥ
ｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位にサブクローンし、前述の部位
特異的変異法に示したようにＣＪ２３６株を用いてウラ
シルを含む１本鎖ファーシｐＩＭＲｈ２−８−Ｕを得た
。　このファージと合成ＤＮＡ　　Ａ３０５　（５’−
ＴＴＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＧＧ−３’）を用
いリボヌクレアーゼＲｈ遺伝子のシグナル配列の後ろに
制限酵素ＢａｍＨ工認識部位を作製したプラスミドｐＩ
Ｍ３０５を得た。

−４０− ｐＩＭ３０５から０．７５ｋｂのＳａｌ　ＩＢ　ａ　ｍ
　Ｈ　Ｉ断片、ｐ工Ｍ３０３から０．２ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片、さらに前述のｐＹＰＲ２８３１か
ら７．５ｋｂのＥｃｏＲエーＳａｌ工断片をそれぞれ調
製し、３つの断片を同時にライゲーションし、パン酵母
のプロモーターの下流にリゾブス酸性プロテアーゼ遺伝
子のシグナルおよび前駆体領域とリゾプスリボヌクレア
ーゼＲｈ遺伝子が同一読み枠でつながったキメラ遺伝子
を接続した、パン酵母で複製、選択が可能なプラスミド
ｐＹＧＲＮＡＰ−Ｒｈを構築した（第４図参照）。

（ｉｉｉ）形質転換パン酵母によるリゾプスリボヌクレ
アーゼＲｈ生産量の検討 前述の発現可能なリゾプスリボヌクレアーゼＲｈ遺伝子
を含むプラスミドｐＹＧＲｈ２８およびｐＹＧＲＮＡＰ
−Ｒｈを用いてパン酵母Ｒ　２　７　−　７　Ｃ　−　
Ｉ　Ｂ　（ＭＡＴ（Ｚ　，ｔｒｐｌ，ｕｒａ３，ｈ　ｉ
ｓ３　，　１ｕｅ２　）を形質転換し、トリプトファン
の要求性でそれぞれのプラスミドによる形質転換体、Ｒ
−Ｒｈ２−８およびＲ−ＲＮＡＰＲｈを選択した。　さ
らに対照としてベクターのみのｐ’ＹＥ２０９を用い、
形質転換体パン酵母Ｒ−２０９を取得した。　得られた
形質転換体を５ｍｌのＹＰＤ培地に１白金耳植菌し、２
４、４８および７８時間振どう培養時の培養上清を用い
て酸性プロテアーゼの活性を測定した（第２表参照）。

　リボヌクレアーゼＲｈの活性は、マクドナルドらの方
法（　Ｍ．Ｒ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＩＩ，　ｅｄ．　ｂｙ　Ｓ．
Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　ａｎｄ　Ｎ．０．Ｋａｐｌａｎ
，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　（１９５５））を改良し行った。

０．５χのＲＮＡを含むＯ．ＬＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
０）　１　０　０μｌにパン酵母の培養土清を１００μ
１加え、３７゜Ｃて５分間あるいは、１時間反応させる
。　反応停止のために１００μｌのマツクファーデン試
薬 （　ＭａｃＦａｄｙｎｅ　ｒｅａｇｅｎｔ：　０．２５
％酢酸ウラン、−４２− ２．５χ　１・リクロ口酢酸）を加える。　遠心分剖に
より沈澱を除いた後、試刺を蒸留水で１２倍に希釈し、
２６０ｎｍの吸収を測定する。

この方法において５分間の吸光度の変化が１のときの活
性を１単位とした。この結果を第２表に示す。

第　　　２　　　表 この結果から明らかなように、　７２時間目の培養上清
のりボヌクレアーゼ活性を測定したところ、Ｒ−Ｒｈ２
−８では、培養上清１　ｍ．　１当り０．０８単位の活
性が認められたに過ぎないが、Ｒ−ＲＮＡＰ−Ｒｈでは
、４３．９単位トＰ−Ｒ　ｈ　２　−　８　（７）約　
５５０倍−４３− の冫古性がＳ誇められた。　り・ゾフ゜スリボヌクｌ／
アーゼＲｈの比活性は、タンパクＬ’１　１　ｍ　ｇ当
り１．１単位ということが知られており、概算で培養」
一清１リットル当り４−　Ｏ　ｍ　ｇのりボヌクレアー
ゼＲｈがパン酵母により生産されたことになる。　対照
としてベクターのみのｐＹＥ２０９を用いた形質転換体
パン酵ｅＲ一２０９においては、培養上清中のりボヌク
レアーゼＲｌ１の活性（、Ｊ、検出限界以下であった。

［発明の効果］ 以」二のよう（こり゛ゾフ゜ス酸性プロテアーセ゛の前
駆体領域は、タンパク質の分泌生産に重要な役割を担っ
ており、この領域を用い他の遺伝子（例えば、リゾブス
リポヌクレアーゼＲｈ遺伝子）とのキメラを構築しキメ
ラタンパク質としてバン酵母で発現させることにより異
種遺伝子産物を効率よく菌体外に分泌生産させることが
可能である。

【図面の簡単な説明】

第１−図は、ｐＹＰＲ２７３］の製造行程図を表わす図
面である。 第２図は、酸性プロテアーゼ遺伝子の前駆体領域に置け
る欠損変異遺伝子を含むベクターｐＹＰＲ２８４１、ｐ
ＹＰＲ２８４２およびｐＹＰＲ２８４３の製造行程図を
表わす図面である。 第３図は、リボヌクレアーゼＲｈ遺伝子を酵母の発現ベ
クターに結合したプラスミドｐＹＲｈ２−８の製造行程
図を表わす図面である。 第４図は、リボヌクレアーゼＲｈ遺伝子を酸性プロテア
ーゼ遺伝子の前駆体領域の下流に接続した酵母で発現可
能なプラスミドｐＹＧＲ　Ｎ　Ａ　Ｐ　−　Ｒ　ｈの製
造行程図を表わす図面である。 以　　上 一４５ー 第１ 図 −６２５−

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）糸状菌リゾプスニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉ
   ｖｅｕｓ）由来の酸性プロテアーゼのシグナルペプチド
   及び前駆体領域をコードする遺 伝子の下流に目的タンパク質若しくはペプ チドをコードする遺伝子を接続してキメラ 遺伝子を作製し、このキメラ遺伝子を組み 込んだ組換ベクターで宿主酵母細胞を形質 転換し、当該宿主酵母細胞を培養すること を特徴とする目的タンパク質若しくはペプ チドの製造法。
2. （２）宿主細胞がパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
   ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１記載の製造法
   。
3. （３）該異種遺伝子産物がリゾプスリボヌクレアーゼＲ
   ｈである請求項１記載の製造法。