JPH0364111B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ペプチドホルモンの一種であるロイ
シンエンケフアリン（Tyr−Gly−Gly−Phe−
Leuの５個のアミノ酸配列よりなるペンタペプタ
イド）を生産可能な新規組換えプラスミドに関す
るものである。本発明の新規組換えプラスミド
pBSFOLEK1は、第１図において示されるDNA
配列を有する。この新規組換えプラスミドの産業
上の利用分野としては、微生物工業、発酵工業、
医薬品工業等の分野に好適である。

従来の技術 ロイシンエンケフアリンは、モルヒネ様鎮痛作
用を示す内因性ペプチドとして知られ、習慣性の
ない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が期待され
る興味深いポリペプチドである。本発明の技術的
背景としては、いわゆる遺伝子操作技術がある。
ロイシンエンケフアリンを組込んだプラスミドと
しては、既に本発明者らが開発したプラスミド
pLEG1（特開昭61−260885号公報）が公知であ
る。pLEG1は、制限酵素EcoRIによる切断によ
つてロイシンエンケフアリンを暗号化する遺伝子
配列を切り出し利用することができるという特徴
を有している。

問題点 しかしながら、pLEG1においてはE.coliのジヒ
ドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリンの融
合タンパク遺伝子が組込まれており、かつ、プロ
モーター等の遺伝子発現効率としては優れている
にもかかわらず、pLEG1をE.coliに導入し、その
発現を試みたところ、その生産量が予想される量
には到底及ばないことが判明した。さらに、融合
タンパクはジヒドロ葉酸還元酵素の活性が消失し
ていた。このため、E.coliで作られた融合タンパ
クの検出方法としては抗体を用いた免疫化学的手
法が唯一であり、かつ、この方法が繁雑であるこ
とから、分離精製の点に関して改良すべき問題が
ある。

発明の目的 本発明者は、上記問題点を解決すべく鋭意研究
を行ない、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子の塩基配列を明らかにその解析を行なつた。
その結果、(1)B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵素
が、168個のアミノ酸より成り立つていること、
(2)遺伝子中に存在するEcoRI部位の下流の配列に
よつて暗号化されるＣ−末端側の６アミノ酸より
成るアミノ酸配列を、他のアミノ酸配列と置き換
えてもジヒドロ葉酸還元酵素の生産性及び活性に
関係がないことを明らかにした。この結果を利用
すると、目的ペプチド遺伝子を、遺伝子の読み取
り枠をあわせてB.subtilisジヒドロ葉酸還元酵素
遺伝子のEcoRI部位下流に組込み、酵素活性を保
有するジヒドロ葉酸還元酵素−目的ペプチド融合
タンパクの合成が可能である。このことにより、
従来宿主内で安定に生産されないペプチド等の遺
伝子産物の生産及びその分離精製が非常に容易に
なることが考えられる。以上のことから、前述の
問題点を解消できる可能性が示唆され、ロイシン
エンケフアリンを暗号化するDNAを分子設計及
び化学合成し、これをB.subtilisのジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子のEcoRI部位下流に組込んだ新規
組換えプラスミドpBSFOLEK1を作成し、発明
を完成させるに至つた。

発明の構成 本発明のプラスミドpBSFOLEK1は、4762塩
基対の大きさを有し、宿主であるE.coliをトリメ
トプリムおよびアンピシリン耐性に形質転換する
ことができ、第１図に示される塩基配列によつて
確定される新規組換えプラスミドである。プラス
ミドpBSFOLEK1は、制限酵素EcoRI、BamHI、
BglII、BstEII、PstI、PvuII、SalIによつて、
各々１箇所切断され、AatII、ClaI、HindIII、
HpaIによつて各々２箇所切断される。

第１図は、pBSFOLEK1の全塩基配列を示す
図であり２本鎖DNAのうち片方の配列だけを示
している。第２図は、pBSFOLEK1中に存在す
るジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリ
ン融合タンパクを暗号化する部分の塩基配列及び
タンパクのアミノ酸配列を示す図である。制限酵
素EcoRIの認識切断部位は、第１図においては、
675〜681塩基の所に、第２図においては、480〜
485塩基の所に存在する。

ジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフアリ
ン融合タンパクは、第２図に示されるように168
個のアミノ酸より構成される。融合タンパクのア
ミノ末端側から162番目までは、B.subtilisのジヒ
ドロ葉酸還元酵素のアミノ酸配列と同一であり、
164〜168番目の配列がロイシンエンケフアリンの
配列である。163番目のアミノ酸はメチオニン
（Met）であり、ブロムシアンで融合タンパクを
処理することによりロイシンエンケフアリンを切
り出すことが可能な構造である。融合タンパクの
分子量は19296である。

pBSFOLEK1を含有するE.coliは、ジヒドロ葉
酸還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパ
クを細胞内で作ることができる。すなわち、
pBSFOLEK1を含有するE.coliを培養し、菌体を
集め、これを破砕した上清中には、ジヒドロ葉酸
還元酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパク
が存在し、この上清から、ジヒドロ葉酸還元酵素
活性を目安にジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエ
ンケフアリン融合タンパクを精製することができ
るのである。さらに、精製したジヒドロ葉酸還元
酵素−ロイシンエンケフアリン融合タンパクは、
ロイシンエンケフアリンに対する抗体と反応する
ことができるのである。

プラスミドpBSFOLEK1は、pBSDHFR1（特
開昭63−28394号公報）、pBR322（J.G.Sutcliffe，
（1978）Cold Spring Harbor Symp.Quant.
Biol.，vol.43，p.77）及び化学合成したDNAを
もちいて、実施例１に記す方法に従つて作成する
ことができるが、プラスミドの作成方法によつて
本発明が制限されるものではない。

本発明のプラスミドpBSFOLEK1は、E.
coliC600株に導入されて安定状態に保たれ、
pBSFOLEK1を含有するE.coliC600株は微工研に
FERM Ｐ−8969のして寄託されている。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ pBSFOLEK1の作成 0.001mgのプラスミドpBSDHFR1を制限酵素
EcoRI及びPstIを用いて切断後、１％アロガース
ゲル電気泳動法により分離した。大小２本の
DNA断片が得られた。小さい断片を切り出し透
析チユーブに入れ１mlの50ｍＭ Tris−HCl、PH
8.0を加えシールし、電気溶出法（electroelution
法、T.Maniatisら、Molecular ClonigA
Loboratory Manual，p.164，Cold Spring
Harbor Laboratory（1982）、文献１）により、
ゲルからDNAを回収し、エタノールでDNAを沈
殿後、減圧下に沈殿を乾燥した（DNA−１と呼
ぶ）。

次に、0.001mgのプラスミドpBR322を制限酵素
BamHI及びPstIを用いて切断後、１％アルガロ
ースゲル電気泳動法により分離した。大小２本の
DNA断片が得られた。大きい断片を切り出し透
析チユーブに入れ１mlの50ｍＭ Tris−HCl、PH
8.0を加えシールし、電気溶出法により、ゲルか
らDNAを回収し、エタノールでDNAを沈殿後、
減圧下に沈殿を乾燥した（DNA−２と呼ぶ）。

ロイシンエンケフアリンを暗号化するDNAと
して、 １ 5′−
AATTCTATGTACGGTGGTTTCCTGTA
ＡＧ−3′ ２ 5′−
GATCCTTACAGGAAACCACCGTACATA
Ｇ−3′ の２本の28ヌクレオチドからなるDNAをホスホ
アミダイト法に従つて化学合成し、精製後、ポリ
ヌクレオチドキナーゼで5′−末端をリン酸化した
後、両者を約0.1ml（約0.0001mgのDNAを含んで
いる）ずつ取り、これを60℃でインキユベートす
ることによりアニールさせた（これをDNA−３
と呼ぶ）。

DNA−１とDNA−２を0.05mlのリガーゼ用反
応液（10ｍＭ Tris−HCl、PH7.4、５ｍ
MMgCl₂、10ｍＭジチオトレイトール、0.5ｍ
MATP）に溶解・混合した後、0.001mlのDNA
−３及び5.0ユニツトのT4−DNAリガーゼを加
え、37℃、１時間、DNAの連結反応を行なわせ
た。この反応物を、形質転換法
（transformationmethod、上記文献１、pp.250）
に従つて、E.coliC600株に取り込ませた。この処
理をした菌体を、50mg／のアンピシリナトリウ
ム及び10mg／のトリメトプリムを含む栄養寒天
培地（１中に、１ｇのグルコース、１ｇのリン
酸２カリウム、５ｇのイーストエキス、５ｇのポ
リペプトン、及び15ｇの寒天を含む寒天培地）上
に塗布し、37℃で24時間培養することにより、
105個のコロニーを得ることができた。これらの
コロニーから、適当に１個選び、菌体を培養し、
TanakaとWeisblumの方法（T.Tanaka，B.
Weisblum；J.Bacteriology，vol121，pp.354
（1975））にしたがつてプラスミドを調製した。得
られたプラスミドを制限酵素EcoRI、BamHAI、
BglII、BstEII、PstI、PvuII、SalI、AatII、
ClaI、HindIII、HpaIによつて切断を試みたとこ
ろ、各々１、１、１、１、１、１、１、２、２、
２、２箇所切断されることが明らかとなつた。得
られたプラスミドをpBSFOLEK1と称した。
pBSFOLEK1の全塩基配列を、ジデオキシ法に
従つて決定した。その結果、第１図に示す塩基配
列が明らかとなり、プラスミドpBSFOLEK1は
4762塩基対より成り立つていることが明らかとな
つた。

実施例 ２ プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliC600
株からのジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエン
ケフアリン融合タンパクの精製。

プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliC600
株を３の50mg／のアンピシリンナトリウムを
含む栄養培地（１中に、５ｇのNaCl、８ｇの
バクトペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液
体培地、PH7.4）３中で37℃で一晩培養後、菌
体を遠心分離により集めた。湿重量約13ｇの菌体
が得られた。菌体を20mlの0.1ｍＭのジチオトレ
イトール（DTT）及び0.1ｍＭのエチレンジアミ
ン４酢酸２ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液PH7.0に懸濁し、超音波破
砕により細胞を破砕した後、20000回転／分、１
時間の遠心分離により上清25mlを得た。得られた
上清のジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したとこ
ろ、144ユニツト／mlという値であつた。上清を、
DEAE−トヨパール650Mカラム（25cmx150cm、
約75cm³）に吸着させ、０から100ｍＭのKCl濃度
勾配をかけ溶出した。約１mlずつフラクシヨンを
集め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を測定し、酵素
活性を有する画分を集めた。25mlの酵素液が得ら
れた。これをアミコン限外ろか装置を用いて約１
mlにまで濃縮し、これをトヨパールHW55カラム
クロマトグラフイーにより分画した。約１mlずつ
フラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元酵素活性
を測定し、酵素活性のピーク画分を集めた（約
3.7ml、48mg）。得られた酵素タンパクをSDS電気
泳動法により分析したところ、均一であり、ラク
トアルブミン、トリプシンインヒビター、トリプ
シノーゲン、カーボニツクアンヒドラーゼ、グリ
セロアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、卵
アルブミン、及び牛血清アルブミンを分子量マー
カーとして精製ジヒドロ葉酸還元酵素の分子量を
推定したところ19000であり、塩基配列から予想
される分子量19296と一致した値であつた。

精製したジヒドロ葉酸還元酵素をエンザイムイ
ムノアツセイにより測定したところ、ロイシンエ
ンケフアリンに対する抗体と反応し、化学合成し
たロイシンエンケフアリンによつて抗原−抗体反
応が競争的に阻害されることが明らかとなつた。
さらに、精製したジヒドロ葉酸還元酵素約1.2mg
を0.5mlの70％ぎ酸中、ブロムシアンで37℃、24
時間処理した後、凍結乾燥しこれを0.2mlの70％
ぎ酸に溶かし、高速液体クロマトグラフイーによ
り分析したところ約0.013mgのロイシンエンケフ
アリンが検出された。この結果は、
pBSFOLEK1を有するE.coliC600株のジヒドロ葉
酸還元酵素がロイシンエンケフアリンとの融合タ
ンパクとして存在することを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、pBSFOLEK1の全塩基配列を示し
た図であり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配
列だけを、5′末端から3′末端の方向に記述してい
る。図中符号は、核酸塩基を表わし、Ａはアデニ
ンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチ
ミンを示している。図中番号はpBSFOLEK1に
２箇所存在する制限酵素ClaI切断認識部位のうち
制限酵素HindIII切断部位に近い方のClaI切断認
識部位の、ATCGATの最初の“Ａ”を１番とし
て数えた番号を示している。第２図は、
pBSFOLEK1中に存在するDHFR−ロイシンエ
ンケフアリン融合タンパクを暗号化する部分の塩
基配列及びタンパクのアミノ酸配列を示す図であ
る。図中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わ
し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
を、Ｔはチミンを、Alaはアラニンを、Argはア
ルギニンを、Asnはアスパラギンを、Aspはアス
パラギン酸を、Cysはシステインを、Glnはグル
タミンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシ
ンを、Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシン
を、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、Metは
メチオニンを、Pheはフエニルアラニンを、Pro
はプロリンを、Serはセリンを、Thrはトレオニ
ンを、Trpはトリプトフアンを、Tyrはチロシン
を、Valはバリンを示している。図中番号は、一
番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化する
ATGコドンの“Ａ”を１番として数えた番号を
示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ E.coliにおいて安定に複製され、宿主である
   E.coliにトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
   性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
   与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ葉酸
   還元酵素遺伝子の3′末端側が一部改変されたこと
   によりジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフ
   アリン融合タンパクを暗号化し、4762塩基対の大
   きさを有し、下記に示されるDNA配列を有する
   新規組換えプラスミドpBSFOLEK1。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ２ E.coliにおいて安定に複製され、宿主である
   E.coliにトリメトプリム耐性及びアンピシリン耐
   性を与えることができ、トリメトプリム耐性を付
   与する遺伝子がBacillus subtilisのジヒドロ葉酸
   還元酵素遺伝子の3′末端側が一部改変されたこと
   によりジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケフ
   アリン融合タンパクを暗号化し、4762塩基対の大
   きさを有し、下記に示されるDNA配列を有する
   新規組換えプラスミドpBSFOLEK1を含有するE.
   coliC600株。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】